CN104762405A - 一种单细胞基因组扩增后扩增产物质量鉴定的方法和试剂盒 - Google Patents

一种单细胞基因组扩增后扩增产物质量鉴定的方法和试剂盒 Download PDF

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CN104762405A
CN104762405A CN201510195108.5A CN201510195108A CN104762405A CN 104762405 A CN104762405 A CN 104762405A CN 201510195108 A CN201510195108 A CN 201510195108A CN 104762405 A CN104762405 A CN 104762405A
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amplification
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冯涛
王丹红
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HUNAN GUANGXIU HIGH LIFE TECHNOLOGY Co Ltd
Renhe Garbo Beijing Medical Science And Technology Co Ltd
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HUNAN GUANGXIU HIGH LIFE TECHNOLOGY Co Ltd
Renhe Garbo Beijing Medical Science And Technology Co Ltd
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Abstract

本发明涉及一种单细胞基因组扩增产物质量鉴定的方法和试剂盒，方法包括以下步骤：对单细胞进行分离并裂解，得到该单细胞的全基因组DNA；对全基因组DNA进行单细胞全基因组扩增，得到全基因组扩增产物；采用5对基因组上保守区段的特异性引物，将其放在一个扩增体系中，以全基因组扩增产物为模板进行PCR扩增，对5个扩增产物进行电泳检测，根据检测结果判断全基因组扩增产物的质量，结果显示为在电泳图上均匀分布条带的3-5个扩增产物为符合测序要求的扩增产物样品；对符合测序要求的扩增产物构建DNA测序文库；对所述DNA测序文库进行高通量测序。

Description

一种单细胞基因组扩增后扩增产物质量鉴定的方法和试剂盒
技术领域
本发明涉及分子细胞生物学领域，具体涉及一种单细胞基因组扩增产物质量鉴定的方法和试剂盒。
背景技术
在单细胞水平下对DNA进行研究能够有效地避免多细胞水平研究的诸多局限，尤其在胚胎领域。由于对早期胚胎进行染色体检测，必须进行单细胞水平的DNA分析。因此，开发应用于单个细胞研究的技术方法，以便揭示细胞异质性的规律，对于更好地进行细胞生物学研究具有重大的意义。单细胞分析中，包括对单细胞基因组、表达谱和代谢组的研究。目前，微量DNA和单细胞基因组研究已被广泛应用于考古学、微生物生态学、医学检测、法医学检测、临床诊断等领域。在生殖医学中，单细胞研究对产前诊断、胚胎植入前遗传诊断、精子和卵子的遗传病诊断等意义尤为重大。
目前，主要通过对单细胞基因组进行测序来进行单细胞基因组分析。因为，常用的DNA分析方法例如聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）、限制性片段长度多态性分析（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）、单链构象多态性分析（SSCP）、指纹技术和荧光原位杂交技术（Fluorescence in Situ Hybridization，FISH）等，只能对单细胞基因组的部分区域或已知位点进行研究，且缺乏对全新物种的基因组研究的有效策略，而对单细胞基因组进行测序可以有效避免这些不足。单细胞基因组的DNA量为皮克级水平，而目前的测序技术要求起始DNA量为微克级水平，因此，必须将单细胞基因组进行全基因组扩增（WGA）使之达到足够量。然而已知的全基因组扩增方法包括PEP-PCR,DOP-PCR（简并寡核苷酸引物的聚合酶链反应）等基于PCR的方法，以及多重链置换扩增（MDA, Multiple Displacement Amplification），均容易受到较多因素干扰，无法保证扩增达到100%的成功率。而对于扩增效率和扩增产物的质量评估，目前只能依据扩增后条带的均匀性及片段长度来判断，但这种方法存在很大的局限性。因此，亟需设计一种新的单细胞基因组扩增产物质量鉴定的方法和试剂盒以解决现有技术存在的上述不足。
发明内容
本发明的目的是提供一种单细胞基因组扩增产物质量鉴定的方法和试剂盒，以克服目前现有技术存在的上述不足。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现：
一种单细胞基因组扩增产物质量鉴定的方法，包括以下步骤：
对单细胞进行分离并裂解，得到该单细胞的全基因组DNA；
对全基因组DNA进行单细胞全基因组扩增，得到全基因组扩增产物；
采用5对基因组上保守区段的特异性引物，将其放在一个扩增体系中，以全基因组扩增产物为模板进行PCR扩增，对5个扩增产物进行电泳检测，根据检测结果判断全基因组扩增产物的质量，结果显示为在电泳图上均匀分布条带的3-5个扩增产物为符合测序要求的扩增产物样品；
