CN105200040A - 一种用于在单细胞水平上同时检测多种耳聋基因的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种用于在单细胞水平上同时检测多种耳聋基因的试剂盒。此外，本发明还提供可在单细胞水平上同时检测多种耳聋基因位点的方法。采用单细胞全基因组扩增技术，通过MDA(multiple？displacement？amplification)，从单细胞样本等DNA含量极其微少的样本类型中，有效扩增得到总量在μg级的全基因组DNA。由此所得的DNA经过特异引物的PCR扩增后，在测序仪上对扩增产物进行Sanger测序，可以有效对多个遗传性耳聋基因进行检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种PCR扩增方法。具体而言，本发明涉及一种可同时扩增多种耳聋基因、特别是人单细胞全基因组来源的耳聋基因的PCR扩增方法。此外，本发明还提供一种用于在单细胞水平上同时检测多种耳聋基因的试剂盒。
背景技术
耳聋是临床上常见的疾病，由遗传性因素引起的约占60％左右。2006年第二次残疾人抽样调查显示，我国残疾人总数8000万，其中听力残疾者2670万，1～7岁听障儿童约有80万。我国每年2000万新生儿中，严重听力障碍发生率为1‰～3‰。新生儿出生听力缺陷给家庭及社会带来了严重的经济和精神负担。耳聋不仅表现为听不见外界的声音，还会影响语言的发育，导致患者无法与外界进行沟通。
迄今为止，耳聋在基因层面上没有有效的治疗方法，最好的办法是通过预防、配戴助听器和人工耳蜗植入术来进行听力修复。导致耳聋的危险因素包括：遗传因素、病毒感染、生产损伤、药物使用不当、免疫性疾病、生理性退化。
由于导致语前聋的环境因素的存在，有时无法判断患者是否为遗传性聋，同时耳蜗结构复杂，耳聋听力表现难以区分，常规的电生理检测或生化检测均不能从病因学上给出满意的解释。这决定了遗传性耳聋基因检测是目前最为有效的病因学分析方法之一。通过常见耳聋基因检测，可以及早发现携带耳聋基因的患儿(包括迟发性听力缺陷患儿)，为后期的诊断及治疗提供科学依据，有助于及时采取干预措施预防言语障碍的发生，有效地降低聋哑发病率。这对于语前聋患者尤为重要，可以尽早利用残余听力佩戴助听器或植入电子耳蜗，防止患儿变哑，对于语后聋患者，可以部分预测以后发病的风险和发病的年龄阶段，从而尽早预防，并对患者的婚配、生育提供遗传信息。
目前遗传性耳聋基因检测的常规检测手段包括直接测序。直接测序(directsequencing，DS)是将聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，PCR)扩增产物纯化、变性后，在测序仪上进行测序，为寻找突变的金标准。
目前遗传性耳聋基因检测主要包含以下基因：
(1)GJB2基因突变引起的耳聋大多表现为语前发病，呈对称性，且导致中重度或极重度耳聋。但目前有学者认为，GJB2基因引起的耳聋在听力损失程度、始发龄及是否为对称性方面都存在着一定的多态性。多数GJB2基因相关性耳聋为双耳同时受损，但也有单耳受损的报道；GJB2基因突变引起的耳聋表现为先天性耳聋，但在某些情况下并不在出生时出现，可表现为听力损害的迟发性。
(2)GJB3基因突变可导致显性或隐性遗传性非综合征性耳聋。1998年Xia等首次克隆了GJB3基因,并在两个常染色体显性非综合征性耳聋家系中发现携带GJB3基因突变，分别是547G>A和538C>T。GJB3基因与GJB2基因虽然不在同一条染色体上，但都编码连接蛋白，在内耳离子平衡中发挥作用，按照双等位基因致聋的模式，有可能GJB2基因与GJB3基因共同导致耳聋患者的发病。
