CN103981175A - 博来霉素抗性报告基因突变体及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了博来霉素抗性报告基因突变体及其用途，其中，在博来霉素基因的起始密码子ATG与其后第一个氨基酸密码子GCC之间插入一定长度的异源靶序列核苷酸片段，一定长度的异源核苷酸片段是指大于等于1bp碱基且小于1kb碱基的3的整数倍或非3整数倍的异源靶序列核苷酸片段。本方法通过对博来霉素抗性报告基因进行插入突变，构建可用于检测核酸酶活性的双抗质粒。通过观察在不同抗性上的菌落的有无或细胞的生存与死亡进行核酸酶活性与脱靶效应的评估。该方法与现有检测技术相比具有快速、准确、方法简单、成本低的优点；尤为突出的是，这一新方法的敏感性远远高于现有技术。

Description

博来霉素抗性报告基因突变体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及医学诊断和生物技术，特别涉及通过对博来霉素抗性报告基因进行插入突变，以获得可同时用于原核体系和真核体系的既可定性也可定量的核酸酶活性检测技术细胞筛查技术。

背景技术

锌指核酸酶（Zinc finger nuclease），归巢核酸酶(meganuclease)，反因子核酸酶(TAL nuclease)和CRISPR-Cas核酸酶，都是可以进行基因工程设计的新酶类，在基因剪辑中具有十分重要的作用，可用于物种基因的改造、动物模型的制备、细胞株的制备，以及基因治疗研究和临床应用。

在上述基因工程酶中，锌指核酸酶历史较长，由于操作复杂和脱靶效应较高，应用受到一定限制。而CRISPR-Cas核酸酶结构简单，易于操作，但同样存在高的脱靶效应。反因子核酸酶则具有较低的脱靶效应。

转录激活样效应因子（Transcription activator–like effectors,TALE）为近年发现的一类可识别碱基的氨基酸序列高度重复蛋白质，来源于一种革兰氏阴性细菌，每一重复单元大多由33-35个氨基酸组成，其中第12和13位氨基酸共同负责识别1个碱基，目前广泛使用的识别单元为四种，即NI识别A,HD识别C,NG识别T,NN识别G或A。这种与核酸碱基具有确切互补识别关系的生物模块，可用于构建人工转录因子或基因工程酶，在工农业和生物医学中具有十分重大的理论和应用价值。

由转录激活样因子与FokI酶的核酸酶裂解中心所形成的反因子核酸酶（TAL effector nucleases,TALENs），在物种基因改造，基因治疗等多方面已显示出其他工程酶如锌指蛋白酶与归巢核酸酶所无法比拟的优势。尽管反因子核酸酶的脱靶效应较低，但当最终研究目的为用于基因治疗时，则为了避免相关基因治疗的可能毒副作用必须进行全基因组脱靶效应的检测。现有技术采用的脱靶效应检测方法如错配双链检测法，不但敏感性低和效率较低，而且不能对脱靶效应进行定位和对全基因范围进行检测。

为了解决上述现有技术存在的缺陷，本发明由此而来。

发明内容：

本发明所要解决的第一方面的技术问题在于提供一种博来霉素抗性报告基因突变体，其中，在博来霉素基因的起始密码子ATG和其后的第一个氨基酸密码子GCC之间插入一定长度的异源靶序列核苷酸片段。

优选地，所述一定长度的异源核苷酸片段是指大于等于1bp碱基并小于1kb碱基的非3整数倍的或大于等于1bp碱基并小于1kb碱基的3的整数倍且含终止密码子异源靶序列核苷酸片段。

