CN110387438A

CN110387438A - 用于肠道病毒高通量测序的多重引物、试剂盒和方法

Info

Publication number: CN110387438A
Application number: CN201910612404.9A
Authority: CN
Inventors: 陆靖; 李晖; 郑焕英; 曾汉日; 易丽娜; 夏昊强; 姚启聪
Original assignee: GUANGDONG PROV DISEASE PREVENTION CONTROL CENTRE; GUANGDONG PROVINCIAL INSTITUTE OF PUBLIC HEALTH
Current assignee: GUANGDONG PROV DISEASE PREVENTION CONTROL CENTRE; GUANGDONG PROVINCIAL INSTITUTE OF PUBLIC HEALTH
Priority date: 2019-07-08
Filing date: 2019-07-08
Publication date: 2019-10-29

Abstract

本发明公开了一种用于高通量检测肠道病毒全基因组的多重引物、试剂盒和高通量测序分析方法。与现有技术相比，本发明不再需要使用特异性的引物有针对性的对某一型别进行一对一检测，而是利用多重PCR通过一次实验将各种肠道病毒亚型进行基因组扩增，对病毒亚型进行准确区分鉴定，其准确率更高，且重复性更好；采取高深度测序，保证足够的检测深度，使假阳性更低；本发明的检测方法不仅实现肠道病毒在基因型别上的快速鉴定，还能够提供病毒的基因组变异位点、多样性及重组结构分析，提供肠道病毒预防和控制的重要科学依据。

Description

用于肠道病毒高通量测序的多重引物、试剂盒和方法

技术领域

本发明涉及病毒基因组高通量测序技术领域，尤其是一种用于高通量测定肠道病毒全基因组的多重引物、试剂盒和高通量测序数据的分析方法。

背景技术

肠道病毒为单股正链RNA病毒，全长约为7.2～8.4kb，其引起的病症非常广泛，除了常见的手足口病外，肠道病毒感染还可引起脑炎、咽峡炎、心肌炎、呼吸道感染等。2008-2018年我国共报道手足口病病例约2000万人，并且由肠道病毒引起的脑炎等其它疾病疫情也持续发生。2019年4月以来，广东省多家医院检测出肠道病毒Echo11，由其引起的肠道病毒院感已导致多起新生儿死亡。因此，肠道病毒是威胁我国公共卫生的重要病原。

目前，人肠道病毒分A-D四个组(species)，其中A、B、C三个组包含95％以上的引起人类致病的肠道病毒，共有上百种基因型别，并且不同基因型别序列差异较大。目前，在我国手足口病病例中已发现30余种肠道病毒基因型，并且仍有部分病例标本中的肠道病毒未能成功鉴定出基因型别。其它病症如心肌炎、脑炎、流感样症状等可由不同型别的肠道病毒感染引起。如何开发高通量多型别通用的分子检测体系从而系统性地描述肠道病毒传染病的病原谱，同时利用病毒基因组序列信息解析病毒变异规律是肠道病毒防控和预警的重点。

目前在肠道病毒检测技术方面，多依靠病毒分离与鉴定、血清学试验以及实时荧光定量PCR反应。病毒分离培养是病毒性疾病诊断的金标准，但其操作繁琐，检测时间长，且阳性率较低。血清方法为传统分型的主要方法，但抗血清的来源很有限，无法满足临床病原诊断的要求。基于肠道病毒基因组的VP1序列，设计针对不同型别的特异引物，通过实时荧光定量PCR技术(Quantitative Real-time PCR)是当前检测肠道病毒型别的主要方法。但随着手足口病流行趋势的改变以及新型别肠道病毒的陆续涌现，RT-PCR方法不再能满足当前肠道病毒监测及分子分型的要求，主要表现在：1、RT-PCR只能针对某一型别肠道病毒设计具有针对性的引物，当前已发现的肠道病毒已多达100余种，当前不具备对所有型别肠道病毒设计探针引物并制备检测试剂盒的条件；2、当前的RT-PCR一次常规反应也只能完成1- 4种肠道病毒的分型，无法对未知型别的肠道病毒样本进行快速全面的鉴定；3、肠道病毒为 RNA病毒，序列变异快，当前针对型别设计的特异RT-PCR探针引物容易在检测过程中形成脱靶，需要每2-3年更新一次；4、RT-PCR只能完成肠道病毒的型别鉴定，无法通过获取病毒的序列信息来解析病毒的变异和传播规律。

