CN102174649A - 快速检测锌指核酸酶介导基因定点整合的方法 - Google Patents
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Abstract
一种快速检测锌指核酸酶介导基因定点整合的方法，在报告基因的读码框内插入了锌指核酸酶的靶序列，破坏了报告基因的读码框。将携带该报告基因的载体整合到细胞中建立稳定表达该突变的报告基因的细胞系。将表达锌指核酸酶的载体和用于纠正的供体载体共转染到携带报告基因的细胞系后通过检测阳性细胞的比例检测锌指核酸酶的定点剪切能力。本发明将报告基因整合到真核细胞基因组中，通过报告基因的纠正，方便的观察基因的定点整合效率，实现对锌指核酸酶介导的基因定点整合的快速检测。本发明具有操作简单、实验周期短、成本低、检测结果准确的优点。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及快速检测锌指核酸酶介导基因定点整合的方法。
技术背景
锌指核酸酶技术是近年来发展起来的一项新的技术，通过人工设计的锌指核酸酶在基因组DNA的特定位置切割产生DNA双链缺口，继而通过细胞内源性的修复机制对断裂部位的基因进行修饰。同传统的同源重组技术相比较，锌指核酸酶技术可以使基因组靶向修饰的效率提高了101～105。锌指核酸酶介导的基因定点修饰已经在多种体外培养的细胞中获得成功；包括人的ES和iPS细胞、植物、果蝇、爪蟾、线虫、斑马鱼、小鼠、大鼠等[2]，显示出该技术的广泛适用性，这将有力地推动基因靶向修饰技术的应用研究。
锌指核酸酶是一种由针对特定DNA序列的锌指蛋白和具有非特异性作用的FokI核酸内切酶催化结构域组成的重组蛋白。FokI核酸内切酶的催化结构域需形成二聚体才能发挥内切酶活性，因此必须由一对锌指核酸酶分别结合于由4-6个碱基间隔的DNA两条链上的靶序列上形成二聚体才能对DNA进行切割。常用的锌指蛋白由3个或4个锌指组成，一个锌指识别连续的三个碱基，因此两个锌指核酸酶共可以识别18个或者24个碱基，锌指核酸酶对DNA靶序列结合的特异性保证了对基因组DNA的特异性的切割。
锌指核酸酶的特异性取决于锌指蛋白，因此筛选高质量的锌指蛋白是获得高效特异性锌指核酸酶的关键。锌指蛋白的筛选方法经历了长时间的发展，已经相对成熟，目前主要的筛选方法有两种：一种是Sangamo Biosciences公司的专利技术，可通过sigma公司订购该服务；另一种是锌指协会开发的开放性技术平台(Oligomerized Pool Engineering，OPEN)，该平台的所有相关技术及资源都是免费开放的，使得研究人员可以筛选自己感兴趣的锌指蛋白。
目前对所筛选的锌指核酸酶的检测方法都是在细菌或酵母中进行的，其过程复杂，而且其所测定的主要是锌指核酸酶对靶位点的结合力，对其所介导的体内定点整合缺乏有效的检测方法。当前需迫切解决的一个技术问题是提供一种快速检测锌指核酸酶介导基因定点整合的方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服上述锌指核酸酶检测方法的缺点，提供一种简单、快速的锌指核酸酶快速检测方法。
解决上述技术问题所采用的技术方案它是由以下步骤组成：
1、构建报告基因表达载体
报告基因表达载体是在真核表达载体中同时表达报告基因和筛选基因。
上述的报告基因被分成上游片段和下游片段，在上游片段和下游片段之间插入锌指核酸酶作用位点，该插入位点距报告基因的3’端或者5’端至少为50bp。
上述的锌指核酸酶作用位点包含左侧锌指核酸酶结合位点和右侧锌指核酸酶结合位点，左侧锌指核酸酶结合位点和右侧锌指核酸酶结合位点之间包含5～7个碱基的间隔序列。
2、构建锌指核酸酶表达载体
锌指核酸酶表达载体表达针对锌指核酸酶作用位点的一对锌指核酸酶，即左侧锌指核酸酶和右侧锌指核酸酶。
3、构建供体载体
供体载体携带报告基因全长序列或部分序列。
部分序列与上游片段、下游两段分别具有至少50bp的同源序列。
4、建立锌指核酸酶检测细胞系
将报告基因表达载体导入到真核细胞中，通过筛选基因的筛选，获得稳定表达报告基因的真核细胞系。
5、检测锌指核酸酶介导的基因定点整合效率
