CN105112435B - 植物多基因敲除载体的构建及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种植物多基因敲除载体的构建及应用，包括如下步骤：1)、双元表达载体pC1300‑Cas9的构建；2)、中间载体SK‑gRNA的构建；3)、单个目的gRNA的构建；4)、多个gRNA的串联及最终双元表达载体的构建。本发明利用同尾酶连接的方法将多个gRNA序列连接至已有Cas9序列的双元表达载体上，进而通过农杆菌侵染的转基因技术获得植物多突变体。利用这种同尾酶连接的构建策略，可以组合多个gRNA，通过一次转基因就可获得植物多突变体，从而建立了一种高效、便捷制备植物多突变体的方法。

Description

植物多基因敲除载体的构建及应用

技术领域

本发明属于生物技术中利用基因工程方法载体构建的技术领域。

背景技术

多突变体在植物基础功能研究及作物育种中有着重要意义。传统获得多突变体的方法是通过单突变体间的相互杂交、子代分离来完成。但是此方法存在以下问题：1、不一定有所需的单突变体；2、若几个基因间存在紧密连锁，则几乎无法获得多突变体；3、整个过程耗时耗力。

近年来，利用改造后的Type II型CRISPR-Cas9系统，在多个物种中成功实现了基因组的定点修饰，证明CRISPR-Cas9是编辑基因组简单、高效且应用广泛的工具。该系统主要利用内切酶Cas9及定位的向导RNA(gRNA)分子，对基因组中特定的DNA序列进行精细改造，在特定的位置敲除或者插入基因。动物中，通过直接注射Cas9及各gRNA的转录本，就可以同时敲除多个基因，获得多突变体。与动物不同，在植物中，获得稳定的多突变体植株需要用转基因技术将Cas9及多个gRNA功能元件导入来发挥功能。其中转基因过程需要先将带功能元件的双元载体转化农杆菌，再通过农杆菌转染植物，将双元载体的LB和RB之间的片段融合进宿主的基因组上。因此，如何将多个gRNA元件及Cas9序列整合在一个双元载体上，是植物中实现多基因同时敲除的关键。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种植物多基因敲除载体的构建及应用；本发明利用同尾酶连接的方法将多个gRNA序列连接至已有Cas9序列的双元表达载体上，进而通过农杆菌侵染的转基因技术获得植物多突变体。利用这种同尾酶连接的构建策略，可以组合多个gRNA，通过一次转基因就可获得植物多突变体，从而建立了一种高效、便捷制备植物多突变体的方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供的双元载体及中间载体序列及构建方法如下：

1)、双元表达载体pC1300-Cas9的构建：

该载体以双元载体pCAMBIA1300为骨架载体，融合了2×CaMV 35S启动子，经密码子优化的Cas9核酸序列，及CaMV终止子。在2×CaMV 35S启动子前，设计了KpnI和BamHI这两个单酶切位点，用于连接单个或多个gRNA；结构如图1所示。

2)、中间载体SK-gRNA的构建：

该载体以pBlueScript(SK+)为骨架载体，融合了水稻的U3启动子/拟南芥的U6启动子，gRNA骨架序列及poly-T尾巴(终止子)，用于敲除单子叶植物基因/敲除双子叶植物基因；

备注说明：若是用于敲除双子叶植物基因，可将水稻的U3启动子替换为拟南芥的U6启动子；

在U3启动子前设计了BglII、NheI、SalI三个单酶切位点，poly-T尾巴之后设计了XhoI、XbaI、BamHI、KpnI单酶切位点。其中，BglII和BamHI，NheI和XbaI，SalI和XhoI是同尾酶；结构如图2所示。

3)、单个目的gRNA的构建：

在目标基因的基因组序列上找序列为目标序列(单下划线表示靶序列，双下划线表示PAM序列,↓表示CAS9蛋白拟切割突变位点，在PAM的前3个碱基处。)设计两个互补DNA序列分别为：在正向序列前加GGCA，在反向互补序列前加AAAC；

SK-gRNA上有两个AarI酶切位点，用AarI酶切后，形成带有粘性末端的载体；将设计的靶序列正向及反向引物变性退火后，T4连接酶连入SK-gRNA，形成单个目的gRNA。原理如图3所示。

