CN103074334A - 检测cho细胞dna的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了检测CHO细胞基因组DNA的引物对、包含该引物对的试剂盒以及利用该引物对检测CHO细胞基因组DNA的方法，所述引物对特异性结合CHO细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示区段。利用所述引物对的PCR检测方法操作简便快捷、灵敏度高、能区分大肠杆菌或人类，甚至与仓鼠细胞高度同源的小鼠或大鼠的干扰性DNA。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测领域。具体地说，本发明涉及CHO细胞DNA的检测方法。
背景技术
在现代，生物重组制品已广泛应用于医药健康领域，发挥着越来越重要的作用。这些生物制品包括重组蛋白药物、基因重组疫苗、生物抗原抗体以及各种细胞因子等。重组生物制品的应用与人类健康事业息息相关，国际上对其的质量控制和安全性检测都具有极其严格的要求。
重组生物蛋白绝大多数由大规模的基因改造工程宿主细胞生产，细胞中复杂的非目标产物是终产物中主要的杂质来源，直接影响生物制品的安全性。其中残余的生物遗传物质DNA是一个非常重要的污染，因此，对它的检测是重要的质量控制环节。
在重组生物蛋白制品中，残余DNA多来源于培养的宿主细胞。这些宿主细胞多为外源哺乳动物细胞以及肿瘤来源细胞。理论上，存在于生物制品中的微量DNA杂质，都有可能传递与肿瘤或病毒相关的基因，并导致癌变或其它病理变化。当一定量的残留DNA与制品一同进入人体后，含有致癌基因的DNA片段就可能诱发肿瘤的产生；如果生物制品中含有某些可以整合病毒的DNA，则这种DNA通过表达后具备感染性，从而导致一系列的不良后果。
从1984年开始，国际官方机构陆续推出了针对生物制品残余DNA检测的各种限度标准，并且根据研究及应用的不断变化而逐步修改完善。1997年，WHO第46届生物制品标准化专家委员会(ECBS)会议上，与会专家通过对传代细胞系残余DNA风险的再评估，认为残余DNA虽然不是主要危险因素，但应视为细胞污染物，要求清除至最低水平。根据这一再评估，建议每人份传代细胞的纯化产品中可接受的DNA含量为10ng。任何生物制品的纯化工艺应经验证，证明其去除细胞DNA的能力，包括参入示踪剂研究。另外，产品批次间的均一性应通过临床效果观察，以及三批以上的检测结果予以证实。目前重组蛋白药物常用的哺乳动物细胞系，如CHO、BHK、SP2/0、C127等，均有逆转录病毒颗粒阳性的报道。因此，对其残余DNA含量就需要严格控制。
目前，针对不同的生物制品，其相对应的检测限也略有不同。一般而言，FDA规定医药生物制品中DNA污染的检测限为100pg/剂，WHO和EU略为宽松，检测限可达10ng/剂。低浓度的检测限对检测的手段及技术提出了更高的要求。
关于生物制品中宿主细胞残余DNA的限量检测，过去比较普遍的采用分子杂交的半定量方法。该方法基于传统的分子基因杂交技术，需要的检测条件相对简单，检测限在10pg左右基本能够满足一些疫苗和治疗性生物制品的检测需求。但由于该方法存在时间长、操作繁琐、稳定性、敏感性、特异性较差等缺点，已经不能满足日益严苛的检测要求，在一些发达国家已经淘汰。
Taqman探针检测属于实时定量PCR技术，是一种快速的高通量检测方法，它在PCR扩增过程中加入一个特异性的荧光探针，通过荧光信号的变化反映产物的增加情况，从而能够定量分析样本中的初始模板。近年来，由于taqman探针技术在特异性、灵敏性、准确性方面的独特优势，其在检测基因突变、基因定量等疾病相关检测领域得到广泛的承认及应用。然而，该方法仍然存在样本需要预处理、各实验室引物探针设计不同、没有统一标准物质等等问题，对以上问题仍需要进一步研究、解决。
在目前重组蛋白药物常用的哺乳动物细胞系中，CHO细胞，即，中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary)因具有无限增殖性，可以传代百代以上，而成为目前生物工程上广泛使用的细胞。当今批准正式应用于人类疾病治疗或预防的基因工程产品约有三十多种，其中只有一种(乙肝疫苗)是由酵母菌生产，其余所有产品均是由CHO细胞和大肠杆菌生产。与原核的大肠杆菌相比，CHO属于真核哺乳细胞，能形成有活性的二聚体和糖基化的功能，因此，CHO成为表达复杂生物大分子的理想宿主，其已广泛用于重组蛋白药物的制取，是一种重要的工程表达细胞株。
综上所述，本领域急需检测生物制品中残余CHO细胞DNA的方法，该方法应具备特异性、灵敏性、操作简便、标准统一等优点，从而能用于生物制品质量控制。
发明内容
本发明的目的是提供检测CHO细胞基因组DNA的引物对、包含该引物对的试剂盒以及利用该引物对检测CHO细胞基因组DNA的方法
在第一方面，本发明提供一种检测CHO细胞基因组DNA的引物对，所述引物对包括正向引物和反向引物，其中所述正向引物结合于CHO细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示区段的第64-92位；其中的反向引物结合于CHO细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示区段的第125-147位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为78-84bp。
在优选的实施方式中，所述正向引物结合于CHO细胞基因组DNA上SEQ IDNO:1所示区段的第67-92位，所述反向引物结合于CHO细胞基因组DNA上SEQID NO:1所示区段的第125-144位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为78bp。
