CN103981176A - kan/neoR抗性报告基因突变体及其应用 - Google Patents
kan/neoR抗性报告基因突变体及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了kan/neoR抗性报告基因突变体，其中，kan/neoR抗性基因起始密码子ATG后与其后第一个氨基酸密码子ATT之间插入一定长度的异源靶序列核苷酸片段；所述一定长度的异源核苷酸片段是指大于等于1bp碱基且小于100bp碱基的3整数倍或者非3整数倍的异源靶序列核苷酸片段。本方法通过对kan/neoR抗性报告基因插入突变，观察在不同抗性上的菌落的有无或细胞的生存与死亡进行核酸酶活性与脱靶效应的评估。该方法与现有检测技术相比具有快速、准确、方法简单、成本低的优点；尤为突出的是，这一新方法的敏感性远远高于现有技术。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及医学诊断和生物技术，具体的是通过对卡那霉素/G418抗性报告基因进行缺失突变和插入突变，以获得可同时用于原核体系和真核体系的既可定性也可定量的核酸酶活性检测技术细胞筛查技术。
背景技术
锌指核酸酶（Zinc finger nuclease），归巢核酸酶(meganuclease)，反因子核酸酶(TAL nuclease)和CRISPR-Cas核酸酶，都是可以进行基因工程设计的新酶类，在基因剪辑中具有十分重要的作用，可用于物种基因的改造、动物模型的制备、细胞株的制备，以及基因治疗研究和临床应用。
在上述基因工程酶中，锌指核酸酶历史较长，由于操作复杂和脱靶效应较高，应用受到一定限制。而CRISPR-Cas核酸酶结构简单，易于操作，但同样存在高的脱靶效应。反因子核酸酶则具有较低的脱靶效应。
转录激活样效应因子（Transcription activator–like effectors）TALE为近年发现的一类可识别碱基的氨基酸序列高度重复蛋白质，来源于一种革兰氏阴性细菌，每一重复单元大多由33-35个氨基酸组成，其中第12和13位氨基酸共同负责识别1个碱基，目前广泛使用的识别单元为四种，即NI识别A,HD识别C,NG识别T,NN识别G或A。这种与核酸碱基具有确切互补识别关系的生物模块，可用于构建人工转录因子或基因工程酶，在工农业和生物医学中具有十分重大的理论和应用价值。
其中由转录激活样因子与FokI酶的核酸酶裂解中心所形成的反因子核酸酶（TAL effector nucleases,TALENs），在物种基因改造，基因治疗等多方面已显示出其他工程酶如锌指蛋白酶与归巢核酸酶或巨核酸酶所无法比拟的优势。尽管反因子核酸酶的脱靶效应较低，但当最终研究目的为用于基因治疗时，则为了避免相关基因治疗的可能毒副作用必须进行全基因组脱靶效应的检测。现有技术采用的脱靶效应检测方法如错配双链检测法，不但敏感性低和效率较低，而且不能对脱靶效应进行定位和对全基因范围进行检测。
为了解决上述现有技术存在的缺陷，本发明由此而来。
发明内容
本发明所要解决的第一方面的技术问题在于提供一种可用于检测反因子核酸酶TALENs活性的kan/neoR抗性报告基因突变体。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是，kan/neoR抗性基因起始密码子ATG后与其后第一个氨基酸密码子ATT之间插入一定长度的异源靶序列核苷酸片段。
优选地，所述一定长度的异源核苷酸片段是指大于等于1bp碱基且小于100bp碱基的非3整数倍的异源靶序列核苷酸片段。
优选地，所述一定长度异源核苷酸片段为16，31bp碱基。
优选地，所述一定长度的异源核苷酸片段是指大于等于1bp碱基且小于100bp碱基的3的整数倍的异源靶序列核苷酸片段。
优选地，所述一定长度异源核苷酸片段为15，39bp碱基。
优选地，所述3的整数倍的异源靶序列核苷酸片段含有或者不含有终止密码子。
本发明所要解决的第二方面的技术问题在于提供一种载体，其含有kan/neoR抗性报告基因突变体；所述载体为质粒。
本发明所要解决的第三方面的技术问题在于提供kan/neoR抗性报告基因突变体用于核酸酶活性的检测的用途。
优选地，kan/neoR抗性报告基因突变体的起始密码子ATG后与其后ATT之间插入1bp碱基且小于100bp碱基的非3整数倍的异源靶序列核苷酸片段，导致其阅读框架改变，kan/neoR抗性消失。
优选地，kan/neoR抗性报告基因突变体的起始密码子ATG后与其后ATT之间插入1bp碱基且小于100bp碱基的3整数倍的异源靶序列核苷酸片段，其阅读框架不改变不提前终止，kan/neoR抗性不消失。
