CN113684266A - 用于单细胞全基因组dna扩增产物质量评价的核酸组合物及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于单细胞全基因组DNA扩增产物质量评价的核酸组合物及方法。本研究发现，LHCGR、TREX1、EVC、MUSK、ABCC8、DAOA、ALDOA和SLC25A1这八个基因可以作为检测单细胞全基因组DNA的扩增产物的质量的靶基因，利用扩增这八个基因的引物对来评价单细胞全基因组DNA的扩增产物的质量，可以提高评价质量的准确率。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及一种用于单细胞全基因组DNA扩增产物质量评价的核酸组合物及方法。
背景技术
胚胎植入前遗传学诊断(Preimplantation genetic diagnosis，PGD)是在体外对胚胎进行遗传学检查，确定胚胎是否携带有遗传缺陷的基因，排除遗传异常胚胎，提高植入成功率，并避免基因缺陷遗传给子代。目前PGD主要集中在胚胎活检，但是由于其是侵入性诊断，可能会对胚胎造成损伤，因而对于新发患者或无先证者家系，采用精子或极体进行PGD检测前预检是一种有效的方式，既可以确定基因变异信息，又可以减少对胚胎造成的损伤。
为了从单精子或极体中最大限度地获取遗传信息，目前利用单细胞全基因组扩增技术(Whole Genome Amplification，WGA)对单精子或极体基因组进行扩增。但由于受到多因素干扰，无法保证细胞全基因组扩增达到100％的成功率，而质量较差的扩增产物会直接影响全面测序结果，降低PGD检测前预检的成功率。因此需要通过评价单细胞全基因组DNA的扩增产物的质量，剔除不合格的样本，避免不合格样本进入下一步测序阶段，减少资源浪费。但是目前评价单细胞全基因组DNA的扩增产物的质量的方法的准确度还比较低。
发明内容
本发明研究发现，LHCGR、TREX1、EVC、MUSK、ABCC8、DAOA、ALDOA和SLC25A1这八个基因可以作为检测单细胞全基因组DNA的扩增产物的质量的靶基因，利用扩增这八个基因的引物对来评价单细胞全基因组DNA扩增产物的质量，可以提高评价质量的准确率。基于此，有必要提供一种LHCGR、TREX1、EVC、MUSK、ABCC8、DAOA、ALDOA和SLC25A1在评价单细胞全基因组DNA扩增产物质量中的应用。
此外，还提供了一种可以提高评价单细胞全基因组DNA扩增产物质量的准确率的核酸组合物，一种准确率高的单细胞全基因组DNA扩增产物质量评价方法和检测试剂盒。
其中一个实施例中，单细胞为生殖细胞或极体。
一种核酸组合物，包括用于扩增LHCGR的引物对、用于扩增TREX1的引物对、用于扩增EVC的引物对、用于扩增MUSK的引物对、用于扩增ABCC8的引物对、用于扩增DAOA的引物对、用于扩增ALDOA的引物对和用于扩增SLC25A1的引物对中的至少六种。
其中一个实施例中，用于扩增LHCGR的引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.1～2所示，用于扩增TREX1的引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.3～4所示，用于扩增EVC的引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.5～6所示，用于扩增MUSK的引物对的核苷酸序列如SEQ IDNo.7～8所示，用于扩增ABCC8的引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.9～10所示，用于扩增DAOA的引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.11～12所示，用于扩增ALDOA的引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.13～14所示，用于扩增SLC25A1的引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.15～16所示。
一种单细胞全基因组DNA扩增产物质量的评价方法，包括以下步骤：
采用上述核酸组合物，利用实时荧光定量PCR扩增单细胞全基因组DNA的扩增产物，并根据扩增结果判断单细胞全基因组DNA的扩增产物是否合格；其中，在核酸组合物中的至少六个扩增引物对有对应的扩增曲线且扩增曲线对应的Ct值小于等于30，及扩增引物对应有单一的熔解曲线峰型且熔解曲线峰型与阳性对照一致时，单细胞的全基因组DNA的扩增产物合格。
其中一个实施例中，单细胞全基因组DNA的扩增产物是单细胞基因组DNA经多重置换扩增(Multiple displacement amplification，MDA)而得到的扩增产物。
其中一个实施例中，单细胞为精子或极体。
一种单细胞全基因组DNA的扩增产物的质量的评价方法，包括以下步骤：
