CN108796129B - 一种GI.Pb/GI.6重组型诺如病毒基因组扩增引物和扩增方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种GI.Pb/GI.6重组型诺如病毒基因组扩增引物和扩增方法。本发明基于GI.Pb/GI.6重组型诺如病毒基因组所包含的三个开放阅读框，采用了“4+1+1”的分段扩增策略，在保守区域设计了六对扩增引物和两条基因组两端的测序引物，以目标病毒RNA为模板进行RT‑PCR扩增与测序，再通过拼接比对，获得GI.Pb/GI.6型诺如病毒基因组序列。利用该引物对GI.Pb/GI.6重组型诺如病毒基因组进行扩增和测序的方法具有操作简单、周期短、成本低、灵敏度高等特点。本发明可广泛应用于医疗卫生、检验检疫等具有诺如病毒检测需求的机构以及相应的科学研究领域。
Description
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种GI.Pb/GI.6重组型诺如病毒基因组扩增引物和扩增方法。
背景技术：
诺如病毒是全球急性胃肠炎的重要非细菌性病原，可感染各年龄段人群。目前每年在全球各地会发生约6.8亿人次的诺如病毒感染，在发展中国家还引起了20万例以上的5岁以下儿童死亡，增加了至少42亿美元的治疗成本以及造成603亿美元的社会经济损失。随着我国食品安全监管体制及公共卫生系统的改善，近年来诺如病毒在许多省市被发现是引起群体中毒的主要食源性病原，对食品安全和公共卫生工作造成了极大威胁。然而合适感染模型的长期缺乏阻碍了对这种病毒的全面认识，至今仍没有有效的病毒防控策略和抗病毒手段。
诺如病毒根据其衣壳蛋白VP1的氨基酸序列，可以被分为六个基因组(Genogroup)GI-GVI，其中GI、GII和GVI可以感染人类。同一基因组内的诺如病毒还可以进一步分成不同的基因型，例如GI包括了至少9种基因型，GII包括了22种基因型。GII.4型诺如病毒是全球的主要流行基因型，约80％的诺如病毒感染是由该型别毒株引起的。然而，其他基因型也在病毒监测过程中被发现，尤其在水体环境中具有更广泛的多样性分布，多种GI基因型毒株被报道。但这些非主要流行基因型则较少被关注，因此，加强不同基因型诺如病毒的信息收集工作具有重要意义。
近年来，尽管人源诺如病毒体外培养方面的研究有了突破性进展，但是合适的复制体系仍然缺乏；尤其是诺如病毒极易变异，因此，持续监测病毒流行水平及变异情况仍是认识病毒的重要基础。基因组信息的获得为诺如病毒研究提供了重要的基础数据。诺如病毒基因组长约7.5-7.8kb，包括3个开放阅读框。我们前期工作中针对GII.4型、GII.17型诺如病毒以及GII.P12/GII.3重组型诺如病毒建立的“4+1+1”扩增策略具有操作简单、周期短、成本低以及灵敏度高的特点，因此，根据这种新颖的扩增策略，我们研发了一种针对GI.Pb/GI.6重组型诺如病毒的基因组扩增引物和扩增方法，为积累我国GI型诺如病毒基因组资源提供了一个有力的研究工具。
发明内容：
本发明的目的是提供一种GI.Pb/GI.6重组型诺如病毒基因组扩增引物和扩增方法。
具体地，本发明提供的GI.Pb/GI.6重组型诺如病毒基因组扩增引物，包括六对扩增引物和两条测序引物：
引物对1：I-1F：5'-GTGAATGATGATGGCGTC-3'；
I.b-1R：5'-GCAGAGAGTTTTCTAGCTTT-3'；
引物对2：I.b-2F：5'-TAGCCATTGGATTTACCAG-3'；
I.b-2R：5'-CTCAGTCTCACATAGTCCA-3'；
引物对3：I.b-3F：5'-AAGAACACAAGTGCAAAGTCC-3'；
I.b-3R：5'-GACATGCATCACTGTAACTCCA-3'；
引物对4：I.b-4F：5'-AAGCCATTTGCTGAGCCAC-3'；
G1SKR：5'-CCAACCCARCCATTRTACA-3'；
引物对5：G1SKF：5'-CTGCCCGAATTYGTAAATGA-3'；
I.6-5R：5'-CATTATATACGCCGCAATCC-3'；
引物对6：I.6-6F：5'-CGACATCATAGGTAGCCTT-3'；
I.6-6R：5'-AAATCTGAATATGGTGCCCAC-3'；
测序引物：I.b-seq1R：5'-GCTGGTTCCATATTCCTTAGGTC-3'；
I.6-seq6F：5'-GGTCTCCAGGCTCAACGGTA-3'；
R代表A/G，Y代表C/T。
本发明还提供一种GI.Pb/GI.6重组型诺如病毒基因组扩增方法，具体为：分别以上述的引物对I-1F/I.b-1R、I.b-2F/I.b-2R、I.b-3F/I.b-3R、I.b-4F/G1SKR、G1SKF/I.6-5R、I.6-6F/I.6-6R作为扩增引物的上下游引物，以GI.Pb/GI.6重组型诺如病毒的RNA为模板进行RT-PCR扩增，分别得到扩增产物，然后采用以上每对扩增引物以及两条测序引物I.b-seq1R、I.6-seq6F分别对相对应的扩增产物进行核酸序列测定，再拼接比对，获得GI.Pb/GI.6重组型诺如病毒的基因组全长序列。
