CN102612525A - 抗原-诺罗病毒p-结构域单体和二聚体，抗原-诺罗病毒p-粒子分子，及其制备和应用方法 - Google Patents

Abstract

取代的诺罗病毒衣壳蛋白单体，其仅含有P-结构域，被称为抗原-诺罗病毒P-结构域单体，包含通过分子克隆插入到每个P-结构域单体上存在的三个表面环中的一或多个的外来抗原。所述抗原-P-结构域单体可以自发组装成八面体形式，被称为抗原-诺罗病毒P-粒子，后者由24个拷贝的抗原-P-结构域单体构成。每个取代的P-结构域单体含有1到3拷贝的外来抗原，每个抗原-P-粒子上共有24-72个抗原拷贝。所述抗原-P-粒子可用于感染了外来病毒(例如轮状病毒)的个体的诊断、免疫和治疗方法中，还可以作为外来抗原的呈递载体用于开发抗许多感染性和非感染性疾病的新疫苗。取代的诺罗病毒P-粒子可以在大肠杆菌和酵母菌中容易地产生，高度稳定并能耐受广泛的物理化学条件。改造过的诺罗病毒P-结构域单体包含插入到P-结构域单体的三个环中的一或多个环的一或多个限制酶识别位点，提供使用方便的克隆盒用于将候选外来抗原插入表面环中。P-粒子-VP8嵌合体还可以作为抗轮状病毒和诺罗病毒的双重疫苗。

Description

抗原-诺罗病毒P-结构域单体和二聚体,抗原-诺罗病毒P-粒子分子,及其制备和应用方法

权益

本发明是在国立卫生院(NIH)、过敏和传染病国立研究院(经费编号R01AI37093和R01 AI055649)以及国防部(经费编号PR033018)授予江熙的政府支持下做出的。这项研究还得到了辛辛那提大学和辛辛那提儿童医院医学中心(来自临床及转化科学与培训中心的T1研究基金)对谭明的支持。此外，Nipert基金会赞助给谭明的传染病研究经费也对该研究作出了贡献。政府对本发明可能拥有某些权利。

发明领域

本发明总体上涉及诺罗病毒(NOROVIRUS，NOR)衣壳蛋白的P-结构域和NOR P-粒子；抗原-诺罗病毒P-结构域单体、抗原-诺罗病毒P-结构域二聚体和抗原-诺罗病毒P-粒子分子的制备；以及它们在抗病毒药物、药物递送系统、以及疫苗开发中的用途。

发明背景

快速发展的生物材料和生物工程领域已成为现代医学的关键组成部分。病毒蛋白笼由于其多功能性和易于形成阵列，成为建立呈递系统的理想基材。通过基因工程，自组装的病毒结构蛋白给生物材料的合成提供了优秀的平台，是外来分子以设定模式进行整合时的良好支架，其可作为疫苗或药物。

近期的一个利用病毒颗粒进行抗原呈递的例子是Manayani等描述的兽棚病毒(flock house virus，FHV)VLP与180个氨基酸的炭疽杆菌抗原插入片段构成的嵌合体。该重组病毒样颗粒既作为炭疽抗毒素，也是炭疽疫苗的分子支架，即在单个化合物中结合了炭疽抗毒素和疫苗的功能。另一个例子是Chatterji等描述的豇豆花叶病毒(Cowpea mosaic virus，CPMV)，文中包括了豇豆花叶病毒用于抗原表位呈递和作为肽和蛋白质附着基质的用途。整个蛋白质被化学交联至通过基因工程加在二十面体CPMV颗粒外壳蛋白上的赖氨酸和半胱氨酸残基。此外，包含伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)表面抗原(OSPA)的乙肝病毒(HBV)衣壳样颗粒(CLP)也有描述。

诺罗病毒(NOR)，以前也被称为“诺瓦克样病毒”(NLV)或小圆结构病毒，在发达国家和发展中国家都是最重要的流行性急性胃肠炎的病毒病原体。这些遗传多样性的病毒包括两个主要遗传组(genogroups)(GI和GII)和大约30种基因型。NORs属于杯状病毒科(Caliciviridae)，是二十面体的单链正链RNA病毒，其衣壳由180个拷贝的单一主要结构蛋白构成。