高通量测序技术(High-throughput sequencing)又称“下一代”测序技术("Next-generation"sequencing technology)，是科技部十三五规划中重点发展的颠覆性技术。它的发展，实现了同时对几百万甚至数亿条DNA序列进行测序，具有费用低、通量高、速度快、灵敏度高及准确度高等优点。通过高通量测序获取病毒全基因组序列不但可以用于病毒基因分型，更可以精确地描述病毒的分子变异数量及单个位点的变异程度，从而系统的提供病毒变异与感染症状及流行趋势之间的关联。肠道病毒基因型别众多，且变异速度快，如何通过分子检测系统性地描述肠道病毒病原谱，开发高通量、低成本、自动化地获取病毒全基因组序列信息的方法用于精确鉴定多基因型肠道病毒，解析病毒变异和流行规律是肠道病毒传染病防控的重点。目前主要的病毒分离培养、血清学试验以及PT-PCR检测技术仅可对少数肠道病毒型别进行简单的血清型或基因型鉴定，无法进行系统地监测、更无法通过获取病毒基因组序列来研究病毒的分子变异的规律，从而无法实施肠道病毒的有效预警和防控。

发明内容

基于上述问题，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种用于高通量检测肠道病毒全基因组的方法和高通量测序数据分析方法，其可以实现对各种已知或未知肠道病毒型别进行准确筛选和鉴定，为肠道病毒精准的预警和防控提供科学信息和依据。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案包括以下几个方面：

在第一个方面，本发明提供一种多核苷酸，其选自SEQ ID NOs：1～10。需要说明的是，简并碱基R代表:A/G，H代表:A/T/C，Y代表:C/T，N代表:A/T/G/C，S代表:G/C。

优选地，所述多核苷酸对是成对使用的，所述多核苷酸对选自：

SEQ ID NO：1和SEQ ID NO:2；

SEQ ID NO：3和SEQ ID NO:4；

SEQ ID NO：1和SEQ ID NO:5；

SEQ ID NO：6和SEQ ID NO:7；

SEQ ID NO：1和SEQ ID NO:8；以及

SEQ ID NO：9和SEQ ID NO:10。

在第二个方面，本发明提供一种用于检测肠道病毒全基因组的试剂盒，其包含上述的多核苷酸。

优选地，所述试剂盒采用新开发的Multiplex-PCR(多重PCR)方法，包括用于扩增4kb片段的第一引物混合液和用于扩增3.5kb片段的第二引物混合液，所述第一引物混合液由多核苷酸SEQ ID NO：1、2、5和8混合而成，所述第二引物混合液由多核苷酸SEQ ID NO：3、4、6、7、9和10混合而成，达到2次PCR反应可以扩增肠道病毒A、B、C组近百种基因亚型的全基因组，大大优化了对未知肠道病毒基因型的分子鉴定流程。

优选地，所述试剂盒还包含逆转录引物、文库构建试剂和质控品。

优选地，所述逆转录引物的碱基序列如SEQ ID NO:11所示。

优选地，所述文库构建试剂包含末端修复反应液、末端修复酶、连接缓冲液、DNA连接酶、接头、特异性接头、文库扩增反应液、文库扩增酶。

优选地，所述接头由多核苷酸SEQ ID NO:12和13混合而成，所述特异性接头为P5引物和P7引物混合液，所述P5引物的碱基序列如SEQ ID NO:14所示，所述P7引物的碱基序列如SEQ ID NO:15所示，P7引物中Index序列如表3所示。

在第三个方面，本发明提供一种用于检测肠道病毒全基因组的方法，包括以下步骤：

1)针对人肠道病毒A、B、C三组设计并合成通用引物，每组包含两对引物，共六对引物，扩增子的长度分别为4kb和3.5kb，以覆盖肠道病毒全基因组；

2)提供待检样本并提取肠道病毒RNA；

3)对步骤2)所得病毒RNA进行逆转录得到cDNA；

4)以步骤3)所得cDNA为模板，利用步骤1)所得六对引物进行多重PCR扩增；

5)混合步骤4)所得扩增产物并纯化，通过超声打断、末端修复以及连接特异性接头，构建测序用文库；

6)将步骤5)所得文库混合后进行高通量测序，得到测序数据；

7)构建自动化分析脚本对步骤6)产生的测序原始数据进行流程分析，具体包括：数据过滤和拆分、病毒基因组拼接组装、聚类分析、病毒分型及多样性分析，最后结合报告数据库出具检测报告。

需要说明的是，本发明的检测方法依据广东省菌毒种保藏库，通过生物信息学分析设计不同组肠道病毒的通用引物，结合多重PCR和二代高通量测序技术，实现两次PCR反应完成A-C组所有型别肠道病毒的全基因组扩增；本申请的发明人还通过脚本编译完成二代测序数据的自动化分析、基因组拼接和分型结果输出，本方法的建立极大的完善了当前肠道病毒的检测和分析技术，为肠道病毒的预警和防控提供了重要的技术支持。

