CN108103052B

CN108103052B - 提高基因组覆盖度的单细胞全基因组扩增及文库构建方法

Info

Publication number: CN108103052B
Application number: CN201611050351.9A
Authority: CN
Inventors: 梁峻彬; 张超; 洪燕; 刘涛; 玄兆伶; 李大为; 陈重建
Original assignee: Annoroad Yiwu Medical Inspection Co ltd; Anouta Gene Technology Beijing Co ltd; Zhejiang Annoroad Biotechnology Co ltd
Current assignee: Annoroad Yiwu Medical Inspection Co ltd; Anouta Gene Technology Beijing Co ltd; Zhejiang Annoroad Biotechnology Co ltd
Priority date: 2016-11-24
Filing date: 2016-11-24
Publication date: 2021-05-07
Anticipated expiration: 2036-11-24
Also published as: CN108103052A

Abstract

本发明提供一种提高基因组覆盖度的单细胞全基因组扩增及文库构建方法。本发明的单细胞基因组扩增方法，采用多重置换扩增方法对单细胞基因组进行扩增，其包括：使一组引物、DNA聚合酶和单细胞基因组在溶液中接触；以及对所述溶液进行扩增，使得进行所述单细胞基因组的扩增反应；其中，所述扩增的时间为0.5小时以上且2小时以下。

Description

提高基因组覆盖度的单细胞全基因组扩增及文库构建方法

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种可提高基因组覆盖度的单细胞全基因组扩增及二代测序文库构建方法。

背景技术

单细胞测序技术(single-cell sequenceing)于2013年荣膺《Nature Mathods》年度技术，在癌症、辅助生殖和免疫学等领域具有广阔的应用前景。

单细胞基因组测序是在单细胞水平对全基因组进行扩增和测序的一项技术，其原理是将分离的单个细胞的微量全基因组DNA进行扩增，获得高覆盖率的完整的基因组后，进行高通量测序，用于揭示细胞群体差异和细胞进化关系。

单细胞的基因组是极其微量的，为满足文库质控，上机测序以及其他检测的需求，必须进行全基因组扩增以实现基因组线型或指数型增长。然而，单细胞基因组测序的主要流程包括：单细胞分离-单细胞全基因组扩增-测序文库制备-测序及数据分析。目前，就单细胞全基因组扩增而言，主要的扩增方法有三种：MDA(多重置换扩增)^[1]、DOP-PCR(简并寡核苷酸引物PCR扩增)^[2]以及MALBAC(多次退火成环循环扩增)^[3]。

MDA是一种等温的链置换扩增反应，其使用随机引物在多位点和模板链结合，接着利用phi29DNA聚合酶很强的模板结合和置换能力实现对全基因组的扩增。

在扩增单细胞基因组后，进行测序文库的构建。目前，主流的基因组文库构建方法依照的是Illumina TruSeq DNA Sample Prep Workflow，其包括基因组DNA片段化、DNA片段末端修复、DNA片段3'端加“A”、DNA片段连接Y型接头、PCR富集等步骤。

从方法学角度来看，获得高覆盖率高保真性的单细胞全基因组扩增产物是准确全面的测序结果的保障。然而，就基因组覆盖度而言，上述三种单细胞全基因组扩增方法均不理想，最高也仅为60％左右，且呈现MDA>MALBAC>DOP-PCR的趋势^[4]。

参考文献

1.Dean FB,Nelson JR,Giesler TL,Lasken RS.2001.Rapid amplification ofplasmid and phage DNA using phi29 DNA polymerase and multiply-primed rollingcircle amplification.Genome Res.11:1095–99。

2.Telenius H,Carter NP,Bebb CE,Nordenskjo M,Ponder BA,TunnacliffeA.1992.Degenerate oligonucleotide-primed PCR:general amplification of targetDNA by a single degenerate primer.Genomics 13:718–25。

3.Zong C,Lu S,Chapman AR,Xie XS.2012.Genome-wide detection of single-nucleotide and copy-number variations of a single human cell.Science 338:1622–26。

4.Huang,L.,et al.,Single-Cell Whole-Genome Amplification andSequencing:Methodology and Applications.Annu Rev Genomics Hum Genet,2015.16:p.79-102。