进一步地，所述的RT-PCR，其反应体系为：含有2×one-step RT-PCR mixture 10μL，10μmol/L上游引物和10μmol/L下游引物各0.6μL，MLV/RNasin/HS-Taq酶混合液0.8μL，RNA模板2μL，其余由双蒸水补足至20μL，反应条件为：50℃反转录30min，94℃预变性3min，然后94℃30s，60℃30s，72℃75s，共30次循环后，最后72℃延伸7min。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明针对常见的GI.Pb/GI.6重组型诺如病毒基因型，采用覆盖整个基因组的“4+1+1”的分段扩增策略，通过应用于实际检出样本的扩增、测序及序列拼接，获得了GI.Pb/GI.6重组型诺如病毒基因组序列。利用该引物进行GI.Pb/GI.6重组型诺如病毒基因组序列扩增和测序的方法具有操作简单、周期短、成本低、灵敏度高等特点。本发明可广泛应用于医疗卫生、检验检疫等具有诺如病毒检测需求的机构以及相应的科学研究领域。
附图说明：
图1为GI.Pb/GI.6重组型诺如病毒基因组扩增策略与相应引物的设计位置。
图2为适用于GI.Pb/GI.6重组型诺如病毒基因组扩增用引物的RT-PCR退火温度优化，电泳顺序为M，1-28。其中M为DNALadder，1-4、5-8、9-12、13-16、17-20、21-24、25-28分别为基因组扩增引物I-1F/I.b-1R、I.b-2F/I.b-2R、I.b-3F/I.b-3R、I.b-4F/G1SKR、G1SKF/I.6-5R、I.6-6F/I.6-6R和检测引物G1SKF/G1SKR在不同退火温度(依次为45℃、50℃、55℃、60℃)下扩增产物的电泳结果。
图3为适用于GI.Pb/GI.6重组型诺如病毒基因组扩增的RT-PCR引物浓度优化，图A-图F分别为引物I-1F/I.b-1R、I.b-2F/I.b-2R、I.b-3F/I.b-3R、I.b-4F/G1SKR、G1SKF/I.6-5R、I.6-6F/I.6-6R的优化结果，电泳顺序为M，1-9，其中M为DNA Ladder，1-3为0.2μL引物分别扩增以RNA原液、RNA原液稀释10倍、RNA原液稀释100倍为模板的电泳结果，4-6为0.6μL引物分别扩增以RNA原液、RNA原液稀释10倍、RNA原液稀释100倍为模板的电泳结果，7-9为1.0μL引物分别扩增以RNA原液、RNA原液稀释10倍、RNA原液稀释100倍为模板的电泳结果。
图4为GI.Pb/GI.6重组型诺如病毒基因组扩增用引物的RT-PCR灵敏度评价，电泳顺序为M，1-35，其中M为DNA Ladder，1-5、6-10、11-15、16-20、21-25、26-30、31-35分别为基因组扩增引物I-1F/I.b-1R、I.b-2F/I.b-2R、I.b-3F/I.b-3R、I.b-4F/G1SKR、G1SKF/I.6-5R、I.6-6F/I.6-6R和检测引物G1SKF/G1SKR在病毒RNA不同稀释度(依次为101-105倍稀释)下扩增产物的电泳结果。
图5为实际样本中GI.Pb/GI.6重组型诺如病毒基因组的扩增效果，电泳顺序为M，1-6，其中M为DNA Ladder，1-6为实际样本L57进行扩增基因组6个片段的电泳结果。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。下列实施例中未注明具体实验条件和方法，所采用的技术手段通常为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1 GI.Pb/GI.6重组型诺如病毒基因组的扩增策略及相应引物的设计
GI.Pb/GI.6重组型诺如病毒基因组大小约7.8kb，包括三个ORF，其中ORF1长约5.1kb，ORF2长约1.6kb，ORF3长约0.8kb。以一代桑格脱氧核苷酸测序法为基础，设定每个扩增片段大小范围设计为1.3kb-1.6kb，其中ORF1分为4个片段，ORF2和ORF3均为1个片段。此外，为获得基因组5'和3'端完整序列，分别在基因组两端设计扩增长度在100-800bp的片段，相应引物分别命名为I.b-Seq1R和I.6-Seq6F。具体基因组分段策略及相应引物位置可见图1。
在以上限制条件下，采用Oligo软件设计相应的引物，具体引物信息见表1。其中，引物核苷酸序列中的R代表A/G，Y代表C/T。
表1：GI.Pb/GI.6型诺如病毒基因组扩增用引物的具体信息
a引物位置参考的GI.Pb/GI.6型诺如病毒代表序列GenBank登录号为KP407451。
实施例2 适用于GI.Pb/GI.6重组型诺如病毒基因组扩增用引物的RT-PCR退火温度优化
(1)病毒样本处理及核酸提取：通过PBS溶液(DEPC处理)稀释收集的待处理样品(GI.Pb/GI.6重组型诺如病毒阳性样本L57)至10％(w/v)浓度，振荡混匀，于12000×g下离心10min，收集上清液140μL，并通过RNA提取试剂盒抽提样本中病毒RNA共60μL。
(2)基因组分段扩增法：即分6段扩增，所使用的引物对如下：I-1F/I.b-1R、I.b-2F/I.b-2R、I.b-3F/I.b-3R、I.b-4F/G1SKR、G1SKF/I.6-5R、I.6-6F/I.6-6R，每次RT-PCR反应选择一对引物。采用20μL的一步法RT-PCR反应体系，含有2×one-step RT-PCR mixture10μL，10μmol/L上游引物和10μmol/L下游引物各0.6μL，MLV/RNasin/HS-Taq酶混合液0.8μL，样本RNA模版2μl，其余由ddH2O补足。
反应条件为：50℃反转录30min，94℃预变性3min，然后94℃30s，45-60℃30s，72℃75s，共30次循环后，72℃最后延伸7min。
退火温度分别选择为45℃、50℃、55℃、60℃。
以检测引物G1SKF/G1SKR作为对照，按照上述体系和反应条件进行。