在优选的实施方式中，所述正向引物和反向引物的长度为29-20bp；优选26和20bp。
在优选的实施方式中，所述正向引物和反向引物的Tm温度为58-60℃，并且正向引物的Tm与反向引物的Tm的差值的绝对值≤2℃。
在另一优选的实施方式中，所述正向引物如SEQ ID NO:3所示，所述反向引物如SEQ ID NO:4所示。
在第二方面，本发明提供一种检测体系，所述检测体系包含本发明第一方面所述的引物对。
在优选的实施方式中，所述检测体系还包含第二引物对，所述第二引物对包括正向引物和反向引物，其中所述正向引物结合于CHO细胞基因组DNA上SEQ IDNO:2所示区段的第1-22位；所述反向引物结合于CHO细胞基因组DNA上SEQ IDNO:2所示区段的第86-110位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为80-110bp。
在优选的实施方式中，所述正向引物结合于CHO细胞基因组DNA上SEQ IDNO:2所示区段的第1-19位，所述反向引物结合于CHO细胞基因组DNA上SEQ IDNO:2所示区段的第89-110位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为110bp。
在优选的实施方式中，所述正向引物和反向引物的长度为16-24bp。
在优选的实施方式中，所述正向引物和反向引物的Tm温度为58-60℃，并且正向引物的Tm与反向引物的Tm的差值的绝对值≤2℃。
在优选的实施方式中，所述第二引物对中所述正向引物如SEQ ID NO:5所示，所述反向引物如SEQ ID NO:6所示。
在另一优选的实施方式中，所述检测体系还包含探针。
在优选的实施方式中，所述探针是5-FAM-TTTCATCAGGCCAAAGGCACCTCTGT-TRAMA-3和/或5-FAM-TCCAGGGCTTGCAGTCTACTTAGAACAGCC-TAMRA-3。
在优选的实施方式中，所述检测体系的检测灵敏度为106-1fg/μl，优选地，所述检测体系的检测灵敏度为0.1fg/μl。
在第三方面，本发明提供一种CHO细胞基因组DNA的检测方法，所述方法包括：利用本发明第一方面所述的引物对或本发明第二方面所述的检测体系，对待测样品进行PCR，并检测PCR扩增产物。
在第四方面，本发明提供一种PCR试剂盒，所述试剂盒中包括容器以及位于所述容器中的本发明第一方面所述的引物对。
在优选的实施方式中，所述试剂盒中还包括第二引物对，所述第二引物对包括正向引物和反向引物，其中所述正向引物结合于CHO细胞基因组DNA上SEQID NO:2所示区段的第1-22位；所述反向引物结合于CHO细胞基因组DNA上SEQID NO:2所示区段的第86-110位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为80-110bp。
在优选的实施方式中，所述正向引物结合于CHO细胞基因组DNA上SEQ IDNO:2所示区段的第1-19位，所述反向引物结合于CHO细胞基因组DNA上SEQ IDNO:2所示区段的第89-110位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为110bp。
在优选的实施方式中，所述正向引物和反向引物的长度为16-24bp。
在优选的实施方式中，所述正向引物和反向引物的Tm温度为58-60℃，并且正向引物的Tm与反向引物的Tm的差值的绝对值≤2℃。
在优选的实施方式中，所述第二引物对中所述正向引物如SEQ ID NO:5所示，所述反向引物如SEQ ID NO:6所示。
在优选的实施方式中，所述试剂盒中还装有探针。
在优选的实施方式中，所述探针是5-FAM-TTTCATCAGGCCAAAGGCACCTCTGT-TRAMA-3和/或5-FAM-TCCAGGGCTTGCAGTCTACTTAGAACAGCC-TAMRA-3。
在优选的实施方式中，所述试剂盒中还装有标准品对照。
在进一步的优选实施方式中，所述标准品对照包含SEQ ID NO:1所示片段；优选地，所述标准品对照是SEQ ID NO:1所示片段。
在第五方面，本发明提供一种PCR方法，包括步骤：
在一PCR检测体系中，利用本发明第一方面所述的引物对扩增目标产物。
在优选的实施方式中，所述方法同时利用第二引物对实施多重PCR，所述第二引物对包括正向引物和反向引物，其中所述正向引物结合于CHO细胞基因组DNA上SEQ ID NO:2所示区段的第1-22位；所述反向引物结合于CHO细胞基因组DNA上SEQ ID NO:2所示区段的第86-110位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为80-110bp。
在优选的实施方式中，所述正向引物结合于CHO细胞基因组DNA上SEQ IDNO:2所示区段的第1-19位，所述反向引物结合于CHO细胞基因组DNA上SEQ IDNO:2所示区段的第89-110位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为110bp。
在优选的实施方式中，所述正向引物和反向引物的长度为16-24bp。
在优选的实施方式中，所述正向引物和反向引物的Tm温度为58-60℃，并且正向引物的Tm与反向引物的Tm的差值的绝对值≤2℃。
在优选的实施方式中，所述第二引物对中所述正向引物如SEQ ID NO:5所示，所述反向引物如SEQ ID NO:6所示。
在第六方面，本发明提供一种检测CHO细胞基因组DNA的引物对，所述引物对包括正向引物和反向引物，其中所述正向引物结合于CHO细胞基因组DNA上SEQ ID NO:2所示区段的第1-22位；所述反向引物结合于CHO细胞基因组DNA上SEQ ID NO:2所示区段的第86-110位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为80-110bp。