发明内容

鉴于上述现有技术中存在的不足，本发明的目的在于提供一种能够提高基因组覆盖度的单细胞全基因组扩增及文库构建方法。

本发明的发明人为解决上述技术问题进行了深入研究，结果发现：通过采用MDA方法扩增单细胞基因组，并显著减少扩增的时间，能够得到高基因组覆盖度的单细胞基因组扩增产物，从而完成了本发明。

即，本发明包括：

1.一种单细胞基因组扩增方法，其采用多重置换扩增方法对单细胞基因组进行扩增，其包括：

使一组引物、DNA聚合酶和单细胞基因组在溶液中接触；以及

对所述溶液进行扩增，使得进行所述单细胞基因组的扩增反应；

其中，所述扩增的时间为0.5小时以上且2小时以下。

2.根据项1所述的扩增方法，其中，所述扩增为0.7小时以上且1.5小时以下。

3.根据项1或2所述的扩增方法，其中，所述引物为具有随机核苷酸的核苷酸序列。

4.根据项1～3中任选一项所述的扩增方法，其中，所述引物具有5～10个碱基的长度。

5.根据项1～4中任一项所述的扩增方法，其中，所述引物具有6个碱基的长度。

6.根据项1～5中任一项所述的扩增方法，其中，所述扩增反应是等温扩增。

7.根据项1～6中任一项所述的扩增方法，其中，所述扩增反应在促进所述引物与所述单细胞基因组杂交的条件下进行。

8.根据项1～7中任一项所述的扩增方法，其中，所述DNA聚合酶选自Phi29DNA聚合酶、Tts DNA聚合酶、M2DNA聚合酶、VENT DNA聚合酶、T5DNA聚合酶、PRD1DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶以及REPLI-g sc DNA聚合酶。

9.一种单细胞基因组测序用DNA文库的构建方法，其包括：

采用项1～8中任一项所述的扩增方法对单细胞基因组进行扩增，得到单细胞基因组扩增产物。

10.根据项9所述的构建方法，其还包括：

将所述单细胞基因组扩增产物片段化，得到片段化产物；

将所述片段化产物进行末端修复，得到末端修复产物；

将所述末端修复产物进行3'端加A，得到3'端加A产物；

将所述3'端加A产物进行加接头，得到加接头产物；以及

将所述加接头产物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

发明效果

根据本发明，能够提高单细胞全基因组扩增产物及单细胞全基因组测序用DNA文库的基因组覆盖度。

发明的具体实施方式

本说明书中提及的科技术语具有与本领域技术人员通常理解的含义相同的含义，如有冲突以本说明书中的定义为准。

在本说明书中，基因组覆盖度是指测序获得的序列占整个基因组的比例。

首先，在一个方面中，本发明提供一种单细胞基因组扩增方法(本发明的扩增方法)，其采用多重置换扩增方法对单细胞基因组进行扩增，其包括：

使一组引物、DNA聚合酶和单细胞基因组在溶液中接触；以及

其中，所述扩增的时间为0.5小时以上且2小时以下。

关于多重置换扩增方法，可以参见例如美国专利US6,124,120。该多重置换扩增方法通常包括使一组引物、DNA聚合酶和靶核酸在溶液中接触；以及对所述溶液进行扩增，使得进行所述靶核酸的扩增反应以复制该靶核酸；其中，该靶核酸的复制产生复制链，并且在复制期间，所述复制链中的至少一条通过另一复制链的链置换复制而从该靶核酸上置换下来。在本发明中，所述单细胞基因组即相当于上述靶核酸。

就单细胞基因组的扩增而言，通常认为需要更长的扩增反应时间，例如常用于单细胞基因组扩增的REPLI-g Single Cell Kit(Qiagen公司)的操作说明书中规定的扩增反应时间为8小时。但本发明的发明人研究发现，延长扩增反应会损害单细胞全基因组扩增产物及单细胞全基因组测序用DNA文库的基因组覆盖度，所述基因组覆盖度在扩增反应时间为约1小时时最高，而且，当扩增反应时间超过2小时时，扩增产物的产量已经达到饱和。因此，从提高基因组覆盖度的角度来看，所述扩增反应时间(扩增)可以为0.5小时以上且2小时以下，优选可以为0.7小时以上且1.5小时以下。即，本发明的一个重要特征是扩增反应时间(扩增时间)显著少于常规。