采用上述核酸组合物，扩增单细胞全基因组DNA扩增产物，得到待电泳的扩增产物；及将待电泳的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果判断所述单细胞全基因组DNA的扩增产物是否合格；其中，在核酸组合物中的至少六个扩增产物引物对有对应电泳条带时，单细胞的全基因组DNA扩增产物合格。
一种用于评价单个细胞全基因组DNA扩增产物质量的检测试剂盒，包括上述核酸组合物。
一种用于单细胞基因组DNA测序的试剂盒，包括上述核酸组合物和辅助试剂，辅助试剂包括单细胞全基因组DNA提取试剂和单细胞全基因DNA扩增试剂中的至少一种。
附图说明
图1～8分别为极体1全基因组DNA扩增产物、阳性对照和阴性对照所对应的LHCGR、TREX1、EVC、MUSK、ABCC8、DAOA、ALDOA和SLC25A1引物的qPCR扩增曲线；
图9～16分别为极体1全基因组DNA扩增产物和阳性对照所对应的LHCGR、TREX1、EVC、MUSK、ABCC8、DAOA、ALDOA和SLC25A1引物的熔解曲线。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明研究发现，LHCGR、TREX1、EVC、MUSK、ABCC8、DAOA、ALDOA和SLC25A1这八个基因可以作为检测单细胞全基因组DNA扩增产物质量的靶基因，利用扩增这八个基因的引物对来评价单细胞全基因组DNA扩增产物的质量，可以提高评价质量的准确率。基于此，本申请一实施方式提供一种LHCGR、TREX1、EVC、MUSK、ABCC8、DAOA、ALDOA和SLC25A1在评价单细胞的全基因组DNA的扩增产物的质量中的应用。
具体地，LHCGR是位于人源2号染色体上的保守区段，TREX1是位于人源3号染色体上的保守区段，EVC是位于人源4号染色体上的保守区段，MUSK是位于人源9号染色体上的保守区段，ABCC8是位于人源11号染色体上的保守区段，DAOA是位于人源13号染色体上的保守区段，ALDOA是位于人源16号染色体上的保守区段，SLC25A1是位于人源22号染色体上的保守区段。
在其中一些实施例中，单细胞为生殖细胞或极体。
此外，本申请一实施方式还提供了一种核酸组合物，该核酸组合物包括用于扩增LHCGR的引物对、用于扩增REX1的引物对、用于扩增EVC的引物对、用于扩增MUSK的引物对、用于扩增ABCC8的引物对、用于扩增DAOA的引物对、用于扩增ALDOA的引物对和用于扩增SLC25A1的引物对中的至少六种。
具体地，扩增LHCGR的引物对扩增的是LHCGR的部分区段，该区段的具体位置为2号染色体上的48956152～48956555；扩增REX1的引物对扩增的是REX1的部分区段，该区段的具体位置为3号染色体上的48508102～48508845；扩增EVC的引物对扩增的是EVC的部分区段，该区段的具体位置为4号染色体上的5755303～5755786；扩增MUSK的引物对扩增的是MUSK的部分区段，该区段的具体位置为9号染色体上的113449276～113449475；扩增ABCC8的引物对扩增的是ABCC8的部分区段，该区段的具体位置为11号染色体上的17417090～17417273；扩增DAOA的引物对扩增的是DAOA的部分区段，该区段的具体位置为13号染色体上的106113890～06114214；扩增ALDOA的引物对扩增的是ALDOA的部分区段，该区段的具体位置为16号染色体上的30060465～30060617；扩增SLC25A1的引物对扩增的是SLC25A1的部分区段，该区段的具体位置为22号染色体上的19164197～19164714。
在其中一个实施例中，用于扩增LHCGR的引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.1～2所示。具体地，SEQ ID No.1的核苷酸序列为：5’-TGCCCATCATGGCTCCTATT-3’；SEQ ID No.2的核苷酸序列为：5’-GCCTGCCCAGACCTAGTAAT-3’。可以理解的是，在其他实施例中，用于扩增LHCGR的引物对不限于上述，还可以是其他可以扩增LHCGR的引物对。
在其中一个实施例中，用于扩增REX1的引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.3～4所示。具体地，SEQ ID No.3的核苷酸序列为：5’-TTTCGACATGGACCGGACTG-3’；SEQ ID No.4的核苷酸序列为：5’-AGGCTGGGACTAGTGTTCCT-3’。可以理解的是，在其他实施例中，用于扩增REX1的引物对不限于上述，还可以是其他可以扩增REX1的引物对。
在其中一个实施例中，用于扩增EVC的引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.5～6所示。具体地，SEQ ID No.5的核苷酸序列为：5’-TCTCTCAAGACGTGGAGGCT-3’；SEQ ID No.6的核苷酸序列为：5’-CTGACACATGGGAAGTAGGCA-3’。可以理解的是，在其他实施例中，用于扩增EVC的引物对不限于上述，还可以是其他可以扩增EVC的引物对。