(3)电泳：取扩增产物5μL，1.0％的琼脂糖凝胶(含0.05％Gold View核酸染料)进行电泳，并通过凝胶成像系统观察结果。按引物对I-1F/I.b-1R、I.b-2F/I.b-2R、I.b-3F/I.b-3R、I.b-4F/G1SKR、G1SKF/I.6-5R、I.6-6F/I.6-6R的顺序，GI.Pb/GI.6重组型诺如病毒基因组扩增条带依次为1551bp、1583bp、1431bp、1626bp、1641bp、1166bp。电泳结果如图2，结果表明，随着退火温度的提高，在扩增效果及特性方面均有改善，因此最终选择60℃为退火温度。
实施例3 适用于GI.Pb/GI.6重组型诺如病毒基因组扩增的RT-PCR引物浓度优化
(1)病毒样本处理及核酸提取：通过PBS溶液(DEPC处理)稀释收集的待处理样品(GI.Pb/GI.6重组型诺如病毒阳性样本L57)至10％(w/v)浓度，振荡混匀，于12000×g下离心10min，收集上清液140μL，通过RNA提取试剂盒抽提样本中病毒RNA共60μL，并采用无核酸酶的ddH2O进行10×梯度的稀释处理，分别选取RNA原液(原液的浓度是103RTPCRU)、RNA原液稀释10倍和RNA原液稀释100倍作为扩增模板。需要注意的是，本发明诺如病毒的含量采用了RTPCRU单位来定义，即为采用检测引物G1SKF/G1SKR，通过标准的RT-PCR方法对10×梯度稀释的病毒液进行检测，则稀释至到恰能检出时的病毒浓度为一个RTPCRU。
(2)基因组分段扩增法：即分6段扩增，所使用的引物对如下：I-1F/I.b-1R、I.b-2F/I.b-2R、I.b-3F/I.b-3R、I.b-4F/G1SKR、G1SKF/I.6-5R、I.6-6F/I.6-6R，每次RT-PCR反应选择一对引物。采用20μL的一步法RT-PCR反应体系，含有2×one-step RT-PCR mixture10μL，10μmol/L上游引物和10μmol/L下游引物分别按不同条件加入0.2μL、0.6μL、1.0μL，MLV/RNasin/HS-Taq酶混合液0.8μL，不同稀释度样本RNA模版2μl，其余由ddH2O补足。
反应条件为：50℃反转录30min，94℃预变性3min，然后94℃30s，60℃30s，72℃75s，共30次循环后，72℃最后延伸7min。
(3)电泳：取扩增产物5μL，1.0％的琼脂糖凝胶(含0.05‰Gold View核酸染料)进行电泳，并通过凝胶成像系统观察结果。按引物对I-1F/I.b-1R、I.b-2F/I.b-2R、I.b-3F/I.b-3R、I.b-4F/G1SKR、G1SKF/I.6-5R、I.6-6F/I.6-6R的顺序，GI.Pb/GI.6重组型诺如病毒基因组扩增条带依次为1551bp、1583bp、1431bp、1626bp、1641bp、1166bp。电泳结果如图3，结果表明，片段1、2、3、5扩增引物最优条件为0.2μL、0.6μL、1.0μL，片段4扩增引物最优条件为0.2μL、0.6μL，片段6扩增引物最优条件为0.6μL、1.0μL，因此，最终选择0.6μL为扩增体系中引物的添加量。
实施例4 GI.Pb/GI.6重组型诺如病毒基因组扩增用引物的RT-PCR灵敏度评价
(1)病毒样本处理及核酸提取：通过PBS溶液(DEPC处理)稀释收集的待处理样品(GI.Pb/GI.6重组型诺如病毒阳性样本L57)至10％(w/v)浓度，振荡混匀，于12000×g下离心10min，收集上清液140μL，并通过RNA提取试剂盒抽提样本中病毒RNA共60μL，并采用无核酸酶的ddH2O进行10×梯度的适当稀释(依次为101-105倍稀释)处理。
(2)基因组分段扩增法：即分6段扩增，所使用的引物对如下：I-1F/I.b-1R、I.b-2F/I.b-2R、I.b-3F/I.b-3R、I.b-4F/G1SKR、G1SKF/I.6-5R、I.6-6F/I.6-6R，每次RT-PCR反应选择一对引物。采用20μL的一步法RT-PCR反应体系，含有2×one-step RT-PCR mixture10μL，上游引物和下游引物(10μmol/L)各0.6μL，MLV/RNasin/HS-Taq酶混合液0.8μL，样本RNA模版2μL，其余由ddH2O补足。
反应条件为：50℃反转录30min，94℃预变性3min，然后94℃30s，60℃30s，72℃75s，共30次循环后，72℃最后延伸7min。
以检测引物G1SKF/G1SKR作为对照，按照上述体系和反应条件进行。
(3)电泳：取扩增产物5μL，1.0％的琼脂糖凝胶(含0.05％Gold View核酸染料)进行电泳，并通过凝胶成像系统观察结果。按引物对I-1F/I.b-1R、I.b-2F/I.b-2R、I.b-3F/I.b-3R、I.b-4F/G1SKR、G1SKF/I.6-5R、I.6-6F/I.6-6R的顺序，GI.Pb/GI.6重组型诺如病毒基因组扩增条带依次为1551bp、1583bp、1431bp、1626bp、1641bp、1166bp，电泳结果如图4，结果显示：与检测引物G1SKF/G1SKR对比，片段1、3、5扩增引物灵敏度优于常规检测引物G1SKF/G1SKR 1个数量级，片段2、4扩增引物灵敏度与检测引物一致，仅片段6扩增引物灵敏度低于该检测引物1个数量级。
实施例5 实际检出样本中GI.Pb/GI.6重组型诺如病毒基因组的扩增效果
(1)病毒样本处理及核酸提取：取GI.Pb/GI.6重组型诺如病毒阳性样本L57，通过PBS溶液(DEPC处理)稀释待处理样品至10％(w/v)浓度，振荡混匀，于12000×g下离心10min，收集上清液140μL，并通过RNA提取试剂盒抽提样本中病毒RNA共60μL。