优选地，所述一定长度的异源核苷酸片段是指大于等于1bp碱基且小于1kb碱基的3的整数倍的异源靶序列核苷酸片段。

优选地，所述异源靶序列核苷酸片段为核酸酶靶序列。

本发明所要解决的第二方面的技术问题在于提供一种载体，其含有前述的博来霉素抗性报告基因突变体。

优选地，所述载体为质粒。

本发明所要解决的第三方面的技术问题在于提供一种细胞，其含有前述的博来霉素抗性报告基因突变体或前述的载体。

优选地，所述细胞为大肠杆菌或哺乳动物细胞。

本发明所要解决的第四方面的技术问题在于提供所述博来霉素抗性报告基因突变体或前述载体用于核酸酶活性和脱靶效应的检测。

优选地，博来霉素抗性报告基因突变体插入大于等于1bp碱基并小于1kb碱基的非3整数倍的或大于等于1bp碱基并小于1kb碱基的3的整数倍且含终止密码子的异源靶序列核苷酸片段，导致其阅读框架改变，博来霉素抗性消失。

优选地，博来霉素抗性报告基因突变体插入大于等于1bp碱基且小于1kb碱基的3整数倍的异源靶序列核苷酸片段，不导致其阅读框架改变与阅读框架的提前终止，博来霉素抗性不消失。

本发明所要解决的第五方面的技术问题在于提供博来霉素抗性报告基因突变体或前述载体用于剪辑后的原核或真核细胞株系的阳性筛选。

本发明所要解决的第六方面的技术问题在于提供所述博来霉素抗性报告基因突变体的制备方法，其包括如下步骤：

(1)扩增或者合成得到起始密码子ATG后含有限制性内切酶位点的博来霉素抗性报告基因片段，

(2)将上述步骤得到的博来霉素抗性报告基因片段插入到具有至少另一种抗性报告基因的质粒中，

(3)将步骤（2）中得到的质粒酶切，在博来霉素基因的起始密码子ATG和其后的第一个氨基酸密码子GCC之间插入待检测的异源靶序列核苷酸片段。

优选地，所述步骤（1）中以具有博来霉素抗性报告基因的质粒为模版扩增。

优选地，所述步骤（3）中，所述异源靶序列核苷酸片段为合成的核酸酶靶序列，且核酸酶靶序列粘性末端为:5’NNNNNNNGCCAA3’；和3’NNTACNNNNNNN5’；可以根据不同的载体具体设计，且N为a、t、c、g四种碱基的任一种。

技术术语及名词：“核酸酶”是指运用基因工程手段重组的可以在特异的位点打断目标基因DNA的核酸酶，使用核酸酶可使基因操作变得更加简单、方便。

技术术语及名词：“靶序列”是指待检测的核酸酶识别和切割的目标序列。本发明中碱基N可以为a、t、c、g四种碱基的任一种。

本方法通过对博来霉素抗性报告基因进行插入突变，构建可用于检测核酸酶活性的双抗质粒，如博来霉素/卡那霉素双抗质粒，当然在本领域技术人员的管用手段，还可以采用其它的质粒。通过观察在不同抗性上的菌落的有无或细胞的生存与死亡进行核酸酶活性与脱靶效应的评估。该方法与现有检测技术luciferase活性检测法、细胞内源基因突变率检测法（非配对内切酶法-T7E1法或CelI法）、融合荧光法、深度高通量测序法等方法相比具有快速、准确、方法简单、成本低的优点；尤为突出的是，这一新方法的敏感性远远高于现有技术。

附图说明

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

图1为博来霉素抗性基因转入pEGFP-N3质粒中，置于GFP阅读框前，得到具有博来霉素抗性和卡那霉素抗性的报告质粒PZGA结构图。其中灰色部分为博来霉素抗性基因部分，黑色部分为卡那霉素抗性基因。

