CN106929588A - Slc26a4基因捕获探针及其在slc26a4基因突变检测中的应用 - Google Patents

Slc26a4基因捕获探针及其在slc26a4基因突变检测中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN106929588A
CN106929588A CN201710242214.3A CN201710242214A CN106929588A CN 106929588 A CN106929588 A CN 106929588A CN 201710242214 A CN201710242214 A CN 201710242214A CN 106929588 A CN106929588 A CN 106929588A
Authority
CN
China
Prior art keywords
probe
slc26a4
sub
gene
genes
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201710242214.3A
Other languages
English (en)
Inventor
伍建
戴朴
黄莎莎
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Makino (Chongqing) Gene Technology Co., Ltd.
Original Assignee
Beijing Maibo Hengye Science And Technology LLC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Maibo Hengye Science And Technology LLC filed Critical Beijing Maibo Hengye Science And Technology LLC
Priority to CN201710242214.3A priority Critical patent/CN106929588A/zh
Publication of CN106929588A publication Critical patent/CN106929588A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了SLC26A4基因捕获探针及其在SLC26A4基因突变检测中的应用。本发明公开的SLC26A4基因捕获探针的制备方法，包括：制备N个亚探针，连接N个亚探针，得到SLC26A4基因捕获探针；N为大于等于2的一个自然数；N个亚探针满足N个亚探针能覆盖SLC26A4基因的全部序列；在SLC26A4基因上任何两个相邻的亚探针均满足上游亚探针的下游有一个或多个核苷酸与下游亚探针的上游重叠；N个亚探针的长度均为50‑150bp。实验证明，利用本发明的SLC26A4基因捕获探针既能准确判断SLC26A4基因外显子的突变情况，又能精确定位至断裂点区域和片段大小。

