CN106220738A - Ev71中和抗原表位与诺如病毒p结构域嵌合载体的构建和表达方法 - Google Patents
Ev71中和抗原表位与诺如病毒p结构域嵌合载体的构建和表达方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明旨在提供肠道病毒EV71中和抗原表位与人诺如病毒P结构域嵌合蛋白，及表达载体的构建方法。通过免疫印迹法验证本发明的EV71中和抗原表位与诺如病毒P结构域的嵌合蛋白可用于EV71和诺如病毒的检测试剂盒及新型二价亚单位疫苗的研发。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，涉及构建和表达EV71中和抗原表位与诺如病毒P结构域嵌合蛋白及其表达载体构建方法，可用于肠道病毒EV71和诺如病毒的检测试剂盒及新型二价亚单位疫苗的研发。
背景技术
急性肠胃炎是目前一个严重的公共卫生问题，它不仅影响了人们的生活、工作和部队战斗力，严重的还会引起死亡，尤其是在儿童和免疫缺陷的人群。诺如病毒感染性腹泻在全世界范围内均有流行。肠道病毒71型(Enterovirus 71，EV71)是手足口病人中最为常见的病原，该病毒的主要感染对象是儿童，引起多种神经症状，给儿童的健康和生长发育造成严重的影响。自20世纪90年代以来，EV71的流行呈明显上升趋势，给亚太地区的公共卫生造成了严重的威胁。然而，目前还没有有效的药物能治疗这两种病毒的感染，疫苗仍然是防治这两类疾病最有效的途径之一。诺如病毒由于在体外不能通过细胞来进行培养扩增，无法研制灭活疫苗。通过基因工程的方法表达诺如病毒的保护性抗原表位，研制亚单位疫苗成为了诺如病毒疫苗研发的首选方法。对于肠道病毒EV71，尽管其灭活疫苗已经批准上市，但是其生产工艺复杂、生产成本高，而且存在一定的风险。因此，EV71亚单位疫苗是一种易于生产、成本低和安全的疫苗，是灭活疫苗一个很重要的补充。
诺如病毒衣壳蛋白VP1由N端的S结构域和C端的P结构域组成，P结构域与病毒衣壳外部形成的刺突有关，也是诺如病毒与受体结合的关键区域。每个P结构域上包含3个环(LOOP)形结构，这些环中可容纳较大外源基因片段的插入，是外来抗原呈递的位点。P结构域可自行形成20纳米左右的颗粒。近年来的研究表明，诺如病毒P结构域既可以用于诺如病毒本身疫苗的研发，也可作为疫苗载体来递呈其他病原体抗原成份，用于研发二价疫苗。动物实验研究表明，诺如病毒的P结构域成功地用于递呈轮状病毒和流感病毒的保护性抗原成分，这2个嵌合的疫苗都能很好的诱导机体产生针对诺如病毒与轮状病毒、诺如病毒与流感病毒特异性的抗体以及免疫保护力。
EV71病毒的颗粒为二十面体立体对称的球形结构，包含VP1、VP2、VP3、VP4四个结构蛋白，其中VP1、VP2、VP3暴露在病毒外壳的表面，而VP4包埋在病毒外壳的内侧，因此抗原决定簇基本位于VP1、VP2、VP3上。文献表明，在EV71不同基因亚型之间存在具有高度保守性的三个线性中和抗原表位，即结构蛋白VP1上的SP55(163aa-177aa)和SP70(208aa-222aa)以及VP2上的SP28(136-150aa)，它们是亚单位疫苗的理想候选分子。
发明内容
本发明主要是在大肠杆菌中表达EV71中和抗原表位与诺如病毒P结构域的嵌合蛋白，并通过免疫印迹法验证了表达的蛋白具有抗原性，可用于EV71和诺如病毒检测试剂盒及新型二价亚单位疫苗的研发。
本发明通过下列技术方案实现：一种肠道病毒EV71中和抗原表位与人诺如病毒P结构域嵌合蛋白，其包括如SEQ ID NO：2所示的VA387氨基酸序列(下划线斜体为LOOP2对应的氨基酸)，以及所述EV71的中和抗原表位，所述中和抗原表位是如SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：5分别所示SP55、SP70、SP28的3个中和抗原表位氨基酸之一或其组合。