图2为带有BaeI位点的博来霉素抗性基因转入pEGFP-N3质粒中，置于GFP阅读框前，得到可用于核酸酶检测的质粒PZGB结构图。

图3为PZGB质粒中BaeI位点详图。

图4博来霉素抗性基因起始密码子ATG后面插入32个异源碱基得到仍具有博来霉素抗性和氨苄青霉素抗性报告质粒测序图。

图5博来霉素抗性基因起始密码子ATG后面插入33个异源碱基得到不具有博来霉素抗性，但仍具有氨苄青霉素抗性报告质粒测序图。

图6博来霉素抗性基因起始密码子ATG后面插入21个异源碱基并且含有终止密码子，得到不具有博来霉素抗性，但仍具有氨苄青霉素抗性报告质粒测序图。

具体实施方式

为了便于理解，以下将通过具体的实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的。

一.仪器、材料

PPICZαA质粒（购于invitrogen公司，编号：190520），pEGFP-N3质粒（购于BD biosciences公司，编号:PT3054-5），PMD-19质粒（购于TaKaRa公司，编号：D102A），引物合成及测序委托苏州金唯智公司完成。

PCR扩增仪（ABI公司，System9700），电泳仪（Bio-Rad生物公司），PCR扩增试剂盒，NheI、BamHI和DrdI相关限制性内切酶（购于thermoscientific公司），BaeI酶（购于New England Biolabs公司），DNA核酸片段回收试剂盒（购于天根生化）。T4DNA连接酶（购于thermoscientific公司）其余均为国产试剂及耗材。

二.建立方法

实施例1以PPICZαA和pEGFP-N3质粒构建博来霉素抗性报告基因突变体

（一）.制备可用于探索具体实验中博来霉素使用浓度的报告质粒PZGA。

为达到上述目的，本发明的技术方案是：在pEGFP-N3质粒GFP阅读框前插入博来霉素抗性基因编码序列，同时去除其终止密码子，以融合博来霉素抗性基因阅读框和GFP阅读框。具体包括如下步骤：

1.以PPICZαA质粒为模版，

引物1：CGATCCGCTAGCATGGCCAAGTTGACCAGTGCCGTTC(SeqNo.1)

引物2：TGGCTGGATCCGTCCTGCTCCTCGGCCACGAAG(Seq No.2)

用PCR扩增试剂盒(Thermoscientific公司)，利用上述引物，扩增得到博来霉素抗性基因目的片段对应序列Seq No.16，PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性20S，58℃退火20S，72℃延伸30S，共35个循环；最后72℃5min。使用DNA纯化回收试剂盒（天根生物公司）回收目的片段；

2.将步骤1中的PCR产物NheI和BamHI双酶切，回收目的片段I备用；将pEGFP-N3质粒（BD公司）用NheI和BamHI双酶切，回收目的片段II备用；

3.PCR产物酶切后片段I与pEGFP-N3酶切后片段II进行连接，得到报告质粒PZGA：

4.将上述连接产物转化DH5α大肠杆菌，并于同时含有博来霉素和卡那霉素的LB固体培养基上过夜培养，挑选单克隆，提取质粒，测序，筛选合适克隆。

用于大肠杆菌体系进行原核筛选时，LB固体培养基中博来霉素的浓度约为5×10^-2mg/ml；用于真核体系筛选时，将质粒转染入筛选细胞后，于不同博来霉素浓度的培养基中平行培养，以最短时间内杀死不带绿色荧光的细胞同时使带有绿色荧光的细胞存活为最佳博来霉素实验浓度。

（二）.制备以博来霉素抗性基因为报告基因的核酸酶检测PZGB质粒

技术方案为在博来霉素抗性报告基因起始密码子和其后的第一密码子CGG之间插入BaeI酶切位点，并在其中融合HindIII和EcoRI酶切位点，使构建的检测质粒可经BaeI酶切后直接插入核酸酶靶序列而不带入多余序列。具体步骤如下

1.以PPICZαA质粒为模版，设计引物：

引物3：

CGATCCGCTAGCATGAAGCTTGTCAACTTCGGTATCTGAATTCGCC

AAGTTGACCAGTGCCGTTC(Seq No.3)