在优选的实施方式中，所述正向引物结合于CHO细胞基因组DNA上SEQ IDNO:2所示区段的第1-19位，所述反向引物结合于CHO细胞基因组DNA上SEQ IDNO:2所示区段的第89-110位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为110bp。
在优选的实施方式中，所述正向引物和反向引物的长度为16-24bp。
在优选的实施方式中，所述正向引物和反向引物的Tm温度为58-60℃，并且正向引物的Tm与反向引物的Tm的差值的绝对值≤2℃。
在另一优选的实施方式中，所述正向引物如SEQ ID NO:5所示，所述反向引物如SEQ ID NO:6所示。
在第七方面，本发明提供一种多核苷酸，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:1所示序列。
在优选的实施方式中，所述多核苷酸如SEQ ID NO:1所示。
在第八方面，本发明提供本发明第七方面所述的多核苷酸在制备检测CHO细胞基因组DNA的试剂中的应用。
在第九方面，本发明提供一种检测CHO细胞基因组DNA的引物对，所述引物对特异性结合于CHO细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示区段。
在优选的实施方式中，所述正向引物的序列如SEQ ID NO:3或5所示，反向引物的序列如SEQ ID NO:4或6所示。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了参考品的扩增曲线。从图1可以看出扩增曲线有明显的指数增长期，其中利用的引物对如SEQ ID NO:3和4所示。
图2显示了参考品的标准曲线。由图2可知，当参考品浓度为1000pg/μl、100pg/μl、10pg/μl、1pg/μl、100fg/μl、10fg/μl、1fg/μl及0.1fg/μl时，绘制得到的标准曲线斜率为-3.39，相关系数(R2)＝0.999，扩增效率为97.2%。标准曲线的线性良好，检测灵敏度可达到0.1fg/μl，其中利用的引物对如SEQ ID NO:3和4所示。
图3显示了利用人类污染DNA进行的体系干扰实验的结果。图中，紫色和绿色线为CHO；粉色和蓝色线为人类DNA，其中利用的引物对如SEQ ID NO:3和4所示。
图4显示了利用大肠杆菌污染DNA进行的体系干扰实验的结果。图中，蓝色和红色线为CHO，紫色和粉色线为大肠杆菌DNA，其中利用的引物对如SEQID NO:3和4所示。
图5显示了大鼠干扰实验的结果。图中：粉色为CHO标准曲线；蓝色为加入大鼠基因的干扰曲线，其中利用的引物对如SEQ ID NO:3和4所示。
图6显示了小鼠干扰实验的结果。图中：粉色为CHO标准曲线，绿色为小鼠基因干扰曲线，其中利用的引物对如SEQ ID NO:3和4所示。
图7显示了参考品的扩增曲线。从图7可以看出扩增曲线有明显的指数增长期，其中利用的引物对如SEQ ID NO:5和6所示。
图8显示了参考品的标准曲线。由图8可知，当参考品浓度为1000pg/μl、100pg/μl、10pg/μl、1pg/μl、0.1pg/μl和0.01pg/μl时，绘制得到的标准曲线斜率为-3.33，相关系数(R2)＝0.997，扩增效率为99.66%。标准曲线的线性良好，检测灵敏度可达到10fg/μl，其中利用的引物对如SEQ ID NO:5和6所示。
图9显示了利用人类污染DNA进行的体系干扰实验的结果。图中，黄色和绿色线为CHO；红色和紫色线人类，其中利用的引物对如SEQ ID NO:5和6所示。
图10显示了利用大肠杆菌污染DNA进行的体系干扰实验的结果。图中，紫色线为CHO，蓝色和粉红色线为大肠杆菌，其中利用的引物对如SEQ ID NO:5和6所示。
图11显示了大鼠干扰实验的结果。图中：粉色为CHO标准曲线；紫色为加入大鼠基因的干扰曲线，其中，利用的引物对如SEQ ID NO:5和6所示。
图12显示了小鼠干扰实验的结果。图中：紫色为CHO标准曲线，蓝色为小鼠基因干扰曲线，其中利用的引物对如SEQ ID NO:5和6所示。
图13显示了CHO细胞DNA经过不同时间超声后的凝胶电泳结果。图中泳道1为DNA分子量标准，由上至下依次为15kb、1kb，7.5kb，5kb，2.5kb，1kb和0.25kb。泳道2为0min超声样本，泳道3为1min超声样本；泳道4为5min超声样本；泳道5为10min超声样本；泳道6为30min超声样本。
图14显示了不同大小片段DNA的检测结果。图中三组曲线由左至右分别为100fg/μl，10fg/μl，1fg/μl浓度下不同大小片段DNA的检测结果。
图15显示了比较SEQ ID NO:7和8所示引物对与SEQ ID NO:5和6所示引物对的标准曲线的实验结果。
具体实施方式
发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现利用针对CHO细胞基因组DNA的SEQ ID NO:1(AGCTGATAAAATAGTAACTATCTACTGTTCAGGCACGAGTTCAAGGTTTTTAAGTTTATTTTGGTTGTCATCTAAGTACAAACTTAAAGGGCTTTTCATCAGGCCAAAGGCACCTCTGTCCAATCCATACCTGGCACTCTGGACAGAAGCTATACATGCTTATAGCCCAAATCTGCAGTTTTTGCTAGGACTCAAAGTTATAAATATGTTCTTGCTGTTTAAACAGATATCTGCTTTTTCTACACTGTGGGCTTCAGTA)所示区和/或SEQ ID NO:2(ACAGGTTTCTGCTTCTGGCAGACATCTGAGTATCAGTTGCTGACTACAGGCTGTTCTAAGTAGACTGCGAGCCCTGGACTTGCTGTGGATGTGAACCAGTCCAGCTGATG)所示区段设计的引物，不仅能够高度灵敏地检测CHO细胞基因组DNA，还能区分大肠杆菌或人类等干扰性DNA，甚至与仓鼠细胞高度同源的小鼠或大鼠的干扰性DNA。因此，本发明方法操作简便快捷、特异性和灵敏性高。