所述引物的长度可以是5～20个碱基，优选是5～10个碱基，最优选是6个碱基。所述引物可以具有随机的核苷酸序列。

除了天然核苷酸之外，引物还可包括修饰的核苷酸。例如，引物可包括至少一个修饰的核苷酸并且因此是耐核酸酶的，例如是耐外切核酸酶的。修饰的核苷酸可为生物素化核苷酸、荧光标记的核苷酸、5-甲基-dCTP、BrdUTP、或5-(3-氨基烯丙基)-2'-脱氧尿苷-5'-三磷酸。引物可包括DNA或RNA引物。而且，引物可用可检测的标记物进行标记。引物组可包括多个引物。引物组可包括与靶核酸的同一条链互补的两个或更多个引物，例如，三个或更多个引物、或者四个或更多个引物、或者五个或更多个引物。引物组还可包括至少一个与靶核酸的另一条链互补的引物。引物组可包括多个引物并且各引物可包括互补部分，其中这些引物的这些互补部分各自与靶核酸的不同部分互补。引物组可包括具有随机核苷酸序列的引物。在本发明的具体实施方式中，引物可以是长度为5bp、6bp、7bp或8bp的随机引物、或其混合物。

优选地，所述扩增反应是等温扩增，即保持所述扩增的温度基本不变，不进行变温或热循环。

优选地，所述扩增反应可以在促进所述引物与所述单细胞基因组杂交的条件下进行。这里，“促进所述引物与所述单细胞基因组杂交的条件”可以包括例如合适的离子环境和合适的温度。作为合适的离子环境，可以列举出例如包含约37mMTris-HCl(pH 8.0)、约50mM KCl、约10mM MgCl₂和约5mM(NH₄)₂SO₄的溶液。作为合适的温度，可以是例如约0℃至约30℃。

对于所述DNA聚合酶没有特殊限制，可以使用本技术领域通常用于MDA的那些DNA聚合酶。例如，所述DNA聚合酶可以选自Phi29DNA聚合酶、Tts DNA聚合酶、M2DNA聚合酶、VENT DNA聚合酶、T5DNA聚合酶、PRD1DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶以及REPLI-g sc DNA聚合酶。

采用本发明的扩增方法获得的单细胞全基因组扩增产物的基因组覆盖度高，其可用于构建单细胞全基因组测序用DNA文库。

因此，在另一方面中，本发明提供一种单细胞基因组测序用DNA文库的构建方法(本发明的构建方法)，其包括：采用本发明的扩增方法对单细胞基因组进行扩增，得到单细胞基因组扩增产物。

本发明的构建方法，还可以包括：将所述单细胞基因组扩增产物片段化，得到片段化产物；将所述片段化产物进行末端修复，得到末端修复产物；将所述末端修复产物进行3'端加A，得到3'端加A产物；将所述3'端加A产物进行加接头，得到加接头产物；以及将所述加接头产物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

优选地，在上述步骤之间还包括纯化步骤和/或片段选择步骤。

采用本发明的扩增方法构建的单细胞全基因组测序用DNA文库的基因组覆盖度高。

实施例

以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例是用于解释本发明，并非对本发明的限定。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得。实施例1

(1)单细胞基因扩增

A.处理分选细胞：

在超净工作台中将细胞分直接分选到3μL PBS中，不经过冻融。

B.单细胞全基因组扩增：

采用MDA进行全基因组扩增，试剂盒选用Qiagen,REPLI-g Single Cell Kit。

a)准备DLB buffer:向提供的管中加入500μL的水，彻底混匀，短暂离心。DLBbuffer可以在-20℃保存6个月。

b)所有buffer和试剂在使用之前要涡旋混匀。

c)PCR仪热盖温度调为70℃。

d)准备足够量的Buffer D2(变性buffer)，bufferD2在-20℃最长可以保存3个月。

每个反应需要3μL的Buffer D2

e)用kit提供的PBS将细胞体积补足为4μL。

f)加入3μL Buffer D2，温和混匀，短暂离心。

g)65℃扩增10钟。

h)加入3μL反应终止液，温和混匀，短暂离心，置于冰上。

将REPLI-g sc DNA Polymerase置于冰上，其他试剂室温融化，涡旋混匀，短暂离心。REPLI-g sc Reaction Buffer融化后可能会有沉淀，涡旋10秒后沉淀会消失。

i)配制mix，配好后短暂离心。

j)每个反应加入40μL mix到步骤5中10μL变性的DNA中。

k)30℃扩增1.3小时

l)65℃放置3分钟以使REPLI-g sc DNA Polymerase失活。

m)取10μL加40μL水，用1×Ampure beads纯化，用40μL EB溶解，

n)用Qubit BR和安捷伦2100检测浓度及片段大小。

(2)DNA样本片段化(200bp的片段大小)：使用Qubit BR测定DNA浓度，取1000ng扩增产物进行超声打断，打断条件：ON/OFF:30秒/30秒，18cycles，4℃。