引物2：TGGCTGGATCCGTCCTGCTCCTCGGCCACGAAG(Seq No.2)

引物3(Seq No.3)为博来霉素起始密码子ATG后加入BaeI的突变引物。可将BaeI位点插入起始密码子ATG和其后第一个氨基酸密码子GCC之间。

2.使用Thermoscientific Pfu扩增试剂盒，利用上述引物，以PPICZαA质粒为模版，扩增得到目的片段，PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性20S，58℃退火20S，72℃延伸30S，共35个循环；最后72℃5min。使用天根DNA纯化回收试剂盒回收目的片段；

3.PCR产物和pEGFP-N3质粒用NheI和BamHI分别进行双酶切，回收PCR酶切片段和质粒酶切大片段（载体片段）；

4.PCR产物酶切后片段与pEGFP-N3酶切后载体片段构建连接体系，连接；室温（20-25℃）20μl反应体系中加入1μl T4DNA连接酶，反应60分钟，得到报告质粒PZGB；

5.转化DH5α大肠杆菌，将5μl的连接产物质粒加入含有100μl的感受态的1.5mlPCR管中，冰浴20min，42℃热击42s，再冰浴10min，加入600μl无抗生素的LB液体培养基，37℃、270rpm振摇培养40min，铺于同时含有博来霉素和卡那霉素的LB固体培养基上过夜培养，挑选单克隆，提取质粒，测序，筛选合适克隆。

（三）在双抗质粒PZGB中插入待检测核酸酶靶序列,即在质粒PZGB博来霉素抗性基因的起始密码子ATG与其后的密码子GCC之间插入一定长度的异源靶序列核苷酸片段。具体步骤如下

1.提取PZGB质粒，使用BaeI酶切，使用天根DNA纯化回收试剂盒回收大片段，作为载体。

2.合成核酸酶靶序列片段，要求其粘性末端为:

5’NNNNNNNGCCAA3’

3’CGTACNNNNNNN5’

3.核酸酶靶序列和载体构建连接体系，进行连接反应。

4.连接产物转化DH5α大肠杆菌，挑选单克隆，鉴定正确后即可与相应的核酸酶重组质粒进行相关实验。

实施例2以PMD-19和pPICαA质粒构建博来霉素抗性报告基因突变体

（一）构建博来霉素，氨苄青霉素双抗质粒PZAA

1.扩设计并合成特异性引物进行重叠延伸PCR得到博来霉素抗性基因1.1以PMD-19质粒为模版，

引物4：5’-CCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTG-3’；(Seq No.4)

引物5：5’-GTCAACTTGGCCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCG-3’(Seq No.5)

进行PCR扩增，得到目的产品片段1；其中，每25μL PCR反应体系包括：2.5μL的10×Pfu Buffer with MgSO4,0.3μL的Pfu Polymerase（2.5U/μL）,0.5μL的dNTP Mix（10mM each），两条特异性引物分别为5μM，5μM，模板40ng，其余为水。PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性20S，58℃退火20S，72℃延伸30S，共35个循环；最后72℃5min。1.2以pPICαA质粒为模版，

引物6：5’-CGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGGCCAAGTTGAC-3’；(Seq No.6)

引物7:

5’-NNNNGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAATCAGTCCTGCTC-3’(Seq No.7)进行PCR扩增，得到目的产品片段2；

其中，每25μL PCR反应体系包括：2.5μL的10×Pfu Buffer withMgSO4,0.3μL的Pfu Polymerase（2.5U/μL）,0.5μL的dNTP Mix（10mMeach），两条特异性引物分别为5μM，5μM，模板40ng，其余为水。PCR

反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性20S，58℃退火20S，72℃延伸30S，共35个循环；最后72℃5min。