对符合测序要求的扩增产物构建DNA测序文库；
对所述DNA测序文库进行高通量测序。
优选的，单细胞全基因组的扩增技术为多重置换扩增MDA全基因组扩增技术。
优选的，所述单细胞为人单细胞，基因组上保守区段选自DCTN6、RPL37A、URI1、SNTA1、人13号染色体上位置82722059、SEMA3A、人16号染色体上位置86386387、RAD9A、DIRC3、EIF2B1中的5种或多于5种。
优选的，所述基因组上保守区段的特异性引物序列为：
URI1引物1：TTCTGTTGAAGGAAAGAAGGTAGG，
URI1引物2：GTCTGATATTTTGGTGCACCCATTAC；
chr13_82722059引物1：ACAGAAGTCTGGGATGTGGAGGA，
chr13_82722059引物2：GGGCAGCCCAAAAAGACAGACAGA；
SEMA3A引物1：CCATGTTGGTCAG，
SEMA3A引物2：GATTCCACATTTA；
chr16_86386387引物1：TTTGTGTGTGCATCTGTAAGCATG，
chr16_86386387引物2：GGGGGTCTAAGAGCTTGTAAAAAG；
DIRC3引物1： TGTGGAGTGGAGGTGCCTAAAG
DIRC3引物2：GTCCTACCAGAATGCCAGTCC；
DCTN6引物1： CTGGGATCTCTCCCTTGGGCGTAAA ，
DCTN6引物2：TTCAGGACAGTGATGCCCCAGGAA；
RPL37A引物1： GCCTGAGGCTTGGTGGTGTGTATCC，
RPL37A引物2：AGTGCTGGTGAAGGGTCACAGCCA；
SNTA1引物1：TGGCCCAGAGTGGGAGGTCATTGT，
SNTA1引物2：TGTTGCCCTATCCCATGCTGGAGA；
RAD9A引物1：TGATTTGGGGTGGGGTGAATGTGA，
RAD9A引物2：AGTGGCTCAGCATGTCAAGGCCAG；
EIF2B1引物1：GGGAAGCCCAAGGGCCTGATTCTA，
EIF2B1引物2：TCATCCCGCAGCTCCAGTCTTCATC。
一种单细胞基因组扩增产物质量鉴定的试剂盒，包括所述基因组上保守区段的特异性引物，以对全基因组扩增产物进行基因组上保守区段检测。
优选的，所述单细胞为人单细胞，基因组上保守区段选自DCTN6、RPL37A、URI1、SNTA1、人13号染色体上位置82722059、SEMA3A、人16号染色体上位置86386387、RAD9A、DIRC3、EIF2B1中的5种或多于5种。
优选的，所述基因组上保守区段的特异性引物序列为：
URI1引物1：TTCTGTTGAAGGAAAGAAGGTAGG，
URI1引物2：GTCTGATATTTTGGTGCACCCATTAC；
chr13_82722059引物1：ACAGAAGTCTGGGATGTGGAGGA，
chr13_82722059引物2：GGGCAGCCCAAAAAGACAGACAGA；
SEMA3A引物1：CCATGTTGGTCAG，
SEMA3A引物2：GATTCCACATTTA；
chr16_86386387引物1：TTTGTGTGTGCATCTGTAAGCATG，
chr16_86386387引物2：GGGGGTCTAAGAGCTTGTAAAAAG；
DIRC3引物1：TGTGGAGTGGAGGTGCCTAAAG
DIRC3引物2：GTCCTACCAGAATGCCAGTCC；
DCTN6引物1：CTGGGATCTCTCCCTTGGGCGTAAA ，
DCTN6引物2：TTCAGGACAGTGATGCCCCAGGAA；
RPL37A引物1：GCCTGAGGCTTGGTGGTGTGTATCC，
RPL37A引物2：AGTGCTGGTGAAGGGTCACAGCCA；
SNTA1引物1：TGGCCCAGAGTGGGAGGTCATTGT，
SNTA1引物2：TGTTGCCCTATCCCATGCTGGAGA；
RAD9A引物1：TGATTTGGGGTGGGGTGAATGTGA，
RAD9A引物2：AGTGGCTCAGCATGTCAAGGCCAG；
EIF2B1引物1：GGGAAGCCCAAGGGCCTGATTCTA，
EIF2B1引物2：TCATCCCGCAGCTCCAGTCTTCATC。
优选的，所述试剂盒还含有用于对单细胞进行全基因组扩增的试剂成分，所述单细胞全基因组扩增采用多重置换扩增MDA或DOP-PCR。
本发明的有益效果为：设计合理，能够在单细胞基因组的全基因组扩增产物测序前，对全基因组扩增产物进行检测和筛选，以去除未扩增成功的样本，保证后续单细胞基因组测序的成功率，避免扩增产物质量不合格导致人力、物力浪费。
附图说明
下面为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例所述的单细胞基因组扩增产物质量鉴定的PCR图一；
图2是本发明实施例所述的单细胞基因组扩增产物质量鉴定的基因组测序图一；
图3是本发明实施例所述的单细胞基因组扩增产物质量鉴定的PCR图二；
图4是本发明实施例所述的单细胞基因组扩增产物质量鉴定的基因组测序图二；
图5是本发明实施例所述的单细胞基因组扩增产物质量鉴定的PCR图三；
图6是本发明实施例所述的单细胞基因组扩增产物质量鉴定的基因组测序图三；
