CN110699447B - miRNA分子标志物及其在显微取精手术预判中的应用 - Google Patents
miRNA分子标志物及其在显微取精手术预判中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一组miRNA分子标志物及其在显微取精手术预判中的应用。所述miRNA分子标志物包括miR‑34b‑3p、miR‑34c‑3p、miR‑3065‑3p和miR‑4446‑3p。通过本发明筛选得到的标志物及相关引物组成的试剂盒，可以实现对显微取精手术结果进行预判，避免对无精患者进行不必要的创伤性检测及手术，节省资源，提高效率，同时也可以给手术医生重要的术前参考，提高手术成功率，并且完全没有创伤性，操作及其简单方便。
Description
技术领域
本发明属于医学检验技术领域，具体涉及一组miRNA分子标志物及其在显微取精手术预判中的应用。
背景技术
不孕不育约占育龄人口15％，其中男性因素占50％，无精子症占10％。目前解决无精症患者生育问题的唯一手段就是显微取精手术，但是手术取精成功率与睾丸内是否有生精密切相关，而如何判断睾丸内部生精的状态目前唯一手段就是睾丸穿刺活检，然而这一方法一则是有创检验，对身体有一定伤害性，二则由于睾丸内部有局灶生精的特点，穿刺活检获得的部位无法代表整个睾丸。
为了提高显微取精手术的成功率，同时减少不必要的手术与穿刺，需要建立无创分子检验的方法，解决目前临床上对于显微取精手术结局无法进行预判的问题。
发明内容
本发明为了解决目前临床上对于显微取精手术结局无法进行预判的技术问题，提出了一组miRNA分子标志物，通过将该组miRNA分子标志物用于设计试剂盒，并建立模型方程，可以得到显微取精手术成功率预判概率，从而提高显微取精的手术成功率，并减少不必要的手术和穿刺创伤。
一组用于判断显微取精手术成功率的miRNA分子标志物，该标志物包括miR-34b-3p、miR-34c-3p、miR-3065-3p和miR-4446-3p。
上述miRNA分子标志物在制备用于判断显微取精手术成功率试剂盒中的应用。
用于检测上述miRNA分子标志物的引物对，具体如下：
对miR-34b-3p来说，上游引物序列如SEQ ID NO.9所示，下游引物为通用引物，序列如SEQ ID NO.13所示；
对miR-34c-3p来说，上游引物序列如SEQ ID NO.10所示，下游引物为通用引物，序列如SEQ ID NO.13所示；
对miR-3065-3p来说，上游引物序列如SEQ ID NO.11所示，下游引物为通用引物，序列如SEQ ID NO.13所示；
对miR-4446-3p来说，上游引物序列如SEQ ID NO.12所示，下游引物为通用引物，序列如SEQ ID NO.13所示。
上述引物对在制备用于判断显微取精手术成功率试剂盒中的应用。
一种用于判断显微取精手术成功率的试剂盒，包含上述引物对。
进一步地，还包括PCR技术常用的试剂和免疫组化技术常用的试剂。
有益效果：通过本发明筛选得到的标志物及相关引物组成的试剂盒，可以实现对显微取精手术结果进行预判，避免对无精患者进行不必要的创伤性检测及手术，节省资源，提高效率，同时也可以给手术医生重要的术前参考，提高手术成功率，并且完全没有创伤性，操作及其简单方便。
附图说明
图1为实施例2中40个样本的qPCR结果。
图2为实施例2中四种miRNA的相互关联性结果。
图3为实施例2中四种miRNA表达水平在预测生精功能中准确性的ROC曲线分析。
具体实施方式
本发明的技术方案通过一系列实验以及临床验证而实现。具体地：首先，通过精浆微小RNA(miRNA)基因测序寻找到可以区分睾丸内部有/无生精的分子标志物，其中有四个miRNA可以作为稳定而准确的分子标志物，即mir-34b、mir-34c、mir-3065、mir-4446；其次，在临床中收集大量患者标本，进行上述四个miRNA分子标志物的qPCR验证实验，并进行机器学习，最终建立方程模型，即miRNA panel；最后，利用四个miRNA分子标志物和设计的引物进行了双盲测试，对显微取精手术成功率的预判概率进行验证。双盲测试的具体实验过程为：提取患者精浆miRNA，用试剂盒中的特异性茎环引物进行逆转录，之后用试剂盒中的预扩增引物进行预扩增实验(pre-PCR)，之后用特异性探针进行多重数字PCR反应(multiplexddPCR)，得到相应荧光值并代入模型方程内，得到概率值，此概率值即为显微取精手术成功率预判概率。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到，未详细描述的技术均按照本领域人员熟知的标准方法进行。本申请中提及的试剂等均有商品供应或以别的途径能为公众所得，它们仅作为举例，对本发明不是唯一的。可分别用其它适合的工具或生物材料来替代。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1
miRNA分子标志物的筛选。通过精浆微小RNA(miRNA)基因测序寻找到可以区分睾丸内部有/无生精的分子标志物，具体过程如下：