1.3将步骤1.1和步骤1.2中得到的两组产物产品片段1和2等量混合再分装至25μL/管，再进行一轮PCR；

1.4以步骤1.3得到的产物作为模版，以引物4、引物7进行PCR扩增，得到含有全长博来霉素基因序列的可用于插入PMD-19质粒的核酸片段。

2.制备插入片段和载体片段

2.1电泳分离纯化目的片段，用DrdI酶切PMD-19和步骤1得到的PCR产物，使用天根DNA纯化回收试剂盒分别回收目的片段

20μl酶切反应体系为2μL的10X FastDigest Green Buffer，限制性内切酶DrdI1μL，PCR产物或PMD-191μg，其余为水。反应条件为37℃30min，65℃5min；使用天根DNA纯化回收试剂盒回收PCR产物酶切片段和PMD-19质粒酶切大片段产物，

2.2将酶切纯化产物混合构建连接体系，进行连接反应。其连接体系为：1uL的10×T4DNA Ligase Buffer，0.5μL的T4DNA Ligase，1μL的PMD-19，0.1pmol～0.3pmol的目标产物，加水至总体积10μL，22℃反应60分钟，得到博来霉素/氨苄青霉素双抗质粒PZAA。

3.转化及筛选

将上述得到的双抗质粒PZAA转化DH5α大肠杆菌，在含有氨苄抗生素和含有博来霉素抗生素的琼脂培养基上平行培养，观察是否形成单菌落，挑选同时抗博来霉素和氨苄青霉素的菌落送测序，并筛选合适菌落。

（二）.双抗质粒PZAB中，博来霉素抗性基因起始密码子ATG后插入3n或非3n碱基

的核酸酶靶序列

1.构建带有BaeI酶切位点的博来霉素报告基因

1.1以PMD-19质粒为模版，

引物4：5’-CCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTG-3’；(Seq No.4)引物8:

5’-CTGGTCAACTTGGCGAATTCAGATACCGAAGTTGACAAGCTTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCG-3’’(Seq No.8)进行PCR扩增，得到目的产品片段1；其中，每25μL PCR反应体系包括：2.5μL的10X Pfu Buffer with MgSO4,0.3μL的PfuPolymerase（2.5U/μL）,0.5μL的dNTP Mix（10mM each），两条特异性引物分别为5μM，5μM，模板40ng，其余为水。PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性20S，58℃退火20S，72℃延伸30S，共35个循环；最后72℃5min。

1.2以pPICαA质粒为模版，

引物9：

5’-：CGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGAAGCTTGTCAACTTCGGTATCTGAATTCGCCAAGTTGACCAG-3’；(Seq No.9)

引物7:

5’-NNNNGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAATCAGTCCTGCTC-3’(Seq No.7)进行PCR扩增，得到目的产品片段2；

其中，每25μL PCR反应体系包括：2.5μL的10X Pfu Buffer withMgSO4,0.3μL的Pfu Polymerase（2.5U/μL）,0.5μL的dNTP Mix（10mMeach），两条特异性引物分别为5μM，5μM，模板40ng，其余为水。PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性20S，58℃退火20S，72℃延伸30S，共35个循环；最后72℃5min。

1.3将步骤1.1和步骤1.2中得到的两组产物产品片段1和2等量混合再分装至25μL/管，再进行一轮PCR；

1.4以步骤1.3得到的产物作为模版，以引物1、引物2进行PCR扩增，得到含有BaeI位点的全长博来霉素基因序列的可用于插入PMD-19质粒的核酸片段。

2电泳分离纯化目的片段，用DrdI酶切PMD-19和步骤1得到的PCR产物，使用天根DNA纯化回收试剂盒分别回收目的片段：

2.120μl酶切反应体系为2μL的10X FastDigest Green Buffer，限制性内切酶DrdI1μL，PCR产物或PMD-191μg，其余为水。反应条件为37℃30min，65℃5min；使用天根DNA纯化回收试剂盒回收PCR产物酶切片段和PMD-19质粒酶切大片段产物，