Description

SLC26A4基因捕获探针及其在SLC26A4基因突变检测中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域中，SLC26A4基因捕获探针及其在SLC26A4基因突变检测中的应用。
背景技术
大前庭水管综合征是儿童、青少年中较为常见的一种耳聋性疾病，可表现为先天性或后天性感音神经性聋。近年来的多项研究表明，大前庭水管综合征与SLC26A4基因的突变关系密切。SLC26A4基因含21个外显子，除21号外显子外，其他外显子长度约为55-231bp；开放阅读框架2343bp，起始于2号外显子；编码780个氨基酸的蛋白质Pendrin。据不完全统计，在各种SLC26A4基因相关疾病中已检测到碱基替换、碱基缺失、移码突变3种方式的30多个基因突变位点。
目前，用于大前庭水管综合征基因诊断的方法主要包括芯片法、荧光探针法、ARMS-PCR法和测序法。其中，荧光探针法和ARMS-PCR法虽然成本低、不需特殊设备，但其操作繁琐、易造成实验室污染；芯片法成本高、需要基因芯片检测的相关设备又易造成实验室污染；而测序法在能检测SLC26A4多种突变类型的同时，还能确定基因突变的精确点与片段大小。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何检测SLC26A4基因全基因的突变。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了SLC26A4基因捕获探针。所用SLC26A4基因的序列为人类参考基因组版本Hg19(更新日期为2015年8月6日)的chr7:107301080-107358252。
本发明提供的SLC26A4基因捕获探针按照捕获探针的制备方法制备，所述捕获探针的制备方法包括：制备N个亚探针，连接所述N个亚探针，得到SLC26A4基因捕获探针；N为大于等于2的一个自然数；
所述N个亚探针满足所述N个亚探针能覆盖所述SLC26A4基因的全部序列。
上述SLC26A4基因捕获探针中，在所述SLC26A4基因上任何两个相邻的亚探针均可满足上游亚探针的下游有一个或多个核苷酸与下游亚探针的上游重叠。在所述SLC26A4基因上任何两个相邻的亚探针具体均可满足上游亚探针的下游有3个核苷酸与下游亚探针的上游重叠。
上述SLC26A4基因捕获探针中，所述N个亚探针的长度均可为50-150bp。所述N个亚探针的长度具体均可为108bp。所述N个亚探针可为545个亚探针。
上述SLC26A4基因捕获探针中，所述N个亚探针的序列均可满足：
第1条单链亚探针的序列为SLC26A4基因的第1-108位；
第2条单链亚探针的序列为SLC26A4基因的第106-213位；
第3条单链亚探针的序列为SLC26A4基因的第211-318位；
……
第n条单链亚探针的序列为SLC26A4基因的第【105(n-1)+1】-【105(n-1)+108】位；
……
第543条单链亚探针的序列为SLC26A4基因的第56911-57018位；
第544条单链亚探针的序列为SLC26A4基因的第57016-57123位；
第545条单链亚探针的序列为SLC26A4基因的第57065-57172位；
其中，n为1-544中的任一个自然数。
上述SLC26A4基因捕获探针中，所述连接所述N个亚探针可包括下述A1)和A2)：
A1)连接所述N个亚探针，得到长链DNA和/或环状DNA；
A2)将所述长链DNA和/或所述环状DNA进行扩增，得到所述SLC26A4基因捕获探针。
所述制备方法在连接所述N个亚探针前还可包括对所述N个亚探针进行磷酸化修饰。
对所述N个亚探针进行磷酸化修饰具体可为在所述N个亚探针的5′端进行磷酸化修饰。所述磷酸化修饰可利用T4多聚核苷酸激酶或NEB的T4多聚核苷酸激酶试剂盒进行。利用NEB的T4多聚核苷酸激酶试剂盒进行所述磷酸化修饰的反应体系可为：所述N个亚探针10μl、10×反应缓冲液5μl、10mM ATP 5μl、T4多聚核苷酸激酶2.5μl和H20 27.5μl。所述反应体系中所述N个亚探针的浓度可为5ng/μl。所述反应体系中10×反应缓冲液、ATP和T4多聚核苷酸激酶均为NEB的T4多聚核苷酸激酶试剂盒中试剂。所述磷酸化修饰的反应条件可为37℃30min。
所述连接所述N个亚探针可利用ssDNA连接酶或epicentre的ssDNA连接试剂盒(CircLigaseTMII ssDNA Ligase，epicentre)进行。所述连接的反应体系可为：所述N个亚探针的磷酸化产物或所述N个亚探针20μl、CircLigase II 10×Reaction Buffer 5μl、50mM MnCl2 2.5μl、5M Betaine 10μl、CircLigase II ssDNA Ligase(100U)2.5μl和H2O 10μl。所述连接的反应条件可为60℃60min。
步骤A2)中，在进行将所述长链DNA或所述环状DNA进行扩增时还可包括利用生物素对扩增产物进行标记。
