CN105176984A - 一种gii.17型诺如病毒基因组扩增引物和扩增方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种GII.17型诺如病毒基因组扩增引物和扩增方法。本发明分别以七对引物作为扩增引物的上下游引物，以GII.17型诺如病毒的RNA为模板进行RT-PCR扩增，分别得到扩增产物，然后对扩增产物进行核酸序列测序，然后再拼接比对，得到GII.17型诺如病毒基因组全长序列。本发明针对新出现的GII.17型诺如病毒流行基因型，根据基因组所包含的三个开放阅读框设计了“4+1+1”的分段扩增策略，根据保守区域设计相应的扩增引物，将该扩增引物应用于实际检出样本，获得了GII.17型诺如病毒基因组序列。本发明方法具有操作简单、周期短、成本低以及灵敏度高的特点，可广泛应用于医疗卫生、检验检疫等具有诺如病毒检测需求及相应的科研领域。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种GII.17型诺如病毒基因组扩增引物和扩增方法。
背景技术
诺如病毒(Norovirus)是全球散发性与流行性胃肠炎的重要食源性病原之一。NoV的危害主要在于其极强的传播能力，美国疾病控制中心已于2006年将其列为生物恐怖B类因子。该病毒可感染各年龄段人群，主要临床表现为呕吐、腹泻、发热等，对儿童、老人及免疫缺陷人群还易造成脱水性死亡。据报道，诺如病毒每年至少造成2.3亿人次的感染，在发展中国家更是导致20万例以上5岁以下儿童的死亡，对公共卫生安全造成了极大的威胁。至目前为止，还没有有效的抗病毒药物及治疗手段。
作为RNA病毒，诺如病毒具有丰富的遗传多样性，根据其衣壳蛋白序列同源性可将病毒分成GI-GVI的6个基因组(Genogroup)，而GI、GII和GIV可感染人类。每个基因组又可进一步分成不同的基因型(Genotype)，例如GI含有9个基因型，GII含有23个(并不断增加)。其中，GII.4型被报道是全球近二十年来的主要流行基因型，约80％的诺如病毒感染是由这种型别的毒株引起的，并且该病毒每隔两三年就会产生一种新的变异株，同时造成一轮大范围的病毒流行。然而引起注意的是，2014年底在中国、日本、韩国等地暴发了多起由一种新型GII.17诺如病毒流行株引起的胃肠炎疫情，同时散发性病例中也证实了该型别毒株的广泛存在。有学者提出了疑问，是否这种新型别毒株将替代已流行近二十年的GII.4型呢？因此，充分积累GII.17型毒株的基因组信息，掌握其自身变异特点以及与原流行株GII.4的差异，将对这种新流行株的预防与控制具有重要意义。
诺如病毒基因组长约7.5-7.8kb，包括3个开放阅读框。目前报道的基因组扩增方法有直接扩增法以及分段扩增法，其中我们前期工作中针对GII.4型诺如病毒建立的“4+1+1”扩增策略具有操作简单、周期短、成本低以及灵敏度高的特点。而对于新流行基因型GII.17，目前还未有关于其扩增方法的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种高灵敏度的GII.17型诺如病毒基因组扩增引物和扩增方法。
本发明的GII.17型诺如病毒基因组扩增引物，其特征在于，包括七对扩增引物：
引物对1：II-P1F：5'-GTGAATGAAGATGGCGTCTAAC-3'；
II.17-1R：5'-GCAACTTTCTTGGCTAGCTC-3'；
引物对2：II.17-2F：5'-CATACATGAGGACTCTTGAC-3'；
II.17-2R：5'-CTTAGCAATGGCAAGCTC-3'；
引物对3：II.17-3F：5'-CAGGGATGAAGATGACCTCAC-3'；
II.17-3R：5'-GAGACCACCAAATGCTCTG-3'；
引物对4：II.17-4F：5'-CCTCGACAAGACAACCTCC-3'；
G2SKR：5'-CCRCCNGCATRHCCRTTRTACAT-3'；
引物对5：NV2of2：5'-GGAGGGCGATCGCAATC-3'；
GV132：5'-CCRGCRAAGAAAGCTCCAGCCAT-3'；