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一
一、材料:
1、标本:合作医院活检的囊胚期细胞5个。
2、试剂:Qiagen的全基因组扩增试剂盒、MDA产物检测试剂盒、MDA产物纯化试剂盒、life文库构建试剂盒、Agencourt®AMPure®XP 磁珠、life模板制备试剂盒，life测序试剂盒。
3、仪器：PCR仪，琼脂糖凝胶电泳系统，ion torrent的PGM测序平台。
4、耗材：1.5ml、0.2ml进口离心管，瑞宁移液枪及带滤芯枪头。
二、操作步骤：
1、取细胞
取发育至囊胚期细胞5个，在显微镜下取出上述新鲜细胞后放入装有1μl PBS缓冲液的PCR管底，离心管编号1。
2、MDA法全基因组扩增
准备Buffer DLB：对Buffer DLB管进行离心处理从而使干粉聚集到管底，加入500µl无核酸酶的水，涡旋彻底混匀使其溶解，然后短暂离心，溶解后的Buffer DLB可在-20℃保存6个月；
准备Buffer D2：如表1所示，可配制12个反应，-20℃可保存3个月；
扩增方法如下：
1）将细胞样本离心，使其离心至管底，用PBS补至4µl；
2）加3µl D2缓冲液，手指轻轻拨动PCR管混匀，瞬时离心；
3）在PCR仪上65℃条件下孵育10min，加热盖，取出时放冰上；
4）加入3µl裂解终止液，手指轻轻拨动PCR管混匀，瞬时离心，放置冰上；
5）冰上融化DNA全基因组扩增酶，其余组分室温融化后涡旋混匀，瞬时离心后放置在冰上，按照表2配制反应：
6）取上述混匀后的反应液40µl，将其加入步骤2.4的10µl DNA中，混匀，瞬时离心；
7）PCR仪上30℃条件下孵育8h；
8）PCR仪上65℃条件下孵育3min使酶失活。
3、MDA产物纯化
产物纯化方法如下：
1）加入50µl膜结合液于50µl MDA产物中，混匀后转移至纯化柱内，室温放置1min，12000rpm离心1min；
2）加入700µl膜洗脱液，12000rpm离心1min，弃上清液；
3）加入500µl膜洗脱液，12000rpm离心1min，弃上清液；
4）12000rpm空转2min弃去多余液体，室温晾干3min；
5）加50µl无核酸酶水至离心柱膜上，室温放置5min后12000rpm离心1min，收集产物DNA。
4、产物检测
产物检测方法如下：
1）浓度：取1µl稀释至20µl，再取2µl用Qubit方法测浓度，1号样本浓度为:16.3ng/µl，则原液浓度为：246ng/µl；
2）MDA产物检测试剂盒检测：
a. PCR体系如表3示：
b. PCR程序：
95℃-5min；
（95℃-30s；60℃-30s；72℃-30s）-40cycles；
72℃-10min；
4℃-holding；
c. 120v，30min，3%的琼脂糖凝胶电泳检测结果如图1所示；
d. 如图1所示的电泳结果表明，1号样本五条带，符合标准，可以进行后期的上机测序。
5、文库构建
构建文库步骤如下：
1）DNA片段化：
a. DNA 起始量为100ng，取4.5µlDNA 于PCR 管中，补水至35µl；
b. 将10X 酶切反应液和片段化酶震荡混匀，瞬时离心5s后放置冰上；
c. 加5µl的10X 酶切反应液于PCR 管中；
d. 加10µl片段化酶，吹吸20次混匀，勿用涡旋混匀，避免产生气泡，瞬时离心5s使液体汇集于管底；
e. PCR仪上，37℃孵育35min；
f. 孵育后立即加入5μl 终止液，vortex 彻底混匀，瞬时离心后置于冰上；
2）纯化
a. 将上述DNA全部转入至一个1.5ml无核酸酶离心管中，加入99μl平衡到室温且充分混匀的纯化磁珠 (约1.8 倍样本体积)，震荡混匀10s，室温孵育5 min，瞬时离心5s；
b. 磁吸3-4 min至液体为澄清，弃上清。如果磁吸后液体仍浑浊，需延长磁吸时间，或改用磁性较强的磁力架；
c. 加入500μl 新鲜配制75%乙醇，将1.5ml离心管在磁力架上旋转2周（所有样本依次旋转1/4周，共旋转8次），弃上清；
d. 重复步骤c；
e. 室温稍晾干沉淀，时间为2-3min；
f. 加20μl DNA洗脱液，震荡5s，瞬时离心2s，磁吸3 min至液体澄清，吸取全部上清至新的PCR管中；
3）连接头
当使用表4中特异性接头时，应使用带滤芯的吸头，这是因为特异性接头一次只能打开一管，且加样管只能打开对应管盖，应避免交叉污染。不同的样本应使用不同的接头，确保一张芯片中不会发生特异性接头出现相同的情况，加样顺序如表4所示：
配好体系后吹吸混匀，放入PCR仪，反应条件如表5所示：
将全部反应液转移到一个新的1.5ml 离心管中，用于纯化；
4）纯化
a.加入180μl平衡到室温且充分混匀的DNA纯化磁珠（约1.8倍样本体积），震荡10s，室温孵育5min，离心5s；
b.重复步骤2）b–e；
c.加入20μl DNA洗脱液，震荡5s，瞬时离心2s，磁吸3min至液体澄清，吸取全部上清至新的PCR管中；
5）片段选择（使用E-Gel预制凝胶电泳系统）
a.准备好E-Gel预制凝胶电泳系统，连接好电源。取出胶上的梳子后放好位置。选择“SizeSelect™2%”程序，调整时间为15min；
b.样本上样20μl，Marker上样10μl，按照如下位置点样：
Marker片段大小依次为50bp、100bp、150bp、200bp（目标条带）、250bp、300bp、350bp（主带）；
c.启动电泳；