2.2将两个酶切产物混合构建连接体系，进行连接反应。其连接体系为：1uL的10×T4DNA Ligase Buffer，0.5μL的T4DNA Ligase，1μL的PMD-19，0.1pmol～0.3pmol的目标产物，加水至总体积10μL，22℃反应60分钟，得到博来霉素/氨苄青霉素双抗质粒PZAB。

3转化及筛选

将上述得到的双抗质粒PZAB转化DH5α大肠杆菌，在含有氨苄抗生素和含有博来霉素抗生素的琼脂培养基上平行培养，观察是否形成单菌落，挑选抗氨苄青霉素且不抗博来霉素的菌落送测序，并筛选合适克隆。

（三）在双抗质粒PZAB中插入待检测核酸酶靶序列,即在质粒PZAB博来霉素抗性基因的起始密码子ATG与其后的密码子GCC之间插入一定长度的异源靶序列核苷酸片段。具体步骤如下

1.提取PZAB质粒，使用BaeI酶切，使用天根DNA纯化回收试剂盒回收大片段，作为载体。

2.合成核酸酶靶序列片段，要求其粘性末端为:

5’NNNNNNNGCCAA3’

3’GATACNNNNNNN5’

3.核酸酶靶序列和载体构建连接体系，进行连接反应。

4.连接产物转化DH5α大肠杆菌，挑选单克隆，鉴定正确后即可与相应的核酸酶重组质粒进行相关实验。

实施例3在PZAB中分别插入32bp，33bp，以及21bp但含有终止密码子的异源核酸序列，验证博来霉素报告基因的可行性和敏感性。

1.委托引物合成公司合成下列oligo：

32+：CTAGAGATATCGTCGACCTGCAGAAGCTTCCGCGGTT，(Seq No.10)

32-:CGGAAGCTTCTGCAGGTCGACGATATCTCTAGCATAG,，(Seq No.11)

33+:CCTAGAGATATCGTCGACCTGCAGAAGCTTCCGCGGTT，(Seq No.12)

33-:CGGAAGCTTCTGCAGGTCGACGATATCTCTAGGCATAG，(Seq No.13)

21+：AAGCTGGATATCGTATAGCTTCGGTT，(Seq No.14)

21-：AAGCTATACGATATCCAGCTTCATAG，(Seq No.15)

1.将各长度插入核酸片断oligo分别构建annealing体系。Annealing体系为：

oligonucleotide+100nmol/ml，oligonucleotide-100nmol/ml，10×退火缓冲液1×，DEPC-水适量。

10×退火缓冲液成分：10mM Tris-HCL（pH7.5），10mM EDTA，1M Nacl

2.将oligo溶液在95℃孵育5min后，以每分钟下降1℃的速度缓慢冷却至40℃，取出，于4℃保存。

3.将annealing产物稀释十倍后取1μl与BaeI切后的PZAB载体构建连接体系，进行连接反应。

4.将连接产物加入100μl DH5α感受态细胞中，转化，并分别同时铺于含有氨苄青霉素和含有博来霉素的LB固体培养基上，过夜培养，观察细菌生长情况，并挑选目的菌落验证。

（三）结果

1.构建的PZAA质粒带有完整的无碱基突变的博来霉素编码序列，得到的PZAA质粒同时抗博来霉素和氨苄青霉素

2.博来霉素基因起始密码子ATG后面插入33个碱基的异源序列得到仍具有博来霉素抗性报告质粒

3.博来霉素基因起始密码子ATG后面插入32个碱基的异源序列造成博来霉素阅读框移码，得到不具有博来霉素抗性报告质粒

4.博来霉素基因起始密码子ATG后面插入21个碱基并且含有终止密码子的异源

序列造成博来霉素阅读框提前终止，得到不具有博来霉素抗性报告质粒

三结果分析

1.若插入采用的核酸酶靶序列为3的整数倍碱基数，且不含终止密码子，其阅读框架不改变，则在核酸酶操作前相应的细胞株具有博来霉素和卡那霉素（或其他抗生素）双抗性，若核酸酶产生切割作用则细胞株失去博来霉素抗性只保留卡那霉素抗性。