4)、多个gRNA的串联及最终双元表达载体的构建：

单个gRNA用KpnI和BglII双酶切SK-gRNA提供片段，连入载体pC1300-Cas9的KpnI和BamHI识别位点间，得到最终双元表达载体pC1300-Cas9-gRNA。

具体如下：

多个gRNA的聚合：利用BamHI和BglII是同尾酶的属性，进行无限个SK-gRNA中间载体的聚合。作为载体的用KpnI和BamHI进行酶切；提供片段的用KpnI和BglII进行酶切。聚合好的多个gRNA用KpnI和BglII进行酶切并回收片段，将片段连接到pC1300-Cas9的KpnI和BamHI位点间，构建最终双元表达载体，用于转基因制备植物多突变体。构建策略如图4所示。

4个之内gRNA的一步法快速连接：利用BglII和BamHI，NheI和XbaI，SalI和XhoI是同尾酶的属性，作为载体的SK-gRNA用KpnI和XhoI进行酶切；提供片段的中间载体SK-gRNA分别用SalI和XbaI，NheI和BamHI，BglII和KpnI进行酶切，进行4个之内gRNA的一步法快速聚合。最终将聚合好的片段用KpnI和BglII进行酶切并回收片段，连接到pC1300-Cas9的KpnI和BamHI位点间，构建最终双元表达载体，用于转基因制备植物多突变体。构建策略如图5所示。

备注说明：上述2个方案基于的最终原理都是同尾酶连接。

本发明还包括了如下的多突变体的获得与鉴定：

将构建好的最终双元表达载体通过电击的方法转入农杆菌(AgroBacteriumtumefaciens)中，利用农杆菌介导法将此双元表达载体转入植物中。获得转基因植物后，通过PCR法将目的基因片段扩增，进行PCR产物序列测序等检测，以确定目的基因是否发生突变。

综上所述，本发明提供了用于植物多基因敲除的双元载体pC1300-Cas9和中间载体SK-gRNA的构建方法。

本发明提供了将多个gRNA整合至pC1300-Cas9的构建方法。利用同位酶连接的特性，可以将多个序列基本一致的gRNA无限地聚合在一个载体上。

本发明提供了植物中多基因敲除的应用。

本发明具有如下优点：

1.可以对任何基因进行基因编辑，不受突变体库的限制，可以获得常规突变手段无法获得的珍贵材料。

2.只需要一次转基因就可以同时编辑多个基因，在T₀代就可获得多突变体，比传统杂交的方法省时省力。

3、通过子代分离，可以将转基因成分快速剔除，可运用于作物的分子设计育种。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是双元载体pC1300-Cas9中2×35S:Cas9的结构图。

备注说明：2×35S:Cas9的序列如SEQ ID NO:1所述，标示KpnI酶切位点序列，标示BamHI酶切位点序列,标示2×CaMV 35S启动子序列，大写字母标示Cas9蛋白编码序列，标示CaMV终止子序列。

图2是中间载体SK-gRNA中OsU3:gRNA的结构图。

备注说明：OsU3:gRNA的序列如SEQ ID NO:2所述，小写字母标示BglII酶切位点序列，标示NheI酶切位点序列，标示SalI酶切位点序列，大写字母标示OsU3启动子，标示gRNA骨架序列，标示KpnI酶切位点序列，标示BamHI酶切位点序列，标示XbaI酶切位点序列，标示XhoI酶切位点序列。

图3是单个gRNA酶切连接示意图；

下划线标注的是AarI限制性内切酶识别的序列表示切割位点。

图4是基于BamHI和BglII一对同尾酶的多个gRNA聚合策略示意图。

图5是基于三对同尾酶的四个gRNA快速聚合策略示意图。

图6是目的基因PCR产物测序结果；

WT表示野生型未发生突变序列，_表示靶序列，表示PAM序列，-表示缺失碱基，小写字母表示插入的碱基。#1，#2是通过转实施例4构建的pC1300-Cas9-gRNA^PDS-gRNA^Os02g23823-gRNA^OsMPK2-gRNA^Os05g02070获得的转基因水稻。#3，#4是通过转实施例5构建的pC1300-Cas9-gRNA^PDS-gRNA^Os02g23823-gRNA^OsMPK2-gRNA^Os05g02070获得的转基因水稻。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1、双元表达载体pC1300-Cas9的构建