(2)基因组分段扩增法：即分6段扩增，所使用的引物对如下：I-1F/I.b-1R、I.b-2F/I.b-2R、I.b-3F/I.b-3R、I.b-4F/G1SKR、G1SKF/I.6-5R、I.6-6F/I.6-6R，每次RT-PCR反应选择一对引物。采用20μL的一步法RT-PCR反应体系，含有2×one-step RT-PCR mixture10μL，10μmol/L上游引物和10μmol/L下游引物各0.6μL，MLV/RNasin/HS-Taq酶混合液0.8μL，样本RNA模版2μL，其余由ddH2O补足。
反应条件为：50℃反转录30min，94℃预变性3min，然后94℃30s，60℃30s，72℃75s，共30次循环后，72℃最后延伸7min。
(3)电泳：取扩增产物5μL，采用1.0％的琼脂糖凝胶(含0.05‰Gold View核酸染料)进行电泳，并通过凝胶成像系统观察结果。按引物对I-1F/I.b-1R、I.b-2F/I.b-2R、I.b-3F/I.b-3R、I.b-4F/G1SKR、G1SKF/I.6-5R、I.6-6F/I.6-6R的顺序，GI.Pb/GI.6重组型诺如病毒基因组扩增条带依次为1551bp、1583bp、1431bp、1626bp、1641bp、1166bp大小附近范围内，电泳结果如图5，结果表明，采用上述扩增引物对样本L57进行扩增均获得成功。
(4)核酸测序与基因组拼接比对：分别采用以上六对扩增引物以及两条测序引物I.b-seq1R、I.6-seq6F对相对应扩增出的L57样本的扩增产物测序并拼接，最终获得的基因组序列长度为7655bp，基因组核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。将该基因组序列提交进行BLAST分析，结果表明，与L57样本基因组覆盖度(>99％)和相似度(>91％)的序列共有四条，相似度从高至低分别为：KP407451/CHN/2008/Huzhou/N11、N854564/NL/2012/GI.6/Groningen、JQ388274/GI.6/Kingston/ACT160D/2010/AU、AB081723/WUG1。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心）
广东环凯微生物科技有限公司
<120> 一种GI.Pb/GI.6重组型诺如病毒基因组扩增引物和扩增方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 7655
<212> DNA
<213> 诺如病毒 GI.Pb/GI.6 L57(norovirus GI.Pb/GI.6 L57)
<400> 1
gtgaatgatg atggcgtcga aagacgtcgt tgcgactaat gttgcaagca ataacaatgc 60
taacaacact agtgctrcat ctcgattttt gtcgagattt aggggtttag gtggtggcgc 120
gagcccccct aaccccataa agatcaaaag cacagaaatg gccctgggtt tgattggcaa 180
gacaacccaa gaggcagcag gggccggtga cctgccacct aaacagcaaa gagaccgacc 240
ccccaggacc caagaggaag tccagtacgg catgggatgg actgaaaggc ccatggacca 300
gaatgttaag tcatgggagg aacttgacgc ctctaccaag gaagagattt tggacagcca 360
caaagagtgg ttcgatgctg gcggcttggg tccgtgcaca atgccctcaa cttgtgaaca 420
ggctaaagat gatagcccac ctggtgagca agtcagatgg tcagcgcgtg atggagttga 480
ccttggagtg aatcgtctca caacagtgag tggccccgag tggaatctct gtcctctacc 540
ccccactgac ctaaggaata tggacccagc tagtgaaccc actattggag acatgataga 600
gttctatgaa ggtcatatct accactactc catatatatt ggtcaaggaa agacagttgg 660
tgtgcattcc ccacaagcgg cattctcagt ggctagagta accatccaac ctatagctgc 720
ttggtggagg gtttgttata taccccagcc caaacataga ttgagttatg accagctcaa 780
ggaattggaa aatgaacctt ggccatacgc agctatcacc aacaattgct ttgagttttg 840
ctgtcaagtc atgaatcttg aggacacatg gctgcagagg cggctaataa catcaggtag 900
gttccaccac ccttcccagc cttggtcaca acagacccct gaatttcagc aggatagcaa 960
gctagaacta gttagggatg ccatattggc tgcggtgaat ggccttgttt cacaaccctt 1020
caagaacttc ttgggcaagc tcaagcctct taacgtgttg aacatcctat ctaactgtga 1080