优选地，所述的肠道病毒EV71中和抗原表位与人诺如病毒P结构域嵌合蛋白，所述EV71的中和抗原表位是SP70、SP55与SP70组合、SP55与SP28组合、SP70与SP28组合，或者SP70与SP545及SP28组合。
最优选地，所述的肠道病毒EV71中和抗原表位与人诺如病毒P结构域嵌合蛋白，所述EV71的中和抗原表位是SP70与SP545及SP28组合。
本发明提供编码所述的肠道病毒EV71中和抗原表位与人诺如病毒P结构域嵌合蛋白的基因。
所述诺如病毒P结构域VA387的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
所述的基因，其特征在于，其中按照大肠杆菌密码子表达使用的偏好性设计和优化肠道病毒EV71中和抗原表位的核苷酸序列。
所述的基因，其特征在于，肠道病毒EV71中和抗原表位优化后的核苷酸序列SP55-F、SP55-R、SP70-F、SP70-R、SP28-F、SP28-R、SP55-SP70-SP28、SP55-SP70、SP55-SP28、SP70-SP28分别如SEQ ID NO:6至SEQ ID NO:15所示，具体详见下表1，其中，ACTAGT和ATCGAT分别为Spe I和Cla I的酶切位点，下划线表示完整或酶切后的部分酶切位点，小写字母表示连接肽的核苷酸序列。
表1
本发明还提供一种表达如权利要求1所述嵌合蛋白的嵌合载体的构建方法，包括以下步骤：
1)设计的核苷酸序列：EV71的单个表位通过诺如病毒P结构域LOOP2插入从而形成嵌合基因,即：SP55-L2、SP70-L2和SP28-L2，在每个EV71单个表位核苷酸序列的3’端加CTAGT和5’端加AT；或EV71的3个表位分别进行两两组合或3表位的组合后，通过诺如病毒P结构域LOOP2插入从而形成嵌合基因，即：SP55-SP70-L2、SP55-SP28-L2、SP70-SP28-L2和SP55-SP70-SP28-L2，在组合中的各表位之间通过3个重复的接头序列GGGGS进行串联；
2)根据设计的核苷酸序列，通过人工合成相应的基因后再克隆到P42质粒的P结构域相应位置中，得到7个含EV71中和抗原表位的P结构域嵌合基因的重组质粒；
3)将步骤2)得到的重组质粒转化大肠杆菌细胞中，涂布含有氨苄西林的LB平板并筛选阳性克隆，将阳性克隆进行培养后提取质粒并送测序验证；
4)将测序验证为正确的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，涂布含有氨苄西林的LB平板并筛选阳性克隆，培养后加IPTG进行诱导，大量表达出含GST标签的EV17中和抗原表位与诺如病毒P结构域的嵌合蛋白，用GST亲和磁珠纯化表达的嵌合蛋白，并通过抗GST标签抗体和免疫印迹验证融合蛋白的表达。
5)通过抗诺如病毒P结构域抗体、抗EV71病毒抗体和免疫印迹法进行验证所得到的嵌合蛋白具有抗原性。
上述的构建方法，其中步骤2)重组质粒构建如下：
1)用限制性内切酶Spe I和Cla I分别酶切P42质粒，获得纯的、线性化的质粒；
2)人工方法分别合成每一个单表位即SP55、SP70、SP28的两条互补的寡核苷酸链，经退火形成双链DNA，通过T4DNA连接酶将退火形成的双链DNA克隆到经Spe I和Cla I酶切过的质粒P42中；或者以基因合成的方式合成串联表位即SP55-SP70-SP28、SP55-SP70、SP55-SP28、SP70-SP28的基因片段，保存在相应的质粒中，再通过设计的无缝克隆引物将4个串联表位分别从合成的基因中扩增出来后，以无缝克隆的方法分别将每一个串联表位克隆到P42质粒中；
3)通过以上方法，总共构建了7个重组质粒，并经过测序验证以正确的序列克隆到了P42质粒P结构域的LOOP2中；