用引物对35S-F:(标示为KpnI，标示为BamHI酶切位点)和35S-R:(标示为BglII酶切位点)PCR扩增质粒pJIT163-2NLSCas9(中国科学院遗传与发育生物学研究所提供)，KOD FX DNA聚合酶(购自东洋纺生物科技有限公司)PCR扩增目的条带，反应条件如下：

反应程序：94℃，变性2分钟；然后98℃变性10秒，58℃退火30秒，68℃延伸40秒，扩增31个循环；最后在68℃下延伸5分钟。

得到约740bp的组成型2×CaMV 35S启动子片段，将该片段用KpnI和BglII双酶切然后连入载体pJIT163-2NLSCas9的KpnI和BamHI识别位点间，构成中间载体163-Cas9。用KpnI和SpeI双酶切质粒163-Cas9，将得到的片段连入双元载体pCAMBIA1300(DingGuo,MCV033)的KpnI和XbaI识别位点间，最终得到双元表达载体pC1300-Cas9。结构如图1所示。

实施例2、中间载体SK-gRNA的构建

用引物对gRNA-F:

(标示为KpnI酶切位点，标示为BamHI酶切位点，标示为XbaI酶切位点，_标示为XhoI酶切位点)和gRNA-R: (标示为NotI酶切位点，标示为BglII酶切位点，_标示为NheI酶切位点，标示为SalI酶切位点)PCR扩增质粒pU3-gRNA(中国科学院遗传与发育生物学研究所)；KOD FX DNA聚合酶(购自东洋纺生物科技有限公司)PCR扩增目的条带，反应条件如下：

反应程序：94℃，变性2分钟；然后98℃变性10秒，58℃退火30秒，68℃延伸30秒，扩增31个循环；最后在68℃下延伸5分钟。

得到约560bp的OsU3:gRNA片段，将该片段用KpnI和NotI双酶切，然后连入载体pBlueScript(SK+)的KpnI和NotI识别位点间，构成中间载体SK-gRNA。结构如图2所示。

备注说明：

质粒pJIT163-2NLSCas9和质粒pU3-gRNA见如下文献：

Shan,Q.,Wang,Y.,Li,J.,Zhang,Y.,Chen,K.,Liang,Z.,Zhang,K.,Liu,J.,Xi,J.J.,Qiu,J.L.,et al.(2013).Targeted genome modification of crop plants usinga CRISPR-Cas system.Nat Biotechnol 31:686-688。

实施例3、单子叶植物水稻中目标序列的选择及单个gRNA中间载体构建

本发明中，以同时敲除OsPDS，Os02g23823，OsMPK2，Os05g02070这四个基因为例，但不限于此。

1.目标序列的选择及引物设计

在目标基因的基因组序列上找序列为目标序列(单下划线表示靶序列，双下划线表示PAM序列,↓表示CAS9蛋白拟切割突变位点，在PAM的前3个碱基处。)设计两个互补DNA序列分别为：在正向序列前加GGCA，在反向互补序列前加AAAC。具体结构如图3所示。

具体如下：

目标基因：OsPDS，基因登陆号：LOC_Os03g08570.1，目标序列：(双下划线表示PAM序列，↓表示CAS9蛋白拟切割突变位点)，用于构建gRNA的引物对:PDS g++：5’-GGCATTGGTCTTTGCTCCTGCAG-3’，PDS g--：5’-AAACCTGCAGGAGCAAAGACCAA-3’。

目标基因：Os02g23823，基因登陆号：LOC_Os02g23823，目标序列：(双下划线表示PAM序列，↓表示CAS9蛋白拟切割突变位点)，用于构建gRNA的引物对：02g23823g++：5’-GGCACTGAAAGATTTGACGTCCC-3’，02g23823g--：5’-AAACGGGACGTCAAATCTTTCAG-3’。