d.观察Marker的200bp条带达到在收集孔位置时，时间在13-14min范围内，250bp条带在孔的上边缘，暂停电泳，吸取第二排收集孔内的液体20μl（未扩增文库），具体操作时，收集液体时间以Marker 位置为准；
6）PCR扩增
a. 室温解冻PCR反应液和引物混合液，震荡混匀10s，瞬时离心5s，使液体离心至管底，放置于冰上；
b. 制备PCR反应液（冰上），体系如表6所示：
c.反应体系加好后，震荡混匀10s，瞬时离心5s，使液体离心至管底；
d. 放入PCR 中反应，程序如表7所示：
7）纯化
a. 将上述液体完全转移至一个新的无核酸酶1.5ml离心管中，加入195μl 平衡到室温且充分混匀的DNA纯化磁珠（约1.5倍样本体积），震荡10s，离心5s，室温孵育5 min；
b. 重复步骤2）b–e；
c. 加20μl DNA洗脱液，震荡10s，离心5s，磁吸3 min至液体澄清，吸取全部液体至新的无核酸酶1.5ml离心管中；
8）文库检测
Qubit 方法检测文库浓度：
a. 配置Qubit反应液：根据待测样本数量配置，每份样本取1μl染料至199μl的Qubit工作液混合，震荡10s，离心，室温保存；
b. 取2μl样本和198μl Qubit反应液充分混匀，避光于室温，温度不低于20度，反应3分钟；
c. 分别取10μl 标准品1和标准品2，各自和190μl Qubit反应液充分混匀，避光室温反应3分钟；
d. 文库检测Qubit方法检测文库浓度，样本1号的文库浓度为：0.082ng/µl；
9）OneTouch，使用Life Tech的模板制备试剂盒
根据Qubit检测的文库浓度，稀释文库至2.5pg/µl，用于OneTouch，运行5.5h；
10）PGM（Life Tech的测序试剂盒）
程序设定中测序Flow数量选择260Flows，参考基因组选择hg19，Ion xpress选择barcode11，318v2芯片测序，运行2.5h。
三、数据分析
1、原始测序数据统计表
表8
2、如图2所示，结果表明该1号样本为正常胚胎且SD<3.5，结果可信，这一结果与MDA产物检测试剂盒提供的质控结果相符。
实施例二
一、材料:
1、标本:合作医院活检的囊胚期细胞5个。
2、试剂: Qiagen的全基因组扩增试剂盒、MDA产物检测试剂盒、MDA产物纯化试剂盒、life文库构建试剂盒、Agencourt®AMPure®XP 磁珠、life模板制备试剂盒，life测序试剂盒。
3、仪器：PCR仪，琼脂糖凝胶电泳系统，ion torrent的PGM测序平台。
4、耗材：1.5ml、0.2ml 进口离心管，瑞宁移液枪及带滤芯枪头。
二、操作步骤：
1、取细胞
取发育至囊胚期细胞5个，在显微镜下取出上述新鲜细胞后放入装有1μl PBS缓冲液的PCR管底，离心管编号2。
2、MDA法全基因组扩增
准备Buffer DLB：对Buffer DLB 管进行离心处理从而使干粉聚集到管底，加入500µl无核酸酶的水，涡旋彻底混匀使其溶解，然后短暂离心，溶解后的Buffer DLB可在-20℃保存6个月；
准备Buffer D2：如表1所示，可配制12个反应，-20℃可保存3个月；
扩增方法如下：
1）将细胞样本离心，使其离心至管底，用PBS补至4µl；
2）加3µl D2缓冲液，手指轻轻拨动PCR管混匀，瞬时离心；
3）在PCR仪上65℃条件下孵育10min，加热盖，取出时放冰上；
4）加入3µl 裂解终止液，手指轻轻拨动PCR管混匀，瞬时离心，放置冰上；
5）冰上融化 DNA全基因组扩增酶，其余组分室温融化后涡旋混匀，瞬时离心后放置在冰上，按照表2配制反应：
6）取上述混匀后的反应液40µl，将其加入步骤2.4的10µl DNA中，混匀，瞬时离心；
7）PCR仪上30℃条件下孵育8h；
8）PCR仪上65℃条件下孵育3min使酶失活。
3、MDA产物纯化
产物纯化方法如下：
1）加入50µl 膜结合液于50µl MDA产物中，混匀后转移至纯化柱内，室温放置 1min，12000rpm离心1 min；
2）加入700µl膜洗脱液，12000rpm离心1min，弃上清液；
3）加入500µl膜洗脱液，12000rpm离心1min，弃上清液；
4）12000rpm空转2min弃去多余液体，室温晾干3min；
5）加50µl无核酸酶水至离心柱膜上，室温放置5min后12000rpm离心1min，收集产物DNA。
4、产物检测
产物检测方法如下：
1）浓度：取1µl稀释至20µl，再取2µl用Qubit方法测浓度，2号样本浓度为：20ng/µl，则原液浓度为：400ng/µl；
2）MDA产物检测试剂盒检测：
a. PCR体系如表3示:
b. PCR程序：
95℃-5min；
（95℃-30s；60℃-30s；72℃-30s）-40cycles；
72℃-10min；
4℃-holding；
c. 120v，30min，3%的琼脂糖凝胶电泳检测结果；
d. 如图3所示的电泳结果表明，2号样本为3条带，符合标准，可以进行后期文库构建及测序。
5、文库构建
构建文库步骤如下：
1）DNA 片段化：
a. DNA 起始量为100ng，取5µlDNA 于PCR 管中，补水至35μl；
b. 将10X酶切反应液和片段化酶震荡混匀，瞬时离心5s后放置冰上；
c. 加5μl的10X 酶切反应液于PCR 管中；
d. 加10μl片段化酶，吹吸20次混匀，勿用涡旋混匀，避免产生气泡。瞬时离心5s使液体汇集于管底；
e. PCR 仪上，37℃孵育35min；
f. 孵育后立即加入5μl 终止液，vortex 彻底混匀，瞬时离心后置于冰上；
2）纯化