此外，发明人还发现利用上述引物构成的多重PCR荧光检测体系能够进一步提高实验结果的精密度和检测灵敏度，降低样本处理损害DNA完整性所带来的漏检率。在此基础上完成了本发明。
本发明的引物
本文所用的术语“引物”具有本领域技术人员常规理解的意义。本发明的CHO细胞基因组DNA特异性引物不是针对外源基因本身或病毒载体本身设计，而是针对CHO细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1(CHO细胞基因组中LTR元件的部分区段)或SEQ ID NO:2(CHO细胞基因组中另一个LTR元件的部分区段)所示区段设计的。换言之，本发明的引物可以特异性结合于CHO细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示区段。
在具体的实施方式中，特异性结合于CHO细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示区段的所述引物构成第一引物对，包括正向引物和反向引物，其中正向引物结合于CHO细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示区段的第64-92位，优选第67-92位；其中的反向引物结合于CHO细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示区段的第125-147位，优选第125-144位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为78~84bp，优选78bp。
在优选的实施方式中，所述正向引物和反向引物的长度为26-20bp；优选26和20bp。
在另一优选的实施方式中，所述正向引物和反向引物的Tm温度为58-60℃，并且正向引物的Tm与反向引物的Tm的差值的绝对值≤2℃。
在优选的实施方式中，所述正向引物如SEQ ID NO:3(5-GTCATCTAAGTACAAACTTAAAGGGC-3)所示，所述反向引物如SEQ ID NO:4(5-GTCCAGAGTGCCAGGTATGG-3)所示。
在具体的实施方式中，特异性结合于CHO细胞基因组DNA上SEQ ID NO:2所示区段的所述引物构成第二引物对，包括正向引物和反向引物，其中正向引物结合于CHO细胞基因组DNA上SEQ ID NO:2所示区段的第1-22位，优选第1-19位；反向引物结合于CHO细胞基因组DNA上SEQ ID NO:2所示区段的第86-110位，优选第89-110位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为80-110bp，优选110bp。
在另一优选实施方式中，所述第二引物对中的正向引物和反向引物的长度为16-24bp，优选19和21bp。
在另一优选实施方式中，所述第二引物对中的正向引物和反向引物的Tm温度为58-60℃，并且正向引物的Tm与反向引物的Tm的差值的绝对值≤2℃。
在具体的实施方式中，第二引物对的所述正向引物如SEQ ID NO:5(5-ACAGGTTTCTGCTTCTGGC-3)所示，所述反向引物如SEQ ID NO:6(5-CATCAGCTGGACTGGTTCACA-3)所示。
在优选的实施方式中，SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4是本发明的最佳引物对。
多重PCR
普通PCR仅应用一对引物，通过PCR扩增产生一个核酸片段，主要用于单一因子的鉴定。多重PCR(multiplex PCR)，又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系里加上二对以上的引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同。但是相比于一般PCR，多重PCR具有以下优点：1.高效性，在同一PCR反应管内同时检出多种病原微生物，或对有多个型别的目的基因进行分型；2.系统性，多重PCR很适宜于成组对象的检测；3.经济简便性，多种对象在同一反应管内同时检出，大大节省时间，节省试剂，节约经费开支，从而提供更多更准确的诊断信息。类似地，本领域普通技术人员明白，“多重荧光PCR”是通过荧光染料或荧光标记的特异性探针进行的多重PCR。
在本发明中，由于检测对象，即，残余CHO细胞DNA不一定是完整的基因组DNA，为进一步提高检测精密度和灵敏度，降低漏检率，本发明可以利用第一对引物(SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4)与第二对引物(SEQ ID NO:5和SEQ IDNO:6)构成多重荧光PCR体系，针对CHO细胞基因组DNA的两处不同区域进行检测，从而极大提高了检测的精密度和灵敏度。
本发明的检测体系
本发明还提供一种检测CHO细胞基因组DNA的检测体系，所述体系包含上述的本发明引物对以及探针等实施PCR所需的其它成分，例如Taq酶、dNTP、Mg2+等等。
在具体的实施方式中，本领域普通技术人员可根据需要具体设计探针，所述探针可以处于液相中，也可以固定于固相上；可以在扩增前结合，也可以在扩增后结合。在具体的实施方式中，所述探针如5-FAM-TTTCATCAGGCCAAAGGCACCTCTGT-TRAMA-3(SEQ ID NO:9)或5-FAM-TCCAGGGCTTGCAGTCTACTTAGAACAGCC-TAMRA-3(SEQ ID NO:10)所示。