将供体载体和锌指核酸酶表达载体同时导入到锌指核酸酶检测细胞系中，统计报告基因纠正的细胞占所有导入锌指核酸酶表达载体和供体载体细胞的比例。
本发明的报告基因表达载体是在慢病毒载体中携带两个表达框，一个表达框中表达报告基因，另一个表达框中表达筛选基因。
本发明的真核表达载体为慢病毒载体、逆转录病毒载体、质粒载体、腺相关病毒载体中的任意一种。
本发明的报告基因是绿色荧光蛋白、mcherry、荧光素酶、DsRed中的任意一种。
本发明的筛选基因是新霉素或潮霉素。
本发明的锌指核酸酶表达载体是一个真核表达载体上同时表达左侧锌指核酸酶和右侧锌指核酸酶或者两个真核表达载体分别表达左侧锌指核酸酶和右侧锌指核酸酶，该真核表达载体是非整合性载体。
本发明的锌指核酸酶表达载体是在真核表达载体中通过可自我剪切的2A肽元件同时表达左侧锌指核酸酶和右侧锌指核酸酶。
本发明的真核细胞为293细胞或U87细胞。
本发明的锌指核酸酶是锌指蛋白和IIS型限制性内切核酸酶的切割结构域组成的融合蛋白。
本发明将报告基因整合到真核细胞基因组中，通过报告基因的纠正，方便的观察基因的定点整合效率，实现对锌指核酸酶介导的基因定点整合的快速检测。本发明具有操作简单、实验周期短、成本低、检测结果准确的优点。
附图说明
图1是报告基因表达载体结构图
图2是锌指核酸酶表达载体结构图
图3是供体载体结构图
图4是携带hVEGF TSF-eGFP报告基因的293细胞纠正结果
图5是携带AAVS1 TSF-luciferase报告基因的293细胞纠正结果
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明不限于这些实施例。
实施例1
快速检测hVEGF锌指核酸酶介导基因定点整合的方法，其步骤如下：
1、构建表达hVEGF TSF-eGFP的报告基因表达载体
(1)在慢病毒载体的第一个表达框中插入筛选基因
将慢病毒载体Lenti用PacI和SalI酶切，与经过同样酶切处理的新霉素(Neomycin)筛选基因片段连接，连接条件同上一步。连接产物采用同样的方法转化、提取质粒DNA、酶切鉴定获得阳性克隆，命名为Lenti/Neomycin。即为携带筛选基因表达框的慢病毒载体。
(2)在慢病毒载体的第二个表达框中插入报告基因
将绿色荧光蛋白(eGFP)报告基因从5’端下游495bp的位置分成两段，根据eGFP的碱基序列设计引物，分别扩增上游片段、下游片段，同时在上游片段的3’端加入TAA使其与eGFP的读码框一致，以终止eGFP的表达，使得eGFP不能产生完整的eGFP蛋白，同时在上游片段、下游片段之间插入hVEGF锌指核酸酶作用位点(hVEGF TSF)。该实施例中用到的锌指核酸酶作用位点是由左侧锌指核酸酶作用位点和右侧锌指核酸酶作用位点以及两者之间的6个间隔碱基组成的，这里的间隔碱基也可以是5个或者7个。
引物序列如下：
P1 eGFP ClaI for：aatcgatatggtgagcaagggcgagga
P2 eGFP UP BamHI-KpnI reverse：
AGGATCCTTGGTACCTTAGTTCACCTTGATGCCGTTCTT
P3 eGFP Down BamHI for：AGGATCCTTCAAGATCCGCCACAACATC
P4 eGFP XbaI reverse：ttctagattacttgtacagctcgtccatgc
P5 hVEGF TSF KpnI for：cAGCAGCGTCTTCGAGAGTGAGGACctcgagtta
P6 hVEGF TSF BglII XhoI reverse：
gatctaactcgagGTCCTCACTCTCGAAGACGCTGCTggtac