2.若插入采用的核酸酶靶序列为3的非整数倍碱基数，其阅读框架改变抗性消失，则在核酸酶操作前相应的细胞株只有卡那霉素（或其他抗生素）抗性，若核酸酶产生切割作用则细胞株获得博来霉素抗性，表现为在含有博来霉素的培养基中存活。

3.若博来霉素起始密码子ATG后面插入含有终止密码子的异源靶序列核苷酸片段，其阅读框架的提前终止，博来霉素抗性消失，则在核酸酶操作前相应的细胞株只有卡那霉素（或其他抗生素）抗性，若核酸酶产生切割作用则细胞株获得博来霉素抗性，表现为在含有博来霉素的培养基中存活。

上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.博来霉素抗性报告基因突变体，其中，在博来霉素基因的起始密码子ATG和其后的第一个氨基酸密码子GCC之间插入一定长度的异源靶序列核苷酸片段。

2.根据权利要求1所述的博来霉素抗性报告基因突变体，其中，所述一定长度的异源核苷酸片段是指大于等于1bp碱基并小于1kb碱基的非3整数倍的或大于等于1bp碱基并小于1kb碱基的3的整数倍且含终止密码子异源靶序列核苷酸片段；

或者，所述一定长度的异源核苷酸片段是指大于等于1bp碱基且小于1kb碱基的3的整数倍的异源靶序列核苷酸片段。

3.权利要求1所述的博来霉素抗性报告基因突变体，其中，所述异源靶序列核苷酸片段为核酸酶靶序列。

4.一种载体，其含有权利要求1-3任一项的博来霉素抗性报告基因突变体，

所述载体为质粒。

5.一种细胞，其含有权利要求1-3任一项的博来霉素抗性报告基因突变体或权利要求4所述的载体，其中，所述细胞为大肠杆菌或哺乳动物细胞。

6.权利要求1-3任一项所述博来霉素抗性报告基因突变体或权利要求4所述载体用于核酸酶活性和脱靶效应的检测。

7.根据权利要求6所述的用途，其中，博来霉素抗性报告基因突变体插入大于等于1bp碱基并小于1kb碱基的非3整数倍的或大于等于1bp碱基并小于1kb碱基的3的整数倍且含终止密码子的异源靶序列核苷酸片段，导致其阅读框架改变，博来霉素抗性消失；

或者，博来霉素抗性报告基因突变体插入大于等于1bp碱基且小于1kb碱基的3整数倍的异源靶序列核苷酸片段，不导致其阅读框架改变与阅读框架的提前终止，博来霉素抗性不消失。

8.权利要求1-3任一项所述博来霉素抗性报告基因突变体或权利要求4所述载体用于剪辑后的原核或真核细胞株系的阳性筛选。

9.制备权利要求1-3任一项所述博来霉素抗性报告基因突变体的方法，其包

括如下步骤：

(1)扩增或者合成得到起始密码子ATG后含有限制性内切酶位点的博来霉素抗性报告基因片段，

(2)将上述步骤得到的博来霉素抗性报告基因片段插入到具有至少另一种抗性报告基因的质粒中，

(3)将步骤（2）中得到的质粒酶切，在博来霉素基因的起始密码子ATG和其后的第一个氨基酸密码子GCC之间插入待检测的异源靶序列核苷酸片段。

10.根据权利要求9所述的制备方法，其中，所述步骤（1）中以具有博来霉素抗性报告基因的质粒为模版扩增；

所述步骤（3）中，所述异源靶序列核苷酸片段为合成的核酸酶靶序列，且核酸酶靶序列粘性末端为:5’NNNNNNNGCCAA3’；和3’NNTACNNNNNNN5’。