在其中一个实施例中，用于扩增MUSK的引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.7～8所示。具体地，SEQ ID No.7的核苷酸序列为：5’-TCAAGTTTCCTCTCACCTTTATTC-3’；SEQ IDNo.8的核苷酸序列为：5’-GCCATCATCACTGTCTTCCAC-3’。可以理解的是，在其他实施例中，用于扩增MUSK的引物对不限于上述，还可以是其他可以扩增MUSK的引物对。
在其中一个实施例中，用于扩增ABCC8的引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.9～10所示。具体地，SEQ ID No.9的核苷酸序列为：5’-GTGCTCCAGATCTGATAAGGCT-3’；SEQ IDNo.10的核苷酸序列为：5’-CCATGCAGGGCACATCATC-3’。可以理解的是，在其他实施例中，用于扩增ABCC8的引物对不限于上述，还可以是其他可以扩增ABCC8的引物对。
在其中一个实施例中，用于扩增DAOA的引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.11～12所示。具体地，SEQ ID No.11的核苷酸序列为：5’-TGTCTCTTCTAAATGTCCCATTCCT-3’；SEQ IDNo.12的核苷酸序列为：5’-CTGATTCTCTCTGTAGGTGGG-3’。可以理解的是，在其他实施例中，用于扩增DAOA的引物对不限于上述，还可以是其他可以扩增DAOA的引物对。
在其中一个实施例中，用于扩增ALDOA的引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.13～14所示。具体地，SEQ ID No.13的核苷酸序列为：5’-GCATAGTGAGTCCTGTGTT-3’；SEQ IDNo.14的核苷酸序列为：5’-CCTATTCGGACTTCATTCAA-3’。可以理解的是，在其他实施例中，用于扩增ALDOA的引物对不限于上述，还可以是其他可以扩增ALDOA的引物对。
在其中一个实施例中，用于扩增SLC25A1的引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.15～16所示。具体地，SEQ ID No.15的核苷酸序列为：5’-CCCCTGTTGGGTGGATATAGAG-3’；SEQID No.16的核苷酸序列为：5’-AAGTTCATCCACGACCAGACC-3’。可以理解的是，在其他实施例中，用于扩增SLC25A1的引物对不限于上述，还可以是其他可以扩增SLC25A1的引物对。
在其中一个实施例中，核酸组合物包括用于扩增LHCGR的引物对、用于扩增REX1的引物对、用于扩增EVC的引物对、用于扩增MUSK的引物对、用于扩增ABCC8的引物对、用于扩增DAOA的引物对、用于扩增ALDOA的引物对和用于扩增SLC25A1的引物对；用于扩增LHCGR的引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.1～2所示，用于扩增TREX1的引物对的核苷酸序列如SEQID No.3～4所示，所述用于扩增EVC的引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.5～6所示，所述用于扩增MUSK的引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.7～8所示，所述用于扩增ABCC8的引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.9～10所示，所述用于扩增DAOA的引物对的核苷酸序列如SEQID No.11～12所示，所述用于扩增ALDOA的引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.13～14所示，所述用于扩增SLC25A1的引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.15～16所示。通过将上述核酸组合物设置为这八对引物对可以提高评价单细胞全基因组DNA扩增产物质量的准确率。
上述核酸组合物包括用于扩增LHCGR、TREX1、EVC、MUSK、ABCC8、DAOA、ALDOA和SLC25A1的引物对。上述核酸组合物可以提高评价单细胞全基因组DNA扩增产物质量的准确率。
此外，本申请一实施方式还提供一种单细胞全基因组DNA扩增产物质量的评价方法，该评价方法包括以下步骤：采用上述核酸组合物，利用实时荧光定量PCR扩增单细胞全基因组DNA的扩增产物，并根据扩增结果判断单细胞全基因组DNA的扩增产物是否合格；其中，核酸组合物中至少六对扩增引物对有对应的扩增曲线且扩增曲线对应的Ct值小于等于30，及扩增引物对应有单一的熔解曲线峰型且熔解曲线峰型与阳性对照一致时，单细胞的全基因组DNA的扩增产物合格。