以eGFP基因的全长序列为模板，通过聚合酶链式反应分别扩增上游片段(eGFP UP)和下游片段(eGFPDown)。聚合酶链式反应扩增条件是：94℃、30秒，98℃、10秒，55℃、15秒，72℃、15秒，28个循环。聚合酶链式反应产物经质量分数为2.0％的琼脂糖电泳后回片段即获得eGFP UP和eGFP Down两个片段。将聚合酶链式反应获得eGFP UP和eGFP Down片段分别与pGEMT-T easy载体连接。连接条件是：2μl酶切纯化片段，1μl 10×T4连接酶缓冲液，0.5μl T载体，0.5μl T4连接酶，6μl三蒸水，16℃连接过夜，将连接产物转化感受态的DH5α细胞，并涂布于含有100μg/ml的氨苄青霉素的LB平板中。挑取菌落接种到含有100μg/ml的氨苄青霉素的LB培养液中，14～16小时后，经碱性裂解法提取质粒DNA，通过酶切及测序鉴定阳性克隆。将所获得阳性克隆分别命名为pGEMT/eGFP UP；pGEMT/eGFP Down。
将pGEMT/eGFP UP通过ClaI和BamHI酶切并回收片段，与经同样酶切处理的921载体连接。连接条件是：2μl酶切纯化片段，1μl 10×T4连接酶缓冲液，1μl酶切载体，0.5μl T4连接酶，5.5μl三蒸水。连接产物采用同样的方法转化、提取质粒DNA、酶切鉴定获得阳性克隆，命名为921/eGFP UP。将pGEMT/eGFP Down通过BamHI和XbaI酶切处理并回收片段，与经过同样酶切处理的921/eGFPUP载体相连接，连接条件与上一步相同。连接产物采用同样的方法转化、提取质粒DNA、酶切鉴定获得阳性克隆，命名为921/eGFP UP-Down。
将引物P5和P6用高压的超纯水稀释至20μM，各取15μl混合，在室温放置2小时，得到hVEGF TSF片段。将hVEGF TSF片段与经KpnI和BamHI酶切处理的921/eGFP UP-Down载体连接，连接条件同上。连接产物采用同样的方法转化、提取质粒DNA、酶切鉴定获得阳性克隆，命名为921/eGFP UP-hVEGF TSF-Down。将921/eGFP UP-hVEGF TSF-Down载体用ClaI和XbaI酶切，与经过同样酶切处理的Lenti/Neomycin连接，连接条件同上一步。连接产物采用同样的方法转化、提取质粒DNA、酶切鉴定获得阳性克隆，命名为Lenti/Neomycin/eGFP UP-hVEGFTSF-Down，即为表达hVEGF TSF-eGFP的报告基因表达载体，此慢病毒载体携带两个表达框，其中一个表达框表达新霉素筛选基因，另一个表达框表达hVEGF TSF-eGFP报告基因。结构见图1。
该步骤中的慢病毒载体可用逆转录病毒载体、质粒载体、腺相关病毒载体中的一种替换。
2、构建锌指核酸酶表达载体
本实施例采用一个表达载体同时表达两个锌指核酸酶，锌指核酸酶间通过一种可自我剪切的2A肽元件(可以是T2A或F2A或P2A或E2A)连接，这里选用的是T2A序列。根据针对hVEGF的锌指核酸酶序列合成hVEGF ZFL-T2A-hVEGF ZFR全长基因，并克隆到pcDNA3.1载体，获得pcDNA3.1/hVEGF ZFN。这里的锌指核酸酶是由针对hVEGF的锌指蛋白和IIS型限制性内切核酸酶FokI的切割结构域组成的融合蛋白。
DNA序列如下：
GCTAGCATcGAt ATGGCACCAAAGAAAAAGCGGAAGGTAGATTACAAAGATCATGATGGCGATTACAAGGACCACGATATCGACTACAAAGATGACGATGATAAGAAGCTTC CCCACGAACGACCCTTTCAGTGCCGGATCTGTATGCGCAATTTCTCCACAGGACAGATTTTGGATAGACATACCCGGACACATACGGGCGAAAAACCTTT TCAGTGCAGAATTTGTATGCGGAATTTTAGCGTGGCGCACAGCCTGAAACGGCATCTGCGCACGCACACCGGAGAAAAACCCTTCCAGTGCAGGATTTGC
将pcDNA 3.1/hVEGF ZFN经过ClaI和SpeI酶切处理，与经过同样酶切处理的pacAd5 CMVK-N pA载体连接，连接条件与上一步相同。连接产物采用同样的方法转化、提取质粒DNA、酶切鉴定获得阳性克隆，将所获得阳性克隆命名为pAd5CMV-hVEGF ZFN。获得hVEGF锌指核酸酶表达载体。载体结构见图2。
3、构建用于hVEGF TSF-eGFP报告基因纠正的供体载体
