CN106868031A - 一种基于分级组装的多个sgRNA串联并行表达的克隆方法及应用 - Google Patents

一种基于分级组装的多个sgRNA串联并行表达的克隆方法及应用 Download PDF

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Abstract

CRISPR/Cas9系统具有强大的并行能力，针对在某些情况下需要同时表达多个sgRNA的需求，本发明提供了一种并行表达多个sgRNA的快速组装方法。本发明利用分级Golden Gate反应，开发了不依赖载体的基于聚合酶链式反应的多轮扩增方法，可以在一周内实现多达20个sgRNA的快速连接组装。本发明新开发的多重sgRNA串联组装的方法具有省时省力，灵活，高效，多功能等优点，可以将2‑20个数量不等的sgRNA迅速组装到一个载体上。利用并行表达的多个sgRNA靶向某一段DNA，可以实现活细胞内非重复序列染色质位点的标记和追踪，单个基因协同激活或抑制，多个基因的同时编辑，多个基因的同时上调和下调等功能，可以在基因编辑以及理解染色质的组织结构和动态变化中有广泛的应用。

Description

一种基于分级组装的多个sgRNA串联并行表达的克隆方法及 应用
The Hierarchical Assembly Method of Multiplexed sgRNA Expression andIts Applications
技术领域
本发明涉及一种分级组装的多个sgRNA串联并行表达的克隆方法及其在基因组编辑，基因表达调控和染色体标记方面的应用。属于基因工程领域。
背景技术
哺乳细胞的细胞核是一个高度复杂的自组装结构，染色质是其主要成分。染色质由DNA、RNA以及与其作用的蛋白组成，共同调控转录，DNA复制、修复和RNA剪接等细胞基础生命活动。研究细胞中某些特定的过程由哪些基因控制，即表型与基因型之间的关系，需要能够特异性的干扰某些基因的表达。这包括基因的永久性失活，基因表达的瞬时上调或者下调。同时很多研究表明染色体及基因的位置信息对基因表达调控有着重要意义，要研究清楚基因在细胞核内的空间位置与其功能的关系，需对细胞内特异的基因位点进行标记以获得空间信息。同时还要获得基因表达过程中的基因位置的动态信息，所以发展活细胞染色质DNA的荧光标记技术和方法对解决染色体结构和功能的关系非常重要。
近几年发展的基于可编程的人工核酸酶可以满足上述三种功能的需要。主要包括，ZFN(zinc finger nuclease，锌指核酸酶)，TALE(transcriptional activator likeeffector，转录因子样效应物)，CRISPR(cluster regularly interspace shortpalindromic repeat，成簇规则间隔的短回文重复)。ZFN和TALE依靠蛋白功能域实现特异性靶向，每个ZFN的功能域对应三个连续的核苷酸，而每个TALE的功能域对应一个核苷酸。要实现在哺乳动物细胞基因组的精确靶向，需要20个连续的核苷酸，因此需要将数十个蛋白功能域组合到一起。串联重复序列的组装是一个比较复杂繁琐的过程。每当改变一个靶向序列需要重新设计一个新的蛋白，因此，ZFN和TALE通量低，无法实现大规模并行操作。而CRISPR系统的靶向特异性是由RNA的序列决定，依靠sgRNA(single guide RNA)和DNA的碱基互补配对实现正确靶向。每当转换一个靶向位点，只需要设计一条新的sgRNA即可。因此CRISPR系统的通量可以非常高，甚至可以达到覆盖整个基因组的水平。
使用CRISPR做基因敲除非常快捷有效，天然的Cas9蛋白具有RuvC和HNH两个内切酶功能域，当提供正确的sgRNA靶向时，可以造成目标序列的双链DNA断裂，依赖于细胞的同源重组和非同源末端连接的修复机制，切断的DNA可以进行再连接。依靠非同源末端连接修复途径容易造成数个碱基的插入和缺失，因此可以造成编码基因的读码框发生改变。当提供两条sgRNA时，可以实现将这两个sgRNA靶向位点之间的序列删除，可以用于敲除非编码序列。当给细胞提供与断点两端同源的模板时，依靠细胞同源重组的修复途径，可以使目标序列发生替换，实现一段DNA序列的靶向插入。
利用CRISPR可以实现在不改变细胞的基因组的条件下干扰细胞内基因的表达。常见的上调基因表达的CRISPR激活系统(CRISPRa)和下调基因表达的CRISPR抑制系统(CRISPRi)。对野生型的Cas9做点突变，将之改造成只能结合DNA而不切割靶向序列的DNA结合蛋白dCas9。在dCas9上融合不同的蛋白，就可以实现不同的功能。如连接转录激活蛋白VP16，VP64，HSF1等就可实现对靶基因的定向激活。当连接转录抑制蛋白KRAB等就能实现对把序列的定向抑制。当连接组蛋白或者DNA修饰蛋白时，就可以定点改变基因组的表观遗传学状态。
利用CRISPR也可以实现在不改变细胞的基因组的条件下对活细胞的染色质位点进行标记和追踪。将dCas9融合荧光蛋白，利用sgRNA的靶向性，就可以实现在特定染色体位点富集荧光蛋白实现标记功能。利用一条靶向重复序列的sgRNA可以实现重复序列的标记，利用多条靶向不同非重复序列的sgRNA可以实现非重复序列的标记。
虽然CRISPR系统的扩展性好，可以针对不同的序列设计不同的sgRNA实现基因组编辑，基因表达调控，染色质标记功能，但是在同一个细胞中并行完成多个序列的同时靶向功能仍然具有挑战性。例如，为了大量获得某种代谢产物，需要将某个代谢通路中分支途径的多个酶在同一个细胞中基因同时敲除，利用常规的基因敲除办法很难一次完成，而顺序敲除费时费力。现存的CRISPR系统难以并行的主要原因是多条sgRNA导入同一细胞难以实现。通过质粒的瞬时转染办法，很难将多个质粒均匀导入细胞。传统方法同时导入多个DNA片段进入细胞有显微注射和病毒感染。显微注射需要特殊的仪器，且操作通量低，对于需要大量细胞的实验无法使用。通过病毒感染对操作者的技术要求较高，同时具有一定的危险性，且病毒感染也具有一定程度的随机性和异质性，无法完全保证所有的DNA会进入同一个细胞。