在具体的实施方式中，本发明检测体系的检测灵敏度达到106-1fg/μl。在优选的实施方式中，本发明检测体系的检测灵敏度达到0.1fg/μl。
在其它实施方式中，本发明还提供利用上述的本发明引物对或本发明检测体系检测CHO细胞基因组DNA的方法。
在其它实施方式中，本发明还提供PCR试剂盒，所述PCR试剂盒装有本发明引物对和用于实施PCR的其它所需成分以及使用该试剂盒作PCR检测的使用说明书。
在优选的实施方式中，为排除假阴性结果，本发明的PCR试剂盒还装有标准品对照。
在进一步的优选实施方式中，所述标准品对照包含SEQ ID NO:1所示片段，优选地，所述标准品对照是SEQ ID NO:1所示片段。
在其它实施方式中，本发明还提供利用本发明引物对实施的PCR方法。
本发明还提供一种多核苷酸，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:1所示片段。
在优选的实施方式中，所述多核苷酸如SEQ ID NO:1所示。
本领域技术人员知道，所述多核苷酸是一种特异性的CHO细胞基因组DNA检测标志物，即，可通过扩增该标志物特异性地检测体系中CHO细胞基因组DNA是否存在。
因此，本领域技术人员不难理解，上述多核苷酸可用于CHO细胞基因组DNA的检测。例如，如果具体的检测环境存在可能影响PCR扩增的因素，就有可能产生假阴性结果，因此，本发明的多核苷酸可在检测中用作标准品对照，以排除特定体系下产生的假阴性结果。
本领域普通技术人员鉴于本文内容可以理解，如果检测体系中只含有一对引物，进行的PCR方法是普通PCR，如果检测体系中含有两对以上的引物，那进行的是多重PCR。
本发明的引物和方法的优点包括:
1.本发明的引物灵敏度高，能够检测出1fg/μl，甚至0.1fg/μl的DNA浓度；
2.本发明的引物特异性好，能够区分CHO细胞基因组DNA与其它干扰性DNA；
3.本发明的方法操作简便快捷。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(Cold SpringHarbor Laboratory Press，2001)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
本发明所用的材料与方法
1.样本处理试剂：(柱纯化回收)包括蛋白酶K 20mg/ml，预处理缓冲液，结合缓冲液，洗涤缓冲液，洗脱缓冲液，结合柱，收集管，1.5ml离心管。
2.DNA检测体系：
2x Taqman mix：含有Taq酶、dNTP、Mg2+、本发明引物及探针等成分。
掺加标准品，阴性质控，DNA稀释液
3.检测仪器：ABI 7500。
4.实验操作及过程
4.1样本处理
4.1.1准备工作：
在洗涤缓冲液中加入80ml无水乙醇
4.1.2样本处理：
1)取100ul检测样品，加入1.5ml离心管中，加入5ul蛋白酶K，55℃1小时；
2)将结合柱内放入收集管，加入200μL预处理缓冲液，室温放置5min；12000g离心2min，弃废液；
3)在检测样品中加入600ul的结合缓冲液，震荡混匀；
4)将溶液加入结合柱中，8000g离心1min，弃废液；
5)结合柱中加入700μL洗涤缓冲液(已加乙醇)，10000g离心1min，弃废液；
6)重复第五步；
7)将空的结合柱与收集管，13000g离心2min，丢弃收集管；
8)将柱子放入干净的1.5ml离心管中，开盖，晾干10min，除去乙醇；
9)柱子中加入50μL洗脱缓冲液(预先55℃水浴)，放置2min；
10)13000g离心1min，所得滤液即为纯化产物。
4.2检测体系
4.2.1准备工作：
参考品：参考品为CHO-K1细胞基因组DNA(仓鼠卵巢细胞亚株CHO-K1细胞来源于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，具体提取DNA方法参考中国药典附录IX B中提供的阳性对照DNA制备方法)，标准参考品经校正后使用，其浓度为50ng/ul，冰冻保存。使用时用DNA稀释液稀释成7个浓度梯度，分别为100pg/μl、10pg/μl、1pg/μl、100fg/μl，10fg/μl，1fg/μl及0.1fg/μl。NTC为无样本阴性质控。
检测体系：30ul
15μl 2X Taqman mix+10μl样品+5μl水=30μl
实时荧光定量PCR反应程序优选为：95℃预变性2min；95℃15s，60℃1min，40个循环。根据所获得的标准曲线，计算得到待检样本中CHO细胞DNA的量。
实施例
实施例1.评价SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示引物对的性能
根据上文“本发明所用的材料与方法”，利用SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的引物对进行PCR检测。实验结果如图1和图2所示。其中图1是参考品扩增曲线，扩增曲线显示出明显的指数增长期。图2是参考品标准曲线。由图2可知，当参考品浓度为1000pg/μl、100pg/μl、10pg/μl、1pg/μl、100fg/μl、10fg/μl、1fg/μl及0.1fg/μl时，绘制得到的标准曲线斜率为-3.39，相关系数(R2)＝0.999，扩增效率为97.23％。标准曲线线性良好，检测灵敏度可达到0.1fg/μl。
实施例2.评价SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示引物对的特异性
为评价SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示引物对的特异性，选取生产中常见的人类及大肠杆菌污染DNA以及与仓鼠细胞同源性高的小鼠、大鼠基因作体系干扰实验。具体为：
1.人类和大肠杆菌污染DNA体系干扰实验