(3)线粒体12SrRNA基因A1555G突变，使毛细胞线粒体损伤导致其产能功能丧失，是听力损害的细胞学基础。此类耳聋患者的临床表型多样，耳聋程度与应用氨基糖甙类药物时的年龄以及发病年龄相关，年龄越小，发生耳聋的程度越重；mtDNAA1555G突变本身不足以引起临床症状，氨基糖甙类药物和核基因在mtDNAA1555G突变的发病机制上起重要作用。携带mtDNAA1555G突变的成员年龄越小,越易出现听力下降，而且耳聋的程度越重。
(4)SLC26A4基因定位于常染色体7q31区域，含21个外显子，编码1个由780个氨基酸残基组成的多次跨膜蛋白Pendrin，属于离子转运体家族，主要与碘/氯离子转运有关，在机体离子成分平衡的维持中发挥重要作用。近年来国外的多项研究表明SLC26A4基因突变与Pendred综合征(PDS)(前庭水管扩大或伴内耳畸形神经性聋和甲状腺肿)和大前庭水管综合征(LVAS)有密切的关系。在众多的突变中，多数突变既见于pendred综合征，又见于大前庭水管综合征。因此，同一位点的突变可能导致不同的临床表现。
在基于直接测序的遗传性耳聋基因检测中，为了增加检测的准确度，往往需要检测多个耳聋基因。
一般而言，对不同的基因的扩增需要采用不同的PCR反应条件。因此，多个耳聋基因的扩增需要在多个PCR反应程序中进行，这就存在扩增时间长、扩增成本高的问题。此外，如在同一PCR反应程序的条件下进行多个基因的扩增，则往往存在其中的一个或多个基因的扩增产物品质不高的问题。
发明内容
鉴于上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种适用于同时扩增多个耳聋基因的PCR扩增方法。
本发明人为解决上述问题进行了深入研究，结果发现，通过设置特定的PCR反应程序条件，可以在同一PCR反应程序中同时高品质地扩增(特别是以人单细胞全基因组作为模板)多个耳聋基因，从而完成了本发明。
即，本发明包括：
1.一种扩增人单细胞全基因组来源的耳聋基因的方法，该方法包括下述步骤：
步骤A：对人单细胞全基因组进行扩增；以及
步骤B：以步骤A中得到的扩增产物为模板，通过PCR反应扩增耳聋基因；
其中，
所述PCR反应的变性温度为94℃-96℃，退火温度为59℃-61℃，且使用选自下述引物对1～4中的至少一对或两对或三对或全部作为扩增引物：
引物对1：核苷酸序列如SEQIDNO：1所示的上游引物及核苷酸序列如SEQIDNO：2所示的下游引物；
引物对2：核苷酸序列如SEQIDNO：3所示的上游引物及核苷酸序列如SEQIDNO：4所示的下游引物；
引物对3：核苷酸序列如SEQIDNO：5所示的上游引物及核苷酸序列如SEQIDNO：6所示的下游引物；以及
引物对4：选自下述引物对41～47中的至少一对或两对以上：
引物对41：核苷酸序列如SEQIDNO：7所示的上游引物及核苷酸序列如SEQIDNO：8所示的下游引物；
引物对42：核苷酸序列如SEQIDNO：9所示的上游引物及核苷酸序列如SEQIDNO：10所示的下游引物；
引物对43：核苷酸序列如SEQIDNO：11所示的上游引物及核苷酸序列如SEQIDNO：12所示的下游引物；
引物对44：核苷酸序列如SEQIDNO：13所示的上游引物及核苷酸序列如SEQIDNO：14所示的下游引物；
引物对45：核苷酸序列如SEQIDNO：15所示的上游引物及核苷酸序列如SEQIDNO：16所示的下游引物；
引物对46：核苷酸序列如SEQIDNO：17所示的上游引物及核苷酸序列如SEQIDNO：18所示的下游引物；以及
引物对47：核苷酸序列如SEQIDNO：19所示的上游引物及核苷酸序列如SEQIDNO：20所示的下游引物。
2.根据项1所述的方法，其中，所述PCR反应用于扩增选自下述人耳聋基因中的至少一种或两种或三种或全部：人GJB2基因、人GJB3基因、人12SrRNA、以及人SLC26A4基因。
3.根据项1或2所述的方法，其中，所述PCR反应的延伸温度为72℃。