有鉴于此，目前需要开发新的可以实现并行基因组编辑、基因表达调控和活细胞兼容基因位点标记方法。本发明克服了显微注射通量低和病毒感染难操作等缺点，发展多个串联sgRNA并行表达的快速克隆技术。利用多轮Golden Gate反应，以实现多个sgRNA的串联表达。利用新开发的多级组装办法，可以将几个至几十个sgRNA迅速串联，sgRNA的数量可以视需要而定。而且新的方法操作更加省时省力，只要一周以内的时间即可完成组装。综上所述，本发明所提供的多个sgRNA串联表达的方法可以用于多基因的同时敲除敲入，基因表达并行调控，包括上调，下调，同时上调和下调，以及重复位点和非重复位点的活细胞基因标记与追踪。具有非常广阔的应用前景(图1)。
发明内容
本发明的技术目的是发展将多个sgRNA串联进同一个质粒的快速克隆方法，可以实现将多个sgRNA的表达框同时转染入细胞的目的，用以解决多个sgRNA表达质粒共同转染时存在的难以将所有的质粒转入同一细胞的问题。在具体实施过程中，可以根据需要灵活调整所需的sgRNA的数量。同时在这个多sgRNA串联表达的载体上表达一个荧光蛋白，就可以将转染成功的细胞与未转染成功的细胞分开，经过流式筛选，最终可以得到完全转入所有sgRNA的细胞，可以用于下游的基因编辑，基因表达调控和基因标记等实验。
本发明公开一种多sgRNA并行表达的快速克隆方法，其特征在于，利用GoldenGate克隆反应，将多达几十个不同的sgRNA同时串联到同一个表达载体上，从而实现并行表达。
根据优选的技术方案，所述sgRNA串联表达克隆方法可以使用不依赖载体的基于聚合酶链式反应的多轮扩增，或依赖于载体的多步克隆连接。不依赖载体的基于聚合酶链式反应的多轮扩增方法操作简单，节约时间。依赖于载体的多步克隆连接方法可以得到不同程度的中间产物质粒，有利于效果对比。
本发明公开一种多sgRNA并行表达的方法在基因编辑领域的应用。利用Cas9和多个sgRNA在多个靶位置造成双链断裂，从而实现同时在同一细胞中对多个位点进行基因编辑，可做基因敲除和敲入。
本发明公开一种多sgRNA并行表达的方法在基因表达调控领域的应用。利用多个sgRNA将连接蛋白功能域的dCas9导向多个靶位置，从而实现同时在同一细胞中对多个基因进行表达上调和下调。
本发明公开一种多sgRNA并行表达的方法在活细胞染色质标记领域的应用。利用多个sgRNA将连接荧光蛋白的dCas9导向同一个靶位置，可以对非重复的染色质序列进行标记。当使用每一个sgRNA靶向不同的重复序列的染色质位置，可以同时对多个染色质位点进行标记。对重复和非重复序列的标记可以用来观察基因位点在细胞核内的位置，长时间动态追踪基因位点的运动过程，在观测基因表达调控，转录，DNA修复，X染色体失活等重要的细胞生物学过程中有重要的应用。
本发明所公开的一种基于分级组装的多个sgRNA串联并行表达的不依赖于载体的克隆方法，包括以下步骤：
(1)先通过PCR从表达单个sgRNA的载体(基础sgRNA载体psgRNA2.0或者改造sgRNA)扩增出表达小RNA的启动子(mU6，hU6，H1，7SK等)和sgRNA基础骨架或改造骨架。扩增启动子的引物的3’端和扩增sgRNA的引物的5’端各带Type IIs限制性酶切位点(BsmBI)。通过DNA琼脂糖凝胶电泳和胶纯化试剂盒回收得到纯净的DNA片段。
(2)将合成的靶向配对引物两条链退火。正链5’端所带有的4碱基突出与启动子酶切后的粘性末端互补，负链5’端所带有的4碱基突出与sgRNA骨架片段酶切后的粘性末端互补。正负链各100μM在10μl反应体系中按照如下步骤进行反应：95℃2min，降温速率-5℃/min至16℃2min。
(3)通过第一步Golden Gate反应将启动子，靶向序列，sgRNA骨架连接起来。
(4)通过对上步所得反应混合液的直接进行PCR扩增，使用接头互补的，带有TypeIIs限制性酶切位点(BsaI)的引物，获得大量的带有接头的连接产物。通过DNA琼脂糖凝胶电泳和胶纯化试剂盒回收得到纯净的DNA片段。
(5)然后将上步所得产物等摩尔量分组混合，继续进行第二步Golden Gate反应进行连接。
(6)对反应混合液再次使用接头互补的，带有Type IIs限制性酶切位点(BpiI)的引物扩增。通过DNA琼脂糖凝胶电泳和胶纯化试剂盒回收得到纯净的DNA片段。
(7)最后将扩增好的多个片段混合，通过第三步Golden Gate反应连入最终的目的载体。目的载体带有红色荧光蛋白的表达框，用于指示多sgRNA并行表达载体的转染情况。
注：不依赖于载体的多个sgRNA串联并行表达的克隆方法中多个步骤所使用的Type IIs限制性内切酶可以是同一种酶，也可以是不同种酶。
(8)将上步反应液转化大肠杆菌感受态细胞Stb3。挑取克隆在30℃下过夜培养。提取质粒琼脂糖凝胶电泳，用原始的质粒作对比，选择正确插入的质粒。
注：此步骤必须使用重组酶缺失的Stb3感受态细胞，并在低温下培养，防止串联重复序列sgRNA的丢失。
附图说明
图1分级组装的多个sgRNA串联并行表达的克隆方法及应用示意图。