ttggaccttt atgggggtgg tagagatggt tatattgctt cttgagctct ttggcgtatt 1140
ctggaacccg cccgatgtgt ctaactttat agcatctctc ctccctgatt tccacctcca 1200
aggaccagaa gacctggccc gggatttggt gccagtcatt cttggtggta tagggctagc 1260
cattggattc accagagaca aagtcactaa ggttatgaaa agtgctgtag atgggctccg 1320
ggctgctacg caactggggc aatacgggtt agaaatattc tcactcctga agaagtattt 1380
ctttggtggg gatcagactg aacggaccct caaaggcatt gaagcagcag ttatagatat 1440
ggaggtcttg tcctctacat cagtgacaca actggtgaga gacaagcagg cagctaaagc 1500
ttacatgaac atcctggata atgaagagga aaaagctaga aaactctctg ctaagaatgc 1560
tgacccccat gtaatatcct caacaaatgc cctaatatca cgtatagcca tggcacggtc 1620
cgctctggct aaggctcaag ctgagatgac cagccgaatg aggccagtcg tcatcatgat 1680
gtgcggacct cctggaattg ggaagactaa ggcagcggaa cacttggcaa aacgcttggc 1740
caatgagatc aggcctggcg gcaaagtggg actggtgcca cgtgaggctg ttgaccactg 1800
ggatggctac cacggtgagg aagtgatgct atgggatgac tatggtatga caaagataca 1860
agatgactgc aacaagctcc aggctattgc tgactctgcc ccacttactc tcaattgcga 1920
caggattgaa aataaaggga tgcagtttgt atcagatgca atagtcatca ccaccaacgc 1980
cccagggccc gcccctgtgg attttgtcaa tctcggcccc gtgtgcagac gggttgactt 2040
cctagtttac tgttccgccc cagaggtgga gcagataagg agagtcagcc ctggcgacac 2100
gtcggcactg aaagattgtt tcaagccaga tttctcccac ttgaggatgg agttagctcc 2160
tcaaggaggg tttgacaacc aggggaacac accattcggc aagggtgtca tgaaaccaac 2220
aaccatcaac agactcctca tacaagctgt ggctctcacc atggagagac aggatgagtt 2280
ccggctccaa ggaaaaatgt atgattttga tgatgacagg gtgtcagctt tcaccactat 2340
ggcacgtgat aatggattgg gcatcctaag tatggcgagc ctaggcaaga aactgcgcgg 2400
tgtcacatcg atggaaggcc tgaagaatgc tttgaaagga tacaaagttg gcgcgtgcac 2460
aattaagtgg caggccaagg tgtattcact cgagtcagat ggcaacagtg ttaacattag 2520
ggaggagaag aacgtcctaa ctcaacagca gcagtcggtg tgtgctgcct ccattgcact 2580
tgcccgcctg cgggccgcgc gtgcggtggc gtatgcgtca tgcatccagt cagctataac 2640
ctccatacta caaattgctg cctcggccct agtggtcaac agggccgtaa aaagaatgtt 2700
tggcacacgc actgctgctc tgtcactaga gggccccccc aaagaacaca agtgcaaagt 2760
ccaccaggct aaagccgcag ggaaagggcc cattggccat gatgacatga ttgatagata 2820
tggactatgt gagactgagg aggatgaaga ggtggtccat actgagatgc cctccgccac 2880
catagaaggc aagaacaaag gtaagaacaa gaaagggcgc ggccgaaaga acaactacaa 2940
tgctttttcc cgtagaggac tcaatgatga agagtatgaa gagtacaaga aaatacggga 3000
agagaagggt ggaaattaca gcattcagga gtacctagag gatagacaaa ggtatgaaga 3060
ggagctcgct gaggttcaag caggtggaga cggaggaatc ggtgaaaccg agatggagat 3120