4.根据项1～3中任一项所述的方法，其中，所述PCR反应的模板在进入该PCR反应的温度循环前在94℃-96℃进行了5～30分钟的预变性。
5.一种通过PCR反应扩增耳聋基因的方法，其中，所述PCR反应的变性温度为94℃-96℃，退火温度为59℃-61℃，且使用选自下述引物对1～4中的至少一对或两对或三对或全部作为扩增引物：
引物对1：核苷酸序列如SEQIDNO：1所示的上游引物及核苷酸序列如SEQIDNO：2所示的下游引物；
引物对2：核苷酸序列如SEQIDNO：3所示的上游引物及核苷酸序列如SEQIDNO：4所示的下游引物；
引物对3：核苷酸序列如SEQIDNO：5所示的上游引物及核苷酸序列如SEQIDNO：6所示的下游引物；以及
引物对4：选自下述引物对41～47中的至少一对或两对以上：
引物对41：核苷酸序列如SEQIDNO：7所示的上游引物及核苷酸序列如SEQIDNO：8所示的下游引物；
引物对42：核苷酸序列如SEQIDNO：9所示的上游引物及核苷酸序列如SEQIDNO：10所示的下游引物；
引物对43：核苷酸序列如SEQIDNO：11所示的上游引物及核苷酸序列如SEQIDNO：12所示的下游引物；
引物对44：核苷酸序列如SEQIDNO：13所示的上游引物及核苷酸序列如SEQIDNO：14所示的下游引物；
引物对45：核苷酸序列如SEQIDNO：15所示的上游引物及核苷酸序列如SEQIDNO：16所示的下游引物；
引物对46：核苷酸序列如SEQIDNO：17所示的上游引物及核苷酸序列如SEQIDNO：18所示的下游引物；以及
引物对47：核苷酸序列如SEQIDNO：19所示的上游引物及核苷酸序列如SEQIDNO：20所示的下游引物。
6.根据项5所述的方法，其用于扩增选自下述人耳聋基因中的至少一种或两种或三种或全部：人GJB2基因、人GJB3基因、人12SrRNA、以及人SLC26A4基因。
7.根据项5或6所述的方法，其中，所述PCR反应的延伸温度为72℃。
8.根据项5～7中任一项所述的方法，其中，所述PCR反应的模板在进入该PCR反应的温度循环前被在94℃-96℃进行了5～30分钟的预变性。
9.根据项5～8中任一项所述的方法，其中，所述PCR反应以人全基因组DNA作为模板。
10.一种用于在单细胞水平上同时检测多种耳聋基因的试剂盒，其包括下述引物对1～4以及用于PCR扩增的试剂；
引物对1：核苷酸序列如SEQIDNO：1所示的上游引物及核苷酸序列如SEQIDNO：2所示的下游引物；
引物对2：核苷酸序列如SEQIDNO：3所示的上游引物及核苷酸序列如SEQIDNO：4所示的下游引物；
引物对3：核苷酸序列如SEQIDNO：5所示的上游引物及核苷酸序列如SEQIDNO：6所示的下游引物；以及
引物对4：选自下述引物对41～47中的至少一对或两对以上：
引物对41：核苷酸序列如SEQIDNO：7所示的上游引物及核苷酸序列如SEQIDNO：8所示的下游引物；
引物对42：核苷酸序列如SEQIDNO：9所示的上游引物及核苷酸序列如SEQIDNO：10所示的下游引物；
引物对43：核苷酸序列如SEQIDNO：11所示的上游引物及核苷酸序列如SEQIDNO：12所示的下游引物；
引物对44：核苷酸序列如SEQIDNO：13所示的上游引物及核苷酸序列如SEQIDNO：14所示的下游引物；
引物对45：核苷酸序列如SEQIDNO：15所示的上游引物及核苷酸序列如SEQIDNO：16所示的下游引物；
引物对46：核苷酸序列如SEQIDNO：17所示的上游引物及核苷酸序列如SEQIDNO：18所示的下游引物；以及
引物对47：核苷酸序列如SEQIDNO：19所示的上游引物及核苷酸序列如SEQIDNO：20所示的下游引物；
所述用于PCR扩增的试剂选自dNTPS、MgC12、Taq酶、PCR反应缓冲液、以及双蒸水。
11.根据项10所述的试剂盒，其中，所述多种耳聋基因为人GJB2基因、人GJB3基因、人12SrRNA以及人SLC26A4基因。
