CN1737154A - 含多拷贝表达盒重组酵母表达质粒的快速构建方法 - Google Patents
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Abstract
一种含有多拷贝表达盒的重组酵母表达质粒的快速构建方法，属于生物技术领域。本发明选取一对同尾酶及限制性内切酶，再用两组限制性内切酶分别对重组酵母表达质粒进行限制性内切酶双酶切消化反应，分别回收含有表达盒的DNA片段，将回收的DNA片段进行连接，形成的阳性重组质粒即是含多拷贝表达盒重组酵母表达质粒。本发明同原始方法相比具有以下特点：①更先进可行；②操作更简便；③含表达盒的多拷贝串联物的获得过程由原来的随机获得改进为可人为设计和控制获得，由此使得重组酵母表达质粒中表达盒拷贝数完全符合实验人员的预期设计数目。
Description
技术领域：
本发明属于生物技术领域。
背景技术：
目前所使用的酵母表达载体主要有YIp型载体、YRp型载体、YCp型载体、YEp型载体和YAC型载体。常用的主要是改造后的YIp型载体，一方面它可通过其整合介导区与酵母染色体的同源重组将外源基因整合到酵母基因组中，产生稳定的转化菌株，另一方面，改造后的载体可以实现在酵母基因组中的多拷贝整合，转化效率很高，有利于外源基因的大量表达。由于酵母表达载体对外源基因的表达是以载体中的表达盒为单位进行的，因此，体外构建具有多拷贝含目的基因表达盒的重组酵母表达质粒对于外源基因的表达是具有现实意义的。
以Invitrogen公司开发的pPICZα系列载体为例，其构建含有多拷贝表达盒重组酵母表达质粒的方法主要有两种，二者原理基本相同，均是利用载体中存在的一对同尾酶(Isocaudarner)Bgl II和BamH I位点而实现的。这里仅简单介绍其中的一种方法：
1、利用Bgl II和BamH I这两种限制性内切酶对单拷贝重组质粒进行酶切，产物中含有两种DNA片段：含有目的基因的片段(即含有目的基因的表达盒，以下简称单体)和载体其余部分。两种片段的四个粘性末端完全相同；
2、将单体回收后用连接酶连接，便可获得随机连接产生的大量多聚体。这些多聚体无论在单体的连接方向上还是在多聚体中单体数目上均存在着很大的随机性，不可人为控制。若单体之间是以首尾方向顺序相连，那么产生的新片段将不能被Bgl II和BamH I中的任何一种酶所识别、切割，若单体之间不是以首尾方向顺序相连，那么产生的新片段必将会被Bgl II或BamH I所识别、切割，从而重新释放出粘末端(如图1)；
3、连接产物进行Bgl II及BamH I酶切反应，酶切产物通过电泳便可分离得到不同长度的DNA片段，这些片段便是含有不同单体数目、且单体间均是以首尾方向顺序串联的单体多聚物；
4、将获得的所有实现单体顺序串联的多聚物同仅经BamH I酶切的单拷贝重组质粒进行连接，连接产物转化入合适的大肠杆菌感受态细胞中；
5、提取质粒，并利用Bgl II及BamH I对各种重组质粒所含单体的拷贝数进行鉴定。
通过上述方法确实可获得含多拷贝表达盒重组酵母表达质粒，但构建过程很繁琐且不确定，而含多拷贝表达盒的重组酵母表达质粒要经过转化后培养、质粒提取，酶切反应鉴定等过程才能确定重组质粒内表达盒的拷贝数、锁定所需要的阳性重组质粒，因此导致实验结果随机性很强且工作量大。
技术内容：
本发明的目的是提供一种获得含有多拷贝表达盒的重组酵母表达质粒的快速构建方法。
本发明的实现过程是：设酵母表达载体为V，含外源插入目的基因的表达盒为C，则含单拷贝表达盒的重组酵母表达质粒为V-C，其构建过程是：
首先尽量靠近表达盒两侧边缘处选取一对同尾酶E2、E3，然后在载体非表达盒部分选取一个在重组酵母表达质粒中仅具有唯一识别序列的限制性内切酶E1；再用E1+E2和E1+E3两组限制性内切酶分别对重组酵母表达质粒V-C进行限制性内切酶双酶切消化反应，分别回收含有表达盒C的DNA片段，将两种回收的DNA片段进行连接，形成的阳性重组质粒即是含二拷贝表达盒重组酵母表达质粒V-2C。