目标基因：OsMPK2，基因登陆号：LOC_Os08g06060.1，目标序列：(双下划线表示PAM序列，↓表示CAS9蛋白拟切割突变位点)，用于构建gRNA的引物对：MPK2g++：5’-GGCAGCGGCGGCCATGGCCATCA-3’，MPK2g--：5’-AAACTGATGGCCATGGCCGCCGC-3’。

目标基因：Os05g02070，基因登陆号：LOC_Os05g02070，目标序列：(双下划线表示PAM序列，↓表示CAS9蛋白拟切割突变位点)，用于构建gRNA的引物对：Os05g02070g++：5’-GGCAAGTGTGGCACCAGCTGCAG-3’，Os05g02070g--：5’-AAACCTGCAGCTGGTGCCACACT-3’。

2.单个gRNA中间载体构建

SK-gRNA进行AarI酶切(购自Ferment公司)，形成带有粘性末端的载体，酶切反应体系如下：

37℃酶切3小时，用Biomed胶回收试剂盒(Biomed，DR0103)按产品说明书进行纯化；得线性载体SK-gRNA/AarI。

100M的g++与g--引物各20μL混合，100℃放置5分钟后置于室温，逐渐冷却，变性退火，形成带有粘性末端的片段。将载体和片段进行T4酶(购自NEB公司)连接，反应如下：

室温反应1小时。连接产物5μL转化大肠杆菌感受态细胞DH5α得到连接质粒。用引物T7：5’-TAATACGACTCACTATAGG-3’，测序确定克隆构建正确。因此，四对g++和g--引物对应的构建获得四个质粒SK-gRNA^PDS，SK-gRNA^Os02g23823，SK-gRNA^MPK2，SK-gRNA^Os05g02070。连接过程如图3所示。

实施例4、基于BamHI和BglII一对同尾酶的四个gRNA聚合

构建策略如图4所示。其中gRNA-1对应gRNA^PDS，gRNA-2对应gRNA^Os02g23823，gRNA-3对应gRNA^MPK2，gRNA-4对应gRNA^Os05g02070。

SK-gRNA^PDS质粒用BamHI和KpnI双酶切，用Biomed胶回收试剂盒(Biomed，DR0103)按产品说明书进行纯化，得线性载体SK-gRNA^PDS/BamHI+KpnI。SK-gRNA^Os02g23823质粒用BglII和KpnI双酶切，切胶回收约550bp大小的条带；将gRNA^Os02g23823片段连入SK-gRNA^PDS载体的BamHI和KpnI识别位点间，获得SK-gRNA^PDS-gRNA^Os02g23823质粒。

载体和片段进行T4酶(购自NEB公司)连接反应如下：

室温反应1小时。连接产物5μL转化大肠杆菌感受态细胞DH5α得到连接质粒。用SK上的通用引物T7:5’-TAATACGACTCACTATAGG-3’和T3:5’-ATTAACCCTCACTAAAGGGA-3’菌落PCR检测克隆是否成功。当扩增得到约1.1Kb条带时，判定克隆成功；反之，则为克隆不成功。

SK-gRNA^MPK2质粒用BamHI和KpnI双酶切，用Biomed胶回收试剂盒(Biomed，DR0103)按产品说明书进行纯化，得线性载体SK-gRNA^MPK2/BamHI+KpnI。SK-gRNA^Os05g02070质粒用BglII和KpnI双酶切，切胶回收约550bp大小的条带；将gRNA^Os05g02070片段连入SK-gRNA^MPK2载体的BamHI和KpnI识别位点间，获得SK-gRNA^MPK2-gRNA^Os05g02070质粒。

载体和片段进行T4酶(购自NEB公司)连接反应如下：

室温反应1小时。连接产物5μL转化大肠杆菌感受态细胞DH5α得到连接质粒。用SK上的通用引物T7和T3菌落PCR检测克隆是否成功。当扩增得到约1.1Kb条带时，判定克隆成功；反之，则为克隆不成功。

SK-gRNA^PDS-gRNA^Os02g23823质粒用BamHI和KpnI双酶切，用Biomed胶回收试剂盒(Biomed，DR0103)按产品说明书进行纯化，得线性载体SK-gRNA^PDS-gRNA^Os02g23823/BamHI+KpnI。SK-gRNA^MPK2-gRNA^Os05g02070质粒用BglII和KpnI双酶切，切胶回收约1100bp大小的条带；将gRNA^MPK2-gRNA^Os05g02070片段连入SK-gRNA^PDS-gRNA^Os02g23823载体的BamHI和KpnI识别位点间，获得SK-gRNA^PDS-gRNA^Os02g23823-gRNA^OsMPK2-gRNA^Os05g02070质粒。