本发明所要解决的第四方面的技术问题在于提供kan/neoR抗性报告基因突变体用于剪辑后的真核细胞株系的阳性筛选的用途。
技术术语及名词。“TALENs”是指转录激活因子样效应蛋白核酸酶，即黄单胞杆菌TAL效应子蛋白与非特异性核酸酶FokI的DNA切割域组成的具有DNA特异性识别-结合-切割的新型工具酶。对任意特定核酸靶序列的重组核酸酶，在特异的位点打断目标基因DNA，进而在该位点进行DNA操作，使基因操作变得更加简单、方便。
技术术语及名词：“异源核苷酸片段”是指待检测的核酸酶识别和切割的目标序列。
本发明涉及的碱基“N”是代指“a、t、c、g”的任一种碱基。
本发明中Kan/Neo抗性报告基因的序列如SeqNo5所示。
本方法通过对kan/Neo抗性报告基因进行插入突变，通过观察在不同抗性上的菌落的有无或细胞的生存与死亡进行核酸酶活性与脱靶效应的评估。该方法与现有检测技术luciferase活性检测法、细胞内源基因突变率检测法（非配对内切酶法-T7E1法或CelI法）、融合荧光法、深度高通量测序法等方法相比具有快速、准确、方法简单、成本低的优点；尤为突出的是，这一新方法的敏感性远远高于现有技术。
附图说明
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：图1kan/neoR抗性基因起始密码子ATG后面插入15个碱基（nntnntnntnntnnt)得到仍具有kan/neoR抗性的报告质粒的测序图，测序十个菌落100%含有插入序列；
图2kan/neoR抗性基因起始密码子ATG后面插入15个碱基（nacnacnacnacnac）得到仍具有kan/neoR抗性报告质粒的测序图；
图3kan/neoR抗性基因起始密码子ATG后面插入39个碱基（nacnacnacnacnac）得到仍具有kan/neoR抗性报告质粒的测序图；
图4kan/neoR抗性基因起始密码子ATG后面插入16个碱基（nntnntnntnntnntn)得到仍具有kan/neoR抗性报告质粒，测序5个菌落，发现均能形成新的起始密码子的测序图；
图5kan/neoR抗性基因起始密码子在ATG后面插入31个碱基
GGAGGTGGAGGTGGAGTGTTTTAATACTGAT得到仍具有kan/neoR抗性报告质粒，发现能形成新的起始密码子测序图。
具体实施方式
为了便于理解，以下将通过具体的实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的。
一.仪器、材料
pEGFP-N1-CVU质粒（CLONTECH公司），pdc316质粒（本元正阳基因公司），引物合成及测序生工生物工程（上海）股份公司。
PCR扩增仪（ABI公司，System9700），电泳仪（Bio-Rad生物公司），PCR扩增试剂盒，NheI和BamHI内切酶（购于thermoscientific公司），核酸片段回收试剂盒（购于天根生物）。T4DNA连接酶（thermoscientific公司）其余均为国产试剂及耗材。
二.建立方法
实施例1
1.扩增插入特定碱基的改造的Kan/neoR抗性基因序列:ATG后插入15个碱基NNT*5
1.1合成引物
引物1：5’-CTAAGATCTATGNNTNNTNNTNNTNNTATTGAACAAGATGGATTGC-3’（SeqNo1）
引物25’-CGAGCTCTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCGATA-3’（SeqNo2）
1.2用1.1中引物，以pEGFP-N1-CVU为模板，进行PCR扩增形成目的产物。
其中，每25μL PCR反应体系包括：12.5μL的2X Tag mix,两条特异性引物分别为5μM，5μM，模板40ng，其余为水。PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性20S，58℃退火20S，72℃延伸30S，共35个循环；最后72℃5min;
1.3用琼脂糖凝胶电泳分离、纯化检测步骤2中的扩增产物;
1.4用SacⅠ、BgIⅡ双酶切纯化后PCR产物和pdc316，并纯化酶切体系
20ul酶切反应体系为2μL的10X FastDigest Green Buffer，限制性内切酶SacⅠ、BgIⅡ分别为1μL，PCR产物或pdc3161ug，其余为水;37℃30min，65℃5min;
1.5连接