图2分级组装的多个sgRNA串联并行表达的克隆方法。(A)克隆过程示意图。第一步先将合成的靶向引物退火，与经过PCR扩增的U6启动子和sgRNA骨架经过第一轮的GoldenGate反应连接起来。第二步将上述反应的混合液使用U6上游引物和sgRNA的下游引物扩增，得到的纯化产物分组混合，进行第二轮Golden Gate反应。第三步对上一步的反应液进行PCR扩增，得到多个sgRNA串联的中间产物片段。第四步将上步所得的多个中间产物与接收载体混合，进行第三轮Golden Gate反应连接起来，转化，挑克隆验证。(B)第一轮的GoldenGate反应产物的琼脂糖凝胶电泳图。(C)第二轮的Golden Gate反应产物的琼脂糖凝胶电泳图。(D)第三轮的Golden Gate反应产物转化大肠杆菌抽取质粒后的琼脂糖凝胶电泳图。
图3多个sgRNA串联并行表达在基因编辑中的应用。(A)整合到哺乳动物细胞基因组中得绿色荧光蛋白sfGFP的切割示意图。剪刀代表sgRNA的切割位点。(B)不同的转染条件下绿色荧光蛋白被切割的细胞的比例。#1-9的图例见C。(C)不同的转染条件下绿色荧光蛋白的强度分布图。曲线上的编号代表不同的转染条件。
图4多个sgRNA串联并行表达在单个基因协同调控中的应用。在人细胞内源基因SOX2的启动子区域设计20个sgRNA，使用dCas9-KRAB抑制SOX2的表达。阴性对照组不做任何转染。阳性对照组只转染dCas9-KRAB。使用内源基因GAPDH做内参量化。
图5多个sgRNA串联并行表达在多个基因同时表达调控中的应用。从人的基因组中随机挑取20个基因，每个基因设计一条sgRNA。所有的基因的表达量都用内源基因GAPDH做内参量化。
图6多个sgRNA串联并行表达在多个基因同时激活和抑制中的应用。(A)10个基因激活，10个基因抑制示意图。利用基于改造的sgRNA可以在同一个细胞中实现对一部分基因的激活同时实现对另一部分的基因的抑制。(B)20个基因的信使RNA表达量。所有的基因的表达量都用内源基因GAPDH做内参量化。
图7基于分级组装的多个sgRNA串联并行表达在单个非重复染色质位点(MUC4基因)标记中的应用。(A)非重复染色质位点标记示意图。同一个位点使用20个sgRNA招募20个dCas9蛋白，每一个dCas9蛋白上连接多个荧光蛋白进行信号放大。(B)人类基因组MUC4位点结构示意图。针对第一个内含子的非重复区域设计20个sgRNA进行CRISPR标记，针对第三个外显子的重复区域设计一条荧光原位杂交的探针，利用双通道的荧光信号共定位情况判断标记效果。(C)CRISPR标记的信号和荧光原位杂交信号共定位情况。
具体实施方式
本发明公开一种多sgRNA并行表达的快速克隆方法，其特征在于，利用GoldenGate克隆反应，将多达几十个不同的sgRNA同时串联到同一个表达载体上，从而实现并行表达。所得的多sgRNA串联表达载体可用于基因组编辑，基因表达调控，活细胞染色质标记等实验。下面结合具体实施例进行说明。为了更清楚的阐述本发明的方法内容，现将本发明所涉及的产品和方法更进一步的总结如下，所涉及的实验数据、步骤或者合成方法等，属于本领域的常规技术，其并不对本专利的保护范围造成限制。这些具体的实施例只用于说明本发明，并不用于限制本发明的范围。
实施例一：一种基于分级组装的多个sgRNA串联并行表达的不依赖于载体的克隆方法，以连接20个sgRNA为例，由以下步骤制备(图2)：
(1)先通过PCR从表达单个sgRNA的载体(基础sgRNA载体psgRNA2.0或者改造sgRNA)扩增出表达小RNA的启动子(mU6，hU6，H1，7SK等)和sgRNA基础骨架。扩增启动子的引物的3’端和扩增sgRNA的引物的5’端各带Type IIs限制性酶切位点(BsmBI)。通过DNA琼脂糖凝胶电泳和胶纯化试剂盒回收得到纯净的DNA片段。
(2)将合成的靶向配对引物两条链退火。正链5’端所带有的4碱基突出与启动子酶切后的粘性末端互补，负链5’端所带有的4碱基突出与sgRNA骨架片段酶切后的粘性末端互补。正负链各100μM在10μl反应体系中按照如下步骤进行反应：95℃2min，降温速率-5℃/min至16℃2min。
(3)通过第一步Golden Gate反应将启动子，靶向序列，sgRNA骨架(修饰或未修饰)连接起来。
反应体系如下：
反应条件如下：
(4)通过对上步所得反应混合液的直接进行PCR扩增，使用接头互补的，带有TypeIIs限制性酶切位点(BsaI)的引物(引物序列见附表1)，获得大量的带有接头的连接产物。通过DNA琼脂糖凝胶电泳和胶纯化试剂盒回收得到纯净的DNA片段(图2B)。
(5)然后将上步所得产物分组混合，继续进行第二步Golden Gate反应进行连接，步骤类似第三步。反应体系如下：
(6)对反应混合液再次使用接头互补的，带有Type IIs限制性酶切位点(BpiI)的引物扩增(引物序列见附表1)。引物的使用情况见附表2。通过DNA琼脂糖凝胶电泳和胶纯化试剂盒回收得到纯净的DNA片段(图2C)。
(7)最后将扩增好的多个片段混合，通过第三步Golden Gate反应连入最终的目的载体。步骤类似第5步，不同之处在于使用BpiI限制酶。目的载体带有红色荧光蛋白的表达框，用于指示多sgRNA并行表达载体的转染情况。
注：不依赖于载体的多个sgRNA串联并行表达的克隆方法中多个步骤所使用的Type IIs限制性内切酶可以是同一种酶，也可以是不同种酶。
(8)将上步反应液转化大肠杆菌感受态细胞Stb3。挑取克隆在30℃下过夜培养。提取质粒琼脂糖凝胶电泳，用原始的质粒作对比，选择正确插入的质粒(图2D)。
注：此步骤必须使用重组酶缺失的Stb3感受态细胞，并在低温下培养，防止串联重复序列sgRNA的丢失。
实施例二：基于分级组装的多个sgRNA串联并行表达在基因编辑中的应用，以切割整合到哺乳动物细胞基因组中得绿色荧光蛋白sfGFP为例进行说明(图3)：
(1)利用sgRNA在线设计工具在sfGFP的基因编码框中寻找可靶向的sgRNA序列，挑选打分最高的5个sgRNA(序列见下文附表3)。
(2)按照常规sgRNA克隆方法获得单独的5个sgRNA.