ccgccataga gtgttctaca agtctaaaaa caagaagcac caccaggaag agcggcgcca 3180
actgggatta gtcacaggct ctgacattcg gaaaaggaaa ccaattgatt ggactccccc 3240
taagtcagca tgggcagatg atgagcgtga agtggattat aatgagagaa tcagctttga 3300
ggcgcccccc actttgtgga gccgagttac aaagtttggg tctgggtggg gtttttgggt 3360
cagccccaca gtcttcataa ccacaacgca cgttatacca accagtgcaa aagaattctt 3420
tggtgaaccc cttgccagca tagccatcca tagggctgga gaattcaccc tcttcaggtt 3480
ctctaagaaa atcaggcccg atctcacggg catgattctt gaggaaggtt gtccagaagg 3540
tacggtgtgc tcagtgttaa yaaagaggga ctccggtgag ctactaccac tagctgtaag 3600
aatgggcgca atagcatcaa tgcgcataca gggtcgcctt gtccatggtc agtctggtat 3660
gttgcttact ggggcgaatg ctaagggcat ggaccttgga actattccag gggactgtgg 3720
agctccctat gtttacaaga gagcaaatga ctgggtggtc tgtggtgtgc acgctgccgc 3780
cactaaatca ggcaacacgg tggtgtgcgc cgtccaagct agtgaagggg agaccacact 3840
tgagggaggt gacaaaggcc actatgccgg gcatgagata atcaagcatg ggagtggacc 3900
agccctgtcg accaaaacaa agttctggaa atcatccccc gaaccattac cccccggggt 3960
ctatgaaccc gcatacctcg gtggccggga tccaagagtg agtggtggcc cctcgctcca 4020
acaggtatta cgggatcagt tgaaaccatt tgctgagcca cgggggcgta tgccagaacc 4080
aggtctcctg gaggccgcag ttgagactgt gacctcatca ctggagcagg ttatggatac 4140
cccagtaccg tggagttaca gcgatgcatg tcaatccctg gacaaaacta ctagctcagg 4200
tttcccccac cataagaaaa agaatgatga ttggaacggc accgccttca ttagagagtt 4260
gggagagcag gcggcacacg ccaataatat gtatgagcaa gccaagagca tgaagcccat 4320
gtacacggcg gcgcttaagg atgaattagt aaagccagaa aaagtgtatc aaaaagtgaa 4380
gaagcgtctg ctttgggggg cagatctagg aacagtgatt cgggccgcac gggcttttgg 4440
cccgttctgt gatgccataa agtcccacac aattaaacta cctatcaaag ttgggatgaa 4500
ttcaatcgag gatggaccat taatttatgc agagcattca aaatataaat atcactttga 4560
tgcagactat acggcttggg actcaacaca aaataggcaa attatgactg aatcattctc 4620
aatcatgtgt cggctaactg cttctccaga attggcctca gtggtggcac aagatctgct 4680
tgcaccctca gaaatggacg ttggtgacta tgtcataagg gtgaaggaag gcctcccatc 4740
cggctttcca tgcacgtcac aagtcaatag tattaaccat tggctgataa ctttgtgtgc 4800
cctctctgag gtgactggcc tgtcaccaga tgttatccag tctatgtcat acttttcttt 4860
ctatggtgat gatgaaatag tgtctactga catagaattt gacccagcaa aattgacaca 4920
ggtccttaaa gagtatggcc tcaaacccac ccgccctgac aagagtgagg gtccaataat 4980
tgtgaggaag aacgtggatg gcttagtctt cctacgtcgc accatttccc gcgacgccgc 5040
ggggttccaa gggcggctag accgagcttc cattgaaaga cagatctatt ggaccagagg 5100
gcccaatcac tcagacccct ttgaaacctt ggtgccccac caacaaagga aagtccagtt 5160