进行所述扩增可采用随机引物进行。所述随机引物可为由A、C、G和T这四个核苷酸随机组成的长度均为6bp的46条单链DNA所形成的混合物。所述随机引物中所有单链DNA的摩尔数均可相同。
将所述长链DNA和/或所述环状DNA进行扩增以及利用生物素对扩增产物进行标记可利用Qiagen公司的全基因组扩增试剂盒进行。利用Qiagen公司的全基因组扩增试剂盒进行反应的反应体系可为：所述长链DNA和/或所述环状DNA 10μl、2×反应缓冲液25μl、Bio-16-dUTP 5μl、Replig_Enzyme 1μl和H2O 9μl。其中，2×反应缓冲液中含有所述随机引物。利用Qiagen公司的全基因组扩增试剂盒进行反应的反应温度可为37℃。利用Qiagen公司的全基因组扩增试剂盒进行反应的时间可不小于16小时。
为解决上述技术问题，本发明还提供了所述N个亚探针。
为解决上述技术问题，本发明还提供了SLC26A4基因突变检测系统。
本发明所提供的SLC26A4基因突变检测系统，包括所述SLC26A4基因捕获探针或所述N个亚探针。
上述系统可由所述SLC26A4基因捕获探针或所述N个亚探针与检测基因突变所需的仪器和/或试剂组成。所述检测基因突变所需的试剂不包括所述SLC26A4基因捕获探针或所述N个亚探针。所述检测基因突变所需的仪器和/或试剂可为构建全基因组文库所需的仪器和/或试剂，和/或，捕获SLC26A4基因所需的仪器和/或试剂，和/或，进行测序所需的仪器和/或试剂。
所述捕获SLC26A4基因所需的仪器和/或仪器可为MyOne磁珠和/或迈基诺基因科技股份有限公司的缓冲液HY、2X结合缓冲溶液、WB1缓冲液、WB3缓冲液和/或稀释缓冲溶液。
所述进行测序所需的仪器和/或试剂可为利用二代测序所需的仪器和/或试剂。所述二代测序可为利用Illumina测序平台或其他测序平台进行的测序，如IlluminaHiSeq2000、Illumina HiSeq2500、Hiseq4000、Nextseq500或X Ten。
所述系统可为仅包括相关试剂的试剂或试剂盒。所述系统也可为含有所述SLC26A4基因捕获探针或所述N个亚探针的生物芯片。
为解决上述技术问题，本发明还提供了所述捕获探针的制备方法。
为解决上述技术问题，本发明还提供了SLC26A4基因突变检测方法。
本发明所提供的SLC26A4基因突变检测方法，包括利用所述SLC26A4基因捕获探针捕获待测样本的SLC26A4基因，然后对捕获的SLC26A4基因进行测序，根据所述待测样本的测序结果确定所述待测样本的SLC26A4基因的突变。
上述SLC26A4基因突变检测方法中，所述确定所述待测样本的SLC26A4基因的突变可将所述待测样本的测序结果与对照样本的SLC26A4基因的检测结果进行比较确定；所述对照样本的SLC26A4基因未发生突变。
所述对照样本的SLC26A4基因的检测结果的检测方法可包括：利用所述SLC26A4基因捕获探针捕获对照样本的SLC26A4基因，然后对捕获的SLC26A4基因进行测序，得到所述对照样本的测序结果。
上述SLC26A4基因突变检测方法中，所述对捕获的SLC26A4基因进行测序可利用现有技术中的测序方法(如二代测序的方法，但不仅限于二代测序的方法)进行，只要能达到对捕获的SLC26A4基因测序的目的即可。所述二代测序可为利用Illumina测序平台或其他测序平台进行的测序，如Illumina HiSeq2000、Illumina HiSeq2500、Hiseq4000、Nextseq500或X Ten。
所述SLC26A4基因突变检测方法可为非诊断目的的SLC26A4基因突变检测方法。
为解决上述技术问题，本发明还提供了下述任一应用：
X1、所述SLC26A4基因捕获探针或所述N个亚探针在检测SLC26A4基因突变中的应用；
X2、所述SLC26A4基因捕获探针或所述N个亚探针在制备检测SLC26A4基因突变产品中的应用；
X3、所述SLC26A4基因捕获探针或所述N个亚探针在诊断或辅助诊断大前庭水管综合征中的应用；
X4、所述SLC26A4基因捕获探针或所述N个亚探针在制备诊断或辅助诊断大前庭水管综合征产品中的应用；
X5、所述系统在检测SLC26A4基因突变中的应用；
X6、所述系统在制备检测SLC26A4基因突变产品中的应用；
X7、所述系统在诊断或辅助诊断大前庭水管综合征中的应用；
X8、所述系统在制备诊断或辅助诊断大前庭水管综合征产品中的应用；
X9、所述SLC26A4基因突变检测方法在诊断或辅助诊断大前庭水管综合征中的应用。
现有的检测技术只能确定SLC26A4基因外显子是否发生突变，而利用本发明的SLC26A4基因捕获探针及SLC26A4基因突变检测方法既能准确判断外显子的突变情况，又能精确定位至断裂点区域和片段大小。因此，利用本发明的SLC26A4基因捕获探针及SLC26A4基因突变检测方法能够一步检测SLC26A4基因突变携带者的全部突变情况，并对相关断裂点进行准确定位，避免假阴性、假阳性出现，有利于分析SLC26A4基因遗传变异机制。另外，本发明的SLC26A4基因捕获探针对SLC26A4基因的捕获均达到了95％以上覆盖，在没有缺失的情况下最高达到了98.06％；其捕获效率均在42％以上，从至少覆盖到4X、10X和20X的参数来看，平均覆盖比例分别达到94％、90％和89％以上，覆盖率根据缺失情况表现不同，探针的整体均一性非常好，具有很好的稳定性。表明，本发明的DMD基因捕获探针可以用于捕获DMD基因及DMD基因突变位点的检测。