发明效果
根据本发明的通过PCR反应扩增耳聋基因的方法，能够在同一PCR反应程序中同时高品质地(特别是以人单细胞全基因组作为模板)扩增多个耳聋基因。
附图说明
图1为显示实施例1中在同一PCR反应程序条件下,同时对20个耳聋基因位点进行扩增的结果的图。
发明的具体实施方式
在一个方面中，本发明提供一种通过PCR反应扩增耳聋基因的方法(本发明的耳聋基因扩增方法)，其中，所述PCR反应的变性温度为94℃-96℃，退火温度为59℃-61℃，且使用选自下述引物对1～4中的至少一对或两对或三对或全部作为扩增引物：
引物对1：核苷酸序列如SEQIDNO：1所示的上游引物及核苷酸序列如SEQIDNO：2所示的下游引物；
引物对2：核苷酸序列如SEQIDNO：3所示的上游引物及核苷酸序列如SEQIDNO：4所示的下游引物；
引物对3：核苷酸序列如SEQIDNO：5所示的上游引物及核苷酸序列如SEQIDNO：6所示的下游引物；以及
引物对4：选自下述引物对41～47中的至少一对或两对以上：
引物对41：核苷酸序列如SEQIDNO：7所示的上游引物及核苷酸序列如SEQIDNO：8所示的下游引物；
引物对42：核苷酸序列如SEQIDNO：9所示的上游引物及核苷酸序列如SEQIDNO：10所示的下游引物；
引物对43：核苷酸序列如SEQIDNO：11所示的上游引物及核苷酸序列如SEQIDNO：12所示的下游引物；
引物对44：核苷酸序列如SEQIDNO：13所示的上游引物及核苷酸序列如SEQIDNO：14所示的下游引物；
引物对45：核苷酸序列如SEQIDNO：15所示的上游引物及核苷酸序列如SEQIDNO：16所示的下游引物；
引物对46：核苷酸序列如SEQIDNO：17所示的上游引物及核苷酸序列如SEQIDNO：18所示的下游引物；以及
引物对47：核苷酸序列如SEQIDNO：19所示的上游引物及核苷酸序列如SEQIDNO：20所示的下游引物。
本发明的耳聋基因扩增方法可适用于同时对多个耳聋基因进行PCR扩增，并能够得到高品质的扩增产物。这里“高品质”是指：对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检查时，条带特异、单一(例如目的条带占98％以上、优选99％以上、更优选99.5％以上、更优选基本上100％)。
PCR(聚合酶链反应)扩增是本领域技术人员熟知的，其一般通过一定的PCR反应程序(温度循环)来实现。所述PCR反应程序一般包括变性、退火、延伸等步骤。用于PCR扩增的试剂包括但不限于选自dNTPS、MgC12、Taq酶、PCR反应缓冲液、双蒸水(ddH2O)等中的至少一种，本领域技术人员可根据需要适当选择。
对本发明的耳聋基因扩增方法而言，变性步骤可以在94-96℃进行0.1～10分钟(优选0.5～1分钟)；退火步骤可以在59-61℃进行0.1～10分钟(优选0.5～2分钟)；延伸步骤可以在72℃进行0.1～10分钟(优选1～5分钟)；由上述变性、退火、延伸步骤组成的循环可以进行10-50次(优选20次以上，更优选25-40次)。优选地，经历上述温度循环前的模板可以在94-96℃进行1～60分钟(优选5～20分钟)的预变性，经历上述温度循环后的扩增产物可以于4℃保存。
作为本发明的耳聋基因扩增方法的扩增对象的耳聋基因包括人GJB2基因、人GJB3基因、人12SrRNA、以及人SLC26A4基因。这里，扩增不仅包括扩增出完整的上述基因，也包括扩增出上述基因的一部分，该部分包含与耳聋相关的位点。作为这样的位点可以选自人GJB2基因的299_300delAT、176_191del、1677delT、35delG、235delC位点，人GJB3基因的538C>T、547G>A位点，人12SrRNA的1494C>T、1555A>G位点，以及人SLC26A4基因的281C>T、589G>A、IVS7-2A>G、1174A>T、1226G>A、1229C>T、IVS15+5G>A、1975G>C、2027T>A、2162C>T、2168A>G位点。在引物对1～3、41～47中，引物对1用于扩增GJB2基因，引物对2用于扩增GJB3基因，引物对3用于扩增人12SrRNA，引物对41～47用于扩增SLC26A4基因。因此，在优选的实施方案中，可以使用引物对1、引物对2、和引物对3，以及选自引物对41～47中的至少一对或两对以上。