在检测体系中加入同样浓度的10pg/μl CHO基因和人类基因(人肝癌细胞SK-HEP-1来源中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库；用takara基因提取试剂盒提取)、以及同样浓度的10pg/μl CHO基因和大肠杆菌基因(E.coil DH5α菌株来源于中国科学院微生物研究所，编号1.1595，用takara基因提取试剂提取)作为样本进行检测。
2.大鼠干扰实验
用参考品稀释1000pg/μl、100pg/μl、10pg/μl、1pg/μl、0.1pg/μl做标准曲线，等量分成两份，一份不加大鼠基因(大鼠来源于浙江医学科学院实验动物中心，SD Wistar；取大鼠肝脏用MP DNA提取试剂盒提取)，一份加入大鼠基因并使加入后的终浓度为100pg/μL。
3.小鼠干扰实验
用参考品稀释1000pg/μl、100pg/μl、10pg/μl、1pg/μl、0.1pg/μl做标准曲线，等量分成两份，一份不加小鼠基因(小鼠来源于浙江医学科学院实验动物中心，昆明种，小鼠肝脏用MP DNA提取试剂盒提取)，一份加入小鼠基因并使加入后的终浓度为100pg/μL。
实验结果如图3-6所示。从产生的曲线可以看出，人类和大肠杆菌DNA污染对SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示引物对的检测结果明显没有造成影响；即便是与仓鼠同源性很高的大鼠和小鼠DNA污染，对SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示引物对的检测结果也未造成实质性影响。
实施例3.评价SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示引物对的性能
按照实施例1所述的方法，评价SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示引物对的性能。
实验结果如图7和图8所示。其中图7是参考品扩增曲线，扩增曲线显示出明显的指数增长期。图8是参考品标准曲线。由图8可知，当参考品浓度为1000pg/μl、100pg/μl、10pg/μl、1pg/μl、0.1pg/μl及0.01pg/μl时，绘制得到的标准曲线斜率为-3.33，相关系数(R2)＝0.997，扩增效率为99.66％。标准曲线线性良好，检测灵敏度可达到10fg/μl。
实施例4.评价SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示引物对的特异性
按照实施例2所述的方法，评价SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示引物对的特异性。
实验结果如图9-12所示。从产生的曲线可以看出，人类和大肠杆菌DNA污染对本发明检测体系的检测结果明显没有造成影响；即便是与仓鼠同源性很高的大鼠和小鼠DNA污染对SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示引物对的检测结果也未造成实质性影响。
实施例5.替代样本实际定量检测实验
用10mg/ml BSA水溶液作为检测基质，在100μl样本基质中分别加入100pg、10pg的CHO参考品DNA，按实验操作(如上所述)步骤，对替代样本进行处理并定量检测，所得数值计算实际检测回收率，其中该实施例使用SEQ ID NO:3和4以及5和6所示两组引物对。
从以上结果可以看出：为了排除样本中高浓度蛋白对检测结果的影响，样本必须经过预处理。从实验结果看，试剂盒预处理过程可以从粗制样本中回收并浓缩微量存在的DNA 目的片段，回收率在70%~130%保证后期检测结果的可靠性。
实施例6.片段化DNA检测实验
取300ng/ul CHO参考品DNA分装入1.5ml离心管中，每管30ul，分装5管。分别将每管DNA在水浴中以不同时间超声(0min、1min、5min、15min、30min)，超声所得不同大小的DNA分别稀释梯至为100fg/μl、10fg/μl及1fg/μl后，以稀释DNA作为模板，用包含SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示引物对和SEQ IDNO:5和SEQ ID NO:6所示引物对的多重检测体系检测。
由图13和图14的结果可知，不同片段大小的DNA作为模版后，对检测结果影响不大。这就表明联用SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示引物对和SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示引物对的检测体系可以很好的避免由于样本中残余DNA收到损伤而造成基因不同程度的片段化所引入的漏检现象，使检测结果更为可靠全面。
实施例7.包含本发明其它引物的检测体系
本发明人还获得了特异性结合于CHO细胞基因组DNA(SEQ ID NO:2)的第1~18以及89~110位的其它引物对：正向引物：ACAGGTTTCTGCTTCTGGCT(SEQ ID NO:7)；反向引物：CATCAGCTGACTGGTTCACA(SEQ ID NO:8)。并且在其他条件不变的情况下，以SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6为对照，对SEQID NO:7和SEQ ID NO:8进行了评估。