在其中一个实施例中，单细胞全基因组DNA扩增产物是单细胞基因组DNA经多重置换扩增(Multiple displacement amplification，MDA)而得到的扩增产物。
在其中一个实施例中，单细胞为精子或极体。
上述单细胞全基因组DNA扩增产物质量的评价方法，是通过qPCR进行，通过对qPCR结果中扩增曲线的监测，能够直接反映该引物对应的靶基因在qPCR扩增过程中是否有被扩增；通过对Ct值监测，能够判断样本中该引物对应的靶基因扩增产物的浓度是否正常；通过对熔解曲线的监测，能够判断该引物的扩增产物是否是唯一及扩增过程有无异常。这三个指标结合能够反映该引物对应的靶基因在qPCR中的扩增质量如何，从而能推断出原样本的扩增产物质量如何。质量合格的样本才能进入下一步进行文库构建和测序，进行遗传学分析。
此外，本申请一实施方式还提供了另一种单细胞全基因组DNA扩增产物质量的评价方法，该方法包括以下步骤：采用上述核酸组合物，扩增单细胞全基因组DNA的扩增产物，得到待电泳检测的扩增产物；及将待电泳的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果判断所述单细胞全基因组DNA扩增产物是否合格；其中，在核酸组合物中的至少六个扩增产物引物对有对应电泳条带时，单细胞的全基因组DNA的扩增产物合格。
上述单细胞全基因组DNA扩增产物质量的评价方法，是通过普通PCR对单细胞全基因组DNA的扩增产物进行扩增，在通过对PCR扩增产物进行电泳，观察引物对应的靶基因的电泳条带的有无可知该靶基因在原扩增产物中是否被覆盖到，反映出全基因组DNA的扩增产物质量。
此外，本申请一实施方式还提供一种单细胞全基因组DNA测序方法，该方法包括以下步骤：裂解单细胞，获得单细胞全基因组DNA；以单细胞全基因组DNA为模板扩增，获得单细胞全基因组DNA的扩增产物；采用上述单细胞全基因组DNA扩增产物质量的评价方法评价单细胞全基因组DNA扩增产物的质量，获得合格的单细胞全基因组DNA的扩增产物；将合格的单细胞全基因组DNA的扩增产物构建文库并测序。
此外，本申请一实施方式还提供一种用于评价单细胞全基因组DNA扩增产物质量的检测试剂盒，该检测试剂盒包括上述核酸组合物。
在其中一个实施例中，单细胞为生殖细胞或极体。该检测试剂盒可以应用于胚胎植入前遗传学诊断，用于减少测序成本。
上述用于评价单细胞全基因组DNA扩增产物质量的检测试剂盒，利用了LHCGR、TREX1、EVC、MUSK、ABCC8、DAOA、ALDOA和SLC25A1在评价单细胞全基因组DNA的扩增产物的质量中的应用，能够实现对单个细胞全基因组DNA扩增产物的质量的评价，并且准确率高。
此外，本申请一实施方式还提供一种用于单细胞基因组DNA测序的试剂盒，包括上述核酸组合物和辅助试剂，辅助试剂包括单细胞全基因组DNA提取试剂和单细胞全基因DNA扩增试剂中的至少一种。
上述用于单细胞基因组DNA测序的试剂盒包括上述核酸组合物，具有上述核酸组合物相应的优点。
具体实施例
以下结合具体实施例进行详细说明。以下实施例如未特殊说明，则不包括除不可避免的杂质外的其他组分。实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者生产厂家推荐的方法实现。
实施例1
1.取样
采用由合作医院提供的精液和废弃极体。将采集到的来自同一人的精液，采用非连续密度梯度离心法进行洗涤，洗涤后的精子转移至含有1mL精子冲洗培养液(CooperSurgical，产品型号：ART-1005)的15mL离心管中。显微操作挑取单个精子、分取极体，分别命名为单精子1～12及极体1～2，每个样本分别放至2μL含有PBS缓冲液的PCR管底部，立即于-80℃保存，避免反复冻融。
2.采用QIAGEN REPLI-g Single Cell Kit对单个精子和极体进行全基因组扩增，具体方法如下：
(1)裂解
1)准备DLB buffer：首次使用时加入500μL的无核酸酶水，充分混合并短暂离心。
2)配制Buffer D1：33μL DLB Buffer加上3μL DTT；该体积可满足12次反应，若一次实验未完全用完，可于-20℃保存3个月。
3)配制Buffer D2：用试剂盒提供的PBS将Buffer D1体积补足为4μL，得到BufferD2。
4)向在上述取样步骤中得到的有单个精子或极体的PCR管中加入3μL Buffer D2，小心轻弹管壁混匀，瞬时离心。
5)上述步骤4)中的PCR管置于65℃孵育10min(PCR仪热盖使用105℃)。
6)向上述孵育完成的样品中加入3μL Stop Solution，小心轻弹管壁混匀，瞬时离心，置于冰盒上。
(2)等温扩增
1)取出REPLI-g sc Reaction Buffer、无核酸酶水置于室温，融化后涡旋混匀，瞬时离心，取出REPLI-g sc DNA Polymerase置于冰盒上。
2)根据表1配制反应混合液，当加入无核酸酶水和REPLI-g sc Reaction Buffer后，涡旋混匀，瞬时离心，然后再加入REPLI-g sc DNA Polymerase。配制好的反应混合液放置冰上并立即使用。
表1