将1.4中酶切后的PCR产物和载体pdc316连接。其连接体系为：1uL的10×T4DNA Ligase Buffer，0.5uL的T4DNA Ligase，1uL的pdc316，0.1pmol～0.3pmol的目标产物，加水至总体积10uL;22℃反应60分钟;
1.6转化
将1.5中的连接产物转化DH5α大肠杆菌，在含有Amp抗生素Amp Kan双抗抗生素的琼脂培养基上平行培养。观察是否形成单菌落。
1.7结果
Kan/neoR抗性基因起始密码子ATG后面插入15个碱基，NNT得到仍具有kan/neoR抗性报告质粒。
实施例2
2.扩增插入特定碱基的改造的Kan/neoR抗性基因序列:ATG后插入16个碱基NNTNNTNNTNNTNNTN
2.1合成引物
引物1：5’-CTAAGATCTATGNNTNNTNNTNNTNNTNATTGAACAAGATGGATTGC-3’（SeqNo3）
引物25’-CGAGCTCTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCGATA-3’（SeqNo2）
2.2用2.1中引物，以pEGFP-N1-CVU为模板，进行PCR扩增形成目的产物。
其中，每25μL PCR反应体系包括：12.5μL的2X Tag mix,两条特异性引物分别为5μM，5μM，模板40ng，其余为水。PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性20S，58℃退火20S，72℃延伸30S，共35个循环；最后72℃5min;
2.3用琼脂糖凝胶电泳分离、纯化检测步骤2中的扩增产物;
2.4用SacⅠ、BgIⅡ双酶切纯化后PCR产物和pdc316，并纯化酶切体系
20ul酶切反应体系为2μL的10X FastDigest Green Buffer，限制性内切酶SacⅠ、BgIⅡ分别为1μL，PCR产物或pdc3161ug，其余为水;37℃30min，65℃5min;
2.5连接
将1.4中酶切后的PCR产物和载体pdc316连接。其连接体系为：1uL的10×T4DNA Ligase Buffer，0.5uL的T4DNA Ligase，1uL的pdc316，0.1pmol～0.3pmol的目标产物，加水至总体积10uL;22℃反应60分钟;
2.6转化
将1.5中的连接产物转化DH5α大肠杆菌，在含有Amp抗生素Amp Kan双抗抗生素的琼脂培养基上平行培养。观察是否形成单菌落。
2.7结果
Kan/neoR抗性基因起始密码子ATG后面插入16个碱基，NNTNNTNNTNNTNNTN得到仍具有kan/neoR抗性报告质粒。测序发现具有kan/neoR抗性报告质粒，均形成了不引起后续阅读框架改变与阅读框架的提前终止的起始密码子。
实施例3
3.扩增插入特定碱基的改造的Kan/neoR抗性基因序列:ATG插入31个碱基“GGAGGTGGAGGTGGAGTGTTTTAATACTGAT”
3.1合成引物
引物4：
5’-CTAAGATCTATGGGAGGTGGAGGTGGAGTGTTTTAATACTGATATTGAACAAGATGGATTGC-3’（SeqNo4）
引物25’-CGAGCTCTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCGATA-3’（SeqNo2）
3.2用3.1中引物，以pEGFP-N1-CVU为模板，进行PCR扩增形成目的产物。
其中，每25μL PCR反应体系包括：12.5μL的2X Tag mix,两条特异性引物分别为5μM，5μM，模板40ng，其余为水。PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性20S，58℃退火20S，72℃延伸30S，共35个循环；最后72℃5min;
3.3用琼脂糖凝胶电泳分离、纯化检测步骤2中的扩增产物;
3.4用SacⅠ、BgIⅡ双酶切纯化后PCR产物和pdc316，并纯化酶切体系20ul酶切反应体系为2μL的10X FastDigest Green Buffer，限制性内切酶SacⅠ、BgIⅡ分别为1μL，PCR产物或pdc3161ug，其余为水;37℃30min，65℃5min;
3.5连接
将1.4中酶切后的PCR产物和载体pdc316连接。其连接体系为：1uL的10×T4DNA Ligase Buffer，0.5uL的T4DNA Ligase，1uL的pdc316，0.1pmol～0.3pmol的目标产物，加水至总体积10uL;22℃反应60分钟;
3.6转化