正常生育力精浆样本6例，无精症患者显微取精获精样本6例，无精症患者显微取精无法获精样本6例，各取精浆500微升，抽提精浆全部小RNA(使用试剂盒为赛默飞公司mirVanaTM miRNA Isolation Kit，货号AM1561)(小于200nt的全部小RNA)，建立测序文库，BGI-500测序仪进行UMI绝对定量小RNA测序，测序数据与人类miRNA数据库进行比对分析，鉴定三组人群精浆差异表达的全部miRNA(共80个)。通过表达量分析、表达丰度分析以及实验验证，最终确定4个稳定表达的差异miRNA(mir-34b，mir-34c，mir-3065，mir-4446)作为最终分子标志物。
上述4个miRNA标志物的核苷酸序列为：
mir-34b CAATCACTAACTCCACTGCCAT(SEQ ID NO.1)；
mir-34c AATCACTAACCACACGGCCAGG(SEQ ID NO.2)；
mir-3065TCAGCA CCAGGATATTGTTGGAG(SEQ ID NO.3)；
mir-4446CAGGGCTGGCAGTGACATGGGT(SEQ ID NO.4)。
实施例2
利用miRNA分子标志物对显微取精手术进行预判
1、建立miRNA panel
共收集40例标本(正常生育力6例，无精症显微取精获精样本12例，无精症患者无法获精样本22例)，提取小RNA，用特异性茎环引物进行逆转录，进行以上四个miRNA的实时定量PCR扩增，实验结果使用R进行有序逻辑回归分析，建立机器学习模型，最终获得miRNApanel。
各样本取5微升miRNA，加1微升混合茎环引物(浓度50nM)，2微升5X逆转录buffer，1微升逆转录酶，1微升无核酸酶水，共10微升体系。PCR仪设置如下：16℃30分钟；60个循环的20℃30s，42℃30s，50℃1s；85℃，5min。逆转录产物取5微升进行预扩增PCR(pre-PCR)反应，具体过程如下：1微升正向引物混合物(浓度50pm)，0.5微升反向引物(浓度100pm)，12.5微升Q5高保真PCR混合酶(NEB公司)，无核酸酶水补齐至25微升。PCR仪设置条件为：98℃30s；12个循环的98℃10s，68℃30s，72℃30s；72℃，5min。
预扩增产物稀释25倍后进行qPCR扩增，具体实验过程为：取1微升稀释后的预扩增产物，1微升10pm正向引物，1微升10pm反向引物，1微升10pm探针，10微升2X探针PCR试剂(TAKARA)，无核酸酶水补齐至20微升。qPCR仪设置程序为：95℃30s；40个循环的95℃10s；60℃1min。
特异性茎环引物序列如下：
PCR扩增引物序列如下：
特异性探针扩增引物序列如下：
得到的CT值数据输入R，进行ordered logistic regression分析，40个数据分为training和test两组进行机器学习，得到方程(miRNA panel)
所得miRNA panel如下所示：
2、在40例临床样本中进行了双盲测试，提取患者精浆miRNA，参照上述实验过程，用特异性茎环引物进行逆转录，之后用预扩增引物进行预扩增实验(pre-PCR)，然后用特异性探针进行多重数字PCR反应(multiplex ddPCR)，得到相应荧光值并代入上述模型方程内，得到概率值，此概率值即为显微取精手术成功率预判概率。
本实施例在40例临床样本中进行了双盲测试，即实验人员事先不知临床标本类型(有精/无精)，按照试剂盒标准操作对40例样本进行检测并得出结果：20例为无精患者，14例为有精患者，6例为正常生育力人群。而该40例样本临床医生显微取精手术结果为：22例无精患者，12例有精患者，6例为正常生育力人群。
实验结果如图1-3所示。
图1为40个样本的qPCR结果，F1-F6为正常生育力样本，E1-E12为无精症患者显微取精获精样本，N1-N22为无精症患者显微取精未获精样本。颜色不同代表四种miRNA表达量由高到低，根据表达量可以区分各样本。
图2为四种miRNA之间相互关联性。Var1-4分别代表mir-34b、mir-34c、mir-3065、mir-4446，其中mir-34b与mir-34c相关系数为0.61，且都倾向于在有生精标本内高表达，即，如果该两个小RNA高表达，则证明患者睾丸内有生精，显微取精获精率很高；mir-3065与mir-4446相关系数为0.75，且都倾向于在无生精标本内高表达，即，如果该两个小RNA高表达，则证明患者睾丸内无生精，显微取精获精率很低。
图3为ROC曲线，用以评判每种小RNA在预测生精功能中的准确性。曲线越靠近左上角，则预测准确率越高。坐标轴横轴代表假阳性率，纵轴代表真阳性率。
将所得实验结果与临床医生显微取精手术结果相比对，无精症患者识别率为100％，无精症患者误判率为14％。即通过试剂盒检测出的无精症患者与临床手术结果吻合率100％，但是存在2例误判，不排除临床医生手术技术问题。该结果证明，通过术前试剂盒检测，可以避免无精患者进行不必要的创伤性检测及手术，节省资源，提高效率，同时也可以给手术医生重要的术前参考，提高手术成功率，并且完全没有创伤性，操作及其简单方便。
序列表
<110> 南通大学
<120> miRNA分子标志物及其在显微取精手术预判中的应用
<130> 20191113
<160> 17
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
caatcactaa ctccactgcc at 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aatcactaac cacacggcca gg 22