载体和片段进行T4酶(购自NEB公司)连接反应如下：

室温反应1小时。连接产物5μL转化大肠杆菌感受态细胞DH5α得到连接质粒。由于各gRNA的序列，除了目标序列，其余序列都是一致的，所以要通过相关引物g++和g--菌落PCR检测克隆是否成功。在本案例中，使用PDS g++与Os05g02070g--引物进行菌落PCR检测，当扩增得到约1.6Kb条带时，判定克隆成功；反之，则为克隆不成功。

SK-gRNA^PDS-gRNA^Os02g23823-gRNA^OsMPK2-gRNA^Os05g02070质粒用KpnI和BglII双酶切，切胶回收约2.2Kb大小的条带，将此片段连入pC1300-Cas9双元载体的BamHI和KpnI识别位点间，得到最终敲除水稻4个基因的双元表达载体pC1300-Cas9-gRNA^PDS-gRNA^Os02g23823-gRNA^OsMPK2-gRNA^Os05g02070。

连接反应如下：

室温反应1小时。连接产物5μL转化大肠杆菌感受态细胞DH5α得到连接质粒。

用引物pC1300-F：5’-ACACTTTATGCTTCCGGCTC-3’，Os05g02070g--，MPK2g--，02g23823g--测序确定克隆构建正确。当测序结果与设计序列比对相符合时，判定构建正确；反之，则为构建不正确。

实施例5、基于三对同尾酶的四个gRNA快速聚合

构建策略如图5所示。其中gRNA-1对应gRNA^PDS，gRNA-2对应gRNA^Os02g23823，gRNA-3对应gRNA^MPK2，gRNA-4对应gRNA^Os05g02070。

SK-gRNA^PDS质粒用XhoI和KpnI双酶切，用Biomed胶回收试剂盒(Biomed，DR0103)按产品说明书进行纯化，得线性载体SK-gRNA^PDS/XhoI+KpnI。SK-gRNA^Os02g23823质粒用SalI和XbaI双酶切，切胶回收约550bp大小的条带；SK-gRNA^OsMPK2质粒用NheI和BamHI双酶切，切胶回收约550bp大小的条带；SK-gRNA^Os05g02070质粒用BglII和KpnI双酶切，切胶回收约550bp大小的条带；将这三个片段用T4连接酶连入线性载体SK-gRNA^PDS的KpnI和XhoI识别位点间，构成中间步骤载体SK-gRNA^PDS-gRNA^Os02g23823-gRNA^OsMPK2-gRNA^Os05g02070。载体和片段进行T4酶(购自NEB公司)连接反应如下：

室温反应1小时。连接产物5μL转化大肠杆菌感受态细胞DH5α得到连接质粒。由于各gRNA的序列，除了目标序列，其余序列都是一致的，所以应通过相关引物g++和g--菌落PCR检测克隆是否成功。在本案例中，使用PDS g++与Os05g02070g--引物进行菌落PCR检测，当扩增得到约1.6Kb条带时，判定克隆成功；反之，则为克隆不成功。

用引物T7，Os05g02070g--，MPK2g--，02g23823g--测序确定克隆构建正确。当测序结果与设计序列比对相符合时，判定构建正确；反之，则为构建不正确。

SK-gRNA^PDS-gRNA^Os02g23823-gRNA^OsMPK2-gRNA^Os05g02070质粒用KpnI和BglII双酶切，切胶回收约2.2Kb大小的条带，将此片段连入pC1300-Cas9双元载体的BamHI和KpnI识别位点间，得到最终敲除水稻4个基因的双元表达载体pC1300-Cas9-gRNA^PDS-gRNA^Os02g23823-gRNA^OsMPK2-gRNA^Os05g02070。此连接反应同实施例4。

实施例4与实施例5中同样获得了最终的双元表达载体pC1300-Cas9-gRNA^PDS-gRNA^Os02g23823-gRNA^OsMPK2-gRNA^Os05g02070。