a. 将上述DNA全部转入至一个1.5ml无核酸酶离心管中，加入99μl平衡到室温且充分混匀的纯化磁珠 (约1.8 倍样本体积)，震荡混匀10s，，室温孵育5 min，瞬时离心5s；
b. 磁吸3-4 min至液体为澄清，弃上清。如果磁吸后液体仍浑浊，需延长磁吸时间，或改用磁性较强的磁力架；
c. 加入500μl 新鲜配制75%乙醇，将1.5ml离心管在磁力架上旋转2周（所有样本依次旋转1/4周，共旋转8次），弃上清；
d. 重复步骤c；
e. 室温稍晾干沉淀（约2-3min）；
f. 加20μl DNA洗脱液，震荡5s，瞬时离心2s，磁吸3 min至液体澄清，吸取全部上清至新的PCR管中；
3）连接头
当使用表4中特异性接头时，应使用带滤芯的吸头，这是因为特异性接头一次只能打开一管，且加样管只能打开对应管盖，应避免交叉污染。不同的样本应使用不同的接头，确保一张芯片中不会发生特异性接头出现相同的情况，加样顺序如表4所示：
配好体系后吹吸混匀，放入PCR仪，反应程序如表5所示：
将全部反应液转移到一个新的1.5ml 离心管中，用于纯化。
4）纯化
a.加入180μl平衡到室温且充分混匀的DNA纯化磁珠(约1.8 倍样本体积)，震荡 10s，室温孵育5 min，离心5s；
b. 重复步骤2）b-e；
c. 加入20μl DNA洗脱液，震荡5s，瞬时离心2s，磁吸3 min至液体澄清，吸取全部上清至新的PCR管中；
5）片段选择（使用E-Gel预制凝胶电泳系统）
a. 准备好E-Gel预制凝胶电泳系统，连接好电源。取出胶上的梳子后放好位置。选择“SizeSelect™2%”程序，调整时间为15min；
b. 样本上样20μl，Marker 上样10μl，按照如下位置点样：
Marker片段大小依次为50bp、100bp、150bp、200bp（目标条带）、250bp、300bp、350bp（主带）；
c. 启动电泳；
d.观察Marker 的200 bp 条带达到在收集孔位置时（约13-14 min），250bp 条带在孔的上边缘，暂停电泳，吸取第二排收集孔内的液体20μl（未扩增文库），收集液体时间应以Marker 位置为准；
6）PCR 扩增
a. 室温解冻PCR反应液和引物混合液，震荡混匀10s，瞬时离心5s，使液体离心至管底，放置于冰上；
b. 制备PCR 反应液（冰上），体系如表6所示：
c. 反应体系加好后，震荡混匀10s，瞬时离心5s，使液体离心至管底；
d. 放入PCR 中反应，程序如表7所示：
7）纯化
a. 将上述液体完全转移至一个新的无核酸酶1.5ml离心管中，加入195μl 平衡到室温且充分混匀的DNA纯化磁珠 (约1.5 倍样本体积)，震荡10s，离心5s，室温孵育5 min；
b. 重复步骤2）b–e；
c. 加20μl DNA洗脱液，震荡10s，离心5s，磁吸3 min至液体澄清，吸取全部液体至新的无核酸酶1.5ml离心管中；
8）文库检测
Qubit 方法检测文库浓度：
a.配置Qubit反应液：根据待测样本数量配置，每份样本取1μl染料至199μl的Qubit工作液混合，震荡10s，离心，染料于低温时会变粘稠，影响试验结果，应室温保存；
b. 取2μl 样本和198μl Qubit反应液充分混匀，避光于室温，不低于20度，反应3分钟；
c. 分别取10μl 标准品1和标准品2，各自和190μl Qubit反应液充分混匀，避光室温反应3分钟；
d. 文库检测Qubit方法检测文库浓度，样本2号的文库浓度为：1.1ng/µl；
9）OneTouch，使用 Life Tech 的模板制备试剂盒
根据Qubit检测的文库浓度，稀释文库至2.5pg/µl，用于OneTouch，运行5.5h；
10）PGM（ION PGM SEQUENCING 200 KIT V2）
程序设定中测序Flow数量选择260Flows，参考基因组选择hg19，Ion xpress选择barcode1，318v2芯片测序，运行2.5h。
三、数据分析
1、原始测序数据统计表
表8
2、如图4所示，结果表明该2号样本为正常胚胎且SD<3.5，结果可信，这一结果与MDA产物检测试剂盒提供的质控结果相符。
实施例三
一、材料:
1、标本:合作医院活检的囊胚期细胞5个。
2、试剂: Qiagen的全基因组扩增试剂盒、MDA产物检测试剂盒、MDA产物纯化试剂盒、life文库构建试剂盒、Agencourt®AMPure®XP 磁珠、life模板制备试剂盒，life测序试剂盒。
3、仪器：PCR仪，琼脂糖凝胶电泳系统，ion torrent的PGM测序平台。
4、耗材：1.5ml、0.2ml 进口离心管，瑞宁移液枪及带滤芯枪头。
二、操作步骤：
1、取细胞
取发育至囊胚期细胞5个，在显微镜下取出上述新鲜细胞后放入装有1μl PBS缓冲液的PCR管底，离心管编号3。
2、MDA法全基因组扩增
准备DLB裂解液：对 DLB裂解液进行离心处理从而使干粉聚集到管底，加入500µl无核酸酶的水，涡旋彻底混匀使其溶解，然后短暂离心，溶解后的Buffer DLB可在-20℃保存6个月；
准备Buffer D2：如表1所示，可配制12个反应，-20℃可保存3个月；
扩增方法如下：
1）将细胞样本离心，使其离心至管底，用PBS补至4µl;
2）加3µl D2缓冲液，手指轻轻拨动PCR管混匀，瞬时离心;
3）在PCR仪上65℃条件下孵育10min，加热盖，取出时放冰上；
4）加入3µl裂解终止液，手指轻轻拨动PCR管混匀，瞬时离心，放置冰上；
5）冰上融化DNA全基因组扩增酶，其余组分室温融化后涡旋混匀，瞬时离心后放置在冰上，按照表2配制反应：