gatatcactg ttaggtgagg cctcattgca tggtgaaaag ttctatagga agatctcaag 5220
caaagtcatc caagagatta agacaggggg ccttgaaatg tatgtaccag ggtggcaagc 5280
catgttccgc tggatgcggt tccacgatct tggcctgtgg acaggagatc gcaatctcct 5340
gcccgaattc gtaaatgatg atggcgtcta aggacgcccc aacatcccct gatggcgcta 5400
gtggcgccgg ccagctggta ccggaggcta atacagctga gcaaatttca atggaccctg 5460
ttgcgggtgc ttcaacagca gtcgcaacgg ctgggcaagt taacatgatt gacccatgga 5520
tcttcaacaa ctttgtccaa gcaccccaag gagaattcac tatttcccct aataataccc 5580
ccggtgatat tttgtttgac ctacaattag gaccccatct taacccattc ctagcccatc 5640
tctcacagat gtataatggt tgggtcggca atatgcgtgt gcgcatattg ttggccggga 5700
acgccttcac agctggaaag ataatcattt gctgtgtccc ccctggtttt gatgctagaa 5760
tactcacaat agctcaagca actctcttcc cacatttgat tgctgatgtt aggacccttg 5820
agcctgtaga gcttcccttg gaggacgtac gcaacgttct ctaccacaac agtagccagc 5880
cacagccaac aatgcggctg gttgctatgt tgtacacccc cctccgcact ggtggtggtt 5940
ctggaggcac tgatgccttt gtggtggcgg gcagggtgct tacgtgcccc gcccccgact 6000
ttagcttttt gtttcttgtt cccccttccg ttgaacaaaa gaccagagtt ttcagtgtcc 6060
ccaacatacc tctgaaagac ctctcaaatt ctcgtgtccc tgtgcctgta cagggcatgt 6120
ttatgtcccc ggatgttaat cagtcagttc agtttcaaaa cggacgctgc caaattgatg 6180
gtcaactcca gggcaccacc ccagtctcgc tcagccaact ctgcaagatt aggggtaaaa 6240
cttcaagcaa tgctagggtg ctcaacttaa gtgaggtaga tggtacacct ttcatccctc 6300
ttgaatcacc agcgccagta ggttttcctg acttaggagg ctgtgactgg cacgtaaatt 6360
ttactttcca gactcaagat cgggacccat ctcaaagtgt gacctttgca accaatgatg 6420
ccagctttgt cccctactta ggcagtgtct cccctcacaa tggggaaggt tttcaagcag 6480
gtgacatcat aggtagcctt gggtggattt cagccccgtc tgataattca caatttaatg 6540
tttgggcaat accaaagtat ggatctagtc tcccagatgt cacccatctt gctcctgctg 6600
tgttcccccc aggctttggg gaggtgatcc tatatttcta ctctaccttc ccaggttctg 6660
gacaacccag tcaacttcaa gtcccatgtt tgttgcctca ggagttcatc acccatttct 6720
gtaacgaaca ggctcccatc gctggggagg ctgccctcct ccactacgtg gaccctgaca 6780
cggggcggaa cttgggggaa ttcaaactct atcctgatgg gtttatgacc tgtgtcccca 6840
atagtgttag cagtggccct caaacccttc ctattaatgg agtctttgtc tttgtttcat 6900
gggtgtccag attctatcaa ctcaagcctg tgggaacggc ctcagcggct agaaggcttg 6960
gattgcggcg tatataatgg cccaagctgt catcggtgcc atagccgcgt ctgccgctgg 7020
cagtatacta ggggcaggca tacaggctgg tgctgaggct ggtctccagg ctcaacggta 7080
ccagcaggat ttacaattgc aacaaaattc tttcaagcat gataaggaaa tgttaggcta 7140
tcaggttcag gctagtaatg ctcttttagc taagaatctt aacactagat atgctcttct 7200