采用引物P1和P4，以eGFP全长基因为模板通过聚合酶链式反应扩增eGFP基因。聚合酶链式反应扩增条件是：94℃、30秒，98℃、10秒，55℃、15秒，72℃、45秒，28个循环。聚合酶链式反应产物经质量分数为2.0％的琼脂糖电泳后回片段即获得eGFP基因。将聚合酶链式反应获得eGFP基因与pGEMT-T easy载体连接，连接条件与上一步相同。连接产物采用同样的方法转化、提取质粒DNA、酶切鉴定获得阳性克隆，所获得阳性克隆命名为pGEMT/eGFP。
将pGEMT/eGFP用ClaI和XbaI酶切处理，与经过同样酶切处理的Lenti/Neomycin连接，连接条件同上一步。连接产物采用同样的方法转化、提取质粒DNA、酶切鉴定获得阳性克隆，将阳性克隆命名为lenti/Neomycin/eGFP。
将lenti/Neomycin/eGFP载体中的eGFP及其下游的1.5kb片段通过ClaI和SalI酶切并回收片段，与经过同样酶切处理的921载体连接，连接条件与上一步相同。连接产物采用同样的方法转化、提取质粒DNA、酶切鉴定获得阳性克隆，将所获得阳性克隆命名为921/eGFPdonor。获得了用于eGFP纠正的供体载体，结构见图3。
建立用于hVEGF锌指核酸酶检测的293细胞系
将第一步获得的表达报告基因的慢病毒载体与慢病毒包装辅助载体以分子数1∶1的比例共转染293T细胞，24小时后收获上清感染60mm平皿的293细胞。48小时后开始在培养基中加G418筛选，至细胞生长稳定，获得用于hVEGF锌指核酸酶检测的稳定293细胞系，命名为hVEGF TSFeGFP-293。
5、针对hVEGF的锌指核酸酶的检测
取供体载体921/eGFP donor 6ug、hVEGF锌指核酸酶表达载体2ug，通过磷酸钙共沉淀共转染hVEGF TSF eGFP-293细胞系。同时设置对照组921/eGFP donor 6μg、921 2μg，采用同样的方法共转染hVEGF TSF eGFP-293细胞系。72小时后在荧光显微镜下观察实验组和对照组中GFP阳性细胞的比例，结果见图4。由图4可见，细胞系中突变的eGFP被定点整合的eGFP供体载体纠正后出现绿色荧光。
实施例2
快速检测AAVS1锌指核酸酶介导基因定点整合的方法，其步骤如下：
1、构建表达AAVS1 TSF-luciferase的报告基因表达载体
(1)在慢病毒载体的第一个表达框中插入筛选基因
将慢病毒载体Lenti用PacI和SalI酶切，与经过同样酶切处理的新霉素(Neomycin)筛选基因片段连接，连接条件同上一步。连接产物采用同样的方法转化、提取质粒DNA、酶切鉴定获得阳性克隆，命名为Lenti/Neomycin。即为携带筛选基因表达框的慢病毒载体。
(2)在慢病毒载体的第二个表达框中插入报告基因
将荧光素酶(luciferase)报告基因从5’端下游717bp的位置分成两段，根据luciferase的碱基序列设计引物，分别扩增上游片段、下游片段，同时在上游片段的3’端加入TAA使其与luciferase的读码框一致，以终止luciferase的表达，使得luciferase不能产生完整的蛋白，同时在上游片段和下游片段之间插入AAVS1锌指核酸酶作用位点(AAVS1TSF)。
引物序列如下：
P7 Luci ClaI for：AATCGATATGGAAGATGCCAAAAACATT
P8 Luci XbaI reverse：ATCTAGATTACACGGCGATCTTGCC
P9 Luci up BamHI KpnI reverse：AGGATCCTTGGTACCTTAGCTGAGGATAGCGGTGTCGG
P10 Luci down BamHI for：AGGATCCGTGGTGCCATTTCACCACGG
P11 AAVS1 TSF KBL for：CcaccccacagtggggccactagggacaggattCTCGAGTTA
P12 AAVS1 TSF KBL reverse：GATCTAACTCGAGaatcctgtccctagtggccccactgtggggtgGGTAC