优选地，所述步骤7)中数据分析流程具体包括：

1、原始数据过滤

使用fastp软件对Illumina测序数据进行质控，筛选标准：

1)去除含有接头的reads(1.截去接头及接头后面的部分；2.如果截去后的reads长度小于50就丢弃该reads，否则保留)；

2)去除全部都是A碱基的reads；

3)去除含N比例大于10％的reads；

4)去除低质量的reads(质量值Q≤20的碱基数占整条reads的50％以上)；

2、数据拆分

根据index序列区分不同样本数据，把不同样本reads进行拆分；

3、病毒基因组拼接组装

使用IVA软件进行过滤后序列数据拼接组装，IVA是英国桑格研究所开发的病毒基因组组装软件，适合用来组装无重复序列、覆盖度高且不均匀的病毒基因组；

4、聚类分析

使用Usearch软件对拼接后的基因组序列进行聚类分析，研究是否存在不同毒株的混合感染；

5、病毒分型

使用blastn将聚类后的基因组序列比对到NCBI病毒数据库，根据比对结果确定病毒的亚型，并进行注释，注释包括聚类序列的病毒基因型、序列相似度、reads数量等；

6、多样性分析

用BWA将原始数据比对回组装结果，用GATK call SNP/InDel，可以检测病毒的变异情况。

优选地，所述六对引物为上述第一个方面的多核苷酸，步骤3)中逆转录采用的引物碱基序列如SEQ ID NO：11所示。

综上所述，本发明的有益效果为：

1)本发明提供了一种通用的肠道病毒基因组高通量检测技术和测序方法，该检测方法结合高通量测序技术，以高通量、低成本的方式可以批量、准确而系统地获得肠道病毒的型别及其全基因组序列信息；

2)与现有传统检测技术相比，本发明不再需要使用特异性的引物有针对性的对某一型别进行一对一检测，而是通过一次实验将各种肠道病毒亚型进行准确区分鉴定，其准确率更高，且重复性更好；采取高深度测序，保证足够的检测深度，使假阳性更低；

3)本发明的检测方法不但实现肠道病毒在基因型别上的快速鉴定，更能够提供病毒的基因组变异位点、多样性及重组结构分析，提供肠道病毒预防和控制的重要科学依据；

4)本发明中针对后续高通量测序数据开发的自动分析方法自动化程度高，能够批量完成对大量序列信息的串联分析，操作简便，节省大量人力物力。

附图说明

图1为本发明的检测流程图；

图2为测序数据分析流程图；

图3为多重PCR扩增反应体系1产物(4kb)电泳图，显示扩增产物在3000-5000bp范围内有单条目的条带；

图4为多重PCR扩增反应体系2产物(3.5kb)电泳图，显示扩增产物在3000-5000bp范围内有单条目的条带；

图5为文库片段质控结果图，显示在471bp位置出现单峰；

图6为测序数据质量评价结果图，显示高质量数据达94.92％；

图7为测序数据过滤后碱基分布及碱基质量统计结果图；

图8为对实例3中检测的Echo11病毒基因组不同区段进行系统进化分析所得进化树图，其中，使用不同基因组片段构建系统进化树显示2019院内感染疫情不同患者的Echo11基因组5UTR-2C片段与其它Echo11病毒基因组在同一分支(左图)；但3A-3UTR片段与EVB106在同一分支，通过基因组测序及进化分析表明引起2019院内感染疫情的Echo11病毒为重组病毒；

图9为12例病例标本中测定的肠道病毒分型及基因组序列进化关系结果图，其中A组3例、B组4例、C组5例。

具体实施方式

本发明提供了一种利用高通量测序技术(参见图1)，通过测定肠道病毒的全基因组序列并进行自动化分析的方法(参见图2)及试剂盒，该方法可以实现对各种已知或未知肠道病毒型别进行准确筛选和鉴定，为肠道病毒精准的预警和防控提供科学信息和依据。

在一些实施例中，本发明的肠道病毒全基因组测序方法采用以下技术方案，包括步骤如下：

(1)利用公共数据库及广东省菌毒种库资源通过生物信息学分析识别基因组头尾及中间区域的保守区段，设计针对人肠道病毒A/B/C三组的通用引物，每组包含两对引物为引物对1和引物对2，共六对引物，扩增子的长度分别为4kb和3.5kb，覆盖肠道病毒全基因组；