对于本发明的耳聋基因扩增方法中的PCR扩增的模板没有限制，只要其包含作为扩增目标的耳聋基因即可。优选地，可以以人全基因组DNA作为模板，例如可以以人单细胞全基因组DNA作为模板。从人体组织或细胞获取全基因组DNA的方法是本领域技术人员已知的。通过在测序仪上对扩增产物进行Sanger测序，可以有效地对多个遗传性耳聋基因进行检测。
此外，在另一个方面中，本发明提供一种扩增人单细胞全基因组来源的耳聋基因的方法(本发明扩增人单细胞全基因组来源的耳聋基因的方法)，该方法包括：首先，以单细胞(如人单细胞)的基因组为模板，扩增得到μg级别的基因组DNA；然后，以所得扩增产物为模板，通过本发明的耳聋基因扩增方法扩增耳聋基因。
本发明中可以采用单细胞全基因组扩增技术，通过MDA(multipledisplacementamplification，多重置换扩增)(Dean,F.B.etal.Comprehensivehumangenomeamplificationusingmultipledisplacementamplification.Proc.NatlAcad.Sci.USA99,5261–5266,(2002))从单细胞样本等DNA含量极其微少的样本类型中，有效扩增得到总量在μg级的全基因组DNA。由此所得的DNA经过特定引物的PCR扩增后，在测序仪上对扩增产物进行Sanger测序，可以有效对多个遗传性耳聋基因进行检测。这极大地拓展了遗传性耳聋基因检测的应用范围，使其可以在更多的情况下获取可用的样本。
实施例
以下结合附图和实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例是用于解释本发明，并非对本发明的限定。
实施例1：MDA方法扩增人单细胞全基因组DNA
使用QIAGENREPLI-gSingleCellKit单细胞全基因组扩增试剂盒，以MDA方法对人单细胞样本进行全基因组DNA扩增。
人单细胞以0.5μL以内体积收集到0.2mL薄壁PCR管中，其中包含试剂盒提供的4μLPBSsc1x(clearlid)。
配制BufferD2(12个反应)，成分如下：
所配BufferD2可用于12个反应，对于每个样本，向PCR管中加入3μLBufferD2混匀。在PCR仪上进行反应，65℃反应10min，向PCR管中加入3μLStopSolution，混匀，置于冰上。
配制MasterMix，成分如下：
将配制的MasterMix加入2.2.1.2的PCR管中混匀，在PCR仪上进行反应，反应程序如下：
30℃8h,65℃3min,4℃保存。
使用1.8倍体积AmpureXP磁珠纯化反应体系，溶于100μL缓冲液EB中回收DNA。
实施例2采用同一PCR反应程序条件同时扩增4个耳聋基因的20个位点
针对遗传性非综合征耳聋基因GJB2、GJB3、12SrRNA、SLC26A4设计引物，共计10对引物，覆盖4个基因的20个突变位点。引物信息如下：
表1引物序列信息
取扩增所得人单细胞全基因组DNA样本作为模板进行PCR反应，样本需进行上述设计的10对引物的PCR扩增，共10个反应，但采用同一PCR反应程序。每个反应需25ng模板DNA，10个反应共需总计250ng模板DNA。
PCR反应体系如下：