实施例6、转基因植株的获得及鉴定

1.转基因植物的获得

通过实施例4和实施例5获得的pC1300-Cas9-gRNA^PDS-gRNA^Os02g23823-gRNA^OsMPK2-gRNA^Os05g02070质粒分别做转基因，即做了两次水稻转基因。

将最终的双元表达载体pC1300-Cas9-gRNA^PDS-gRNA^Os02g23823-gRNA^OsMPK2-gRNA^Os05g02070通过电击的方法转入农杆菌(AgroBacteriumtumefaciens)株系EHA105中，利用农杆菌介导法将此双元表达载体转入水稻日本晴的胚中。转化的具体方法是将日本晴种子的幼胚灭菌后切出，接种到诱导愈伤组织的培养基中。培养1周后，挑选生长旺盛，颜色浅黄，比较松散的胚性愈伤组织，用作转化的受体。用含有pC1300-Cas9-gRNA^OsPDS-gRNA^Os02g23823-gRNA^OsMPK2-gRNA^Os05g02070质粒的EHA105菌株侵染水稻愈伤组织，在黑暗处25℃培养3天后，在含有50mg/L潮霉素的选择培养基上筛选抗性愈伤组织和转基因植株。挑选在潮霉素选择培养基上正常生长的转基因植株，进行下述步骤。2.目的基因PCR产物测序鉴定结果

利用分子生物学手段鉴定目的基因突变情况。CTAB法单株提取转基因植物基因组DNA，分别用引物对PDS-F:5’-TAGGCAACATGTCACTTGGCTCTAGAG-3’和PDS-R:5’-CTCCACTACAGACTGAGCACAAAGCTTC-3’，片段大小578bp；Os02g23823-F:5’-GCTGCATCTATGCGATATCATAATC-3’和Os02g23823-R:5’-CACGCATTCGTTGCTGATACTG-3’，片段大小408bp；MPK2-F:5’-TTATCTCCTCCCAACGCCATTGAATCC-3’和MPK2-R:5’-GAGGAAGAATCAGAATTAGATGGAGATGA-3’，片段大小400bp；Os05g02070-F:5’-ATGGATGCAGATGCAAGATGT-3’和Os05g02070-B:5’-TCAAAGCTCTGATCGACAGTA-3’，片段大小388bp；PCR扩增目的条带。

KOD FX DNA聚合酶(购自东洋纺生物科技有限公司)PCR扩增目的条带，反应条件如下：

反应程序：94℃，变性2分钟；然后98℃变性10秒，58℃退火30秒，68℃延伸40秒，扩增34个循环；最后在68℃下延伸5分钟。

得到的PCR产物送测序公司(杭州擎科梓熙生物技术有限公司)，分别用PDS-F，Os02g23823-F，MPK2-F，Os05g02070-F作为测序引物测序。所得结果与野生型序列进行比对。测序结果为双峰的，用简并密码子策略分析(http://dsdecode.scgene.com/进行峰图分析)，可直接获得杂合突变信息。

得到的转基因水稻的测序结果如图6所示。

#1，#2是通过转实施例4构建的pC1300-Cas9-gRNA^PDS-gRNA^Os02g23823-gRNA^OsMPK2-gRNA^Os05g02070获得的转基因水稻。#1转基因水稻中，OsPDS的两个等位基因都发生了1个碱基的插入，Os02g23823的两个等位基因分别发生了5个碱基的缺失和1个碱基的插入，OsMPK2的两个等位基因分别发生了32bp和31bp的缺失，Os05g02070的两个等位基因分别发生了1个碱基和7个碱基的缺失。#2转基因水稻中，OsPDS的两个等位基因都发生了1个碱基的插入，Os02g23823的两个等位基因都发生了2个碱基的缺失，OsMPK2的两个等位基因发生了小片段的缺失和插入，Os05g02070的两个等位基因分别发生了1个碱基的插入和6个碱基的缺失。由此可以证明#1和#2转基因水稻都是OsPDS、Os02g23823、OsMPK2、Os05g02070这四个基因发生突变的四突变体。