以luciferase基因的全长序列为模板，通过聚合酶链式反应分别扩增上游片段(Luci UP)和下游片段(Luci Down)。聚合酶链式反应扩增条件是：94℃、30秒，98℃、10秒，55℃、15秒，72℃、1min，28个循环。聚合酶链式反应产物经质量分数为2.0％的琼脂糖电泳后回片段即获得Luci UP和Luci Down两个片段。将聚合酶链式反应获得Luci UP和Luci Down片段分别与pGEMT-T easy载体连接。连接条件是：2μl酶切纯化片段，1μl 10×T4连接酶缓冲液，0.5μl T载体，0.5μl T4连接酶，6μl三蒸水，16℃连接过夜，将连接产物转化感受态的DH5α细胞，并涂布于含有100μg/ml的氨苄青霉素的LB平板中。挑取菌落接种到含有100μg/ml的氨苄青霉素的LB培养液中，14～16小时后，经碱性裂解法提取质粒DNA，通过酶切及测序鉴定阳性克隆。将所获得阳性克隆分别命名为pGEMT/Luci UP；pGEMT/Luci Down。
将pGEMT/Luci UP通过ClaI和BamHI酶切并回收片段，与经同样酶切处理的921载体连接。连接条件是：2μl酶切纯化片段，1μl 10×T4连接酶缓冲液，1μl酶切载体，0.5μl T4连接酶，5.5μl三蒸水。连接产物采用同样的方法转化、提取质粒DNA、酶切鉴定获得阳性克隆，命名为921/LuciUP。将pGEMT/Luci Down通过BamHI和XbaI酶切处理并回收片段，与经过同样酶切处理的921/Luci UP载体相连接，连接条件与上一步相同。连接产物采用同样的方法转化、提取质粒DNA、酶切鉴定获得阳性克隆，命名为921/Luci UP-Down。
将引物P11和P12采用同实施例1相同的方式退火形成AAVS1TSF片段，与用KpnI和BamHI酶切处理好的载体921/Luci UP-Down连接，连接条件同实施例1。连接产物采用同样的方法转化、提取质粒DNA、酶切鉴定获得阳性克隆，命名为921/Luci UP-AAVS1TSF-Down。
其它步骤与实施例1相同，即可获得Lenti/Neomycin/Luci UP-AAVS1 TSF-Down，即为表达AAVS1TSF-Luciferase的报告基因表达载体，此慢病毒载体携带两个表达框，其中一个表达框表达新霉素筛选基因，另一个表达框表达AAVS1 TSF-luciferase报告基因。
2、构建锌指核酸酶表达载体
在本实施例中采用两个表达载体分别表达左侧锌指核酸酶和右侧锌指核酸酶。
根据已报道的AAVS1锌指核酸酶的DNA序列分别合成AAVS1的左侧锌指核酸酶和右侧锌指核酸酶，并克隆只pcDNA3.1载体，获得pcDNA3.1/AAVS1 ZFNL和pcDNA3.1/AAVS1 ZFNR。这里的锌指核酸酶是由针对AAVS1的锌指蛋白和IIS型限制性内切核酸酶FokI的切割结构域组成的融合蛋白。DNA序列如下：
AAVS1 ZFNL：
GCTAGCATcGAtATGGCACCAAAGAAAAAGCGGAAGGTAGATTACAAAGATCATGATGGCGATTACAAGGACCACGATATCGACTACAAAGATGACGATGATAAGAAGCTTATGGCCGAGAGACCCTTCCAGTGCAGGATCTGCATGCGGAACTTTAGCTACAACTGGCACCTGCAGAGACATATTAGGACCCACACCGGGCGAAAAGCCCTTTGCTTGCGACATTTGCGGACGGAAATTCGCCAGGAGCGACCACCTGACCACCCACACAAAGATCCATACAGGAAGCCAGAAGCCATTTCAATGTAGAATTTGTATGAGGAATTTCTCCCACAACTACGCCAGGGACTGCCATATCCGGACACACACAGGGGAGAAACCATTCGCCTGTGATATCTGTGGCAGAAAGTTTGCCCAGAACAGCACCAGAATCGGCCACACCAAAATTCATCTcGAgCAGCTGGTTAAATCCGAGTTGGAAGAGAAAAAGTCTGAGCTCCGCCATAAGTTGAAATACGTGCCTCACGAGTATATCGAACTGATCGAGATCGCCAGAAACTCAACCCAAGACAGGATTTTGGAAATGAAAGTGATGGAGTTCTTTATGAAGGTCTATGGCTATAGGGGAAAGCACCTCGGCGGGAGCAGGAAGCCCGACGGCGCCATTTATACAGTCGGGTCTCCAATCGACTATGGGGTCATCGTTGACACTAAGGCCTATTCCGGGGGTTACAACCTCCCAATAGGGCAGGCTGACGAGATGCAGGACTACGTGGAGGAGAACCAAACAAGGAACAAGCATATAAACCCTAACGAGTGGTGGAAAGTATACCCTAGTTCTGTTACTGAGTTCAAGTTTCTCTTCGTGAGCGGACACTTCAAAGGAAATTACAAAGCTCAACTGACAAGACTGAATCATATTACTAACTGTAATGGTGCCGTCCTGTCAGTGGAGGAACTGCTGATTGGCGGAGAGATGATCAAGGCAGGCACCCTTACTCTCGAAGAAGTGCGGCGAAAGTTTAATAACGGTGAAATCAACTTCTAATCTAGA
AAVS1 ZFNR：
GAATTCATGGCGCCCAAGAAGAAACGAAAGGTCTATCCTTACGATGTGCCAGACTACGCCGGGTATCCATATGATGTGCCTGACTATGCCGGCAGCTATCCCTATGACGTGCCCGATTATGCAGCTCACGGtACcATGGCCGAGAGACCCTTCCAGTGCAGGATCTGCATGCGGAACTTTAGCCAGAGCAGCAACCTGGCCAGACATATTAGGACCCACACCGGCGAAAAGCCCTTTGCTTGCGACATTTGCGGACGGAAATTCGCCAGAACCGACTACCTGGTGGACCACACAAAGATCCATACAGGAAGCCAGAAGCCATTTCAATGTAGAATTTGTATGAGGAATTTCTCCTACAACACCCACCTGACCAGACATATCCGGACACACACAGGGGAGAAACCATTCGCCTGTGATATCTGTGGCAGAAAGTTTGCCCAGGGCTACAACCTGGCCGGCCACACCAAAATTCATGGaTCcCAGTTGGTGAAATCCGAGCTGGAGGAGAAAAAGTCAGAGCTGCGCCACAAACTCAAGTACGTGCCACACGAATACATTGAGCTGATCGAGATCGCCAGGAACTCCACGCAGGACAGAATCCTgGAGATGAAGGTAATGGAATTTTTCATGAAGGTGTACGGCTACAGAGGCAAGCATCTGGGAGGGTCCCGCAAGCCTGATGGAGCAATCTACACCGTCGGAAGCCCCATaGATTACGGGGTAATCGTCGATACCAAAGCATATAGTGGCGGATACAACCTGCCAATCGGCCAAGCCCGGGAAATGCAGCGATACGTGGAAGAAAACCAGACTAGGAACAAACACATTAACCCAAACGAATGGTGGAAAGTCTATCCTAGCTCTGTGACGGAGTTCAAGTTTCTCTTTGTTTCCGGCCATTTCAAGGGGAATTACAAGGCTCAGCTGACAAGGCTGAATCATATTACTAATTGTAACGGGGCCGTTCTCTCAGTGGAAGAGCTGCTGATTGGCGGAGAGATGATTAAAGCCGGCACCCTTACCCTGGAAGAGGTTCGGCGGAAATTCAACAATGGCGAGATAAACTTTTGAACTAGTGcggccgc
将pcDNA3.1/AAVS1 ZFNL用ClaI和XbaI酶切处理并回收片段，与经过同样酶切处理的载体pacAd5 CMV K-N pA连接，连接条件与上一步相同。连接产物采用同样的方法转化、提取质粒DNA、酶切鉴定获得阳性克隆，将所获得阳性克隆命名为pAd5CMV-AAVS1 ZFNL。将pcDNA3.1/AAVS1 ZFNR用EcoRI和SpeI酶切并回收片段，与经过同样酶切处理的载体pacAd5CMV K-N pA连接，连接条件与上一步相同。连接产物采用同样的方法转化、提取质粒DNA、酶切鉴定获得阳性克隆，将所获得阳性克隆命名为pAd5CMV-AAVS1 ZFNR，获得用于分别表达AAVS1左侧锌指核酸酶和右侧锌指核酸酶的载体。