PCR反应程序如下：95℃15min,(95℃30s,59℃30s,72℃1min)×40个循环,72℃10min,4℃保存。
采用1％琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行检查，结果如图1，Marker为TIANGEN1kbplusDNAMarker。如图1所示，对于全部的4个基因的20个突变位点均获得了高品质的扩增产物，并且扩增片段大小与目标片段大小一致。
还需要说明的是，在可实施且不明显违背本发明的主旨的前提下，在本说明书中作为某一技术方案的构成部分所描述的任一技术特征或技术特征的组合同样也可以适用于其它技术方案；并且，在可实施且不明显违背本发明的主旨的前提下，作为不同技术方案的构成部分所描述的技术特征之间也可以以任意方式进行组合，来构成其它技术方案。本发明也包含在上述情况下通过组合而得到的技术方案，并且这些技术方案相当于记载在本说明书中。
上述说明示出并描述了本发明的优选实施例，如前所述，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域技术人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。
工业实用性
根据本发明，提供一种能够在同一PCR反应程序中同时高品质地扩增多个耳聋基因的PCR扩增方法。
Claims (10)
1.一种扩增人单细胞全基因组来源的耳聋基因的方法，该方法包括下述步骤：
步骤A：对人单细胞全基因组进行扩增；以及
步骤B：以步骤A中得到的扩增产物为模板，通过PCR反应扩增耳聋基因；
其中，
所述PCR反应的变性温度为94℃-96℃，退火温度为59℃-61℃，且使用选自下述引物对1～4中的至少一对或两对或三对或全部作为扩增引物：
引物对1：核苷酸序列如SEQIDNO：1所示的上游引物及核苷酸序列如SEQIDNO：2所示的下游引物；
引物对2：核苷酸序列如SEQIDNO：3所示的上游引物及核苷酸序列如SEQIDNO：4所示的下游引物；
引物对3：核苷酸序列如SEQIDNO：5所示的上游引物及核苷酸序列如SEQIDNO：6所示的下游引物；以及
引物对4：选自下述引物对41～47中的至少一对或两对以上：
引物对41：核苷酸序列如SEQIDNO：7所示的上游引物及核苷酸序列如SEQIDNO：8所示的下游引物；
引物对42：核苷酸序列如SEQIDNO：9所示的上游引物及核苷酸序列如SEQIDNO：10所示的下游引物；
引物对43：核苷酸序列如SEQIDNO：11所示的上游引物及核苷酸序列如SEQIDNO：12所示的下游引物；
引物对44：核苷酸序列如SEQIDNO：13所示的上游引物及核苷酸序列如SEQIDNO：14所示的下游引物；
引物对45：核苷酸序列如SEQIDNO：15所示的上游引物及核苷酸序列如SEQIDNO：16所示的下游引物；
引物对46：核苷酸序列如SEQIDNO：17所示的上游引物及核苷酸序列如SEQIDNO：18所示的下游引物；以及
引物对47：核苷酸序列如SEQIDNO：19所示的上游引物及核苷酸序列如SEQIDNO：20所示的下游引物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述PCR反应用于扩增选自下述人耳聋基因中的至少一种或两种或三种或全部：人GJB2基因、人GJB3基因、人12SrRNA、以及人SLC26A4基因。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述PCR反应的延伸温度为72℃。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述PCR反应的模板在进入该PCR反应的温度循环前在94℃-96℃进行了5～30分钟的预变性。