附图说明
图1为临床样本SLC26A4基因高通量测序图谱。其中，标注区域为突变区域。
图2为样本G161027C01501的检测结果。
图3为样本G161027C02001的检测结果。
图4为样本G161027C03801的检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、SLC26A4基因捕获探针的制备
1、单链亚探针的序列设计及制备
所用SLC26A4基因的序列为人类参考基因组版本Hg19(更新日期为2015年8月6日)的chr7:107301080-107358252。根据SLC26A4基因序列设计SLC26A4基因捕获单链亚探针的序列，每条单链亚探针的长度为108bp，各单链亚探针的序列如下：
第1条单链亚探针的序列为SLC26A4基因的第1-108位(即chr7:107301080-107301187)；
第2条单链亚探针的序列为SLC26A4基因的第106-213位；
第3条单链亚探针的序列为SLC26A4基因的第211-318位；
……
第n条单链亚探针的序列为SLC26A4基因的第【105(n-1)+1】-【105(n-1)+108】位；
……
第543条单链亚探针的序列为SLC26A4基因的第56911-57018位；
第544条单链亚探针的序列为SLC26A4基因的第57016-57123位；
第545条单链亚探针的序列为SLC26A4基因的第57065-57172位(即chr7:107358145-107358252)。
其中，n为1-544中的任一个自然数。
利用原位合成的方法，根据序列分别为上述各探针序列在芯片合成寡核苷酸探针，得到捕获SLC26A4基因的545条单链亚探针。
利用35％的氨水，将固定在芯片上的545条单链亚探针洗脱下来，收集到离心管中，利用真空浓缩仪浓缩后，加入超纯水溶解，成为一个SLC26A4基因的545条单链亚探针的混池；调整探针浓度到50ng/μl。
2、可以捕获SLC26A4基因全基因的SLC26A4基因捕获探针的制备
1)单链亚探针的5′磷酸化修饰：利用NEB的T4多聚核苷酸激酶试剂盒进行。5′磷酸化修饰的反应体系如下：
组分 体积(μl)
545条单链亚探针的混池(50ng/μl) 10
10×反应缓冲液(Reaction Buffer) 5
10mM ATP 5
T4Polynucleotide Kinase(T4多聚核苷酸激酶) 2.5
H20 27.5
总反应体积50μl，该反应体系中，除545条单链亚探针的混池和H2O外的试剂均为T4多聚核苷酸激酶试剂盒中试剂。混合均匀后，恒温加热器或PCR仪器上37℃恒温孵育30min。反应结束后，利用微量PCR产物回收试剂盒按照其操作流程进行产物纯化回收，洗脱体积20μl，得到磷酸化产物；
2)连接反应：将步骤1)得到的磷酸化产物，利用商业的ssDNA连接试剂盒(CircLigaseTM II ssDNA Ligase，epicentre)连接，连接反应体系如下：
组分 体积(μl)
步骤1)得到的磷酸化产物 20
CircLigase II 10×Reaction Buffer 5
50mM MnCl2 2.5
5M Betaine 10
CircLigase II ssDNA Ligase(100U) 2.5
H2O 10
总反应体积为50μl，该反应体系中，除步骤1)得到的磷酸化产物和H2O外的试剂均为ssDNA连接试剂盒中试剂。混合均匀后，60℃反应1小时。反应产物利用微量DNA回收试剂盒按照其操作流程进行产物纯化回收，回收产物，得到连接产物(长链DNA和环状DNA)。通过凝胶电泳，鉴别连接产物片段，结果显示，得到了成功连接的连接产物。
3)标记生物素与扩增：利用Qiagen公司的全基因组扩增试剂盒，反应体系如下：
组分 体积(μl)
步骤2)得到的连接产物 10
2×反应缓冲液(2×Reaction Buffer) 25
Bio-16-dUTP 5
Replig_Enzyme 1
H2O 9
总体积50μl，该反应体系中，除步骤2)得到的连接产物和H2O外的试剂均为全基因组扩增试剂盒中试剂，其中，2×反应缓冲液中含有随机引物，随机引物为由A、C、G和T这四个核苷酸随机组成的长度均为6bp的46条单链DNA所形成的混合物，该混合物中所有单链DNA的摩尔数均相同。混合均匀后，37度恒温孵育16小时以上。反应产物采用DNA回收试剂盒，按照试剂盒的标准操作流程，进行DNA纯化，得到SLC26A4基因捕获探针。采用Nanodrop2000进行定量，并将SLC26A4基因富集探针稀释到
150ng/μl，形成最终的SLC26A4基因捕获探针溶液。
实施例2、SLC26A4基因突变检测方法的建立
1.待测样本全基因组文库构建
该步骤中用到的各试剂均为天根生化科技(北京)有限公司产品。