引物对6：II.17-6F：5'-GCTCACTCTGGAGACTATC-3'；
II.17-6R：5'-TCACTAAACACGTGACTCC-3'；
引物对7：II.17-Seq1R：5'-ACTTCTCTCTGGCTAAGTGG-3'；
II.17-Seq6F：5'-CAACCAAGCAGCTGCAATC-3'；
R代表A/G，H代表A/C/T，N代表碱基A/C/T/G。
本发明的第二个目的是提供一种GII.17型诺如病毒基因组的扩增方法，其特征在于，分别以上述引物对II-P1F/II.17-1R、II.17-2F/II.17-2R、II.17-3F/II.17-3R、II.17-4F/G2SKR、NV2of2/GV132、II.17-6F/II.17-6R和II.17-Seq1R/II.17-Seq6F作为扩增引物的上下游引物，以GII.17型诺如病毒的RNA为模板进行RT-PCR扩增，分别得到扩增产物，然后对扩增产物进行核酸序列测定，再拼接比对，得到GII.17型诺如病毒基因组全长序列。
优选，所述的RT-PCR，其反应体系为：含有2×one-stepRT-PCRmixture10μL，10μmol/L上游引物和10μmol/L下游引物各0.6μL，MLV/RNasin/HS-Taq酶混合液0.8μL，RNA模板2μL，其余由双蒸水补足至20μL；反应条件为：50℃反转录30min，94℃预变性3min，然后94℃30s、55℃30s、72℃80s，共30次循环后，72℃最后延伸7min。
本发明针对我国2014/2015年冬季新出现的GII.17型诺如病毒流行基因型，根据基因组所包含的三个开放阅读框设计了“4+1+1”的分段扩增策略，根据保守区域设计相应的扩增引物，将该扩增引物应用于实际检出样本，获得了GII.17型诺如病毒基因组序列。利用该扩增引物扩增GII.17型诺如病毒基因组序列的方法具有操作简单、周期短、成本低以及灵敏度高的特点。本发明可广泛应用于医疗卫生、检验检疫等具有诺如病毒检测需求及相应的科研领域。
附图说明
图1是GII.17型诺如病毒基因组扩增策略及相应引物的设计位置。
图2是适用于GII.17型诺如病毒基因组扩增用引物的RT-PCR灵敏度分析。电泳顺序为M，1-42；其中M为DNALadder，1-6、7-12、13-18、19-24、25-30、31-36、37-42分别为基因组扩增引物II-P1F/II.17-1R、II.17-2F/II.17-2R、II.17-3F/II.17-3R、II.17-4F/G2SKR、NV2of2/GV132、II.17-6F/II.17-6R和检测引物G2SKF/G2SKR在病毒RNA不同稀释度(依次为101—106倍稀释)下扩增产物的电泳结果。
图3是实际样本中病毒基因组的扩增效果。电泳顺序为M，1-18；其中M为DNALadder，1-6、7-12、13-18依次为实际样本L324、L337、L343进行“4+1+1”策略扩增基因组6个产物的电泳结果。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：GII.17型诺如病毒基因组扩增策略及相应引物的设计
(1)GII型诺如病毒基因组约7.5kb，包括三个ORF，其中ORF1长约5.1kb，ORF2长约1.6kb，ORF3长约0.8kb。以一代桑格脱氧核苷酸测序法为基础，则每个扩增片段设计为1.3kb-1.6kb，其中ORF1分为4个片段，ORF2和ORF3均为1个片段。此外，为获得基因组5'和3'端完整序列，分别在基因组两端设计扩增长度在100-800bp的片段，相应引物分别命名为II.17-Seq1R和II.17-Seq6F。具体基因组分段策略及相应引物位置可见图1。
(2)在建立扩增策略的基础上，根据Oligo软件设计相应的引物，具体引物信息见表1。其中，引物核苷酸序列中的R代表A/G，H代表A/C/T，N代表碱基A/C/T/G。
表1GII.17型诺如病毒基因组扩增用引物信息
a位置参考GII.17的代表序列-KP998539-HK-2014。
实施例2：适用于GII.17型诺如病毒基因组扩增用引物的RT-PCR灵敏度分析