本发明再利用限制性内切酶E1+E2、E1+E3分别对重组酵母发达质粒V-mC及V-nC进行限制性内切酶双酶切消化反应，进行回收、连接反应后便可获得顺序插入m+n拷贝表达盒的重组酵母表达质粒V-(m+n)C，由此构建了含多拷贝表达盒重组表达质粒；其中，m、n为大于等于1的整数，m+n的和视酵母表达载体可容纳范围而定。
本发明的优点和积极效果为：
本发明是在认真分析、总结酵母表达载体基本核苷酸序列及其表达目的基因基本原理基础上，提出的一种新的重组酵母表达质粒构建方法，其结果是获得含有预期拷贝表达盒的重组酵母表达质粒。同原始方法相比具有以下特点：①更先进可行；②操作更简便；③含表达盒的多拷贝串联物的获得过程由原来的随机获得改进为可人为设计和控制获得，由此使得重组酵母表达质粒中表达盒拷贝数完全符合实验人员的预期设计数目。
1、本发明提供的构建方法较以往技术更具有现实可行性；
2、本发明提供的构建方法较以往技术具有操作简便、快捷性；
3、以往技术中含目的基因表达盒的多聚体是通过连接反应随机获得，而本发明提供的构建方法则使之改进为可人为设计和控制获得；
4、以往技术中含多拷贝表达盒的重组酵母表达质粒要经过转化后培养、质粒提取，酶切反应鉴定等过程才能确定重组质粒内表达盒的拷贝数，而本发明提供的构建方法则在转化之前便已明确阳性重组质粒中所含表达盒的拷贝数，从而避免了转化后随机的质粒提取及鉴定，直至最终锁定目标克隆的大工作量操作。
附图说明：
图1是本发明同尾酶酶切产物随机连接产物模式图；
图2是本发明含二拷贝目的基因重组酵母表达质粒构建策略示意图；
具体实施方式：
本发明的实现过程是：设酵母表达载体为V，含外源插入目的基因的表达盒为C，则含单拷贝表达盒的重组酵母表达质粒为V-C，其构建过程是：
首先尽量靠近表达盒两侧边缘处选取一对同尾酶E2、E3，然后在载体非表达盒部分选取一个在重组酵母表达质粒中仅具有唯一识别序列的限制性内切酶E1；再用E1+E2和E1+E3两组限制性内切酶分别对重组酵母表达质粒V-C进行限制性内切酶双酶切消化反应，分别回收含有表达盒C的DNA片段，将两种回收的DNA片段进行连接，形成的阳性重组质粒即是含二拷贝表达盒重组酵母表达质粒V-2C。
本发明再利用限制性内切酶E1+E2、E1+E3分别对重组酵母发达质粒V-mC及V-nC进行限制性内切酶双酶切消化反应，进行回收、连接反应后便可获得顺序插入m+n拷贝表达盒的重组酵母表达质粒V-(m+n)C，由此构建了含多拷贝表达盒重组表达质粒；其中，m、n为大于等于1的整数，m+n的和视酵母表达载体可容纳范围而定。
本发明以pPICZαA载体(3.6kb)为例进行具体的叙述：
1、限制性内切酶的选择
在表达盒内，尽量靠近表达盒两侧边缘处选取一对同尾酶，然后，在载体非表达盒部分选取一个在重组酵母表达质粒中仅具有唯一识别序列的限制性内切酶。以pPICZ α为例选取BamH I与Bgl II这对同尾酶，以及EcoR V。
2、含二拷贝表达盒重组酵母表达质粒的构建
以pPICZαA载体(3.6kb)为例，设插入的外源目的基因为S，长度约为1.0kb，命名含单拷贝表达盒重组酵母表达质粒为pPICZαA-S。含二拷贝表达盒重组酵母表达质粒构建策略详见附页图1。简述如下：
2.1第一次限制性内切酶酶切反应
用限制性内切酶EcoR V(识别位点为GATATC，产物为平末端，位于载体第2602碱基处)与BamH I(识别位点为GGATCC，产物为5′突出粘末端，位于载体第1414碱基处)对重组质粒pPICZ αA-S进行限制性内切酶双酶切消化反应，其产物为两种DNA片段，长度分别为(2.4+1.0)kb(含有目的基因S的表达盒及部分载体片段)与1.2kb(载体其余部分)。回收长度约为(2.4+1.0)kb的DNA片段，该片段两端分别为EcoR V酶切产生的平末端，及BamH I酶切产生的5′突出粘末端。
2.2第二次限制性内切酶酶切反应