⑴超声片段化:用1×low TE Buffer(Thermo)将样本DNA稀释到30ng/μL。采用Covaris超声仪进行超声片段化，得到片段化的DNA。(参数设定：6次循环×60s，水浴温度:5℃,占空比:20％，强度:5,模式:Frequency sweeping)
⑵末端修复及末端加“A”:分别取30μL步骤⑴的片段化的DNA、10μL ER-ATReaction Buffer、3μL ER-AT Enzyme Mix、7μL H2O于同一离心管中，进行PCR反应，反应程序为：20℃，30min；72℃，20min；65℃，10min；4℃，Hold。
⑶Adapter的连接:分别取20μL Ligation Reaction Buffer、2μL Adaper(50μM)、3μL T4DNA Ligase Enzyme Mix以及步骤⑵中的全部反应产物于同一离心管中，充分混合后置于22℃的恒温加热器上恒温,7min后纯化。
⑷PCR反应:分别取27μL PCR Reaction Buffer、1μL PCR Enzyme、1μL Barcode、1μL PE 1.0、40μL H2O以及30μL的步骤⑶的纯化产物于同一试管中，进行PCR扩增，扩增程序为：98℃2min，1个循环；98℃30S，8个循环；65℃30S，8个循环；72℃30S，8个循环；72℃5min，1个循环；4℃，HOLD。再将PCR产物进行纯化，得到待测样本的DNA全基因组文库。
2.SLC26A4基因全基因捕获
⑴取500ng步骤1得到的DNA全基因组文库(20μl,25ng/μl)，10μl Buffer BL(迈基诺基因科技股份有限公司)，5μl的实施例1的SLC26A4基因富集探针溶液，6μl BlockingOligo Mix(迈基诺基因科技股份有限公司)于同一离心管中，进行PCR反应，反应程序为：95℃，7min；65℃，2min。再取已65℃预热的Buffer HY溶液(迈基诺基因科技股份有限公司)23μl加入到上述体系中，于PCR仪上65℃杂交22h，得到反应产物。
⑵取50μl MyOne beads(Invitrogen)于新的1.5ml的离心管中，漩涡震荡至少5s，使磁珠充分悬浮，短暂离心后放入磁力架上1min，离心管在磁力架上保持静止(不要旋转离心管)，吸弃上清。
⑶取下离心管，加入50μl的1X Binding Buffer(binding缓冲液)(迈基诺基因科技股份有限公司)，旋窝震荡至少5s，短暂离心后放入磁力架上静止1min，吸弃上清。重复清洗两次(一共三次)。取下离心管，加入100μl 2X Binding Buffer(binding缓冲液)(迈基诺基因科技股份有限公司)，旋窝震荡至少5s，短暂离心后将全部液体转入一个新的离心管中。
⑷将步骤⑴的反应产物完全转入磁珠的离心管中(总体积约200μl，同时处理多个样本时，混合后轻弹几下混匀)，旋窝震荡至少5s(不用离心)，置于Rotator上室温旋转1小时。
⑸利用WB1buffer(迈基诺基因科技股份有限公司)室温清洗磁珠一次，然后在WB3buffer(迈基诺基因科技股份有限公司)中洗3次，65℃，15min/次，磁珠上捕获目的DNA。
⑹将磁珠上捕获的DNA利用Buffer Elute(迈基诺基因科技股份有限公司)洗脱。将洗脱后的DNA进行PCR扩增，扩增程序如下:98℃，30s(1cycle)；98℃，25s,；65℃，30s；72℃，30s(15cycles)；72℃，5min(1cycle)。所用引物为Illumina通用引物。PCR产物利用SPRIbeads(Beckman Coulter)进行纯化，得到富集SLC26A4基因片段文库。
其中，步骤2中所用各试剂的配方如下：
3.步骤2中得到的富集SLC26A4基因片段进行高通量测序
将步骤2中得到的富集SLC26A4基因片段通过Illumina HiSeq2500/Hiseq4000/Nextseq500/X Ten，将得到测序数据进行如下分析：
⑴数据预处理：
从测序仪中获取原始短序列，再用Fastq-Mcf去除接头、低质量以及短序列(<40bp)数据；QC统计序列的数量及测序质量。
⑵Mapping
用BWA软件将预处理后的数据与人基因组(hg19)进行比对，得到比对后的Sam文件；Samtools软件可将Sam文件转换为Bam文件并排序；Bamtools软件对Bam文件进行过滤(-isMapped true-isPaired true-isProperPair true)；用Picard/MarkDuplicates.jar工具去除(或Mark)PCR扩增产生的冗余序列，消除由文库扩增而导入的突变，降低假阳性发生概率。Picard提供的多个工具可对Bam文件进行修改，使之适合于后续的GATK软件包中的工具的处理。
⑶Indel区域的序列重新做局部多序列比对
Indel的边缘存在一些错配看起来很像是SNP的序列，通过对dbSNP库及Bam文件检测到的Indel附件的序列进行局部重比对，消除Indel周边的假阳性SNP。此步骤需用GATK的Realigner Target Creator和Indel Realigner工具进行。