(3)按照上述实施例二中所述方法将5个sgRNA克隆到同一个载体上。
(4)在稳定表达sfGFP的细胞的六孔板中使用转染试剂chemifect共转染1μg表达Cas9的质粒px330和1μg单独表达的sgRNA载体或1μg串联表达5个sgRNA的载体。作为对照，共转染1μg的px330和1μg的五个单独表达的sgRNA载体的混合物。
(5)转染48小时后，利用流式细胞仪分析细胞的绿色荧光。
(6)结果表明，使用5个sgRNA串联表达的实验组GFP阴性的细胞比例要低于5个sgRNA单独表达的实验组。同时5个sgRNA串联表达的实验组GFP阴性的细胞比例要低于五个单独表达的sgRNA载体的混合物的对照组。这表明切割一个基因，多条sgRNA同时工作效果要好于单条sgRNA。因为设计的原因，每一条sgRNA的效率是不同的，多条sgRNA协同作用能保证高效率的sgRNA出现的概率增大。同时单独一条sgRNA在靶位点的切割容易被细胞修复成为未切割的状态或者发生不移码的突变，导致敲除的失败。而多条sgRNA协同作用能大幅度降低细胞回复突变，造成靶基因的彻底切割。共转染多条sgRNA的细胞中GFP阴性的比例高于5个sgRNA串联表达组，低于5个sgRNA单独表达组。这是由于存在转染效率问题，有一部分细胞中进入多条sgRNA，但是并非所有细胞中都进入所转染的五条sgRNA。
(7)多个sgRNA串联并行表达系统除了可以切割外源的基因，同理亦可以用于内源基因的高效编辑，包括基因敲除与敲进。
(8)本例所用的5个sgRNA串联，在实际应用中可根据效果使用数量不等的sgRNA。
实施例三：基于分级组装的多个sgRNA串联并行表达在单个基因协同调控中的应用，以使用20个sgRNA下调哺乳动物细胞内源基因SOX2为例进行说明(图4)：
(1)利用sgRNA在线设计工具在SOX2的启动子区域中寻找可靶向的sgRNA序列，挑选打分最高的20个sgRNA(序列见下文附表4)。
(2)按照常规sgRNA克隆方法获得单独的20个sgRNA表达载体以作为对照使用。
(3)按照上述实施例一中所述方法将20个sgRNA克隆到同一个载体上。
(4)在MDA-MB-231细胞的六孔板中使用转染试剂chemifect共转染1μg表达dCas9-KRAB的质粒pHAGE-EF1α-dCas9-KRAB和1μg单独表达的sgRNA载体或1μg串联表达20个sgRNA的载体。作为对照，共转染1μg的20个单独表达的sg RNA载体的混合物。
(5)转染48小时后，利用荧光定量PCR检测各组SOX2的表达情况。
(6)结果表明，使用20个sgRNA串联表达的实验组SOX2基因mRNA的表达量要低于20个sgRNA单独表达的实验组。同时20个sgRNA串联表达的实验组SOX2基因mRNA的表达量要低于20个单独表达的sgRNA载体的混合物的对照组。这表明下调一个基因，多条sgRNA同时工作效果要好于单条sgRNA。
实施例四：基于分级组装的多个sgRNA串联并行表达在多个基因表达调控中的应用，以同时上调或下调哺乳动物细胞基因组20个内源的基因为例进行说明(图5)：
(1)所挑选的20个基因如下：SOX2，ASCL1，MYOD1，IL1RN，NTF3，VPS54，RAB1A，ST3GAL4，OCT4，NANOG，VEGFA，NEUROD1，TTN，HBG1，RHOXF2，LBR，SMCA4，LMNA，CBX5，RAD21。
(2)用sgRNA在线设计工具在每一个基因的启动子区域中寻找可靶向的sgRNA序列，挑选打分最高的一个sgRNA(序列见下文附表5)。
(3)按照上述实施例一中所述方法将20个sgRNA克隆到同一个载体上。
(4)在MDA-MB-231细胞的六孔板中使用转染试剂chemifect共转染各1μg表达dCas9-24XGCN4和ScFV-VP64的质粒(上调)或者1μg dCas9-KRAB的质粒(下调)和1μg表达20个串联sgRNA的载体。
(5)转染48小时后，利用荧光定量PCR检测每一个基因的表达情况。
(6)结果表明，使用20个sgRNA串联表达可以实现多个基因的同时激活或抑制。每一个基因的上调或下调水平不同，主要受限于每一个sgRNA的效率不同。
实施例五：基于分级组装的多个sgRNA串联并行表达在多个基因表达调控中的应用，以同时上调哺乳动物细胞基因组10个内源的基因，并下调10个内源的基因为例进行说明(图6)：
(1)仍然是使用实施例五中所挑选的20个基因，分组如下(图6A)：
激活组：SOX2，ASCL1，MYOD1，IL1RN，NTF3，VPS54，RAB1A，ST3GAL4，OCT4，NANOG，
抑制组：VEGFA，NEUROD1，TTN，HBG1，RHOXF2，LBR，SMCA4，LMNA，CBX5，RAD21。
(2)用sgRNA在线设计工具在每一个基因的启动子区域中寻找可靶向的sgRNA序列，挑选打分最高的一个sgRNA。
(3)按照上述实施例一中所述方法将20个sgRNA克隆到同一个载体上。与其他的实施例不同，此处使用有适配子插入的修饰sgRNA骨架。激活组使用PP7插入的sgRNA骨架，抑制组使用MS2插入的sgRNA骨架。
(4)在MDA-MB-231细胞的六孔板中使用转染试剂chemifect共转染各1μg表达dCas9，tdPCP-VPR，tdMCP-KRAB的质粒和1μg表达20个串联sgRNA的载体。
(5)转染48小时后，利用荧光定量PCR检测每一个基因的表达情况(图6B)。
(6)结果表明，使用20个sgRNA串联表达可以实现多个基因的同时激活和抑制。每一个基因的上调或下调水平不同，主要受限于每一个sgRNA的效率不同。激活组的基因表达水平全部上升，抑制组的表达水平全部下降，这表明激活和抑制之间相互独立，没有交叉影响。
实施例六：基于分级组装的多个sgRNA串联并行表达在单个非重复染色质位点标记中的应用，以人的细胞中MUC4基因的非重复部分为例进行说明(图7)：
(1)利用sgRNA在线设计工具在MUC4的的第一个内含子区域中寻找可靶向的sgRNA序列，挑选打分最高的20个sgRNA(序列见下文附表6)。
(2)按照上述实施例一中所述方法将20个sgRNA克隆到同一个载体上。
(3)在稳定表达SunTag系统的MDA-MB-231细胞系的六孔板中使用转染试剂chemifect转染1μg串联表达20个sgRNA的载体。
(4)转染24小时后，利用高倍荧光倒置显微镜检测基因位点的标记情况(图7C)。
(5)使用单颗粒追踪算法U-track对MUC4基因位点的运动行为进行分析。
附表1并行表达的sgRNA组装过程中的扩增引物。
附表2并行表达的sgRNA组装过程中的扩增引物的使用分配情况。
附表3切割基因组的GFP基因所用的sgRNA引物。
附表4靶向SOX2基因启动子区域的sgRNA引物。
附表5靶向20个不同基因启动子区域的sgRNA引物。
附表6靶向MUC4基因区域的sgRNA引物。

Claims (30)

1.一种基于分级组装的多个sgRNA串联并行表达的克隆方法，其特征在于，利用GoldenGate克隆反应，将多达几十个不同的sgRNA同时串联到同一个表达载体上，从而实现并行表达。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，可以使用不依赖载体的基于聚合酶链式反应(PCR)的多轮扩增。
3.根据权利要求1和2所述的方法，一种基于分级组装的多个sgRNA串联并行表达的不依赖于载体的克隆方法，其特征在于，由以下步骤制备：
先通过PCR扩增出表达小RNA的启动子和sgRNA基础骨架，将合成的靶向配对引物两条链退火，通过第一步Golden Gate反应将启动子，靶向序列，sgRNA骨架连接起来。再通过对反应混合液的直接PCR扩增，使用接头互补的，带有Type IIs限制性酶切位点的引物，获得大量的带有接头的连接产物。然后将上步所得产物分组混合，继续进行第二步GoldenGate反应进行连接，对反应混合液再次使用接头互补的，带有Type IIs限制性酶切位点的引物扩增，最后将扩增好的多个片段混合，通过第三步Golden Gate反应连入最终的目的载体。目的载体带有红色荧光蛋白的表达框，用于指示多sgRNA并行表达载体的转染情况。不依赖于载体的多个sgRNA串联并行表达的克隆方法中多个步骤所使用的Type IIs限制性内切酶可以是同一种酶，也可以是不同种酶。
4.根据权利要求1-3所述的方法，其特征在于，每一个sgRNA都有自己的表达框，含有独立的启动子和终止子，互相之间无相互干扰。
5.根据权利要求1-3所述的方法，其特征在于，所述sgRNA串联数量可根据需要调整。
6.根据权利要求1-3所述的方法，其特征在于，所述sgRNA的分级扩增可以为一轮，两轮，或者多轮，可根据所要串联的sgRNA需要进行调整。
7.根据权利要求1-3所述的方法，其特征在于，利用Type IIs的限制内切酶和连接酶将多个sgRNA连接进同一个载体。