gcaggcaggg ggcttatcta gtgctgatgc tgctcgggca gtggctggtg ctcctgtcac 7260
ccgtatagtg gactggaatg gcacgcgtat tgcagcgcct acctcaagca ccactacact 7320
cagatctggt ggttttatgg ctgtccctat accattgtct tcaaagacca agcaaccagt 7380
gatgtctggg caggataatc caaattatgc tgcttcttct atctctagaa ctgcttcatg 7440
ggtgcaatct caaaattcta tgagatctgt ttctcctttc cacagtgatg ctctgagaac 7500
cgtgtgggtc acaccaccag gttcatcatc aacttcatct gtgcaatcta gtttttatgg 7560
tgtttttaat acagatagat tgcctctgtt cgcaaacaga aggtaaagat tttgtaatag 7620
gatgccagtg ggcaccatat cagaaatctc tagag 7655
Claims (3)
1.一种GI.Pb/GI.6重组型诺如病毒基因组扩增引物，其特征在于，包括六对扩增引物和两条测序引物：
扩增引物对1 ：
I-1F：5'-GTGAATGATGATGGCGTC-3'；
I.b-1R：5'-GCAGAGAGTTTTCTAGCTTT-3'；
扩增引物对2 ：
I.b-2F：5'-TAGCCATTGGATTTACCAG-3'；
I.b-2R：5'-CTCAGTCTCACATAGTCCA-3'；
扩增引物对3 ：
I.b-3F：5'-AAGAACACAAGTGCAAAGTCC-3'；
I.b-3R：5'-GACATGCATCACTGTAACTCCA-3'；
扩增引物对4 ：
I.b-4F：5'-AAGCCATTTGCTGAGCCAC-3'；
G1SKR：5'-CCAACCCARCCATTRTACA-3'；
扩增引物对5 ：
G1SKF：5'-CTGCCCGAATTYGTAAATGA-3'；
I.6-5R：5'-CATTATATACGCCGCAATCC-3'；
扩增引物对6 ：
I.6-6F：5'-CGACATCATAGGTAGCCTT-3'；
I.6-6R：5'-AAATCTGAATATGGTGCCCAC-3'；
测序引物 ：
I.b-seq1R：5'-GCTGGTTCCATATTCCTTAGGTC-3'；
I.6-seq6F：5'-GGTCTCCAGGCTCAACGGTA-3'；
R代表A/G，Y代表C/T。
2.一种GI.Pb/GI.6重组型诺如病毒基因组扩增方法，其特征在于，分别以权利要求1所述的六对扩增引物对I-1F/I.b-1R、I.b-2F/I.b-2R、I.b-3F/I.b-3R、I.b-4F/G1SKR、G1SKF/I.6-5R、I.6-6F/I.6-6R作为扩增引物的上下游引物，以GI.Pb/GI.6重组型诺如病毒的RNA为模板进行RT-PCR扩增，分别得到扩增产物，然后采用权利要求1所述的每对扩增引物以及两条测序引物I.b-seq1R、I.6-seq6F分别对相对应的扩增产物进行核酸序列测定，再拼接比对，获得GI.Pb/GI.6重组型诺如病毒的基因组全长序列。
3. 根据权利要求2所述的扩增方法，其特征在于，所述的RT-PCR，其反应体系为：含有2×one-step RT-PCR mixture 10μL，10μmol/L上游引物和10μmol/L 下游引物各0.6μL，MLV/RNasin/HS-Taq酶混合液0.8μL，RNA模板2μL，其余由双蒸水补足至20μL，反应条件为：50℃反转录30min，94℃预变性3min，然后94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 75s，共30次循环后，最后72℃延伸7min。
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|---|---|---|---|---|
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|---|
| "Genogroup-specific PCR primers for detection of Norwalk-like viruses";Shigeyuki Kojima等;《Journal of Virological Methods》;20011206;第100卷;第107-114页 * |
| "GI型诺如病毒湖州株2008/Huzhou/N11进行全基因组序列测定与分析";纪蕾等;《病毒学报》;20160531;第32卷(第3期);摘要、第263页左栏第2段至265页右栏第1段 * |
| "Rapid Emergence of Novel GII.4 Sub-Lineages Noroviruses Associated with Outbreaks in Huzhou, China, 2008–2012";Lei Ji等;《PLOS ONE》;20131204;第8卷(第12期);第1-9页 * |
| "湖州市散发急性胃肠炎病例诺如病毒检测结果分析";吴晓芳等;《预防医学》;20170731;第29卷(第7期);摘要，第714页右栏第1段至715页右栏最后一段 * |
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