| 组分 | 体积(μL) |
| 无核酸酶水 | 9 |
| REPLI-g sc Reaction Buffer | 29 |
| REPLI-g sc DNA Polymerase | 2 |
| 总体积 | 40 |
3)将上述混合好的40μL反应混合液加入到经过裂解变性的样本管中。
4)设置PCR仪反应程序，按照表2条件进行孵育，得到单精子和极体全基因组DNA的扩增产物：
表2
3.采用实时荧光定量PCR(qPCR)对上述步骤2中得到的单精子和极体全基因组DNA的扩增产物分别进行扩增，扩增所需酶、Buffer和染料选用KAPA SYBR FAST qPCR Kits(Roche)试剂盒，具体步骤如下：
(1)将单精子或极体扩增产物用无核酸酶水稀释10倍，作为qPCR反应模板；选用外周血基因组DNA作为阳性对照；将无核酸酶水作为阴性对照。
(2)按照表3配制qPCR反应体系，引物组中的每对引物单独为一个扩增体系，引物对序列如表4所示：
表3
| 试剂名称 | 使用量 |
| KAPA SYBR Mix 2× | 10μL |
| 模板DNA | 2μL |
| F引物 | 3μL |
| R引物 | 3μL |
| High Rox | 0.4μL |
| ddH<sub>2</sub>O | 1.6μL |
| 总体积 | 20μL |
表4
(3)按照表5参数进行qPCR扩增：
表5
4.结果及判断：
qPCR结果如图1～图16及表6所示，其中：
图1～图8所示为极体1全基因组DNA扩增产物的qPCR扩增曲线结果。在图1～图8中，极体1全基因组DNA的扩增产物的扩增曲线对应于标号2的曲线，阳性对照的扩增曲线对应于标号为1的曲线，阴性对照的扩增曲线对应于标号为3的曲线。由图1～图8可知，极体1全基因组DNA的扩增产物所对应的八对引物均有扩增曲线。
图9～图16为极体1全基因组DNA扩增产物的qPCR熔解曲线结果。在图9～图16中，极体1全基因组DNA的熔解曲线对应标号2的曲线，阳性对照的熔解曲线对应于标号为1的曲线，阴性对照的熔解曲线对应于标号为3的曲线。图9～图16所示的熔解曲线表明，八对引物对所对应的极体1扩增产物的熔解曲线均是单一峰型且与阳性对照一致。
表6为单精子和极体全基因组DNA扩增产物对应的各引物对qPCR的Ct值及Tm值统计结果。由表6可知，极体1扩增产物所对应的八对引物的Ct值均小于30。
综上，极体1全基因组DNA的扩增产物合格。
表6
根据表6对其他样本均根据此方法对其扩增产物质量进行判断，即核酸组合物中至少六对扩增引物对有对应的扩增曲线且扩增曲线对应的Ct值小于等于30及扩增引物对应有单一的熔解曲线峰型且熔解曲线峰型与阳性对照一致，则判断该样本的扩增产物质量合格。结果表明：在本次实验中，用以试验的单精子1～12和极体1～2中，其中，单精子1、单精子3、单精子4、单精子5、单精子6、单精子7、单精子8、单精子9、单精子10、极体1和极体2扩增产物质量合格。
5.测序及单体型构建：
(1)DNA文库构建及测序：采用Ion AmpliSeqTM Library Kit 2.0对合格样本的扩增产物进行多重PCR文库构建，所构建文库采用DA8600进行上机测序，测序质控数据如表7所示。其中，覆盖度(coverage)说明可捕获到的SNP位点比例，Frac_100X表示测序深度大于100X的SNP位点比例。
表7
(2)构建单体型：对以上测序完成的单精子进行单体型构建，通过变异位点上下游1M范围内SNP位点连锁分析，共检测到56个用于构建男女双方单体型的SNP位点，以上扩增产物质量评价合格的单精子均成功构建单体型。所构建的单体型如表8所示：
表8
注：“MISS”代表该位点漏检，“CC”、“GT”和“CTA”是由于碱基的插入或缺失造成的，即等位基因上碱基的一对多或多对一。
对比例1
本对比例与实施例1的步骤相同，采用的样本有所不同，其不同在于：步骤5中对步骤4中不合格的样本(单精子2、单精子11和单精子12)进行测序和单体型构建，测序质控结果如表9所示，单体型构建结果如表10所示。
表9
表10
注：“MISS”代表该位点漏检，“CC”、“GT”和“CTA”是由于碱基的插入或缺失造成的，即等位基因上碱基的一对多或多对一。
对比例2
本对比例与实施例1的步骤大致相同，其不同在于：无实施例1中的步骤3和4；对比例1中样本DNA扩增产物测序质控结果如表11所示：
表11
| 样本名称 | Raw_reads | Mapped_reads | mean_DP | coverage | capture_rate | Frac_30X | Frac_100X |
| 男方 | 3208332 | 3195143 | 23493.53 | 1 | 0.7314 | 1 | 0.9997 |
| 女方 | 3185364 | 3171730 | 23128.08 | 1 | 0.7312 | 1 | 0.9995 |
| 单精子21 | 3071743 | 3057384 | 7712.61 | 0.1689 | 0.2909 | 0.0623 | 0.0392 |