8.根据前面任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述的多级sgRNA串联表达方法可以针对不同来源的CRISPR系统，包括但不局限于SP、NM、ST1、SA、CPF1、C2C2等。
9.根据前面任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述的多级sgRNA串联表达方法可以针对最原始的sgRNA，也可以针对插入功能拓展域的修饰的sgRNA，所插入的RNA适配子是MS2或者PP7或者Spinach或者COM或者λN等。
10.根据前面任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述的多级sgRNA串联表达方法可以利用不同的启动子，包括但不局限于U6、H1、7SK等驱动小RNA表达的启动子。
11.权利要求1所述的方法在基因组靶向编辑中的应用。
12.权利要求1所述的方法在基因定点表达调控中的应用。
13.权利要求1所述的方法在染色质位点标记中的应用。
14.如权利要求11所述的应用，其特征在于利用同一个质粒上同时表达的多条sgRNA,可以靶向不同的染色质区域，利用Cas9造成DNA双链断裂，利用细胞自身的非同源末端连接的修复机制进行易错修复，以达到对多个靶基因或其他非基因的功能性片段同时敲除的目的。
15.如权利要求11所述的应用，其特征在于利用同一个质粒上同时表达的多条sgRNA,可以靶向染色质同一区域，利用Cas9在同一个基因位点造成多处DNA双链断裂，防止细胞自身的非同源末端连接的修复机制造成断点原样再连接，以达到对同一个基因的高效率敲除的目的。
16.如权利要求11所述的应用，其特征在于利用同一个质粒上同时表达的多条sgRNA,可以靶向不同的染色质区域，利用Cas9造成DNA双链断裂，在共转染同源修复模板的协助下，利用细胞自身的同源重组的修复机制进行精准修复，以达到对多个靶基因或其他非基因的功能性片段同时任意修改的目的。
17.如权利要求12所述的应用，其特征在于利用同一个质粒上同时表达的多条sgRNA,可以靶向不同的染色质区域，利用dCas9融合转录激活蛋白，以达到对多个靶基因同时转录上调的目的。可用于同时上调多个不相关的基因，也可用于同时上调同一代谢通路中的多个基因。
18.如权利要求12所述的应用，其特征在于利用同一个质粒上同时表达的多条sgRNA,可以靶向不同的染色质区域，利用dCas9融合转录抑制蛋白，以达到对多个靶基因同时转录下调的目的。可用于同时下调多个不相关的基因，也可用于同时下调同一代谢通路中的多个基因。
19.如权利要求12所述的应用，其特征在于利用同一个质粒上同时表达的多条sgRNA,可以靶向不同的染色质区域，利用dCas9融合具有表观遗传学修饰作用的蛋白，以达到对多个靶基因同时表观遗传学修饰的目的。可用于同时修饰多个不相关的基因，也可用于同时修饰同一代谢通路中的多个基因。
20.如权利要求12所述的应用，其特征在于利用同一个质粒上同时表达的多条sgRNA,可以靶向相同的染色质区域，利用dCas9融合转录激活蛋白，定点招募多个激活蛋白到同一基因位点，以达到对一个靶基因高效率转录上调的目的。
21.如权利要求12所述的应用，其特征在于利用同一个质粒上同时表达的多条sgRNA,可以靶向相同的染色质区域，利用dCas9融合转录抑制蛋白，定点招募多个抑制蛋白到同一基因位点，以达到对一个靶基因高效率转录下调的目的。
22.如权利要求12所述的应用，其特征在于利用同一个质粒上同时表达的多条sgRNA,可以靶向相同的染色质区域，利用dCas9融合具有表观遗传学修饰作用的蛋白，定点招募多个酶分子到同一基因位点，以达到对一个靶基因高效率修饰的目的。
23.如权利要求12所述的应用，其特征在于利用同一个质粒上同时表达的多条带不同适配子修饰的sgRNA,可以靶向不同的染色质区域，利用不同适配子结合蛋白融合转录激活蛋白或转录抑制蛋白，以达到同时到对一部分靶基因转录上调和对另一部分靶基因转录下调的目的。
24.如权利要求13所述的应用，其特征在于利用同一个质粒上同时表达的多条sgRNA,全部靶向某一小段的染色质区域的非重复序列，每条之间间隔大于20碱基，利用dCas9上连接荧光蛋白，实现在一段DNA序列上富集荧光以标记该段DNA的目的。可以用于观测这段DNA的在细胞核中的位置以及细胞分裂过程中的动态变化。
25.如权利要求12和24所述的应用，其特征在于所标记的序列可以为基因的编码区，也可为非编码区，包括启动子、增强子等调控原件，长非编码RNA，小RNA，以及尚未注释功能的DNA区域。
26.如权利要求13所述的应用，其特征在于利用同一个质粒上同时表达的多条sgRNA,每一条可以靶向一段重复次数较多的串联重复的染色质区域，这些区域可以分布在不同的染色体，也可以分布在同一条染色体上，亦可集中分布于某条染色质的小区段，利用dCas9上连接荧光蛋白，实现在每一条sgRNA单独标记一个位点的目的。可以用于观测所标记的染色体的在细胞核中的位置以及细胞分裂过程中的动态变化。
27.如权利要求13所述的应用，其特征在于利用同一个质粒上同时表达的多条sgRNA,每条靶向一段短的串联重复序列，这些串联重复的在基因组上距离相隔较近，利用dCas9上连接荧光蛋白，实现在一段DNA序列上富集荧光以标记该段DNA的目的。可以用于观测这段DNA的在细胞核中的位置以及细胞分裂过程中的动态变化。
28.如权利要求13和24-27所述的应用，可直接在dCas9上连接荧光蛋白，也可以通过信号放大装置在dCas9上先做信号富集。
29.如权利要求14和24-28所述的应用，可使用原始的sgRNA,也可使用进过RNA适配子插入的改造sgRNA。
30.如权利要求14和24-29所述的应用，其特征在于，可以靶向哺乳动物细胞基因组的DNA，也可以是线粒体DNA，或者外援入侵的病毒基因组和质粒等。
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CN (1) CN106868031A (zh)

Cited By (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107164407A (zh) * 2017-07-04 2017-09-15 王小平 无物种限制的真核生物同时进行基因敲除和基因过表达
CN107384968A (zh) * 2017-08-23 2017-11-24 中国科学院上海生命科学研究院 染色体融合改造的酵母工程菌株
CN108048485A (zh) * 2017-12-22 2018-05-18 清华大学 运用CRISPRi基因敲低技术快速构建急性脑科学研究模型的方法
US9999671B2 (en) 2013-09-06 2018-06-19 President And Fellows Of Harvard College Delivery of negatively charged proteins using cationic lipids
CN108559738A (zh) * 2018-02-12 2018-09-21 南昌大学 一种植物rna修饰和编辑的系统及方法
US10113163B2 (en) 2016-08-03 2018-10-30 President And Fellows Of Harvard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof
US10167457B2 (en) 2015-10-23 2019-01-01 President And Fellows Of Harvard College Nucleobase editors and uses thereof
US10323236B2 (en) 2011-07-22 2019-06-18 President And Fellows Of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
CN110128546A (zh) * 2019-04-28 2019-08-16 河北科技大学 一种用于rna示踪的融合蛋白及其应用
WO2019196717A1 (zh) * 2018-04-13 2019-10-17 青岛清原化合物有限公司 一种随机突变的基因编辑系统及其应用
US10465176B2 (en) 2013-12-12 2019-11-05 President And Fellows Of Harvard College Cas variants for gene editing
CN110551796A (zh) * 2019-09-16 2019-12-10 重庆威斯腾生物医药科技有限责任公司 一种用于fish的快速标记基因组探针及其制备方法和应用