⑷碱基质量值重新打分
测序仪给出的序列中的碱基Qual值存在一定的偏差，GATK的Base Recalibrator工具通过经验的错误模型重新计算碱基Qual值，对质量值进行校正。
⑸Call SNP和INDEL
GATK的Haplotype Caller检测SNP和Indel；
GATK的Variant Filtration过滤SNP和Indel结果，参数–Filter Expression"MQ0>＝4&&((MQ0/(1.0*DP))>0.1)"–Filter Name“HARD_TO_VALIDATE”–Filter Expression"DP<5"–Filter Name"Low Coverage"–Filter Expression"QUAL<30.0"–Filter Name"VeryLow Qual"–Filter Expression"QUAL>30.0&&QUAL<50.0"–Filter Name"Low Qual"–Filter Expression"QD<1.5"–Filter Name"Low QD"–Filter Expression"FS>10.0"–Filter Name"Strand Bias"。用Annovar和自编脚本对SNP和INDEL结果进行注释，关联到多个数据库。
实施例3、利用实施例1的捕获探针与实施例2的方法检测临床样本的基因突变
经知情同意，选择大前庭水管综合征临床发病患者3例(Sanger测序为阳性、Q-PCR检测阳性)，应用本发明的实施例2的SLC26A4基因突变检测方法进行检测。3例检测样本的高通量测序图见图1，数据分析结果见表1和表2。其中，对照样本是指经Sanger测序的SLC26A4基因未突变的阴性样本。
结果发现：1例(样本编号为G161027C02001)纯合缺失突变，突变范围chr7:107314280-107315730区域，该区域包括5-6号外显子；1例(样本编号为G161027C01501)点突变并伴有杂合缺失突变，点突变为：c.919-2A>G，即编码区第919-2号核苷酸由腺嘌呤核苷酸变异为鸟嘌呤核苷酸，导致氨基酸改变splicing(剪接突变)，该变异不属于多态性位点，在人群中发生频率极低，杂合缺失范围chr7:107303705-107313630区域，该区域包括3-4号外显子；另1例(样本编号为G161027C03101)包含1个纯合突变和1个杂合缺失，杂合突变的核苷酸变化为c.1174A>T(编码区第1174号核苷酸由腺嘌呤核苷酸变异为胸腺嘧啶核苷酸)，导致氨基酸改变p.N392Y(第392号氨基酸由天冬酰胺变异为酪氨酸)，为错义突变，该变异不属于多态性位点，在人群中发生频率极低；杂合缺失的区域为chr7:107318501-107331018区域(该区域包括7-10号外显子)。上述结果与Sanger测序和Q-PCR结果一致，证明了本试剂盒的准确性、有效性。
其中Sanger测序通过在各突变位点上下游设计引物，对相应样本的基因组DNA进行PCR扩增，并对PCR扩增产物进行测序。
其中，Q-PCR检测突变的方法为通过在各突变位点上下游设计引物，对相应样本的基因组DNA利用Q-PCR进行检测，将待检基因Ct值与内参基因Ct值相减，得△Ct值；再用实验组的△Ct减去对照组的△Ct得到△△Ct，根据公式计算结果，确定样本相应位点的突变情况。
结果发现，各PCR扩增产物的检测结果(图2-图4)与利用实施例2的方法检测的突变的结果完全一致。
表1、SLC26A4基因突变检测
现有的检测技术只能确定SLC26A4基因外显子是否发生突变，而本发明提供的SLC26A4全基因突变检测方法既能准确判断外显子的突变情况，又能精确定位至断裂点区域和片段大小。因此，本发明的捕获探针与SLC26A4基因突变方法，能够一步检测SLC26A4基因突变携带者的全部突变情况，并对相关断裂点进行准确定位，避免假阴性、假阳性出现，有利于分析SLC26A4基因遗传变异机制。
表2、测序数据
表2中参数说明：
A.测序数据量是指完成SLC26A4基因捕获的样本进行测序时产生的总的测序数据；
B.覆盖率：覆盖目的碱基数/目的碱基数；
C.目的碱基数：指探针设计所要覆盖到的目的区域的总碱基数；
D.覆盖目的碱基数：指经过富集测序后，能够成功比对到设计所要覆盖的碱基区域的碱基数；
E.捕获效率(有效数据量)：覆盖目的碱基数/测序数据量
F.测序平均深度：指目的区域测序时，平均所读取到的次数；
G.平均覆盖4X比例：指最少读到4次以上的碱基数占比；
H.平均覆盖10X比例：指最少读到10次以上的碱基数占比；
I.平均覆盖20X比例：指最少读到20次以上的碱基数占比；
探针质量评估：
SLC26A4基因捕获探针对SLC26A4基因的捕获均达到了95％以上覆盖，最高达到了98.06％；其捕获效率均在42％以上，从至少覆盖到4X、10X和20X的参数来看，平均覆盖比例分别达到94％、90％和89％以上，探针的整体均一性非常好，具有很好的稳定性。表明，本发明的DMD基因捕获探针可以用于捕获DMD基因及DMD基因突变位点的检测。