6）取上述混匀后的反应液40µl，将其加入步骤2.4的10µl DNA中，混匀，瞬时离心；
7）PCR仪上30℃条件下孵育8h；
8）PCR仪上65℃条件下孵育3min使酶失活。
3、MDA产物纯化
产物纯化方法如下：
1）加入50µl 膜结合液于50µl MDA产物中，混匀后转移至纯化柱内，室温放置 1min，12000rpm离心 1 min；
2）加入700µl 膜洗脱液，12000rpm离心1min，弃上清液；
3）加入500µl 膜洗脱液，12000rpm离心1min，弃上清液；
4）12000rpm空转2min弃去多余液体，室温晾干3min；
5）加50µl无核酸酶水至离心柱膜上，室温放置5min后12000rpm离心1min，收集产物DNA。
4、产物检测
产物检测方法如下：
1）浓度：取1µl稀释至20µl，再取2µl用Qubit方法测浓度，3号样本浓度为:14.5ng/µl，则原液浓度为：290ng/µl；
2）MDA产物检测试剂盒检测与管家基因GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）检测：
a. PCR体系如表3-1和表3-2所示:
b. PCR程序：
95℃-5min；
（95℃-30s；60℃-30s；72℃-30s）-40cycles；
72℃-10min;
4℃-holding；
c. 120v，30min，3%的琼脂糖凝胶电泳检测结果如图3中编号3所示；
d. 如图3中本试剂盒检测编号3所示的电泳结果表明，3号样本一条带，不符合标准，不可以进行后期的上机测序。如图5中管家基因检测的3号样本有目标条带，无法排除样本不合格。
5、文库构建
构建文库步骤如下：
1）DNA片段化：
a. DNA 起始量为100ng，取6.9µlDNA 于PCR 管中，补水至35μl；
b. 将10X 酶切反应液和片段化酶震荡混匀，瞬时离心5s后放置冰上；
c. 加5μl的10X 酶切反应液于PCR 管中；
d. 加10μl片段化酶，吹吸20次混匀，勿用涡旋混匀，避免产生气泡，瞬时离心5s使液体汇集于管底；
e. PCR仪上，37℃孵育35min；
f. 孵育后立即加入5μl 终止液，涡旋彻底混匀，瞬时离心后置于冰上；
2）纯化
a. 将上述DNA全部转入至一个1.5ml无核酸酶离心管中，加入99μl平衡到室温且充分混匀的纯化磁珠 (约1.8 倍样本体积)，震荡混匀10s，，室温孵育5 min，瞬时离心5s；
b. 磁吸3-4 min至液体为澄清，弃上清。如果磁吸后液体仍浑浊，需延长磁吸时间，或改用磁性较强的磁力架；
c. 加入500μl 新鲜配制75%乙醇，将1.5ml离心管在磁力架上旋转2周（所有样本依次旋转1/4周，共旋转8次），弃上清；
d. 重复步骤c；
e. 室温稍晾干沉淀，时间为2-3min；
f. 加20μl DNA洗脱液，震荡5s，瞬时离心2s，磁吸3 min至液体澄清，吸取全部上清至新的PCR管中；
3）连接头
当使用表4中特异性接头时，应使用带滤芯的吸头，这是因为特异性接头一次只能打开一管，且加样管只能打开对应管盖，应避免交叉污染。不同的样本应使用不同的接头，确保一张芯片中不会发生特异性接头出现相同的情况，加样顺序如表4所示：
配好体系后吹吸混匀，放入PCR仪，反应程序如表5所示：
将全部反应液转移到一个新的1.5ml 离心管中，用于纯化；
4）纯化
a.加入180μl平衡到室温且充分混匀的DNA纯化磁珠(约1.8 倍样本体积)，震荡 10s，室温孵育5 min，离心5s；
b. 重复步骤2）b–e；
c. 加入20μl DNA洗脱液，震荡5s，瞬时离心2s，磁吸3 min至液体澄清，吸取全部上清至新的PCR管中；
5）片段选择（使用E-Gel预制凝胶电泳系统）
a. 准备好E-Gel预制凝胶电泳系统，连接好电源。取出胶上的梳子后放好位置。选择“SizeSelect™2%”程序，调整时间为15min；
b. 样本上样20μl，Marker 上样10μl，按照如下位置点样：
Marker片段大小依次为50bp、100bp、150bp、200bp（目标条带）、250bp、300bp、350bp（主带）；
c. 启动电泳；
d.观察Marker 的200 bp 条带达到在收集孔位置时（约13-14 min），250bp 条带在孔的上边缘，暂停电泳，吸取第二排收集孔内的液体20μl（未扩增文库），收集液体时间应以Marker 位置为准；
6）PCR扩增
a. 室温解冻PCR反应液和引物混合液，震荡混匀10s，瞬时离心5s，使液体离心至管底，放置于冰上；
b. 制备PCR 反应液（冰上），体系如表6所示：
c. 反应体系加好后，震荡混匀10s，瞬时离心5s，使液体离心至管底；
d. 放入PCR 中反应，程序如表7所示：
7）纯化
a. 将上述液体完全转移至一个新的无核酸酶1.5ml离心管中，加入195μl 平衡到室温且充分混匀的DNA纯化磁珠 (约1.5 倍样本体积)，震荡10s，离心5s，室温孵育5 min；
b. 重复步骤2）b–e；
c. 加20μl DNA洗脱液，震荡10s，离心5s，磁吸3 min至液体澄清，吸取全部液体至新的无核酸酶1.5ml离心管中；
8）文库检测
Qubit 方法检测文库浓度：
a. 配置Qubit反应液：根据待测样本数量配置，每份样本取1μl染料至199μl的Qubit工作液混合，震荡10s，离心，染料于低温时会变粘稠，影响试验结果，应室温保存；
b. 取2μl 样本和198μl Qubit反应液充分混匀，避光于室温，不低于20度反应3分钟；