| 单精子22 | 3234180 | 3216517 | 16287.36 | 0.2994 | 0.5368 | 0.155 | 0.1097 |
| 单精子23 | 3985407 | 3963836 | 25660.62 | 0.427 | 0.6489 | 0.2646 | 0.2449 |
| 单精子24 | 2941109 | 2919277 | 18185.97 | 0.1633 | 0.6417 | 0.0869 | 0.0626 |
| 单精子25 | 2798494 | 2788140 | 12757.16 | 0.1652 | 0.4707 | 0.0672 | 0.0597 |
| 单精子26 | 2820574 | 2810524 | 18389.61 | 0.2035 | 0.6531 | 0.1022 | 0.0724 |
| 单精子27 | 2959179 | 2948781 | 8216.12 | 0.3195 | 0.2848 | 0.1252 | 0.0768 |
| 单精子28 | 3173426 | 3151637 | 10702.05 | 0.2267 | 0.4079 | 0.1149 | 0.083 |
| 单精子29 | 2431629 | 2427267 | 15061.16 | 0.1941 | 0.596 | 0.0641 | 0.0383 |
| 单精子30 | 2630311 | 2622491 | 14073.67 | 0.5439 | 0.5561 | 0.2634 | 0.2102 |
| 单精子31 | 2261250 | 2250520 | 8504.28 | 0.5652 | 0.4134 | 0.0941 | 0.0728 |
| 单精子32 | 3071743 | 3057384 | 7712.61 | 0.1689 | 0.2909 | 0.0623 | 0.0392 |
| 单精子34 | 2445548 | 2437477 | 16967.67 | 1.0000 | 0.6966 | 0.9678 | 0.9419 |
| 单精子35 | 2485999 | 2477101 | 16108.69 | 0.9283 | 0.6625 | 0.8501 | 0.7721 |
| 单精子36 | 2343328 | 2336797 | 13551.46 | 0.8460 | 0.5963 | 0.6111 | 0.4650 |
对比例3
本对比例与实施例1的步骤大致相同，其不同在于：无实施例1中的步骤3和4；对比例2中样本DNA扩增产物测序质控结果如表12所示：
表12
从表7和表8中可知，实施例1中通过本发明的方法进行了全基因组DNA的扩增产物的质量评价后筛选出的合格样本，测序深度大于100X的SNP位点比例平均值为0.87，coverage的平均值为0.97，一般情况下能满足构建单体型的要求。结合表8的单体型构建结果可知，筛选出的合格的单精子构建的单体型，均满足致病位点上下游附近各至少需要2个有效SNP位点的要求，可用于后续的遗传连锁分析检测。此外，不同的单精子所构建的单体型一致，相互验证了构建的单体型的准确性。经过本发明的方法筛选出的合格样本单体型构建成功率为100％。
从表9和表10中可知，对比例1中，通过本发明的方法筛选出的不合格的样本，测序深度大于100X的SNP位点比例平均值为0.25，coverage的平均值为0.61，与男女双方的gDNA的Frac_100X值和coverage值相差太远，结合表10可知，用这三个不合格的样本构建出的单体型无法满足致病位点上下游附近各至少需要2个有效SNP位点的要求，不可用于后续的遗传连锁分析检测。经过本发明的方法筛选出的不合格样本单体型构建成功率为0。
上述结果说明LHCGR、TREX1、EVC、MUSK、ABCC8、DAOA、ALDOA和SLC25A1在评价单细胞全基因组DNA的扩增产物的质量中的应用的准确度很高。
此外，从表11中可知，对比例2中，未经本发明的方法筛选的样本中测序深度大于100X的SNP位点比例平均值只有0.38，coverage平均值只有0.41，相比较于男女双方的gDNA的Frac_100X值和coverage值严重偏低。一般难以用于单体型构建，即使能构建出单体型也难以满足后续遗传连锁分析，各样本之间构建出的单体型也无法相互验证。
从表12中可知，对比例3中，未经本发明的方法筛选的样本中测序深度大于100X的SNP位点比例平均值只有0.54，coverage平均值只有0.85，不是所有样本都能满足构建单体型的要求，且有些样本Frac_100X值和coverage值都很低，如单精子52、单精子53和单精子54，与男女双方的gDNA的Frac_100X值和coverage值相差太大，难以满足后续遗传连锁分析。
显然，如果对全基因组DNA的扩增产物的质量不经过筛选即进行测序及后续遗传分析，会大量浪费测序及遗传分析的资源，浪费时间。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。
序列表
<110> 苏州贝康医疗器械有限公司
<120> 用于单细胞全基因组DNA扩增产物质量评价的核酸组合物及方法