Claims (10)

1.SLC26A4基因捕获探针，所述捕获探针的制备方法包括：制备N个亚探针，连接所述N个亚探针，得到SLC26A4基因捕获探针；N为大于等于2的一个自然数；
所述N个亚探针满足所述N个亚探针能覆盖所述SLC26A4基因的全部序列。
2.根据权利要求1所述的SLC26A4基因捕获探针，其特征在于：在所述SLC26A4基因上任何两个相邻的亚探针均满足上游亚探针的下游有一个或多个核苷酸与下游亚探针的上游重叠。
3.根据权利要求1或2所述的SLC26A4基因捕获探针，其特征在于：所述N个亚探针的长度均为50-150bp。
4.根据权利要求1-3中任一所述的SLC26A4基因捕获探针，其特征在于：所述N个亚探针的长度均为108bp。
5.根据权利要求1-4中任一所述的SLC26A4基因捕获探针，其特征在于：所述N个亚探针的序列均满足：
第1条单链亚探针的序列为SLC26A4基因的第1-108位；
第2条单链亚探针的序列为SLC26A4基因的第106-213位；
第3条单链亚探针的序列为SLC26A4基因的第211-318位；
……
第n条单链亚探针的序列为SLC26A4基因的第【105(n-1)+1】-【105(n-1)+108】位；
……
第543条单链亚探针的序列为SLC26A4基因的第56911-57018位；
第544条单链亚探针的序列为SLC26A4基因的第57016-57123位；
第545条单链亚探针的序列为SLC26A4基因的第57065-57172位；
其中，n为1-544中的任一个自然数。
6.权利要求1-5中任一所述的N个亚探针。
7.SLC26A4基因突变检测系统，包括权利要求1-5中任一所述的SLC26A4基因捕获探针或所述的N个亚探针。
8.权利要求1-5中任一所述捕获探针的制备方法。
9.SLC26A4基因突变检测方法，包括利用权利要求1-5中任一所述SLC26A4基因捕获探针捕获待测样本的SLC26A4基因，然后对捕获的SLC26A4基因进行测序，确定所述待测样本的SLC26A4基因的突变。
10.下述任一应用：
X1、权利要求1-5中任一所述SLC26A4基因捕获探针或所述N个亚探针在检测SLC26A4基因突变中的应用；
X2、权利要求1-5中任一所述SLC26A4基因捕获探针或所述N个亚探针在制备检测SLC26A4基因突变产品中的应用；
X3、权利要求1-5中任一所述SLC26A4基因捕获探针或所述N个亚探针在诊断或辅助诊断大前庭水管综合征中的应用；
X4、权利要求1-5中任一所述SLC26A4基因捕获探针或所述N个亚探针在制备诊断或辅助诊断大前庭水管综合征产品中的应用；
X5、权利要求7所述系统在检测SLC26A4基因突变中的应用；
X6、权利要求7所述系统在制备检测SLC26A4基因突变产品中的应用；
X7、权利要求7所述系统在诊断或辅助诊断大前庭水管综合征中的应用；
X8、权利要求7所述系统在制备诊断或辅助诊断大前庭水管综合征产品中的应用；
X9、权利要求9所述方法在诊断或辅助诊断大前庭水管综合征中的应用。
CN201710242214.3A 2017-04-12 2017-04-12 Slc26a4基因捕获探针及其在slc26a4基因突变检测中的应用 Pending CN106929588A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710242214.3A CN106929588A (zh) 2017-04-12 2017-04-12 Slc26a4基因捕获探针及其在slc26a4基因突变检测中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710242214.3A CN106929588A (zh) 2017-04-12 2017-04-12 Slc26a4基因捕获探针及其在slc26a4基因突变检测中的应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN106929588A true CN106929588A (zh) 2017-07-07