(3)末端修复：取75μL打断后溶液进行末端修复反应，反应体系如下：

反应条件为20℃，30分钟；1.8倍AMPure XP Beads纯化，70％乙醇洗两次，33μL EB溶液洗脱。

(4)加“A”：末端修复纯化产物加“A”反应体系如下：

反应条件为37℃，30分钟；1.8倍AMPure XP Beads，70％乙醇洗两次，18μL EB洗脱。

(5)加“Adapter”：加“A”产物加“Adapter”反应体系如下：

反应条件为20℃，15分钟；1.8倍AMPure XP Beads，70％乙醇洗两次，30μL EB溶液洗脱。

(6)PCR扩增：加“Adapter”的纯化产物进行PCR扩增，反应体系如下：

反应程序为：94℃，4分钟；(94℃15秒，62℃30秒，72℃50秒)6cycles；72℃10分钟；4℃，保存。PCR产物使用0.9倍AMPure XP Beads纯化，70％乙醇洗两次，30μL EB洗脱DNA。

Ann公共引物：

5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGAC-3'

Ann Index-54：

5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCTCTATTGTGACTGGAGTTC-3'

(7)测序

使用高通量测序仪Hiseq2000，使用PE100测序类型进行测序，测量1G的数据量。

对比例

对比例与实施例的不同在于：单细胞扩增步骤11中扩增温度由本发明温度变成了常规的扩增温度8小时。其他处理方法与实施例一致。

其中MDA-H14为实施例的编号(使用本发明的方法)，47XYY-8HR为对比例的编号(常规方法)，结果如下表，其中，在相同的测序条件及结果分析条件下，编号为MDA-H14的比对率为97.8％，编号为47XYY-8HR的比对率为95.27％，前者明显高于后者。进一步分析发现，编号为MDA-H14的覆盖高达31.03％，明显高于编号为47XYY-8HR的16.03％，说明本发明的方法能够明显提高基因组的覆盖度，提高数据的产出。

工业实用性

根据本发明，提供了一种能够提高基因组覆盖度的单细胞全基因组扩增及文库构建方法。

Claims

使一组引物、DNA聚合酶和单细胞基因组在溶液中接触；以及

其中，

所述扩增的时间为0.5小时以上且2小时以下。

2.根据权利要求1所述的扩增方法，其中，所述扩增的时间为0.7小时以上且1.5小时以下。

3.根据权利要求1或2所述的扩增方法，其中，所述引物为具有随机核苷酸的核苷酸序列。

4.根据权利要求1所述的扩增方法，其中，所述引物具有5～10个碱基的长度。

5.根据权利要求1所述的扩增方法，其中，所述引物具有6个碱基的长度。

6.根据权利要求1所述的扩增方法，其中，所述扩增反应是等温扩增。

7.根据权利要求1所述的扩增方法，其中，所述扩增反应在促进所述引物与所述单细胞基因组杂交的条件下进行。

8.根据权利要求1所述的扩增方法，其中，所述DNA聚合酶选自Phi29DNA聚合酶、TtsDNA聚合酶、M2DNA聚合酶、VENT DNA聚合酶、T5DNA聚合酶、PRD1DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶以及REPLI-g sc DNA聚合酶。

9.一种单细胞基因组测序用DNA文库的构建方法，其包括：

采用权利要求1～8中任一项所述的扩增方法对单细胞基因组进行扩增，得到单细胞基因组扩增产物。

10.根据权利要求9所述的构建方法，其还包括：

将所述单细胞基因组扩增产物片段化，得到片段化产物；

将所述片段化产物进行末端修复，得到末端修复产物；将所述末端修复产物进行3'端加A，得到3'端加A产物；

将所述3'端加A产物进行加接头，得到加接头产物；以及

将所述加接头产物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。