过去，对人类NORs的生物学研究受到了阻碍，因为病毒无法有效地在细胞培养中生长，并且没有建立合适的动物模型来进行病毒复制。从疾病爆发和人类志愿者研究获得的人类粪便样本是病毒的唯一来源，但粪便中的病毒含量太低以至于用常规电子显微镜进行病毒检测是不可能的。然而，最近通过杆状病毒(主要感染昆虫的双链DNA病毒)在昆虫细胞中成功表达NOR衣壳蛋白给NORs免疫学、流行病学和病理学研究提供了有力的替代。产生的病毒衣壳蛋白单体自组装成病毒样颗粒(VLPs)。这些VLPs与人类粪便中发现的真正病毒在形态和抗原性上没有区别，因此给免疫检测和关于受体-病毒相互作用的研究提供了一个有用的工具。

重组NOR衣壳蛋白的原子结构表明，它包含180个衣壳蛋白单体组织成的90个二聚体壳微体，形成T＝3的二十面体。来自冷冻电子显微镜和X射线晶体学的数据显示，病毒衣壳蛋白折叠成两个主要结构域，N-末端壳(Shell，S)结构域和C-末端突起(Protrusion，P)结构域。S结构域形成内壳，而P-结构域建成从内壳延伸出来或者从内壳隆起的拱形结构。形态发生研究表明，S结构域包含衣壳的内壳组装所需的元件，而P-结构域二聚体亚基之间的分子相互作用增加了衣壳的稳定性。这两个结构域是通过一个8-10-残基(氨基酸)铰链连接在一起。P-结构域又分为P1和P2结构域，后者位于衣壳的最外表面。与S和P1结构域不同，P2结构域具有较高的序列变异。由于P-结构域位于病毒粒子的最外表面且包含最可变的序列，P-结构域被认为是负责与宿主的相互作用、免疫识别、受体结合和免疫反应。已经证明分离的含有铰链(但缺乏s域)的P-结构域可以体外形成二聚体，该二聚体保持与人类组织血型抗原(HBGA)受体的结合。

HBGAs是复杂聚糖和相关碳水化合物的异质群体。NORs以多样化毒株特异的方式识别人类HBGAs。在HBGAs中，最常遇到的血型是ABO(ABH)和Lewis。ABH和Lewis血型系统中抗原形成使用的生物合成途径是相互关联的。

人类HBGAs存在于许多类型的细胞，包括红血细胞和血管内皮细胞，以及胃肠、泌尿生殖道和呼吸道粘膜上皮细胞。它们也可能以可溶形式存在于生物液体中，比如血液、唾液、胃肠内容物和乳汁。HBGAs是由前体结构经一组糖基转移酶逐步添加单糖单位而合成的，所述糖基转移酶受到基因的控制并被称为ABO、Lewis和分泌型(secretor)基因家族。

人类HBGA系统高度多态性，受到多个带有沉默等位基因的基因家庭的控制。细胞表面上有HBGAs这样的多元化分子表明可能存在对抗不断变化的外部环境的宿主防御机制。然而，HBGAs一直与一些细菌和病毒病原体的感染联系在一起，并可能为诺罗病毒提供“对接站”。也就是说，HBGAs可以作为病原体的识别目标，并可能促进病原体进入那些表达或者形成与抗原的受体-配体键的细胞。虽然这种相互作用的确切性质目前还不清楚，抗原结合时发生的与病原体的紧密关联可能在感染过程的初始步骤中具有将病原体锚定到细胞上的作用。

NORs对人类HBGAs的识别是典型的蛋白质-碳水化合物相互作用，其中病毒衣壳蛋白突起结构域与HBGA抗原的寡糖侧链形成交界面，不同毒株之间有广泛的多样性。作为只可能在肠道复制的病原体，NORs已发展出独特的策略来克服宿主防御系统。其遗传和结构的变化证实了这种独特性，这就解释了为什么NOR相关疾病如此普遍和广泛存在于全球各个人口群体。

2003年12月2日出版的PCT专利出版物US2003/101176(通过引用全文并入本文)涉及NOR毒株以几种不同组织血型模式之一与ABO和LewisHBGAs的结合。NORs对HBGAs的识别是毒株特异性的，已确认了多种独特的HBGA结合模式。基于NORs的多样性和宿主细胞表面上碳水化合物的多态性，可能会发现更多的模式。

2006年12月28日出版的PCT专利公开US2006/138,514(通过引用全文并入本文)涉及一种被称为P-粒子的小粒子，该粒子显示对HBGA有增强的结合亲和力。P-粒子是T＝1的二十面体，由24个P-结构域单体组织成12个相同的P-结构域二聚体后建成。12(P-结构域二聚体)和24(P-结构域单体)均是二十面体对称的完美单元数，在植物和动物病毒中经常出现。分离的P-结构域(没有S结构域或单体衣壳蛋白的铰链)可以自发形成T＝1的二十面体P-粒子，该复合体由排列成12个二聚体的24个P-结构域单体构成。P-粒子可以与相应的HBGAs结合，并揭示强烈阻断NOR VLP与HBGAs的结合。多个NOR毒株中都观察到P-粒子的自发形成，包括VA387、MOH和诺瓦克病毒(Norwalk Virus，NV)株。NOR P-粒子可以用于NOR感染的治疗和抗NOR感染疫苗的制备。