其中，所述串联表位基因无缝克隆的引物SP55-F、SP70-F、SP28-R序列分别如SEQID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18所示，具体如下表2。
表2
上述的构建方法，其中步骤4)中嵌合蛋白的诱导表达和纯化的详细步骤如下：
1)蛋白表达：将转化有重组质粒的BL21(DE3)感受态细胞涂布含氨苄西林的LB平板，挑选阳性克隆加入到100mL含氨苄西林的LB培养基，培养至OD600约为0.5时，加入IPTG至其终浓度为0.5mM，于22℃、220r/min过夜诱导表达；将过夜诱导表达的菌液于12000g、4℃离心10min，弃上清；用10mL 4℃预冷的PBS(pH7.3)重悬菌体，于12000g、4℃离心10min，弃上清，菌体沉淀用于进一步的蛋白纯化或保存于-80℃备用；
2)蛋白纯化：用10mL PBS(pH7.3)重悬步骤1)的菌体沉淀，加入蛋白酶抑制剂PMSF至终浓度为1mM，超声波破碎菌体(200W功率、工作2s、间歇2s、总超声时间30min)，然后于12000g、4℃离心10min，丢弃沉淀，收集上清约10mL。将上清用0.22μm滤膜过滤后，按GST亲和纯化磁珠BeaverBeadsTMGSH说明书操作步骤进行蛋白纯化。
上述的构建方法，步骤4)中，用免疫印迹法分析纯化得到的嵌合蛋白，步骤如下：首先通过抗GST单克隆抗体分析表达的蛋白是否符合预期的分子量大小；然后通过抗EV71多克隆兔血清和抗诺如病毒P结构域的小鼠多克隆抗体分析，发现这些表达的嵌合蛋白具有相应的抗原性，可用于EV71和诺如病毒的检测试剂盒及新型二价亚单位疫苗的研发。
本发明的优点和效果如下：
1)首次将诺如病毒的P结构域和EV71中和抗原表位嵌合在一起，而且我们通过预测这种嵌合蛋白的结构发现，短的EV71中和抗原表位都能很好地被展示在P结构域的表面。因为它们都是诱导产生中和抗体的区域，所以我们获得的这种嵌合抗原可用于诺如病毒和手足口病二价疫苗和检测试剂盒的研发。
2)通过优化EV71中和抗原表位的不同的组合发现具有最优抗原性的嵌合蛋白，如：单表位SP55和SP28与诺如病毒P结构域形成的嵌合蛋白并不能很好地与抗EV71病毒多克隆抗体反应。然而，这3个中和表位形成的各种组合表位，都能与抗EV71的抗体反应，且3个串联表位的组合的反应性最强。
3)制备简单：利用基因工程技术在原核系统即可实现高水平的大量表达，且纯化工艺简单，通过GST亲和纯化柱可以在短时间内获得大量高纯度的目的蛋白。
附图说明
图1.P42的质粒图谱及其LOOP2的核苷酸序列。
图2.通过P结构域LOOP2插入的EV71中和表位的氨基酸序列。
图3.EV71各个单中和表位蛋白表达的SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色分析。
图4.EV71各个串联中和表位蛋白表达的SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色分析。
图5.纯化后的EV71各个单、串联表位蛋白表达的SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色分析。
图6.纯化后的EV71各个单、串联表位的GST融合蛋白的免疫印迹分析。
图7.纯化后的EV71各个单、串联表位与诺如病毒P结构域嵌合蛋白的免疫印迹分析。
图8.EV71多克隆血清抗体免疫印迹(图7)与考马斯亮蓝染色(图4)后个对应条带灰度比值。
图9.EV71各表位和诺如病毒P结构域嵌合蛋白空间结构的模型。
具体实施方式
(一)重组质粒的构建及鉴定