结果如图15所示。由图15可知，当参考品浓度为1000pg/μl、100pg/μl、10pg/μl和1pg/μl时，SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示引物可以检测出DNA，但它们的检测限不如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示引物那般优秀，不能检测出0.1pg/μL的DNA浓度，高浓度下的CT出现值比SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示引物少1个循环，即，检测浓度差一个数量级。但SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示引物对依然是可以实现本发明目的的引物对。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (17)
1.一种检测CHO细胞基因组DNA的引物对，其特征在于，所述引物对包括正向引物和反向引物，其中所述正向引物结合于CHO细胞基因组DNA上SEQ IDNO:1所示区段的第64-92位；其中的反向引物结合于CHO细胞基因组DNA上SEQID NO:1所示区段的第125-147位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为78-84bp。
2.如权利要求1所述的引物对，其特征在于，所述正向引物如SEQ ID NO:3所示，所述反向引物如SEQ ID NO:4所示。
3.一种检测体系，其特征在于，所述检测体系包含权利要求1或2所述的引物对。
4.如权利要求3所述的检测体系，其特征在于，所述检测体系还包含第二引物对，所述第二引物对包括正向引物和反向引物，其中所述正向引物结合于CHO细胞基因组DNA上SEQ ID NO:2所示区段的第1-22位；所述反向引物结合于CHO细胞基因组DNA上SEQ ID NO:2所示区段的第86-110位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为80-110bp。
5.如权利要求3或4所述的检测体系，其特征在于，所述检测体系还包含探针。
6.如权利要求3-5中任一项所述的检测体系，其特征在于，所述检测体系的检测灵敏度为106-1 fg/μl，优选地，所述检测体系的检测灵敏度为0.1 fg/μl。
7.一种CHO细胞基因组DNA的检测方法，所述方法包括：利用权利要求1或2所述的引物对或权利要求3-5中任一项所述的检测体系，对待测样品进行PCR，并检测PCR扩增产物。
8.一种PCR试剂盒，所述试剂盒中包括容器以及位于所述容器中的权利要求1或2所述的引物对。
9.如权利要求8所述的PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括第二引物对，所述第二引物对包括正向引物和反向引物，其中所述正向引物结合于CHO细胞基因组DNA上SEQ ID NO:2所示区段的第1-22位；所述反向引物结合于CHO细胞基因组DNA上SEQ ID NO:2所示区段的第86-110位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为80-110bp。
10.一种PCR方法，包括步骤：
在一PCR检测体系中，利用权利要求1或2所述的引物对扩增目标产物。
11.如权利要求10所述的PCR方法，其特征在于，所述方法同时利用第二引物对实施多重PCR，所述第二引物对包括正向引物和反向引物，其中所述正向引物结合于CHO细胞基因组DNA上SEQ ID NO:2所示区段的第1-22位；所述反向引物结合于CHO细胞基因组DNA上SEQ ID NO:2所示区段的第86-110位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为80-110bp。
12.一种检测CHO细胞基因组DNA的引物对，其特征在于，所述引物对包括正向引物和反向引物，其中所述正向引物结合于CHO细胞基因组DNA上SEQ IDNO:2所示区段的第1-22位；所述反向引物结合于CHO细胞基因组DNA上SEQ IDNO:2所示区段的第86-110位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为80-110bp。
13.如权利要求3所述的引物对，其特征在于，所述正向引物如SEQ ID NO:5所示，所述反向引物如SEQ ID NO:6所示。
14.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:1所示序列。
15.如权利要求14所述的多核苷酸在制备检测CHO细胞基因组DNA的试剂中的应用。
16.一种检测CHO细胞基因组DNA的引物对，其特征在于，所述引物对特异性结合于CHO细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示区段。
17.如权利要求16所述的引物对，其特征在于，所述正向引物的序列如SEQ IDNO:3或5所示，反向引物的序列如SEQ ID NO:4或6所示。
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Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2014079350A1 (zh) * | 2012-11-20 | 2014-05-30 | 中国科学院上海生命科学研究院湖州营养与健康产业创新中心 | 检测cho细胞dna的方法 |
| CN104762405A (zh) * | 2015-04-22 | 2015-07-08 | 北京嘉宝仁和医疗科技有限公司 | 一种单细胞基因组扩增后扩增产物质量鉴定的方法和试剂盒 |
| CN105441438A (zh) * | 2015-12-01 | 2016-03-30 | 北京科兴中维生物技术有限公司 | 检测人二倍体细胞dna的试剂盒及其应用 |