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgcccatcat ggctcctatt 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcctgcccag acctagtaat 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tttcgacatg gaccggactg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aggctgggac tagtgttcct 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tctctcaaga cgtggaggct 20
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctgacacatg ggaagtaggc a 21
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tcaagtttcc tctcaccttt attc 24
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gccatcatca ctgtcttcca c 21
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gtgctccaga tctgataagg ct 22
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ccatgcaggg cacatcatc 19
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tgtctcttct aaatgtccca ttcct 25
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ctgattctct ctgtaggtgg g 21
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gcatagtgag tcctgtgtt 19
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cctattcgga cttcattcaa 20
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cccctgttgg gtggatatag ag 22
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
aagttcatcc acgaccagac c 21
Claims (10)
1.LHCGR、TREX1、EVC、MUSK、ABCC8、DAOA、ALDOA和SLC25A1在评价单细胞全基因组DNA的扩增产物的质量中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述单细胞为生殖细胞或极体。
3.一种核酸组合物，其特征在于，包括用于扩增LHCGR的引物对、用于扩增TREX1的引物对、用于扩增EVC的引物对、用于扩增MUSK的引物对、用于扩增ABCC8的引物对、用于扩增DAOA的引物对、用于扩增ALDOA的引物对和用于扩增SLC25A1的引物对中的至少六种。
4.根据权利要求3所述的核酸组合物，其特征在于，所述用于扩增LHCGR的引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.1～2所示，所述用于扩增TREX1的引物对的核苷酸序列如SEQ IDNo.3～4所示，所述用于扩增EVC的引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.5～6所示，所述用于扩增MUSK的引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.7～8所示，所述用于扩增ABCC8的引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.9～10所示，所述用于扩增DAOA的引物对的核苷酸序列如SEQ IDNo.11～12所示，所述用于扩增ALDOA的引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.13～14所示，所述用于扩增SLC25A1的引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.15～16所示。
5.一种单细胞全基因组DNA的扩增产物的质量的评价方法，其特征在于，包括以下步骤：