Family

ID=59437398

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710242214.3A Pending CN106929588A (zh) 2017-04-12 2017-04-12 Slc26a4基因捕获探针及其在slc26a4基因突变检测中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106929588A (zh)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1837375A (zh) * 2005-12-22 2006-09-27 中国人民解放军总医院 前庭导水管扩大相关基因突变及其检测方法
CN105200040A (zh) * 2015-10-22 2015-12-30 安诺优达基因科技(北京)有限公司 一种用于在单细胞水平上同时检测多种耳聋基因的试剂盒
CN105441540A (zh) * 2015-12-04 2016-03-30 长沙迪安医学检验所有限公司 检测非综合症型耳聋基因多态性的试剂盒及其应用
CN105441432A (zh) * 2014-09-05 2016-03-30 天津华大基因科技有限公司 组合物及其在序列测定和变异检测中的用途
CN106520978A (zh) * 2016-11-29 2017-03-22 北京迈博恒业科技有限责任公司 靶dna富集探针的制备方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1837375A (zh) * 2005-12-22 2006-09-27 中国人民解放军总医院 前庭导水管扩大相关基因突变及其检测方法
CN105441432A (zh) * 2014-09-05 2016-03-30 天津华大基因科技有限公司 组合物及其在序列测定和变异检测中的用途
CN105200040A (zh) * 2015-10-22 2015-12-30 安诺优达基因科技(北京)有限公司 一种用于在单细胞水平上同时检测多种耳聋基因的试剂盒
CN105441540A (zh) * 2015-12-04 2016-03-30 长沙迪安医学检验所有限公司 检测非综合症型耳聋基因多态性的试剂盒及其应用
CN106520978A (zh) * 2016-11-29 2017-03-22 北京迈博恒业科技有限责任公司 靶dna富集探针的制备方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ALEJANDRA PERA ET AL: "A mutational analysis of the SLC26A4 gene in Spanish hearing-impaired families provides new insights into the genetic causes of Pendred syndrome and DFNB4 hearing loss", 《EUROPEAN JOURNAL OF HUMAN GENETICS》 *
YONGYI YUAN ET AL: "Molecular Epidemiology and Functional Assessment of Novel Allelic Variants of SLC26A4 in Non-Syndromic Hearing Loss Patients with Enlarged Vestibular Aqueduct in China", 《PLOS ONE》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106834507B (zh) Dmd基因捕获探针及其在dmd基因突变检测中的应用
CN105671176A (zh) 一种用于检测alk融合断裂点的探针组及试剂盒
CN113362891A (zh) 用短读测序数据检测重复扩增
TR201807917T4 (tr) Maternal numunelerde fetal nükleik asitlerin fraksiyonunu belirleme yöntemleri.
CN105779590A (zh) 一种用于人类线粒体基因检测的捕获探针组及试剂盒
WO2021232388A1 (zh) 确定胚胎细胞染色体中预定位点碱基类型的方法及其应用
WO2013041021A1 (zh) 一种分析基因表达定量的方法
Jones et al. A verified genomic reference sample for assessing performance of cancer panels detecting small variants of low allele frequency
CN114026646A (zh) 用于评估肿瘤分数的系统和方法
Raza et al. Recent advancement in next-generation sequencing techniques and its computational analysis
CN110387438A (zh) 用于肠道病毒高通量测序的多重引物、试剂盒和方法
KR20230117036A (ko) 게놈의 반복 영역들에서의 짧은 판독물들을 시각화하기 위한 방법들 및 시스템들
CN113450871A (zh) 基于低深度测序的鉴定样本同一性的方法
Smart et al. A novel phylogenetic approach for de novo discovery of putative nuclear mitochondrial (pNumt) haplotypes
Pendergrass et al. Phenome-wide association studies: embracing complexity for discovery
CN113564266B (zh) Snp分型遗传标记组合、检测试剂盒及用途
CN110512007A (zh) 一种对犬类基因位点集合数据库
CN108728515A (zh) 一种使用duplex方法检测ctDNA低频突变的文库构建和测序数据的分析方法
CN105950709A (zh) 试剂盒、建库方法以及检测目标区域变异的方法及系统
Weißbach et al. Reliability of genomic variants across different next-generation sequencing platforms and bioinformatic processing pipelines
CN108570496A (zh) 一种遗传性骨病的分子诊断方法及试剂盒
CN107034287A (zh) 用于异烟肼个体化用药一次性检出NAT2常见SNPs的Sanger测序法
CN106929588A (zh) Slc26a4基因捕获探针及其在slc26a4基因突变检测中的应用
KR20220125708A (ko) 차세대 염기서열분석 기반 표적유전자 rna 염기서열 분석 패널 및 분석알고리즘
CN105986032A (zh) 试剂盒、建库方法以及检测目标区域变异的方法及系统

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20180604

Address after: 400026 Chongqing City Jiangbei District East City Ring Road 6, 1 buildings 1-2, 2-2, 3-2, 4-2, 5-2, 6-2

Applicant after: Makino (Chongqing) Gene Technology Co., Ltd.

Address before: 101300 4 floor 402, Mau Hua workshop 7, 1 Cai Da San Jie, Nan Cai Town, Shunyi District, Beijing.

Applicant before: Beijing Maibo Hengye science and technology limited liability company

TA01 Transfer of patent application right
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20170707

RJ01 Rejection of invention patent application after publication