(2)以咽拭子、粪便样本为待检样本，提取肠道病毒RNA；

(3)采用逆转录试剂将提取的病毒RNA以EV-REVTran特异性引物为引物逆转录为cDNA；

(4)以cDNA为模板，利用肠道病毒A/B/C三组引物对其进行多重PCR扩增，扩增子的长度分别为4kb和3.5kb；

(5)扩增产物混合纯化，通过超声打断，末端修复，连接特异性接头，构建为测序用文库；

(6)将步骤(5)获得的文库混合后进行高通量测序，得到测序数据；

(7)分析测序数据结果，结合报告数据库出具检测报告。

在一个实施方案中，上述关于肠道病毒A/B/C三组包含的亚型分别有：A组的CVA2，CVA6，CVA10(AY421767)，CVA12(AY421768)，CVA3(AY421761)，EVA71(U22521)，CVA8(AY421766)，CVA5(AY421763)，CVA7(AY421765)，EVA120(LK021688)，CVA4(AY421762)，CVA14(AY421769)，CVA16(U05876)，EVA114(KU355876)等；B组的E9(AF524867)，E4(FJ172447)，E6(JQ729993)，EVB80(JX644073)，E25(HM031191)，EVB106(KF990476)，EVB77(AY843302)，CVB6(AF039205)，E26(AY302550)，E27(AY302551)，CVB2(AF085363)，CVB5(AF114383)，CVB3(JX312064)，E20(AY302546)，E33(AY302556)，E29(AY302552)，E19(AY302544)，E32(AY302555)，E7(AF465516)，E31(AY302554)，CVA9(D00627)，E21(AY302547)，E15(AY302541)，E17(AY302543)，E5(HM775882)，EVB82(AY843300)，EVB83(AY843301)，EVB81(AY843299)，E14(AY302540)，E16(AY302542)，E18(HM777023)，CVB4(KP289433)，CVB1(JX976769)，E30(JN704615)，EVB74(JQ397329)，EVB86(AY843304)，EVB100(DQ902713)，EVB87(AY843305)，EVB88(AY843306)，EVB98(AB426608)，EVB97(AY843307)，EVB85(JX898908)，E11(EF634316)，EVB84(DQ902712)，EVB101(AY843308)等；C组的CVA24(EF015040)，EVC99(KF129412)，EVC96(KF495604)，PV1(V01149)，PV3(K01392)，CVA20(AF499642)，PV2(M12197)，CVA17(AF499639)，EVC102(EF555645)，CVA11(AF499636)，CVA13(AF499637)，CVA21(AF546702)，CVA1(AF499635)，CVA19(AF499641)，CVA22(AF546702)，EVC113(KC344833)，EVC116(JX514942)，EVC104(JX982259)，EVC117(JX262382)，EVC105(KM880100)，EVC109(GQ865517)，EVC118(JX678288)等。由此可知，三组肠道病毒A/B/C的型别非常多，本发明的难点和创意之一就在于此，本发明不再需要使用特异性的引物、有针对性的对某一型别进行一对一检测，而是通过一次实验将各种肠道病毒亚型进行准确区分鉴定，相比采用传统方法的一对一检测需要至少100对引物，本发明仅采用6对引物(实际上只有10条引物)即可实现对上述近百种肠道基因型别准确检测，以及基因组序列的准确获取，极大程度上节省了试剂、耗材成本和检测时间成本，其准确率更高，且重复性更好。

在一个实施方案中，针对上述三组病毒的基因组序列进行分析，将其分为4kb和3.5kb的2个片段，分别设计通用引物，共六对，分别为：EVA1：EVInnerF+EVA4532R、EVA2:EVA4499F+EVA7493R、EVB1：EVInnerF+EVB4512R、EVB2:EVB4487F+EVBInnerR、EVC1：EVInnerF+EVC4486R、EVC2:EVC4538F+EVC7524R。

在一个实施方案中，上述六对引物的序列为SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.10，其碱基序列如下表1所示，其中，简并碱基R代表:A/G，H代表:A/T/C，Y代表:C/T，N代表:A/T/G/C，S代表:G/C。

表1简并引物

在一个实施方案中，上述多重PCR扩增过程中，EVA1、EVB1、EVC1三对引物(即SEQID NO.1和2，SEQ ID NO.1和5，SEQ ID NO.1和8)混合进行4kb片段的扩增，EVA2、EVB2、EVC2三对引物(即SEQ ID NO.3和4，SEQ ID NO.6和7，SEQ ID NO.9和10)混合进行3.5kb片段的扩增。

在一个实施方案中，上述逆转录引物为与肠道病毒3’μTR区域polyA区域互补的一段单链核酸序列。

在一个实施方案中，上述逆转录引物序列为SEQ ID NO.11：

TTTTTTTTTTTTTCGCACCGA。

在一个实施方案中，测序数据分析包含对原始测序数据的过滤(去接头、去污染、去低质量数据)、原始测序数据进行碱基质量分析和评估、基因组denovo组装、与nt数据库进行序列比对。