用限制性内切酶EcoR V与Bgl II(识别位点为AGATCT，产物为5′突出粘末端，位于载体第2碱基处，与BamH I酶切后产生的5′突出粘末端同尾，二者可通过反向互补配对进行连接，但连接后产生的序列却不能被二者中的任何一个所识别、切割，参见附图1)对重组质粒pPICZαA-S进行限制性内切酶双酶切消化反应，其产物也为两种DNA片段，长度分别为(2.6+1.0)kb(含有目的基因S的表达盒及部分载体片段)与1.0kb(载体其余部分)。回收长度约为(2.6+1.0)kb的DNA片段，该片段两端分别为EcoR V酶切产生的平末端，及Bgl II酶切产生的5′突出粘末端。
2.3连接反应
将2.1中获得的3.4kb DNA片段与2.2中获得的长约3.6kb的DNA片段在T4DNA连接酶的作用下，4℃过夜连接。连接产物转化至JM109感受态细胞中。阳性重组质粒即为pPICZαA-2S。该质粒是以pPICZαA为载体，顺序插入两拷贝的含有目的基因S的表达盒。
3、含多拷贝表达盒重组酵母表达质粒的构建
3.1第一组限制性内切酶酶切反应
用限制性内切酶EcoR V与BamH I对重组酵母表达质粒pPICZαA-nS进行限制性内切酶双酶切消化反应，其产物为两种DNA片段，即由n个表达盒(含目的基因S)及部分载体片段构成的长片段与1.2kb(载体其余部分)的小片段。回收酶切产物中DNA大片段，该片段两端分别为EcoR V酶切产生的平末端，及BamH I酶切产生的5′突出粘末端。其核苷酸序列为n个含有目的基因S的表达盒及部分载体片段。
3.2第二组限制性内切酶酶切反应
用限制性内切酶EcoR V与Bgl II对重组酵母表达质粒pPICZ α A-mS进行限制性内切酶双酶切消化反应，其产物也为两种DNA片段，即由m个表达盒(含目的基因S)及部分载体片段构成的长片段与1.0kb(载体其余部分)的小片段。回收酶切产物中DNA大片段，该片段两端分别为EcoR V酶切产生的平末端，及Bgl II酶切产生的5′突出粘末端。其核苷酸序列为m个含有目的基因S的表达盒及部分载体片段。
3.3连接反应
将3.1中获得的DNA片段与3.2中获得的DNA片段在T4 DNA连接酶的作用下，4℃过夜连接。连接产物转化至JM109感受态细胞中。阳性重组质粒为pPICZαA-(m+n)S。该质粒是以pPICZαA为载体，顺序插入m+n个拷贝的含目的基因S的表达盒，从而轻松实现含预期拷贝表达盒重组酵母表达质粒的构建。
Claims (2)
1、一种含有多拷贝表达盒的重组酵母表达质粒的快速构建方法，设酵母表达载体为V，含外源插入目的基因的表达盒为C，则含单拷贝表达盒的重组酵母表达质粒为V-C，其构建过程是：
首先尽量靠近表达盒两侧边缘处选取一对同尾酶E2、E3，然后在载体非表达盒部分选取一个在重组酵母表达质粒中仅具有唯一识别序列的限制性内切酶E1；再用E1+E2和E1+E3两组限制性内切酶分别对重组酵母表达质粒V-C进行限制性内切酶双酶切消化反应，分别回收含有表达盒C的DNA片段，将两种回收的DNA片段进行连接，形成的阳性重组质粒即是含二拷贝表达盒重组酵母表达质粒V-2C。
2、根据权利要求1所述的含有多拷贝表达盒的重组酵母表达质粒的快速构建方法，其特征在于：利用限制性内切酶E1+E2、E1+E3分别对重组酵母发达质粒V-mC及V-nC进行限制性内切酶双酶切消化反应，进行回收、连接反应后便可获得顺序插入m+n拷贝表达盒的重组酵母表达质粒V-(m+n)C，由此构建了含多拷贝表达盒重组表达质粒；其中，m、n为大于等于1的整数，m+n的和视酵母表达载体可容纳范围而定。
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| CN105647959A (zh) * | 2016-03-24 | 2016-06-08 | 华中科技大学 | 一种构建酵母多拷贝表达载体的方法 |
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2004
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