质粒P42来自美国辛辛那提儿童医学研究中心(已受专利保护，专利号为：WO2010144602-A2；US2010322962-A1；WO2010144602-A3；EP2440582-A2；CN102612525-A；JP2012529298-W；HK1169426-A0；US8486421-B2；US2013273090),它是含有GST标签和人诺如病毒GII.4基因型P结构域(GI:146387016)基因的载体，质粒图谱见图1。从文献报道中获取EV71的中和抗原表位的氨基酸序列，即VP1上的SP55(163aa-177aa)和SP70(208aa-222aa)以及VP2上的SP28(136-150aa)表位(图2)，按照大肠杆菌密码子表达使用的偏好性优化各单表位的核苷酸序列，设计由单表位组合构成的串联表位为：SP55-SP70-SP28、SP55-SP70、SP55-SP28、SP70-SP28(核苷酸序列分别如SEQ ID NO:2至SEQ ID NO:15所示)，其中串联表位的各单表位之间加上连接肽[(G4S)3]的核苷酸序列。用限制性内切酶Spe I和Cla I分别酶切P42质粒，获得纯的、线性化的质粒用于以下克隆。通过人工化学合成单表位(SP55、SP70、SP28)的两条互补寡核苷酸链(核苷酸序列分别如SEQ ID NO:6至SEQ IDNO:11所示，具体见表1)，并在各自的5’端和3’端分别加上Spe I、Cla I部分酶切位点序列，将所得的各个表位的2条引物序列各自退火形成双链DNA(退火缓冲液：10mM Tris-HCl，[pH7.5]、1M EDTA、0.1M NaCl)，用T4DNA连接酶将用Spe I和Cla I双酶切的P42分别与退火的双链DNA进行连接。通过基因合成的方式得到串联表位(SP55-SP70-SP28、SP55-SP70、SP55-SP28、SP70-SP28)基因片段，在每段基因的5’端和3’端分别加上Spe I、Cla I全部酶切位点序列，基因片段储存在适当的载体中。通过设计适于无缝克隆的PCR引物将4个串联表位分别从储存基因的载体中扩增出来，再通过无缝克隆的方法将4个表位与用Spe I和Cla I双酶切的P42进行连接。总共获得了7个重组质粒。将这些质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中，通过含有氨苄西林的LB平板筛选阳性克隆。将阳性克隆进行培养后提取质粒并送测序验证。经过测序验证，各个单表位和串联表位均以正确的序列克隆到了P42质粒P结构域序列相应的LOOP2中(图2)。
(二)嵌合蛋白的诱导表达及纯化
将测序验证序列正确的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，通过含有氨苄西林的LB平板筛选阳性克隆。挑取阳性克隆的菌落接种到100mL LB培养基(含0.01％氨苄西林)，在37℃、220r/min的摇床中培养至OD600约为0.5时，加入IPTG至终浓度为0.5mM，设置摇床参数为22℃、220r/min过夜诱导表达。将过夜诱导表达的菌液于12000g、4℃离心10min。弃上清，收集菌体沉淀，用10mL 4℃预冷的PBS(pH7.3)重悬菌体一次，再次12000g、4℃离心10min。弃上清，保留菌体沉淀，用10mL 4℃预冷PBS(pH7.3)重悬菌体沉淀，并加入蛋白酶抑制剂PMSF至终浓度为1mM。超声波破碎(200W功率、工作2s、间歇2s、总超声时间30min)菌体后于12000g、4℃离心10min，收集上清，弃沉淀，通过SDS-PAGE分析蛋白表达情况。将上清用0.22μm滤膜过滤，按GST亲和磁珠纯化说明书操作步骤纯化目的蛋白，并通过SDS-PAGE分析纯化的蛋白。结果如图3和图4所示，所有构建的7个嵌合基因都得到了表达，而且表达的蛋白都在上清里。图5表明，我们通过GST亲和磁珠纯化后，得到了较纯的、预期分子量大小的蛋白。
(三)嵌合蛋白的免疫印迹检测