c. 分别取10μl 标准品1和标准品2，各自和190μl Qubit反应液充分混匀，避光室温反应3分钟；
d. 文库检测Qubit方法检测文库浓度，样本3号的文库浓度为：1.2ng/µl；
9）OneTouch，使用 Life Tech 的模板制备试剂盒
根据Qubit检测的文库浓度，稀释文库至2.5pg/µl，用于OneTouch，运行5.5h；
10）PGM（life tech的测序试剂盒）
程序设定中测序Flow数量选择260Flows，参考基因组选择hg19，Ion xpress选择barcode8，318v2芯片测序，运行2.5h。
三、数据分析
1、原始测序数据统计表
表8
2、如图6所示，结果表明该3号样本为正常胚胎且SD>3.5，结果不可信，这一结果与MDA产物检测试剂盒提供的质控结果相符与管家基因提供的检测结果不符。
本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>北京嘉宝仁和医疗科技有限公司
<120>一种单细胞基因组扩增产物质量鉴定的方法和试剂盒
<130> 2015
<160> 20
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 1
ttctgttgaa ggaaagaagg tagg 24
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 2
gtctgatatt ttggtgcacc cattac 26
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 3
acagaagtct gggatgtgga gga 23
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 4
gggcagccca aaaagacaga caga 24
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 5
ccatgttggt caggctgact atg 23
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 6
gattccacat ttatcctcat tgac 24
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 7
tttgtgtgtg catctgtaag catg 24
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 8
gggggtctaa gagcttgtaa aaag 24
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 9
tgtggagtgg aggtgcctaa ag 22
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 10
gtcctaccag aatgccagtc c 21
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 11
ctgggatctc tcccttgggc gtaaa 25
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 12
ttcaggacag tgatgcccca ggaa 24
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 13
gcctgaggct tggtggtgtg tatcc 25
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 14
agtgctggtg aagggtcaca gcca 24
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 15
tggcccagag tgggaggtca ttgt 24
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 16
tgttgcccta tcccatgctg gaga 24
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 17
tgatttgggg tggggtgaat gtga 24
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 18
agtggctcag catgtcaagg ccag 24
<210> 19
<211> 24
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 19
gggaagccca agggcctgat tcta 24
<210> 20
<211> 25
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 20
tcatcccgca gctccagtct tcatc 25

Claims (8)

1.一种单细胞基因组扩增产物质量鉴定的方法，其特征在于，包括以下步骤：
对单细胞进行分离并裂解，得到该单细胞的全基因组DNA；
对全基因组DNA进行单细胞全基因组扩增，得到全基因组扩增产物；