在一些实施例中，本发明提供一种包含上述扩增引物的试剂盒。

在一个实施方案中，所述试剂盒包含逆转录试剂、多重PCR扩增试剂、文库构建试剂、质控品。

在一个实施方案中，所述逆转录试剂包含逆转录引物、逆转录反应液、逆转录酶混合液、dNTP。

在一个实施方案中，所述逆转录引物为EV-REVTran特异性引物。

在一个实施方案中，所述多重PCR扩增试剂包含多重PCR反应液、多重PCR酶、多重PCR引物混合液1、多重PCR引物混合液2。

在一个实施方案中，所述多重PCR引物混合液1由EVA1、EVB1、EVC1三对引物(即SEQID NO.1和2，SEQ ID NO.1和5，SEQ ID NO.1和8)混合而成。

在一个实施方案中，所述多重PCR引物混合液2由EVA2、EVB2、EVC2三对引物(即SEQID NO.3和4，SEQ ID NO.6和7，SEQ ID NO.9和10)混合而成。

在一个实施方案中，所述多重PCR反应体系为：多重PCR反应液13μL，多重PCR酶0.5μL，多重PCR引物混合液(1/2)6μL，cDNA2μL，补RNase-Free H₂O至50μL。

在一个实施方案中，所述多重PCR反应程序为：(I)94℃，1min；(II)98℃，10s；55℃，30s；72℃，4min；30～45个循环；(III)72℃，10min。

在一个实施方案中，所述文库构建试剂包含末端修复反应液、末端修复酶、连接缓冲液、DNA连接酶、接头、特异性接头1-12、文库扩增反应液、文库扩增酶。

在一个实施方案中，所述质控品包含阳性质控品和空白质控品，阳性质控品分别由提取的A组CVA16、B组CVB3、C组CVA22基因型病毒RNA组成，空白质控品由无菌纯化水制备。

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。如无特别说明，本发明中的材料、试剂均可从市场上或其它公开渠道获得；如无特别说明，本发明中的实验方法均为常规方法；如无特别说明，本发明中试剂的浓度均为质量浓度。

实施例1多重PCR引物设计

利用公共数据库(NCBI)及广东省菌毒种库资源获得肠道病毒各种基因型碱基序列，通过生物信息学分析识别基因组头尾及中间的保守区段。不同于过去设计多个引物组通过一代测序的方式完成基因组扩增的方法，也区别于近期发表的通过polyA富集结合二代测序测定病毒基因组的方式，本实施例针对肠道病毒A/B/C三组基因组的保守区段，将肠道病毒全基因组分为4kb和3.5kb两段，在保守区段设计针对人肠道病毒A/B/C三组的通用引物，每组包含两对引物，共六对引物覆盖肠道病毒全基因组，保证引物的通用性及扩增的简便性同时又增加扩增的灵敏度和特异性。经过试验优化筛选，选用的通用引物序列如表1所示。引物由生工生物工程(上海)有限公司进行合成，使用灭菌纯化水配制为10μM的工作液。

实施例2试剂盒制备

本发明中可用于肠道病毒全基因组文库构建和检测的试剂盒的一种实施例，其包含逆转录试剂(逆转录引物、逆转录反应液、逆转录酶混合液、dNTP)、多重PCR扩增试剂(多重PCR反应液、多重PCR酶、多重PCR引物混合液1、多重PCR引物混合液2)、文库构建试剂(末端修复反应液、末端修复酶、连接缓冲液、DNA连接酶、接头、特异性接头1-12、文库扩增反应液、文库扩增酶)。其中，多重PCR引物混合液1由多核苷酸SEQ ID NO.1和2，SEQ ID NO.1和5，SEQ ID NO.1和8混合而成；多重PCR引物混合液2由多核苷酸SEQ ID NO.3和4，SEQ IDNO.6和7，SEQ ID NO.9和10混合而成。

根据实验对比研究，逆转录试剂选择Fisher Scientific公司的Superscript^TMⅣFirst-Strand Synthesis System试剂盒(批号：REF18091050)，通过优化配制为本试剂盒中的逆转录试剂。

根据实验研究，多重PCR扩增试剂中多重PCR反应液采购自Kapa Biosystems公司，多重PCR酶采购自南京诺唯赞生物科技有限公司，多重PCR引物混合液由生工生物工程(上海)有限公司合成的引物配制而成，引物的浓度在1-5μM。

根据实验研究，文库构建试剂中末端修复反应液、末端修复酶、连接缓冲液、DNA连接酶、文库扩增反应液、文库扩增酶采购自南京诺唯赞生物科技有限公司，接头及特异性接头由生工生物工程(上海)有限公司合成。