采用权利要求3～4任一项所述的核酸组合物，利用实时荧光定量PCR扩增单细胞全基因组DNA的扩增产物，并根据扩增结果判断所述单细胞全基因组DNA的扩增产物是否合格；其中，所述核酸组合物中至少六对扩增引物对有对应的扩增曲线且扩增曲线对应的Ct值小于等于30，及所述扩增引物对应有单一的熔解曲线峰型且熔解曲线峰型与阳性对照一致时，所述单细胞的全基因组DNA的扩增产物合格。
6.根据权利要求5所述的评价方法，其特征在于，所述单细胞全基因组DNA的扩增产物是单细胞基因组DNA经多重置换扩增而得到的扩增产物。
7.根据权利要求5～6任一项所述的评价方法，其特征在于，所述单细胞为精子或极体。
8.一种单细胞全基因组DNA的扩增产物的质量的评价方法，其特征在于，包括以下步骤：
采用权利要求3～4任一项所述的核酸组合物，扩增单细胞全基因组DNA的扩增产物，得到待电泳的扩增产物；及将所述待电泳的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，并根据电泳结果判断所述单细胞全基因组DNA的扩增产物是否合格；其中，在所述核酸组合物中的至少六对扩增产物引物对有对应电泳条带时，所述单细胞的全基因组DNA的扩增产物合格。
9.一种用于评价单细胞全基因组DNA扩增产物质量的检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求3～4任一项所述的核酸组合物。
10.一种用于单细胞基因组DNA测序的试剂盒，其特征在于，包括权利要求3～4任一项所述的核酸组合物和辅助试剂，所述辅助试剂包括单细胞全基因组DNA提取试剂和单细胞全基因DNA扩增试剂中的至少一种。
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Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102533960A (zh) * | 2010-12-31 | 2012-07-04 | 深圳华大基因科技有限公司 | 一种单细胞基因组分析方法及试剂盒 |
| CN104762405A (zh) * | 2015-04-22 | 2015-07-08 | 北京嘉宝仁和医疗科技有限公司 | 一种单细胞基因组扩增后扩增产物质量鉴定的方法和试剂盒 |
| US20150299753A1 (en) * | 2012-03-30 | 2015-10-22 | Bgi Tech Solutions Co., Ltd. | Whole genome amplification method and application thereof |
| CN106591447A (zh) * | 2016-12-09 | 2017-04-26 | 上海美吉医学检验有限公司 | 一种单细胞全基因组的测序方法 |
| CN112662748A (zh) * | 2019-10-15 | 2021-04-16 | 骏实生物科技(上海)有限公司 | 用于单细胞dna测序文库质量鉴定的引物对组合、方法和试剂盒 |
-
2021
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Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102533960A (zh) * | 2010-12-31 | 2012-07-04 | 深圳华大基因科技有限公司 | 一种单细胞基因组分析方法及试剂盒 |
| US20150299753A1 (en) * | 2012-03-30 | 2015-10-22 | Bgi Tech Solutions Co., Ltd. | Whole genome amplification method and application thereof |
| CN104762405A (zh) * | 2015-04-22 | 2015-07-08 | 北京嘉宝仁和医疗科技有限公司 | 一种单细胞基因组扩增后扩增产物质量鉴定的方法和试剂盒 |
| CN106591447A (zh) * | 2016-12-09 | 2017-04-26 | 上海美吉医学检验有限公司 | 一种单细胞全基因组的测序方法 |
| CN112662748A (zh) * | 2019-10-15 | 2021-04-16 | 骏实生物科技(上海)有限公司 | 用于单细胞dna测序文库质量鉴定的引物对组合、方法和试剂盒 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| CHRISTIANE BÄUMER等: "Exploring DNA quality of single cells for genome analysis with simultaneous whole-genome amplification", 《SCI REP .》, vol. 8, no. 1, pages 7476 * |
| 潘星华等: "单细胞基因组学分析的技术前沿", 《遗传》, vol. 33, no. 1, pages 17 - 24 * |
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