| CN105803050A (zh) * | 2014-12-29 | 2016-07-27 | 上海伯安生物科技有限公司 | 检测cho细胞dna的引物及方法 |
| CN105861641A (zh) * | 2015-01-23 | 2016-08-17 | 珠海市丽珠单抗生物技术有限公司 | 一种用于检测cho细胞dna残留的引物、试剂盒及检测方法 |
| CN109837345A (zh) * | 2017-11-24 | 2019-06-04 | 中国食品药品检定研究院 | 检测小鼠细胞残留dna的引物及方法 |
| CN112301028A (zh) * | 2020-10-27 | 2021-02-02 | 武汉珈创生物技术股份有限公司 | 一种用于鉴定cho细胞的scar标记及其构建方法和应用 |
| CN115976232A (zh) * | 2023-01-05 | 2023-04-18 | 鲲鹏基因（北京）科技有限责任公司 | 利用分子信标检测cho核酸残留的方法及引物和试剂盒 |
Families Citing this family (1)
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|---|---|---|---|---|
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Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102154503A (zh) * | 2011-04-20 | 2011-08-17 | 上海复宏汉霖生物技术有限公司 | 探针法检测cho细胞dna含量的方法 |
| CN102181530A (zh) * | 2011-03-18 | 2011-09-14 | 上海复宏汉霖生物技术有限公司 | 用于cho细胞dna残留检测的试剂盒及其使用方法 |
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|---|---|---|---|---|
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-
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Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102181530A (zh) * | 2011-03-18 | 2011-09-14 | 上海复宏汉霖生物技术有限公司 | 用于cho细胞dna残留检测的试剂盒及其使用方法 |
| CN102154503A (zh) * | 2011-04-20 | 2011-08-17 | 上海复宏汉霖生物技术有限公司 | 探针法检测cho细胞dna含量的方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 《GeneBank》 20070106 Lamnert,B.G.et al. GeneBank:EF540878.1 , * |
| LAMNERT,B.G.ET AL.: "GeneBank:EF540878.1", 《GENEBANK》 * |
Cited By (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2014079350A1 (zh) * | 2012-11-20 | 2014-05-30 | 中国科学院上海生命科学研究院湖州营养与健康产业创新中心 | 检测cho细胞dna的方法 |
| CN105803050A (zh) * | 2014-12-29 | 2016-07-27 | 上海伯安生物科技有限公司 | 检测cho细胞dna的引物及方法 |
| CN105803050B (zh) * | 2014-12-29 | 2020-10-16 | 湖州申科生物技术有限公司 | 检测cho细胞dna的引物及方法 |
| CN105861641A (zh) * | 2015-01-23 | 2016-08-17 | 珠海市丽珠单抗生物技术有限公司 | 一种用于检测cho细胞dna残留的引物、试剂盒及检测方法 |
| CN104762405A (zh) * | 2015-04-22 | 2015-07-08 | 北京嘉宝仁和医疗科技有限公司 | 一种单细胞基因组扩增后扩增产物质量鉴定的方法和试剂盒 |
| CN105441438A (zh) * | 2015-12-01 | 2016-03-30 | 北京科兴中维生物技术有限公司 | 检测人二倍体细胞dna的试剂盒及其应用 |
| CN109837345A (zh) * | 2017-11-24 | 2019-06-04 | 中国食品药品检定研究院 | 检测小鼠细胞残留dna的引物及方法 |
| CN109837345B (zh) * | 2017-11-24 | 2022-08-02 | 中国食品药品检定研究院 | 检测小鼠细胞残留dna的引物及方法 |
| CN112301028A (zh) * | 2020-10-27 | 2021-02-02 | 武汉珈创生物技术股份有限公司 | 一种用于鉴定cho细胞的scar标记及其构建方法和应用 |
| CN112301028B (zh) * | 2020-10-27 | 2021-06-08 | 武汉珈创生物技术股份有限公司 | 一种用于鉴定cho细胞的scar标记及其构建方法和应用 |
| CN115976232A (zh) * | 2023-01-05 | 2023-04-18 | 鲲鹏基因（北京）科技有限责任公司 | 利用分子信标检测cho核酸残留的方法及引物和试剂盒 |
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