US10508298B2 (en) 2013-08-09 2019-12-17 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a CAS9 nuclease
CN110835635A (zh) * 2018-08-16 2020-02-25 深圳华大生命科学研究院 不同启动子启动多个串联sgRNA表达的质粒构建方法
US10597679B2 (en) 2013-09-06 2020-03-24 President And Fellows Of Harvard College Switchable Cas9 nucleases and uses thereof
US10704062B2 (en) 2014-07-30 2020-07-07 President And Fellows Of Harvard College CAS9 proteins including ligand-dependent inteins
CN111440799A (zh) * 2020-04-17 2020-07-24 皖南医学院第一附属医院（皖南医学院弋矶山医院） 一种CRISPR-Cpf1介导实现多个免疫卡控点基因编辑免疫细胞的试剂盒及其应用
US10745677B2 (en) 2016-12-23 2020-08-18 President And Fellows Of Harvard College Editing of CCR5 receptor gene to protect against HIV infection
US10858639B2 (en) 2013-09-06 2020-12-08 President And Fellows Of Harvard College CAS9 variants and uses thereof
US11046948B2 (en) 2013-08-22 2021-06-29 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
CN113980999A (zh) * 2021-01-21 2022-01-28 扬州大学 基于多位点同时敲除的CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用
US11268082B2 (en) 2017-03-23 2022-03-08 President And Fellows Of Harvard College Nucleobase editors comprising nucleic acid programmable DNA binding proteins
US11306324B2 (en) 2016-10-14 2022-04-19 President And Fellows Of Harvard College AAV delivery of nucleobase editors
US11319532B2 (en) 2017-08-30 2022-05-03 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising Gam
US11447770B1 (en) 2019-03-19 2022-09-20 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for prime editing nucleotide sequences
US11542496B2 (en) 2017-03-10 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Cytosine to guanine base editor
US11542509B2 (en) 2016-08-24 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
US11560566B2 (en) 2017-05-12 2023-01-24 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide RNAs for use with CRISPR-Cas9 in genome editing and transcriptional activation
US11661590B2 (en) 2016-08-09 2023-05-30 President And Fellows Of Harvard College Programmable CAS9-recombinase fusion proteins and uses thereof
US11732274B2 (en) 2017-07-28 2023-08-22 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for evolving base editors using phage-assisted continuous evolution (PACE)
US11795443B2 (en) 2017-10-16 2023-10-24 The Broad Institute, Inc. Uses of adenosine base editors
US11898179B2 (en) 2017-03-09 2024-02-13 President And Fellows Of Harvard College Suppression of pain by gene editing
US11912985B2 (en) 2020-05-08 2024-02-27 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for simultaneous editing of both strands of a target double-stranded nucleotide sequence
US12084663B2 (en) 2022-11-14 2024-09-10 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105255937A (zh) * 2015-08-14 2016-01-20 西北农林科技大学 一种真核细胞III型启动子表达CRISPR sgRNA的方法及其应用
CN105567718A (zh) * 2016-01-22 2016-05-11 东华大学 一种同时表达多个sgRNA的载体的构建方法
CN105624146A (zh) * 2015-05-28 2016-06-01 中国科学院微生物研究所 基于CRISPR/Cas9和酿酒酵母细胞内源的同源重组的分子克隆方法
WO2016094874A1 (en) * 2014-12-12 2016-06-16 The Broad Institute Inc. Escorted and functionalized guides for crispr-cas systems
CN106191099A (zh) * 2016-07-27 2016-12-07 苏州泓迅生物科技有限公司 一种基于CRISPR‑Cas9系统的酿酒酵母基因组并行多重编辑载体及其应用
WO2016205711A1 (en) * 2015-06-18 2016-12-22 The Broad Institute Inc. Novel crispr enzymes and systems

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016094874A1 (en) * 2014-12-12 2016-06-16 The Broad Institute Inc. Escorted and functionalized guides for crispr-cas systems
CN105624146A (zh) * 2015-05-28 2016-06-01 中国科学院微生物研究所 基于CRISPR/Cas9和酿酒酵母细胞内源的同源重组的分子克隆方法
WO2016205711A1 (en) * 2015-06-18 2016-12-22 The Broad Institute Inc. Novel crispr enzymes and systems
CN105255937A (zh) * 2015-08-14 2016-01-20 西北农林科技大学 一种真核细胞III型启动子表达CRISPR sgRNA的方法及其应用
CN105567718A (zh) * 2016-01-22 2016-05-11 东华大学 一种同时表达多个sgRNA的载体的构建方法
CN106191099A (zh) * 2016-07-27 2016-12-07 苏州泓迅生物科技有限公司 一种基于CRISPR‑Cas9系统的酿酒酵母基因组并行多重编辑载体及其应用