将1.5中的连接产物转化DH5α大肠杆菌，在含有Amp抗生素Amp Kan双抗抗生素的琼脂培养基上平行培养。观察是否形成单菌落。
3.7结果
Kan/neoR抗性基因起始密码子ATG后面插入31个碱基，GGAGGTGGAGGTGGAGTGTTTTAATACTGAT得到仍具有kan/neoR抗性报告质粒。
三.结果
（一）kan/neoR抗性基因起始密码子ATG后面插入不含有终止密码子的3整数倍的核苷酸片段不导致其阅读框架改变与阅读框架的提前终止，抗性不消失。
1.kan/neoR抗性基因起始密码子ATG后面插入15个NAC,NNT得到仍具有kan/neoR抗性报告质粒
2.kan/neoR抗性基因起始密码子ATG后面插入15个碱基“CCTTCTTCTATTTCT”不移码，得到仍具有kan/neoR抗性报告质粒
3.kan/neoR抗性基因起始密码子ATG后面插入39个碱基“CACTACCACTACGACTACCACAACTACAACTACGACTAC”不移码，得到仍具有kan/neoR抗性报告质粒
（二）kan/neoR抗性基因起始密码子ATG后面插入非3整数倍的核苷酸片段则导致其阅读框架改变，抗性消失。
kan/neoR基因起始密码子ATG后面插入16个碱基“CCTTCTTCTATTTCTT”移码，报告质粒kan/neoR抗性失效
（三）kan/neoR抗性基因起始密码子ATG后面插入非3整数倍的核苷酸片段若可形成新的不引起后续阅读框架改变与阅读框架的提前终止的起始密码子，抗性不消失。
1.kan/neoR抗性基因起始密码子ATG后面插入16个碱基若可以形成新的不引起后续阅读框架改变与阅读框架的提前终止的起始密码GTG,TTG得到仍具有kan/neoR抗性报告质粒
2.kan/neoR抗性基因起始密码子ATG后面插入31个碱基可形成新的不引起后续阅读框架改变与阅读框架的提前终止的起始密码子“GGAGGTGGAGGTGGAGTGTTTTAATACTGAT”得到仍具有kan/neoR抗性报告质粒
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实例的限制，上述实例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。
Claims (10)
1.kan/neoR抗性报告基因突变体，其中，kan/neoR抗性基因起始密码子ATG后与其后第一个氨基酸密码子ATT之间插入一定长度的异源靶序列核苷酸片段。
2.根据权利要求1所述的kan/neoR抗性报告基因突变体，其中，所述一定长度的异源核苷酸片段是指大于等于1bp碱基且小于100bp碱基的非3整数倍的异源靶序列核苷酸片段；优选为16，31bp碱基。
3.根据权利要求1所述的kan/neoR抗性报告基因突变体，其中，所述一定长度的异源核苷酸片段是指大于等于1bp碱基且小于100bp碱基的含有或者不含有终止密码子3的整数倍的异源靶序列核苷酸片段，优选为15，39bp碱基。
4.一种载体，其含有权利要求1-3任一项的kan/neoR抗性报告基因突变体；所述载体为质粒。
5.权利要求1-3任一项的kan/neoR抗性报告基因突变体或权利要求4所述的载体用于核酸酶活性的检测。
6.根据权利要求5所述的用途，其中，kan/neoR抗性报告基因突变体的起始密码子ATG后与其后ATT之间插入1bp碱基且小于100bp碱基的非3整数倍的异源靶序列核苷酸片段，其阅读框架改变，kan/neoR抗性消失。
7.根据权利要求5所述的用途，其中，kan/neoR抗性报告基因突变体的起始密码子ATG后与其后ATT之间插入1bp碱基且小于100bp碱基的非3整数倍的异源靶序列核苷酸片段，该异源靶序列核苷酸片段形成新的不引起后续阅读框架改变与阅读框架的提前终止的起始密码子，抗性不消失。
8.根据权利要求5所述的用途，其中，kan/neoR抗性报告基因突变体的起始密码子ATG后与其后ATT之间插入1bp碱基且小于100bp碱基的不含有终止密码子3整数倍的异源靶序列核苷酸片段，其阅读框架不改变不提前终止，kan/neoR抗性不消失。
9.根据权利要求5所述的用途，其中，kan/neoR抗性报告基因突变体的起始密码子ATG后与其后ATT之间插入1bp碱基且小于100bp碱基的含有终止密码子3整数倍的异源靶序列核苷酸片段，其阅读框架提前终止，kan/neoR抗性消失。
10.权利要求1-3任一项的kan/neoR抗性报告基因突变体或权利要求4所述的载体用于剪辑后的真核细胞株系的阳性筛选。
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