5.一种通过PCR反应扩增耳聋基因的方法，其中，所述PCR反应的变性温度为94℃-96℃，退火温度为59℃-61℃，且使用选自下述引物对1～4中的至少一对或两对或三对或全部作为扩增引物：
引物对1：核苷酸序列如SEQIDNO：1所示的上游引物及核苷酸序列如SEQIDNO：2所示的下游引物；
引物对2：核苷酸序列如SEQIDNO：3所示的上游引物及核苷酸序列如SEQIDNO：4所示的下游引物；
引物对3：核苷酸序列如SEQIDNO：5所示的上游引物及核苷酸序列如SEQIDNO：6所示的下游引物；以及
引物对4：选自下述引物对41～47中的至少一对或两对以上：
引物对41：核苷酸序列如SEQIDNO：7所示的上游引物及核苷酸序列如SEQIDNO：8所示的下游引物；
引物对42：核苷酸序列如SEQIDNO：9所示的上游引物及核苷酸序列如SEQIDNO：10所示的下游引物；
引物对43：核苷酸序列如SEQIDNO：11所示的上游引物及核苷酸序列如SEQIDNO：12所示的下游引物；
引物对44：核苷酸序列如SEQIDNO：13所示的上游引物及核苷酸序列如SEQIDNO：14所示的下游引物；
引物对45：核苷酸序列如SEQIDNO：15所示的上游引物及核苷酸序列如SEQIDNO：16所示的下游引物；
引物对46：核苷酸序列如SEQIDNO：17所示的上游引物及核苷酸序列如SEQIDNO：18所示的下游引物；以及
引物对47：核苷酸序列如SEQIDNO：19所示的上游引物及核苷酸序列如SEQIDNO：20所示的下游引物。
6.根据权利要求5所述的方法，其用于扩增选自下述人耳聋基因中的至少一种或两种或三种或全部：人GJB2基因、人GJB3基因、人12SrRNA、以及人SLC26A4基因。
7.根据权利要求5所述的方法，其中，所述PCR反应的模板在进入该PCR反应的温度循环前在94℃-96℃进行了5～30分钟的预变性。
8.根据权利要求5所述的方法，其中，所述PCR反应以人全基因组DNA作为模板。
9.一种用于在单细胞水平上同时检测多种耳聋基因的试剂盒，其包括下述引物对1～4以及用于PCR扩增的试剂；
引物对1：核苷酸序列如SEQIDNO：1所示的上游引物及核苷酸序列如SEQIDNO：2所示的下游引物；
引物对2：核苷酸序列如SEQIDNO：3所示的上游引物及核苷酸序列如SEQIDNO：4所示的下游引物；
引物对3：核苷酸序列如SEQIDNO：5所示的上游引物及核苷酸序列如SEQIDNO：6所示的下游引物；以及
引物对4：选自下述引物对41～47中的至少一对或两对以上：
引物对41：核苷酸序列如SEQIDNO：7所示的上游引物及核苷酸序列如SEQIDNO：8所示的下游引物；
引物对42：核苷酸序列如SEQIDNO：9所示的上游引物及核苷酸序列如SEQIDNO：10所示的下游引物；
引物对43：核苷酸序列如SEQIDNO：11所示的上游引物及核苷酸序列如SEQIDNO：12所示的下游引物；
引物对44：核苷酸序列如SEQIDNO：13所示的上游引物及核苷酸序列如SEQIDNO：14所示的下游引物；
引物对45：核苷酸序列如SEQIDNO：15所示的上游引物及核苷酸序列如SEQIDNO：16所示的下游引物；
引物对46：核苷酸序列如SEQIDNO：17所示的上游引物及核苷酸序列如SEQIDNO：18所示的下游引物；以及
引物对47：核苷酸序列如SEQIDNO：19所示的上游引物及核苷酸序列如SEQIDNO：20所示的下游引物；
所述用于PCR扩增的试剂选自dNTPS、MgC12、Taq酶、PCR反应缓冲液、以及双蒸水。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其中，所述多种耳聋基因为人GJB基因、人GJB3基因、人12SrRNA以及人SLC26A4基因。
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