用10％SDS-PAGE凝胶对纯化后的嵌合蛋白样品进行电泳，先于80伏电泳30min，然后于150伏电泳1h。电泳完成后，将凝胶上的蛋白通过转膜的形式转移至硝酸纤维素(NC)膜上，转膜参数为45V、1h。取出转有蛋白的NC膜，用含5％脱脂奶粉的封闭液在常温下封闭1h。用PBST洗涤封闭完的NC膜一次。加一抗后于4℃过夜孵育，一抗分别为抗GST单克隆抗体(1：5000)、抗EV71多克隆兔血清(1：5000)、抗诺如病毒P结构域小鼠血清(1：500)。次日，用PBST洗膜3次，10min/次，然后孵育辣根过氧化物酶标记的(HRP-labeled)抗兔(1：10000)或抗鼠二抗(1：5000)，于室温孵育2h。用PBST洗膜3次,20min/次，最后用增强化学发光法(ECL)进行显色。结果如图6所示，抗GST单克隆抗体能检测的特异性的GST融合蛋白。除了单表位SP55和SP28与P结构域形成的嵌合蛋白不能与抗EV71多克隆抗体反应外，其它的都有特异性反应。得到的所有7个嵌合蛋白都能与抗诺如病毒P结构域小鼠血清发生特异性反应(图7)。这些结果表明我们成功地表达了7个嵌合蛋白，且这些蛋白具有针对EV71和诺如病毒抗体的抗原性。
(四)嵌合蛋白的结构预测
基于各个嵌合蛋白的氨基酸序列，通过在线蛋白质结构预测工具SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/interactive)对其蛋白质结构进行预测(图9)。除EV71的3个表位串联的嵌合蛋白是单体外，其它7个嵌合蛋白都可以形成二聚体，且EV71的各个表位及组合均能较好地展示在诺如病毒P结构域的表面，这进一步从理论上支持了这些嵌合蛋白的抗原性。
Claims (10)
1.一种肠道病毒EV71中和抗原表位与人诺如病毒P结构域嵌合蛋白，其特征在于，其包括如SEQ ID NO：2所示的VA387氨基酸序列，以及所述EV71的中和抗原表位，所述中和抗原表位是如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5分别所示SP55、SP70、SP28的3个中和抗原表位之一或其组合。
2.如权利要求1所述的肠道病毒EV71中和抗原表位与人诺如病毒P结构域嵌合蛋白，其特征在于，所述EV71的中和抗原表位是SP70、SP55与SP70组合、SP55与SP28组合、SP70与SP28组合，或者SP70与SP545及SP28组合。
3.如权利要求2所述的肠道病毒EV71中和抗原表位与人诺如病毒P结构域嵌合蛋白，其特征在于，所述EV71的中和抗原表位是SP70与SP545及SP28组合。
4.编码如权利要求1至3任一项所述的肠道病毒EV71中和抗原表位与人诺如病毒P结构域嵌合蛋白的基因。
5.如权利要求4所述的基因，其特征在于，其中按照大肠杆菌密码子表达使用的偏好性设计和优化肠道病毒EV71中和抗原表位的核苷酸序列。
6.如权利要求5所述的基因，其特征在于，肠道病毒EV71中和抗原表位优化后的核苷酸序列SP55-F、SP55-R、SP70-F、SP70-R、SP28-F、SP28-R、SP55-SP70-SP28、SP55-SP70、SP55-SP28、SP70-SP28分别如SEQ ID NO:6至SEQ ID NO:15所示，其中，ACTAGT和ATCGAT分别为Spe I和Cla I的酶切位点。
7.一种表达如权利要求1所述嵌合蛋白的嵌合载体的构建方法，其特征包括以下步骤：
1）设计的核苷酸序列：EV71的单个表位通过诺如病毒P结构域LOOP2插入从而形成嵌合基因,即：SP55-L2、SP70-L2和SP28-L2，在每个EV71单个表位核苷酸序列的3’端加CTAGT和5’端加AT；或EV71的3个表位分别进行两两组合或3表位的组合后，通过诺如病毒P结构域LOOP2插入从而形成嵌合基因，即：SP55-SP70-L2、SP55-SP28-L2、SP70-SP28-L2和SP55-SP70-SP28-L2，在组合中的各表位之间通过3个重复的接头序列GGGGS进行串联；