接头由2个双链DNA片段组成，长度为20-25bp，序列如下：

接头序列1：CAGACGTGTGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO：12)；

接头序列2：CCTACACGACGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO：13)。

特异性接头为P5引物和P7引物混合液，由生工生物工程(上海)有限公司进行合成，使用灭菌纯化水配制为10μM的工作液，使用量为1-3μL。

P5引物序列：

5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCGTACACGACGCTGTTCCGATCT-3′(SEQID NO：14)；

P7引物序列：

5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3(SEQ ID NO：15)。

其中“NNNNNN”为index序列。

Index序列如下表2所示：

表2

Index编号	碱基序列
		1	CGTGAT
2	ACATCG
		3	GCCTAA
4	TGGTCA
		5	CACTGT
6	ATTGGC
		7	GATCTG
8	TCAAGT
		9	CTGAGC
10	AAGCTA
		11	GTAGCC
12	TACAAG

质控品包含阳性质控品和空白质控品，阳性质控品分别由提取的A组CVA16、B组CVB3、C组CVA22基因型病毒RNA组成，空白质控品由无菌纯化水制备。

实施例3 2019肠道病毒院感疫情样本检测

本发明较当前荧光定量PCR(RT-PCR)方法的优势在于提供一种基于高通量检测平台的肠道病毒全基因组通用测序方法，克服了常规RT-PCR需要针对特异的型别设计特异引物探针的缺点。更重要的是肠道病毒全基因组序列的获取不但可以进行肠道病毒型别的准确鉴定，还可以对病毒基因组特点进一步的分析。2019年4月，广东省顺德暴发肠道病毒的院内感染疫情，引起4例新生儿死亡，数十人出现感染症状，造成严重的社会影响。现以此次疫情为例，说明如何使用实施例2中的试剂盒对疫情病原进行快速的序列测定、分型诊断及序列分析。

(1)病毒核酸提取

取2例疫情病例的咽拭子样本，使用QIAGEN公司的QIAamp Viral RNA Mini Kit试剂盒(批号：No.52906)，按照说明书的操作进行RNA提取。

提取的RNA使用超微量紫外分光光度计测定RNA的浓度(≥1ng/μL)和纯度(1.8～2.0)。

(2)逆转录

1)从试剂盒中取出逆转录引物、dNTP(10mM)按下表3配制体系：

表3

试剂	用量
		RNA	1ng-5μg
逆转录引物	1μL
		dNTP(10mM)	1μL
RNase-Free H<sub>2</sub>0	补至10μL

瞬时离心，65℃，5min，迅速置于冰上骤冷，并在冰上静置2min。

2)从试剂盒中取出逆转录反应液、逆转录酶混合液，按下表4配制反应体系：

表4

试剂	用量
		步骤1)反应液	10μL
逆转录反应液	8μL
		逆转录酶混合液	2μL

瞬时离心，在PCR仪上，50℃1h，80℃15min，-20℃保存。

(3)多重PCR扩增

1)从试剂盒中取出多重PCR酶、多重PCR反应液、多重PCR引物混合液1、多重PCR引物混合液2，冰上融化后混匀，瞬时离心，计算需准备反应试剂人份数【n＝样本数+2(对照品数)】；每人份反应体系配制如下表5：

表5

PCR扩增：将各反应放入PCR仪上，按表6中程序进行PCR扩增。

表6

2)质检

配制0.8％的琼脂糖胶，取2μL反应产物上样，100V电泳，15-20min。反应体系1产物应出现单一片段，电泳结果参见图3，反应体系2产品应出现单一片段(电泳结果参见图4)，且片段大小在3000～5000bp之间。

3)PCR产物纯化

室温平衡DNA Clean beads(VAHTSTM DNA Clean Beads(Vazyme#N411)，南京诺唯赞生物科技有限公司)30mins，静置使其温度平衡至室温；

颠倒或旋涡振荡使DNA Clean beads，充分混匀，吸取50μL(1.0×)加到连接产物中，用移液器吹打10次以彻底混匀；

室温孵育10分钟。

磁力架上静置5分钟；待溶液澄清后，保持样品始终处于磁力架中，小心移除上清。

保持样品始终处于磁力架中，加入200μL新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠(注意不要吹散磁珠)，室温孵育30秒，小心移除上清。

重复上一步，总计漂洗2次；

保持样品始终处于磁力架中，开盖空气干燥磁珠5-10分钟。

将样品从磁力架中取出，加入30μL nuclease free水，涡旋振荡或使用移液器吹打充分混匀,室温静置2min。在磁力架上静置5分钟，待溶液澄清后，小心吸取30μL上清至一个新的nuclease free离心管中。