轮状病毒(RVS)和NORs是全球范围内的常见病原体，造成巨大的医疗负担。全球来说，每年＜5岁儿童中发生高达10亿起各种原因导致的肠胃炎，其中13％至25％(～1亿3千万起)是由RV造成的。RV是儿童严重腹泻和脱水的首要原因，每年严重的RV胃肠炎造成350,000-600,000例＜5岁儿童死亡。它还造成每年2百万儿童入院，估计超过10亿美元的花费。另一方面，NORs是非细菌性急性胃肠炎流行病的最重要病因，影响到所有年龄的个体。NORs具有高度传染性，可迅速蔓延，在各种环境中造成大规模爆发。最近的一份报告估计，发展中国家每年NORs在＜5岁儿童中造成1091,000例住院和218,000例死亡。在美国，每年食源性病原体感染估计7千6百万人，造成325,000例住院。因为临床护理和食品召回，每年仅仅NORs即造成3亿5千万-7亿5千万美元的损失。

虽然最近有两种新的RV疫苗(GlaxoSmithKline的Rotarix^TM，和Merck的

)上市，仍有几个与疫苗相关的问题尚未完全解决：a)当接种和未接种疫苗的儿童接触到比疫苗所含更广泛的RV血清型时，疫苗的效力；b)疫苗成本及发售成本造成的这些疫苗在最需要它们的贫穷国家中发行能达到多广泛的问题；和c)在死亡率最高的发展中国家的保护水平还有待确定。这些减毒活疫苗有可能回复或重新排列组合生成毒性株。因此，需要含有高度有效的RV中和表位的新一代亚单位疫苗。目前，还没有NOR相关疾病的治疗方法。因此，开发抗NOR和RV的有效疫苗，特别是可以提供抗两者的保护作用的单一疫苗，将填补一个重要的临床需要，而这更突出了本文公开的P-粒子疫苗平台的显著商业潜力。

尽管NOR感染的治疗和疫苗开发所取得的进步，仍然需要加强对其他病毒类型引起的感染的鉴定、对其他病毒类型的治疗、抗其他病毒类型的疫苗开发、以及建立改进的药物递送系统以便针对特定的组织或器官。

发明概述

本发明涉及这样的发现，即NOR P-结构域单体的远端部分包含一个肽串，外来抗原，特别是外来病毒抗原可以插入其中。这样得到的抗原-P-结构域单体可以自发地组装成被称为抗原-P-粒子的纳米粒子，通常处于八面体形式，由排列成12个二聚体的24个抗原-P-结构域单体构成。所述P-粒子很容易在大肠杆菌中产生，非常稳定，并且是强免疫原性的。每个P-结构域单体有3个表面环，使每个粒子的环共达到72个，这些环是用于免疫增强的潜在的外来抗原呈递位点。抗原-P-粒子自发形成，并有位于P-结构域单体远端部分的外来抗原。抗原-P-粒子的这一形成过程，根据抗原-P二聚体的浓度，可以动态地转化或达到平衡。抗原-P-粒子可以用于培育抗外来病毒抗原的抗体，还可用于制造针对这些外来病毒感染的疫苗。

本发明的第一个方面涉及改造过的NOR P-粒子，所述改造过的P-粒子可以作为呈递多种传染性病原体的平台，从而提供了抗这些疾病的新的疫苗策略。平台还可以用于疫苗的开发或者作为药物载体或药物递送媒介用于治疗包括癌症、过敏和自身免疫性疾病的非传染性疾病。与许多其他疫苗平台相比，抗原-P-粒子系统有许多优点，包括高产量和生产成本低、纯化程序简单和抗原呈递效率高。

本发明的抗原-P-粒子是由NOR衣壳的突起(P)结构域形成的，包含24个拷贝的P-结构域单体，所述单体排列为二聚体。抗原-P-粒子的分子量(大约830kDa)和大小(Φ＝20nm)对于亚单位疫苗是有效的尺寸。外来抗原被插入到每个P-结构域单体上的三个表面环中的一或多个，从而每个抗原-P-粒子表面上最多可以呈递72拷贝的外来抗原。单个抗原-P-粒子上存在多个外来抗原大大提高了外来抗原的抗原性和免疫原性。不同类型和大小的外来抗原，从小多肽到大蛋白，都可插入三个表面环中的任何一或多个，包括作为外来抗原的代表性例子：His标签(7个组氨酸)、小鼠巨细胞病毒的T细胞抗原表位(9aa)、假单胞菌的Epi8抗原(10aa)、轮状病毒(RV)的VP8(159aa)和绿色荧光蛋白(238aa)。