3、构建用于AAVS1 TSF-eGFP报告基因纠正的供体载体
采用引物P7和P8，以Luciferase全长基因为模板通过聚合酶链式反应扩增Luciferase基因。聚合酶链式反应扩增条件是：94℃、30秒，98℃、10秒，55℃、15秒，72℃、1分45秒，28个循环。聚合酶链式反应产物经质量分数为1.0％的琼脂糖电泳后回片段即获得eGFP基因。将聚合酶链式反应获得Lucfferase基因与pGEMT-T easy载体连接，连接条件与上一步相同。连接产物采用同样的方法转化、提取质粒DNA、酶切鉴定获得阳性克隆，所获得阳性克隆命名为pGEMT/Luciferase，获得供体载体。
4、建立用于AAVS1锌指核酸酶检测的U87细胞系
采用与实施例1相同的方法包装lenti/Neomycin/Luci UP-AAVS1 TSF-Down慢病毒并建立用于AAVS1锌指核酸酶检测的稳定U87细胞系，命名为AAVS1 TSF eGFP-U87。
5、针对AAVS1的锌指核酸酶的检测
取供体载体pGEMT/luciferase 6μg、AAVS1锌指核酸酶表达载体2μg，通过磷酸钙共沉淀共转染AAVS1 TSF-U87细胞系。同时设置对照组pGEMT/luciferase 6μg、921 2μg，采用同样的方法共转染AAVS1 TSF-U87细胞系。72小时后收细胞，采用Promega公司的Dual-Luciferase ReporterAssay System(Cat No.E1910)试剂盒检测报告基因的荧光强度，结果见图5。由图5可见在AAVS1的锌指核酸酶(AAVS1 ZFN)与用于纠正的供体载体(Donor)共转染的实验组中荧光素酶的荧光强度明显高于只转染了供体载体的对照组。
实施例3
快速检测hVEGF锌指核酸酶介导基因定点整合的方法，其步骤如下：
1、构建表达hVEGF TSF-mcherry的报告基因表达载体
将mcherry报告基因从5’端下游50bp的位置分成两段，根据mcherry的碱基序列设计引物，分别扩增上游片段、下游片段，同时在上游片段的3’端加入TAA使其与mcherry的读码框一致，以终止mcherry的表达，使得mcherry不能产生完整的蛋白，同时在上游片段、下游片段之间插入hVEGF锌指核酸酶作用位点(hVEGF TSF)。
引物序列如下：
P13 mcherry up BamHI-KpnI reverse：AGGATCCTTGGTACCTTAAATGAACTCCTTGATGA
P14 mcherry down BamHI for：AGGATCCGCGCTTCAAGGTGCACATG
采用与实施例1相同的方法，获得表达报告基因的慢病毒载体：Lenti/Neomycin/mcherryup-hVEGF TSF-down。
2、构建用于hVEGF TSF-mcherry报告基因纠正的供体载体
根据mcherry基因的序列涉及引物，序列如下：
P15 mcherry 100 reverse：TCTCGAACTCGTGGCCGTT
采用引物P1和P15，以mcherry全长基因为模板通过聚合酶链式反应扩增mcherry基因5‘端的100bp碱基序列mcherry100。聚合酶链式反应扩增条件是：94℃、30秒，98℃、10秒，55℃、15秒，72℃、20秒，28个循环。聚合酶链式反应产物经质量分数为2.0％的琼脂糖电泳后回片段即获得mcherry100片段。将聚合酶链式反应获得mcherry100片段与pGEMT-T easy载体连接，连接条件与上一步相同。连接产物采用同样的方法转化、提取质粒DNA、酶切鉴定获得阳性克隆，所获得阳性克隆命名为pGEMT/mcherry100，即获得了用于mcherry报告基因纠正的供体载体。
其它步骤与实施例1相同。
实施例4
快速检测hVEGF锌指核酸酶介导基因定点整合的方法，其步骤如下：
1、构建表达hVEGF TSF-mcherry的报告基因表达载体