(1)病毒样本处理及核酸提取：通过PBS溶液(pH7.4，DEPC处理)稀释收集的待处理样品(含有GII.17型诺如病毒L324)至10％(w/v)浓度，充分振荡混匀，于12000×g下离心10min收集上清液140μL，并通过RNA提取试剂盒抽提样本中病毒RNA共60μL，并进行10×梯度的适当稀释处理。
(2)“4+1+1”基因组分段扩增法(即分6段扩增，所使用的引物配组如下：II-P1F/II.17-1R、II.17-2F/II.17-2R、II.17-3F/II.17-3R、II.17-4F/G2SKR、NV2of2/GV132和II.17-6F/II.17-6R，每次RT-PCR反应选择一对引物)：采用20μL的一步法RT-PCR反应体系，含有2×one-stepRT-PCRmixture10μL，上游引物和下游引物(10μmol/L)各0.6μL，MLV/RNasin/HS-Taq酶混合液0.8μL，样本RNA模版2μL，其余由ddH2O补足。
反应条件为：50℃反转录30min，94℃预变性3min，然后94℃30s、55℃30s、72℃80s，共30次循环后，72℃最后延伸7min。
以检测引物G2SKF/G2SKR(G2SKR：5'-CCRCCNGCATRHCCRTTRTACAT-3'；G2SKF：5'-CNTGGGAGGGCGATCGCAA-3')作为对照，按照上述体系和反应条件进行。
(3)电泳、PCR产物序列测定：取扩增产物5μL，1.0％的琼脂糖凝胶(含0.05‰GoldView核酸染料)进行电泳，并通过凝胶成像系统观察结果。按引物对II-P1F/II.17-1R、II.17-2F/II.17-2R、II.17-3F/II.17-3R、II.17-4F/G2SKR、NV2of2/GV132和II.17-6F/II.17-6R的顺序，诺如病毒基因组扩增条带依次为1551bp、1511bp、1597bp、1483bp、1680bp、908bp。电泳结果如图2，基因组扩增引物能检出的样本最低稀释度与常用检测引物G2SKF/G2SKR(G2SKR：5'-CCRCCNGCATRHCCRTTRTACAT-3'；G2SKF：5'-CNTGGGAGGGCGATCGCAA-3')一致，均为103倍稀释，这表明新设计引物可达到检测引物的灵敏度。
实施例3：实际样本中病毒基因组的扩增效果
(1)病毒样本处理及核酸提取：取GII.17型诺如病毒阳性样本L324、L337、L343，通过PBS溶液(pH7.4，DEPC处理)稀释待处理样品至10％(w/v)浓度，充分振荡混匀，于12000×g下离心10min收集上清液140μL，并通过RNA提取试剂盒抽提样本中病毒RNA共60μL。
(2)“4+1+1”因组分段扩增法(即分6段扩增，所使用的引物配组如下：II-P1F/II.17-1R、II.17-2F/II.17-2R、II.17-3F/II.17-3R、II.17-4F/G2SKR、NV2of2/GV132和II.17-6F/II.17-6R，另外添加II.17-seq1R/II.17-seq6F一对引物，用于扩增补充完整基因组的5'与3'端序列，每次RT-PCR反应选择一对引物)：采用20μL的一步法RT-PCR反应体系，含有2×one-stepRT-PCRmixture10μL，上游引物和下游引物(10μmol/L)各0.6μL，MLV/RNasin/HS-Taq酶混合液0.8μL，样本RNA模版2μL，其余由ddH2O补足。
反应条件为：50℃反转录30min，94℃预变性3min，然后94℃30s、55℃30s、72℃80s，共30次循环后，72℃最后延伸7min。
(3)电泳、PCR产物序列测定：取扩增产物5μL，1.0％的琼脂糖凝胶(含0.05‰GoldView核酸染料)进行电泳，并通过凝胶成像系统观察结果。按引物对II-P1F/II.17-1R、II.17-2F/II.17-2R、II.17-3F/II.17-3R、II.17-4F/G2SKR、NV2of2/GV132和II.17-6F/II.17-6R的顺序，诺如病毒基因组扩增条带依次为1551bp、1511bp、1597bp、1483bp、1680bp、908bp。电泳结果如图3，II.17-seq1R/II.17-seq6F的扩增产物也被扩增出来，结果表明，三份样本均成功获得扩增。