NOR P-粒子高度稳定，并能耐受广泛的物理-化学条件。最重要的是，与其他许多需要利用真核系统来生产的重组亚单位疫苗不同，抗原-P-粒子和野生型NOR P-粒子一样，可以很容易地在大肠杆菌和酵母或其他细菌源中产生，并且有极高的产量和简单的纯化程序。

本发明的第二个方面是一种用户友好的用具(means)，其通过插入便利的克隆盒，向每个P-结构域单体上存在的一或多个表面环中插入候选的外来抗原。克隆盒一般给P-结构域载体中的一或多个环带来一或多个，通常至少是一对特异识别核苷酸序列，又称为限制性位点或限制识别位点。限制性位点是被限制性内切酶所识别的特异核苷酸序列。位点一般是回文的(因为通常限制性内切酶以二聚体结合)，特定的限制性内切酶通常会切割其识别位点内部或者附近的两个核苷酸之间的特异DNA序列。例如，常见的限制性内切酶EcoRI识别回文序列GAATTC，并在顶部和底部的DNA链上的G和A之间切开，给每个末端留下突出末端(DNA链不带有互补序列的结束部分)。然后这个突出末端或“粘性末端”可以用于添加或连接(通过DNA连接酶)带有与之互补的突出末端(例如，另一个DNA的EcoRI酶切片段)的DNA片断。在每个P-结构域单体上存在的一或多个表面环中使用限制性位点，允许克隆盒内含有的外来抗原被替换到任何一或多个表面环内，或者两个或两个以上不同外来抗原，或者其他克隆盒被替换到P-结构域单体的三个环中的不同的一个/多个内。

本发明另一个方面是通过24个P-结构域单体(以12对二聚体的形式)自发组装形成抗原-P-粒子。当所有P-结构域单体都相同时，这种抗原-P-粒子被称为同质性P-粒子。

本发明的另一个方面是形成异质性抗原-P-粒子，其包括两个或两个以上经不同修饰的抗原-P-结构域单体，或者至少一个经不同修饰的抗原-P-结构域单体或野生型P-结构域单体。所述经不同修饰的抗原-P-结构域单体或野生型P-结构域单体可以按照任何比率(分子或重量比)使用，以获得各种各样的抗原-P-粒子。

本发明另一个方面是抗原-P-粒子作为候选疫苗的用途，所述候选疫苗提供抗病毒的免疫保护作用，其中P-粒子中每个P-结构域单体至少有一个表面环中插入了特异病毒抗原，包括例如轮状病毒(RV)抗原。

本发明另一个方面涉及保护人类免于病毒性疾病的方法，所述方法包括给予人免疫量的抗原-P-粒子，所述抗原-P-粒子含有特异病毒抗原，后者被插入到无菌无毒药物可接受载体中本文描述的P-粒子中P-结构域单体上至少一个表面环内，其中所述抗原是病毒抗原。

本发明另一个方面涉及在个体中诱发抗病毒性疾病的免疫反应的方法，所述方法包括的步骤是口服或肠胃外给予个体至少免疫有效剂量的组合物，所述组合物包含本文描述的抗原-P-粒子和药物载体，其中所述抗原是病毒抗原，其中所述剂量能够有效地诱发个体的免疫反应。

本发明另一个方面是抗原-P-粒子载体/疫苗平台试剂盒。

本发明另一个方面涉及向P-结构域单体的一或多个完全暴露的环的克隆盒中引入限制性位点，包括独特或罕见的限制性位点。就插入含有限制性位点的克隆盒来说，建议避免在环的克隆盒中插入蛋白酶识别序列。例如，BgIII位点(AGATCT)编码的二氨基酸限制性位点是典型的胰蛋白酶切割位点，应当避免。

本发明另一个方面涉及一个或多个环的修饰，包括加上间隔臂或手臂来延长环的暴露部位，以便最好地容纳某些外来抗原。

本发明另一个方面涉及插入多个不同抗原的设计，以防止大抗原(比如RV VP8)遮盖了带有较小外来抗原的相邻环，因为这种情况可能使得很难在该环上进行小抗原表位的呈递。