使用Qubit3.0测定纯化后样品的浓度，浓度在10ng/μL以上。

(4)文库构建

1)超声打断

将(3)反应体系1、反应体系2的纯化产物等量混合，配制成DNA在500ng以上，体积50μL的反应液。

使用宁波新芝生物科技股份有限公司的Scientz-ⅡD型超声波细胞粉碎机打断，30％振幅，6min，时间可根据样品适当调整，琼脂糖电泳主峰集中在300～500bp。

2)打断后纯化

室温平衡30mins，静置使其温度平衡至室温。

颠倒或旋涡振荡使DNA Clean beads充分混匀，吸取90μL(1.8×)加到50μL打断产物中，充分混匀。

室温孵育5分钟。

重复上一步，总计漂洗2次；

保持样品始终处于磁力架中，开盖空气干燥磁珠5-10分钟。

将样品从磁力架中取出，加入18μL灭菌超纯水进行DNA洗脱。涡旋振荡或使用移液器吹打充分混匀，室温静置2分钟。将反应管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。静置5分钟，待溶液澄清后，小心吸取16μL上清至一个新的nuclease free离心管中。

使用Qubit3.0测定纯化后样品的浓度。

3)末端修复

从试剂盒取出末端修复反应液、末端修复酶按下表7配制反应体系；

表7

试剂	体积(μL)
		纯化后片段化DNA	X
末端修复反应液	5
		末端修复酶	4
ddH<sub>2</sub>O	To 25

反应程序如下表8所示：

表8

4)接头连接

从试剂盒取出接头、连接缓冲液、DNA连接酶按下表9配制反应体系；

表9

反应试剂	用量(μL)
		末端修复产物	25
接头	2.5
		连接缓冲液	5
DNA连接酶	2.5

反应程序如下表10所示：

表10

5)连接产物纯化及

室温平衡DNA Clean beads 30mins，静置使其温度平衡至室温；

颠倒或旋涡振荡使DNA Clean beads，充分混匀，吸取35μL(1.0×)加到连接产物中，用移液器吹打10次以彻底混匀；

室温孵育10分钟。

重复上一步，总计漂洗2次；

保持样品始终处于磁力架中，开盖空气干燥磁珠5-10分钟。

将样品从磁力架中取出，加入105μL nuclease free水，涡旋振荡或使用移液器吹打充分混匀，室温静置2min。在磁力架上静置5分钟，待溶液澄清后，小心吸取100μL上清至一个新的nuclease free离心管中。

6)片段分选

颠倒或旋涡振荡使DNA Clean beads充分混匀，吸取60μl(0.6×)加到纯化后的连接产物中，使用移液器轻轻吹打10次充分混匀。

室温孵育5分钟。

磁力架上静置5分钟；待溶液澄清后，保持样品始终处于磁力架中，小心转移上清155μL至一个新的nuclease free离心管。

吸取10μL(0.1×)DNA Clean beads至上清中，使用移液器轻轻吹打10次充分混匀。

室温孵育5分钟。

保持样品始终处于磁力架中，加入200μL新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠，室温孵育30秒，小心移除上清。

重复上一步，总计漂洗2次。

保持样品始终处于磁力架中，开盖空气干燥磁珠5-10分钟。

将样品从磁力架中取出，加入36μL灭菌超纯水进行DNA洗脱。涡旋振荡或使用移液器吹打充分混匀，室温静置2分钟。将反应管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。静置5分钟，待溶液澄清后，小心吸取34μL上清至一个新的nuclease free离心管中，请勿触碰DNA Clean beads。

7)文库扩增

从试剂盒取出文库扩增应液、文库扩增引物混合液、文库扩增酶，按下表11配制反应体系：

表11

反应试剂	用量(μL)
		连接反应纯化产物	34
文库扩增应液	11
		文库扩增引物混合液	4
文库扩增酶	1

反应程序如下表12所示：

表12

8)产物纯化

室温平衡DNA Clean beads 30mins,静置使其温度平衡至室温；

颠倒或旋涡振荡使DNA Clean beads充分混匀，吸取45μL(0.9×)加到PCR产物中，使用移液器轻轻吹打10次充分混匀。

室温孵育5分钟。

重复上一步，总计漂洗2次。

保持样品始终处于磁力架中，开盖空气干燥磁珠5-10分钟。

将样品从磁力架中取出，加入17μL灭菌超纯水进行DNA洗脱。涡旋振荡或使用移液器吹打充分混匀，室温静置2分钟。将反应管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。静置5分钟，待溶液澄清后，小心吸取15μL上清至一个新的nuclease free离心管中。

9)质检

使用Qubit3.0测定文库的浓度，文库浓度应≥2ng/μL；使用Qsep100 TM全自动核酸蛋白分析系统分析文库片段分布，片段应为430-490bp的单峰，文库质检结果参见图5。