采用5对基因组上保守区段的特异性引物，将其放在一个扩增体系中，以全基因组扩增产物为模板进行PCR扩增，对5个扩增产物进行电泳检测，根据检测结果判断全基因组扩增产物的质量，结果显示为在电泳图上均匀分布条带的3-5个扩增产物为符合测序要求的扩增产物样品；
对符合测序要求的扩增产物构建DNA测序文库；
对所述DNA测序文库进行高通量测序。
2.根据权利要求1所述的单细胞基因组扩增产物质量鉴定的方法，其特征在于，单细胞全基因组的扩增技术为多重置换扩增MDA全基因组扩增技术。
3.根据权利要求2所述的单细胞基因组扩增产物质量鉴定的方法，其特征在于，所述单细胞为人单细胞，基因组上保守区段选自DCTN6、RPL37A、URI1、SNTA1、人13号染色体上位置82722059、SEMA3A、人16号染色体上位置86386387、RAD9A、DIRC3、EIF2B1中的5种或5种以上。
4.根据权利要求3所述的单细胞基因组扩增产物质量鉴定的方法，其特征在于，所述基因组上保守区段的特异性引物序列为：
URI1引物1：TTCTGTTGAAGGAAAGAAGGTAGG，
URI1引物2：GTCTGATATTTTGGTGCACCCATTAC；
chr13_82722059引物1：ACAGAAGTCTGGGATGTGGAGGA，
chr13_82722059引物2：GGGCAGCCCAAAAAGACAGACAGA；
SEMA3A引物1：CCATGTTGGTCAG，
SEMA3A引物2：GATTCCACATTTA；
chr16_86386387引物1：TTTGTGTGTGCATCTGTAAGCATG，
chr16_86386387引物2：GGGGGTCTAAGAGCTTGTAAAAAG；
DIRC3引物1：TGTGGAGTGGAGGTGCCTAAAG，
DIRC3引物2：GTCCTACCAGAATGCCAGTCC；
DCTN6引物1：CTGGGATCTCTCCCTTGGGCGTAAA ，
DCTN6引物2：TTCAGGACAGTGATGCCCCAGGAA；
RPL37A引物1：GCCTGAGGCTTGGTGGTGTGTATCC，
RPL37A引物2：AGTGCTGGTGAAGGGTCACAGCCA；
SNTA1引物1：TGGCCCAGAGTGGGAGGTCATTGT，
SNTA1引物2：TGTTGCCCTATCCCATGCTGGAGA；
RAD9A引物1：TGATTTGGGGTGGGGTGAATGTGA，
RAD9A引物2：AGTGGCTCAGCATGTCAAGGCCAG；
EIF2B1引物1：GGGAAGCCCAAGGGCCTGATTCTA，
EIF2B1引物2：TCATCCCGCAGCTCCAGTCTTCATC。
5.一种单细胞基因组扩增产物质量鉴定的试剂盒，其特征在于，包括所述基因组上保守区段的特异性引物，以对全基因组扩增产物进行基因组上保守区段检测。
6.根据权利要求5所述的单细胞基因组扩增产物质量鉴定的试剂盒，其特征在于，所述单细胞为人单细胞，基因组上保守区段选自DCTN6、RPL37A、URI1、SNTA1、人13号染色体上位置82722059、SEMA3A、人16号染色体上位置86386387、RAD9A、DIRC3、EIF2B1中的5种或多于5种。
7.根据权利要求6所述的单细胞基因组扩增产物质量鉴定的试剂盒，其特征在于，所述基因组上保守区段的特异性引物序列为：
URI1引物1：TTCTGTTGAAGGAAAGAAGGTAGG，
URI1引物2：GTCTGATATTTTGGTGCACCCATTAC；
chr13_82722059引物1：ACAGAAGTCTGGGATGTGGAGGA，
chr13_82722059引物2：GGGCAGCCCAAAAAGACAGACAGA；
SEMA3A引物1：CCATGTTGGTCAG，
SEMA3A引物2：GATTCCACATTTA；
chr16_86386387引物1：TTTGTGTGTGCATCTGTAAGCATG，
chr16_86386387引物2：GGGGGTCTAAGAGCTTGTAAAAAG；
DIRC3引物1：TGTGGAGTGGAGGTGCCTAAAG
DIRC3引物2：GTCCTACCAGAATGCCAGTCC；
DCTN6引物1：CTGGGATCTCTCCCTTGGGCGTAAA，
DCTN6引物2：TTCAGGACAGTGATGCCCCAGGAA；
RPL37A引物1：GCCTGAGGCTTGGTGGTGTGTATCC，
RPL37A引物2：AGTGCTGGTGAAGGGTCACAGCCA；
SNTA1引物1：TGGCCCAGAGTGGGAGGTCATTGT，
SNTA1引物2：TGTTGCCCTATCCCATGCTGGAGA；
RAD9A引物1：TGATTTGGGGTGGGGTGAATGTGA，
RAD9A引物2：AGTGGCTCAGCATGTCAAGGCCAG；
EIF2B1引物1：GGGAAGCCCAAGGGCCTGATTCTA，
EIF2B1引物2：TCATCCCGCAGCTCCAGTCTTCATC。
8.根据权利要求5-7中任一项所述的单细胞基因组扩增产物质量鉴定的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有用于对单细胞进行全基因组扩增的试剂成分，所述单细胞全基因组扩增采用多重置换扩增MDA或DOP-PCR。
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