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tcagcaccag gatattgttg gag 23
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cagggctggc agtgacatgg gt 22
<210> 5
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ctcaactggt gtcgtggagt cggcaattca gttgagatgg cagt 44
<210> 6
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctcaactggt gtcgtggagt cggcaattca gttgagcctg gccg 44
<210> 7
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ctcaactggt gtcgtggagt cggcaattca gttgagctcc aaca 44
<210> 8
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ctcaactggt gtcgtggagt cggcaattca gttgagaccc atgt 44
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
acactccagc tatacaatca ctaact 26
<210> 10
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
acactccagc tataaatcac taacca 26
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
acactccagc tatatcagca ccagg 25
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
acactccagc tatacagggc tggc 24
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ctcaactggt gtcgtggagt c 21
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cagttgagcc tggccgtg 18
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cagttgagat ggcagtggag t 21
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
cagttgagcc caacaatatc ctgg 24
<210> 17
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
cagttgagac ccagtcactg cca 23
Claims (3)
1.用于检测miR-34b-3p、miR-34c-3p、miR-3065-3p和miR-4446-3p的引物对组在制备用于判断显微取精手术成功率试剂盒中的应用，所述引物对组如下：
对miR-34b-3p来说，上游引物序列如SEQ ID NO.9所示，下游引物为通用引物，序列如SEQ ID NO.13 所示；
对miR-34c-3p来说，上游引物序列如SEQ ID NO.10所示，下游引物为通用引物，序列如SEQ ID NO.13 所示；
对miR-3065-3p来说，上游引物序列如SEQ ID NO.11所示，下游引物为通用引物，序列如SEQ ID NO.13 所示；
对miR-4446-3p来说，上游引物序列如SEQ ID NO.12所示，下游引物为通用引物，序列如SEQ ID NO.13 所示。
2.一种用于判断显微取精手术成功率的试剂盒，其特征在于：包含用于检测miR-34b-3p、miR-34c-3p、miR-3065-3p和miR-4446-3p的引物对组，所述引物对组如下：
对miR-34b-3p来说，上游引物序列如SEQ ID NO.9所示，下游引物为通用引物，序列如SEQ ID NO.13 所示；
对miR-34c-3p来说，上游引物序列如SEQ ID NO.10所示，下游引物为通用引物，序列如SEQ ID NO.13 所示；
对miR-3065-3p来说，上游引物序列如SEQ ID NO.11所示，下游引物为通用引物，序列如SEQ ID NO.13 所示；
对miR-4446-3p来说，上游引物序列如SEQ ID NO.12所示，下游引物为通用引物，序列如SEQ ID NO.13 所示。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：还包括逆转录茎环引物、探针、PCR技术常用的试剂和免疫组化技术常用的试剂。
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