2）根据设计的核苷酸序列，通过人工合成相应的基因后再克隆到P42质粒的P结构域相应位置中，得到7个含EV71中和抗原表位的P结构域嵌合基因的重组质粒；
3）将步骤得到的重组质粒转化大肠杆菌细胞中，涂布含有氨苄西林的LB平板并筛选阳性克隆，将阳性克隆进行培养后提取质粒并送测序验证；
4）将测序验证为正确的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，涂布含有氨苄西林的LB平板并筛选阳性克隆，培养后加IPTG进行诱导，大量表达出含GST标签的EV17中和抗原表位与诺如病毒P结构域的嵌合蛋白，用GST亲和磁珠纯化表达的嵌合蛋白，并通过抗GST标签抗体和免疫印迹验证融合蛋白的表达；
5）通过抗诺如病毒P结构域抗体、抗EV71病毒抗体和免疫印迹法进行验证所得到的嵌合蛋白具有抗原性。
8.如权利要求7所述的表达如权利要求1所述嵌合蛋白的嵌合载体的构建方法，其特征，其特征在于所述步骤2）重组质粒构建如下：
1）用限制性内切酶Spe I和Cla I分别酶切P42质粒，获得纯的、线性化的质粒；
2）人工方法分别合成每一个单表位即SP55、SP70、SP28的两条互补的寡核苷酸链，经退火形成双链DNA，通过T4 DNA连接酶将退火形成的双链DNA克隆到经Spe I和Cla I酶切过的质粒P42中；或者以基因合成的方式合成串联表位即SP55-SP70-SP28、SP55-SP70、SP55-SP28、SP70-SP28的基因片段，保存在相应的质粒中，再通过设计的无缝克隆引物将4个串联表位分别从合成的基因中扩增出来后，以无缝克隆的方法分别将每一个串联表位克隆到P42质粒中；
3）通过以上方法，总共构建了7个重组质粒，并经过测序验证以正确的序列克隆到了P42质粒P结构域的LOOP2中；
其中，所述无缝克隆引物SP55-F、SP70-F、SP28-R序列分别如SEQ ID NO：16、SEQ IDNO：17、SEQ ID NO：18所示。
9.如权利要求7所述的表达如权利要求1所述嵌合蛋白的嵌合载体的构建方法，其特征在于所述步骤4）中嵌合蛋白的诱导表达和纯化的详细步骤如下：
1）蛋白表达：将转化有重组质粒的BL21(DE3)感受态细胞涂布含氨苄西林的LB平板，挑选阳性克隆加入到100mL含氨苄西林的LB培养基，培养至OD600约为0.5时，加入IPTG至其终浓度为0.5mM，于22℃、220r/min过夜诱导表达；将过夜诱导表达的菌液于12000g、4℃离心10min，弃上清；用10mL 4℃预冷的PBS（pH7.3）重悬菌体，于12000g、4℃离心10min，弃上清，菌体沉淀用于进一步的蛋白纯化或保存于-80℃备用；
2）蛋白纯化：用10mL PBS（pH7.3）重悬步骤1）的菌体沉淀，加入蛋白酶抑制剂PMSF至终浓度为1mM，超声波破碎菌体，然后于12000g、4℃离心10min，丢弃沉淀，收集上清约10mL，将上清用0.22μm滤膜过滤后，按GST亲和纯化磁珠BeaverBeads GSH说明书操作步骤进行蛋白纯化。
10.如权利要求7所述的表达如权利要求1所述嵌合蛋白的嵌合载体的构建方法，其特征在于所述步骤4）中，用免疫印迹法分析纯化得到的嵌合蛋白，步骤如下： 首先通过抗GST单克隆抗体分析表达的蛋白是否符合预期的分子量大小；然后通过抗EV71多克隆兔血清和抗诺如病毒P结构域的小鼠多克隆抗体分析，发现这些表达的嵌合蛋白具有相应的抗原性，可用于EV71和诺如病毒的检测试剂盒及新型二价亚单位疫苗的研发。
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