将mcherry报告基因从3’端上游50bp的位置分成两段，根据mcherry的碱基序列设计引物，分别扩增上游片段、下游片段，同时在上游片段的3’端加入TAA使其与mcherry的读码框一致，以终止mcherry的表达，使得mcherry不能产生完整的蛋白，同时在上游片段、下游片段之间插入hVEGF锌指核酸酶作用位点(hVEGF TSF)。
引物序列如下：
P16 mcherry up BamHI-KpnI reverse：
AGGATCCTTGGTACCTTATTGTTCGTACTGTTCCACGAT
P17 mcherry down BamHI for：AGGATCCGCGCCGAGGGCCGCCAC
采用与实施例1相同的方法，获得表达报告基因的慢病毒载体：Lenti/Neomycin/mcherryup-hVEGF TSF-down。
其它步骤与实施例1相同。
实施例5
将实施例1构建表达hVEGF TSF-eGFP报告基因的表达载体步骤1中的eGFP报告基因替换为DsRed，其它步骤与实施例1相同。
实施例6
在以上的实施例1～5中的筛选基因新霉素(Neomycin)替换为潮霉素(Hygromycin)，其它步骤与相应的实施例相同。
Claims (9)
1.一种快速检测锌指核酸酶介导基因定点整合的方法，其特征在于它由以下步骤组成：
(1)构建报告基因表达载体
报告基因表达载体是在真核表达载体中同时表达报告基因和筛选基因；
上述的报告基因被分成上游片段和下游片段，在上游片段和下游片段之间插入锌指核酸酶作用位点，该插入位点距报告基因的3’端或者5’端至少为50bp；
上述的锌指核酸酶作用位点包含左侧锌指核酸酶结合位点和右侧锌指核酸酶结合位点，左侧锌指核酸酶结合位点和右侧锌指核酸酶结合位点之间包含5～7个碱基的间隔序列；
(2)构建锌指核酸酶表达载体
锌指核酸酶表达载体表达针对锌指核酸酶作用位点的一对锌指核酸酶，即左侧锌指核酸酶和右侧锌指核酸酶；
(3)构建供体载体
供体载体携带报告基因全长序列或部分序列；
部分序列与上游片段、下游两段分别具有至少50bp的同源序列；
(4)建立锌指核酸酶检测细胞系
将报告基因表达载体导入到真核细胞中，通过筛选基因的筛选，获得稳定表达报告基因的真核细胞系；
(5)检测锌指核酸酶介导的基因定点整合效率
将供体载体和锌指核酸酶表达载体同时导入到锌指核酸酶检测细胞系中，统计报告基因纠正的细胞占所有导入锌指核酸酶表达载体和供体载体细胞的比例。
2.按照权利要求1所述的快速检测锌指核酸酶介导基因定点整合的方法，其特征在于：所说的报告基因表达载体是在慢病毒载体中携带两个表达框，一个表达框中表达报告基因，另一个表达框中表达筛选基因。
3.按照权利要求1所述的快速检测锌指核酸酶介导基因定点整合的方法，其特征在于：所说的真核表达载体为慢病毒载体、逆转录病毒载体、质粒载体、腺相关病毒载体中的任意一种。
4.按照权利要求1或2所述的快速检测锌指核酸酶介导基因定点整合的方法，其特征在于：所说的报告基因是绿色荧光蛋白、mcherry、荧光素酶、DsRed中的任意一种。
5.按照权利要求1或2所述的快速检测锌指核酸酶介导基因定点整合的方法，其特征在于：所说的筛选基因是新霉素或潮霉素。
6.按照权利要求1所述的快速检测锌指核酸酶介导基因定点整合的方法，其特征在于：所说的锌指核酸酶表达载体是一个真核表达载体上同时表达左侧锌指核酸酶和右侧锌指核酸酶或者两个真核表达载体分别表达左侧锌指核酸酶和右侧锌指核酸酶，该真核表达载体是非整合性载体。
7.按照权利要求1或6所述的快速检测锌指核酸酶介导基因定点整合的方法，其特征在于：所说的锌指核酸酶表达载体是在真核表达载体中通过可自我剪切的2A肽元件同时表达左侧锌指核酸酶和右侧锌指核酸酶。
8.按照权利要求1所述的快速检测锌指核酸酶介导基因定点整合的方法，其特征在于：所说的真核细胞为293细胞或U87细胞。
9.按照权利要求1所述的快速检测锌指核酸酶介导基因定点整合的方法，其特征在于：所说的锌指核酸酶是锌指蛋白和IIS型限制性内切核酸酶的切割结构域组成的融合蛋白。
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