(4)基因组序列拼接与比对：对三份样本通过引物对II-P1F/II.17-1R、II.17-2F/II.17-2R、II.17-3F/II.17-3R、II.17-4F/G2SKR、NV2of2/GV132、II.17-6F/II.17-6R和II.17-seq1R/II.17-seq6F的扩增产物测序并拼接，分别获得三条基因组序列；样本L324基因组长度为7498bp，其基因组核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；样本L337基因组长度为7495bp，其基因组核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；样本L343基因组长度为7495bp，其基因组核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。将三条基因组序列分别提交进行BLAST分析，结果表明，GII.17型诺如病毒L324、L337和L343分别与Genbank登录号为：KP998539.1(香港)、LC037415.1(日本)、KR020503.1(广州)及KR083017.1(美国)等GII.17型诺如病毒毒株基因组序列达到99％的相似度。
Claims (3)
1.一种GII.17型诺如病毒基因组扩增引物，其特征在于，包括七对扩增引物：
引物对1：II-P1F：5′-GTGAATGAAGATGGCGTCTAAC-3′；
II.17-1R：5′-GCAACTTTCTTGGCTAGCTC-3′；
引物对2：II.17-2F：5′-CATACATGAGGACTCTTGAC-3′；
II.17-2R：5′-CTTAGCAATGGCAAGCTC-3′；
引物对3：II.17-3F：5′-CAGGGATGAAGATGACCTCAC-3′；
II.17-3R：5′-GAGACCACCAAATGCTCTG-3′；
引物对4：II.17-4F：5′-CCTCGACAAGACAACCTCC-3′；
G2SKR：5′-CCRCCNGCATRHCCRTTRTACAT-3′；
引物对5：NV2of2：5′-GGAGGGCGATCGCAATC-3′；
GV132：5′-CCRGCRAAGAAAGCTCCAGCCAT-3′；
引物对6：II.17-6F：5′-GCTCACTCTGGAGACTATC-3′；
II.17-6R：5′-TCACTAAACACGTGACTCC-3′；
引物对7：II.17-Seq1R：5′-ACTTCTCTCTGGCTAAGTGG-3′；
II.17-Seq6F：5′-CAACCAAGCAGCTGCAATC-3′；
R代表A/G，H代表A/C/T，N代表碱基A/C/T/G。
2.一种GII.17型诺如病毒基因组的扩增方法，其特征在于，分别以权利要求1所述的引物对II-P1F/II.17-1R、II.17-2F/II.17-2R、II.17-3F/II.17-3R、II.17-4F/G2SKR、NV2of2/GV132、II.17-6F/II.17-6R和II.17-Seq1R/II.17-Seq6F作为扩增引物的上下游引物，以GII.17型诺如病毒的RNA为模板进行RT-PCR扩增，分别得到扩增产物，然后对扩增产物进行核酸序列测定，再拼接比对，得到GII.17型诺如病毒基因组全长序列。
3.根据权利要求2所述的扩增方法，其特征在于，所述的RT-PCR，其反应体系为：含有2×one-stepRT-PCRmixture10μL，10μmol/L上游引物和10μmol/L下游引物各0.6μL，MLV/RNasin/HS-Taq酶混合液0.8μL，RNA模板2μL，其余由双蒸水补足至20μL；反应条件为：50℃反转录30min，94℃预变性3min，然后94℃30s、55℃30s、72℃80s，共30次循环后，72℃最后延伸7min。
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