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AMI M. KABADI ET AL.: ""Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering from a single lentiviral vector"", 《NUCLEIC ACIDS RESEARCH》 *
JOHAN VAD-NIELSEN ET AL.: ""Golden Gate Assembly of CRISPR gRNA expression array for simultaneously targeting multiple genes"", 《CELL. MOL. LIFE SCI.》 *
RYAN E. COBB ET AL.: ""High-Efficiency Multiplex Genome Editing of Streptomyces Species Using an Engineered CRISPR/Cas System"", 《ACS SYNTH. BIOL.》 *
SHIPENG SHAO ET AL.: ""Multiplexed sgRNA Expression Allows Versatile Single Nonrepetitive DNA Labeling and Endogenous Gene Regulation"", 《ACS SYNTH. BIOL.》 *
TETSUSHI SAKUMA ET AL.: ""Multiplex genome engineering in human cells using all-in-one CRISPR/Cas9 vector system"", 《SCIENTIFIC REPORTS》 *
VAD-NIELSEN，J. ET AL.: ""基于Golden Gate法的CRISPR/Cas9多重gRNA表达阵列组装方案"", 《BIO-PROTOCOL》 *

Cited By (58)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US12006520B2 (en) 2011-07-22 2024-06-11 President And Fellows Of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
US10323236B2 (en) 2011-07-22 2019-06-18 President And Fellows Of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
US10508298B2 (en) 2013-08-09 2019-12-17 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a CAS9 nuclease
US11920181B2 (en) 2013-08-09 2024-03-05 President And Fellows Of Harvard College Nuclease profiling system
US10954548B2 (en) 2013-08-09 2021-03-23 President And Fellows Of Harvard College Nuclease profiling system
US11046948B2 (en) 2013-08-22 2021-06-29 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
US9999671B2 (en) 2013-09-06 2018-06-19 President And Fellows Of Harvard College Delivery of negatively charged proteins using cationic lipids
US11299755B2 (en) 2013-09-06 2022-04-12 President And Fellows Of Harvard College Switchable CAS9 nucleases and uses thereof
US10912833B2 (en) 2013-09-06 2021-02-09 President And Fellows Of Harvard College Delivery of negatively charged proteins using cationic lipids
US10858639B2 (en) 2013-09-06 2020-12-08 President And Fellows Of Harvard College CAS9 variants and uses thereof
US10682410B2 (en) 2013-09-06 2020-06-16 President And Fellows Of Harvard College Delivery system for functional nucleases
US10597679B2 (en) 2013-09-06 2020-03-24 President And Fellows Of Harvard College Switchable Cas9 nucleases and uses thereof
US11124782B2 (en) 2013-12-12 2021-09-21 President And Fellows Of Harvard College Cas variants for gene editing
US10465176B2 (en) 2013-12-12 2019-11-05 President And Fellows Of Harvard College Cas variants for gene editing
US11053481B2 (en) 2013-12-12 2021-07-06 President And Fellows Of Harvard College Fusions of Cas9 domains and nucleic acid-editing domains
US10704062B2 (en) 2014-07-30 2020-07-07 President And Fellows Of Harvard College CAS9 proteins including ligand-dependent inteins
US11578343B2 (en) 2014-07-30 2023-02-14 President And Fellows Of Harvard College CAS9 proteins including ligand-dependent inteins
US12043852B2 (en) 2015-10-23 2024-07-23 President And Fellows Of Harvard College Evolved Cas9 proteins for gene editing
US11214780B2 (en) 2015-10-23 2022-01-04 President And Fellows Of Harvard College Nucleobase editors and uses thereof
US10167457B2 (en) 2015-10-23 2019-01-01 President And Fellows Of Harvard College Nucleobase editors and uses thereof
US10113163B2 (en) 2016-08-03 2018-10-30 President And Fellows Of Harvard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof
US11702651B2 (en) 2016-08-03 2023-07-18 President And Fellows Of Harvard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof
US11999947B2 (en) 2016-08-03 2024-06-04 President And Fellows Of Harvard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof
US10947530B2 (en) 2016-08-03 2021-03-16 President And Fellows Of Harvard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof
US11661590B2 (en) 2016-08-09 2023-05-30 President And Fellows Of Harvard College Programmable CAS9-recombinase fusion proteins and uses thereof
US11542509B2 (en) 2016-08-24 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
US11306324B2 (en) 2016-10-14 2022-04-19 President And Fellows Of Harvard College AAV delivery of nucleobase editors
US11820969B2 (en) 2016-12-23 2023-11-21 President And Fellows Of Harvard College Editing of CCR2 receptor gene to protect against HIV infection
US10745677B2 (en) 2016-12-23 2020-08-18 President And Fellows Of Harvard College Editing of CCR5 receptor gene to protect against HIV infection
US11898179B2 (en) 2017-03-09 2024-02-13 President And Fellows Of Harvard College Suppression of pain by gene editing
US11542496B2 (en) 2017-03-10 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Cytosine to guanine base editor
US11268082B2 (en) 2017-03-23 2022-03-08 President And Fellows Of Harvard College Nucleobase editors comprising nucleic acid programmable DNA binding proteins
US11560566B2 (en) 2017-05-12 2023-01-24 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide RNAs for use with CRISPR-Cas9 in genome editing and transcriptional activation
CN107164407A (zh) * 2017-07-04 2017-09-15 王小平 无物种限制的真核生物同时进行基因敲除和基因过表达
US11732274B2 (en) 2017-07-28 2023-08-22 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for evolving base editors using phage-assisted continuous evolution (PACE)
CN107384968B (zh) * 2017-08-23 2021-06-08 中国科学院分子植物科学卓越创新中心 染色体融合改造的酵母工程菌株
CN107384968A (zh) * 2017-08-23 2017-11-24 中国科学院上海生命科学研究院 染色体融合改造的酵母工程菌株
US11319532B2 (en) 2017-08-30 2022-05-03 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising Gam
US11932884B2 (en) 2017-08-30 2024-03-19 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising Gam
US11795443B2 (en) 2017-10-16 2023-10-24 The Broad Institute, Inc. Uses of adenosine base editors
CN108048485A (zh) * 2017-12-22 2018-05-18 清华大学 运用CRISPRi基因敲低技术快速构建急性脑科学研究模型的方法
CN108559738A (zh) * 2018-02-12 2018-09-21 南昌大学 一种植物rna修饰和编辑的系统及方法
WO2019196717A1 (zh) * 2018-04-13 2019-10-17 青岛清原化合物有限公司 一种随机突变的基因编辑系统及其应用
CN110373430A (zh) * 2018-04-13 2019-10-25 青岛清原化合物有限公司 一种随机突变的基因编辑系统及其应用
CN110835635B (zh) * 2018-08-16 2024-01-09 深圳华大生命科学研究院 不同启动子启动多个串联sgRNA表达的质粒构建方法
CN110835635A (zh) * 2018-08-16 2020-02-25 深圳华大生命科学研究院 不同启动子启动多个串联sgRNA表达的质粒构建方法
US11795452B2 (en) 2019-03-19 2023-10-24 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for prime editing nucleotide sequences
US11643652B2 (en) 2019-03-19 2023-05-09 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for prime editing nucleotide sequences
US11447770B1 (en) 2019-03-19 2022-09-20 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for prime editing nucleotide sequences
CN110128546B (zh) * 2019-04-28 2022-05-17 河北科技大学 一种用于rna示踪的融合蛋白及其应用
CN110128546A (zh) * 2019-04-28 2019-08-16 河北科技大学 一种用于rna示踪的融合蛋白及其应用
CN110551796A (zh) * 2019-09-16 2019-12-10 重庆威斯腾生物医药科技有限责任公司 一种用于fish的快速标记基因组探针及其制备方法和应用
CN111440799B (zh) * 2020-04-17 2021-03-02 皖南医学院第一附属医院（皖南医学院弋矶山医院） 一种CRISPR-Cpf1介导实现多个免疫卡控点基因编辑免疫细胞的试剂盒及其应用
CN111440799A (zh) * 2020-04-17 2020-07-24 皖南医学院第一附属医院（皖南医学院弋矶山医院） 一种CRISPR-Cpf1介导实现多个免疫卡控点基因编辑免疫细胞的试剂盒及其应用
US11912985B2 (en) 2020-05-08 2024-02-27 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for simultaneous editing of both strands of a target double-stranded nucleotide sequence
US12031126B2 (en) 2020-05-08 2024-07-09 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for simultaneous editing of both strands of a target double-stranded nucleotide sequence
CN113980999A (zh) * 2021-01-21 2022-01-28 扬州大学 基于多位点同时敲除的CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用
US12084663B2 (en) 2022-11-14 2024-09-10 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing

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