(5)测序

质检合格的文库使用HiSeq测序仪进行2X 150bp测序。

数据分析，样本测序深度在2000X以上，Q30>80％，符合质控要求。

数据分析软件：Fastp、IVA、Blastn、BWA、GATK，Linux操作系统。

数据分析流程如图2所示，包括如下几个方面：

1、原始数据过滤

使用fastp软件对Illumina测序数据进行质控，筛选标准：

2)去除全部都是A碱基的reads；

3)去除含N比例大于10％的reads；

2、数据拆分

根据index序列区分不同样本数据，把不同样本reads进行拆分。

3、病毒基因组拼接组装

使用IVA软件进行过滤后序列数据拼接组装，IVA是英国桑格研究所开发的病毒基因组组装软件，适合用来组装无重复序列、覆盖度高且不均匀的病毒基因组。

4、聚类分析

使用Usearch软件对拼接后的基因组序列进行聚类分析，研究是否存在不同毒株的混合感染。

5、病毒分型

使用blastn将聚类后的基因组序列比对到NCBI病毒数据库，根据比对结果确定病毒的亚型，并进行注释，注释包括聚类序列的病毒基因型、序列相似度、reads数量等。

6、多样性分析

结果如表13、图6和图7所示，A1和B1样本分别得到了一条长度为6954bp和7034bp的近全长序列，包含完整的编码区序列，经过比对到数据库分析发现两样本之间相似性为99.9％，序列同源，结合流行病学信息可判断为院内感染。病毒基因组序列与KX5327626(Echovirus E11)序列的E-value＝0，相似度为88.9％，所以判定这两份病例为Echo11病毒感染，且序列高度同源。同时与Genebank数据库中的Echo11序列比存在一定差异。通过后续进一步的进化分析可以看到，此次院感疫情的病毒为重组的Echo11病毒(参见图8)。

表13

实施例4 12例临床样本检测

本实施例中针对12例临床样本：咽拭子(6)和粪便(6)样本，采用实施例3中试剂盒的使用方法进行检测。

具体操作步骤同实施例3：样本测序深度均在2000X以上，Q30>80％，符合质控要求。

结果如表14和图9所示，12例样本各得到一条基因组序列，长度在6958～7051bp。将待测样本的序列与A组CVA16、B组CVB3、C组CVA22序列进化树分析发现样本1、5、6、9、11和CVA22聚类到一起，说明样本1、5、6、9、11属于肠道病毒C组；样本3、10、12和CVA16聚类到一起，说明样本3、10、12属于肠道病毒A组；样本2、4、7、8和CVB3聚类到一起，说明样本2、4、7、8属于肠道病毒B组。

表14

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims

1.多核苷酸，其选自SEQ ID NOs：1～10。

2.权利要求1所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸对是成对使用的，所述多核苷酸对选自：

SEQ ID NO：1和SEQ ID NO:2；

SEQ ID NO：3和SEQ ID NO:4；

SEQ ID NO：1和SEQ ID NO:5；

SEQ ID NO：6和SEQ ID NO:7；

SEQ ID NO：1和SEQ ID NO:8；以及

SEQ ID NO：9和SEQ ID NO:10。

3.用于检测肠道病毒全基因组的试剂盒，其包含权利要求1或2的多核苷酸。

4.权利要求3的试剂盒，其包含针对用于扩增4kb片段的第一引物混合液和用于扩增3.5kb片段的第二引物混合液，所述第一引物混合液由多核苷酸SEQ ID NO：1、2、5和8混合而成，所述第二引物混合液由多核苷酸SEQ ID NO：3、4、6、7、9和10混合而成。

5.权利要求3或4的试剂盒，其还包含逆转录引物、文库构建试剂和质控品。

6.权利要求5的试剂盒，其中所述逆转录引物的碱基序列如SEQ ID NO:11所示。

7.权利要求5的试剂盒，其中所述文库构建试剂包含末端修复反应液、末端修复酶、连接缓冲液、DNA连接酶、接头、特异性接头、文库扩增反应液、文库扩增酶。

8.权利要求7的试剂盒，其中所述接头由多核苷酸SEQ ID NO:12和13混合而成，所述特异性接头为P5引物和P7引物混合液，所述P5引物的碱基序列如SEQ ID NO:14所示，所述P7引物的碱基序列如SEQ ID NO:15所示，P7引物中Index序列如表2所示。

9.用于检测肠道病毒全基因组的方法，包括以下步骤：

2)提供待检样本并提取肠道病毒RNA；

3)对步骤2)所得病毒RNA进行逆转录得到cDNA；

6)将步骤5)所得文库混合后进行高通量测序，得到测序数据；

10.权利要求9的方法，其中所述六对引物为权利要求1或2的多核苷酸，步骤3)中逆转录采用的引物碱基序列如SEQ ID NO：11所示。