#3，#4是通过转实施例5构建的pC1300-Cas9-gRNA^PDS-gRNA^Os02g23823-gRNA^OsMPK2-gRNA^Os05g02070获得的转基因水稻。#3转基因水稻中，OsPDS的两个等位基因都发生了1个碱基的插入，Os02g23823的两个等位基因分别发生了3个碱基和2个碱基的缺失，OsMPK2的两个等位基因都发生了2个碱基的缺失，Os05g02070的两个等位基因分别发生了2个碱基和1个碱基的缺失。#4转基因水稻中，OsPDS的两个等位基因都发生了1个碱基的插入，Os02g23823的两个等位基因分别发生了1个和2个碱基的缺失，OsMPK2的两个等位基因分别发生了1个和2个碱基的缺失，Os05g02070的两个等位基因分别发生了1个碱基的插入和3个碱基的缺失。由此可以证明#3和#4转基因水稻都是OsPDS、Os02g23823、OsMPK2、Os05g02070这四个基因发生突变的四突变体。

至此，在实施例6中我们可以看出，利用本发明中所构建的双元表达载体pC1300-Cas9-gRNA^PDS-gRNA^Os02g23823-gRNA^OsMPK2-gRNA^Os05g02070，无论是通过实施例4还是实施例5方法构建的质粒，通过农杆菌介导的转基因，可同时敲除多个基因，一步获得多突变体。整个过程只需要构建几步克隆，一次转基因，最快只需要3-4个月，就可以得到多突变体，比传统制备多突变体的方法节约了大量的时间和人力物力，且具有高度的目标性，不再受单突变体材料的限制。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，任何基于同一同尾酶连接策略的构建方式，包括调换同尾酶的顺序，增加或减少同尾酶的对数，及更改骨架载体等变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (2)

1.植物多基因敲除载体的构建方法，其特征是包括如下步骤：

1)、双元表达载体pC1300-Cas9的构建：

以双元载体pCAMBIA1300为骨架载体，融合了2×CaMV 35S启动子，经密码子优化的Cas9核酸序列，及CaMV终止子；在2×CaMV 35S启动子前，设计了KpnI和BamHI这两个单酶切位点，用于连接单个或多个gRNA；

2)、中间载体SK-gRNA的构建：

以pBlueScript SK(+)为骨架载体，融合了水稻的U3启动子/拟南芥的U6启动子，gRNA骨架序列及poly-T尾巴，用于敲除单子叶植物基因/敲除双子叶植物基因；

在U3启动子前设计了BglII、NheI、SalI三个单酶切位点，poly-T尾巴之后设计了XhoI、XbaI、BamHI、KpnI单酶切位点；其中，BglII和BamHI，NheI和XbaI，SalI和XhoI是同尾酶；

3)、单个目的gRNA的构建：

在目标基因的基因组序列上找序列为目标序列；

设计两个互补DNA序列分别为：在正向序列前加GGCA，在反向互补序列前加AAAC；

SK-gRNA上有两个AarI酶切位点，用AarI酶切后，形成带有粘性末端的载体；将设计的靶序列正向及反向引物变性退火后，T4连接酶连入SK-gRNA，形成单个目的gRNA；

4)、多个gRNA的串联及最终双元表达载体的构建：

①、单个gRNA用KpnI和BglII双酶切SK-gRNA提供片段，连入载体pC1300-Cas9的KpnI和BamHI识别位点间，得到双元表达载体pC1300-Cas9-gRNA；

②、4个之内gRNA的一步法快速连接：

利用BglII和BamHI，NheI和XbaI，SalI和XhoI是同尾酶的属性，作为载体的用KpnI和XhoI进行酶切；提供片段的分别用SalI和XbaI，NheI和BamHI，BglII和KpnI进行酶切，进行4个之内gRNA的一步法快速聚合；最终将聚合好的片段用KpnI和BglII进行酶切并回收片段，连接到pC1300-Cas9的KpnI和BamHI位点间，构建最终双元表达载体，用于转基因制备植物多突变体。

2.根据权利要求1所述的植物多基因敲除载体的构建方法，其特征是：双元表达载体pC1300-Cas9-gRNA¹-gRNA²gRNA³-gRNA⁴，1、2、3、4代表不同的敲除位点。