本发明另一个方面涉及向P-结构域单体的一或多个表面环中插入配体或信号肽，从而得到一或多个远端表面含有插入的配体或信号肽的取代的P-粒子。然后所述配体或信号肽使得取代的P-粒子能够靶向特定器官或组织中的相应受体，并前往这些位置。例如，带有肽CNGRC(5个氨基酸)的P-粒子可能能够到达大量表达CNGRC的受体(CD13)的肿瘤组织(即癌)。

本发明另一个方面涉及取代的P-粒子单体，和二聚体及其P-粒子，这些分子含有借助表面暴露的赖氨酸和半胱氨酸通过化学反应插入P-粒子的环的药物偶联物。这种情况中，取代的P-粒子可以作为药物载体使用。

本发明另一个方面涉及取代的P-单体，和二聚体及由其形成的P-粒子，这些分子含有插入到至少一个表面环的配体或信号肽，和插入到至少一个表面环的药物偶联物。这些取代的P-粒子提供了药物递送系统，将药物靶向到患病的特定组织或器官。

本发明另一个方面是改造过的或抗原-P-结构域单体的改造过的遗传密码的基因序列。

本发明另一个方面是可增殖的生物实体(例如，大肠杆菌)，所述生物实体含有改造过的或抗原-P-结构域单体的改造过的遗传密码。

虽然由以下附图和详细描述(显示了如文中所描述的，更特别是由所附权利要求限定的新颖构建、组合和元件)，本发明的性质和优势将得到更充分的理解，应当明白在本发明的确切实施方案中进行的改变包含在权利要求的范围内，除非是可能被现有技术排除在外。

附图简述

图1显示了P-粒子-VP8嵌合体的冷冻电镜结构。(A)野生型P-粒子。(B)P-粒子-VP8嵌合体。与野生型P-粒子相比，嵌合体显示了中间带有缺口的延长的突起，表明P2亚结构域和插入的VP8抗原之间的边界。(A)和(B)中粒子的半径用不同颜色图案表示。(C)，轮状病毒(Wa)VP8抗原晶体结构的两个拷贝(卡通模型，绿色和蓝色)在嵌合体的延长突起的电子密度图(透明灰色)中的拟合情形，证实VP8抗原在嵌合P-粒子上暴露。(D-E)，P-粒子-VP8嵌合体的突起的放大侧视图(D)和俯视图(E)。

图2展示了NOR衣壳和衣壳蛋白(VP1)。视图A和B显示了诺瓦克病毒的病毒样颗粒(NOR VLP)的表面结构(视图A)和横截面(视图B)。视图C显示了作为VLP的基本单元的VP1二聚体(带状模型)。每个VP1分为N末端臂(绿色)、壳(S)结构域(黄色)和突起(P)结构域。P-结构域又分为P1和P2亚结构域(分别是红色和蓝色)，其中P2在VLP的最外表面。视图D中按相同的颜色方案显示了VP1的线性结构。

图3显示了NOR P-粒子及其表面环的结构。视图(A)展示了重建的诺罗病毒P-粒子的冷冻电镜结构，视图(B)显示多个突起中的一个，是P二聚体的最外层区域，以晶体结构(带状模型)来阐述，表明二聚体的六个(6)表面环。红-绿色和蓝-黄色分别表示两个P-结构域。图中显示了每个P单体中适合作为抗原插入位点的三个表面环。两个P-结构域单体形成稳定的球形P二聚体。然后十二(12)个相同的P二聚体组装成T＝1的二十面体P-粒子，根据P二聚体的浓度进行动态地转换和/或达到平衡。P-结构域之间的分子间相互作用是P-粒子形成的初始力量。末端连接的半胱氨酸(S)可以通过形成分子间二硫键来稳定P-粒子。

图4显示了NOR P二聚体-B-三糖复合体的晶体结构。三糖(病毒受体)是在带状模型显示的拱形样P二聚体的顶部球形内。

图5显示了NOR P-粒子与野生型的NOR VLPs具有类似的免疫原性和免疫反应性。在视图A中，NOR株VA387的P-粒子所诱发的超免疫抗体对VLP的反应滴度与VLP诱发的抗体类似。VLP(视图B)和P-粒子(视图C)诱导的抗体表现出对NOR VLP结合A型HBGA受体有类似的阻断作用。

图6用冷冻电镜显示了对小P-粒子的3-D结构重建。A和B显示了小P-粒子的侧视和俯视图，而C显示了P二聚体晶体结构与小P-粒子的冷冻电镜密度图的拟合。

图7显示了在不损害P-粒子的形成和稳定性的情况下完全暴露的P-粒子中LOOP2上7xHis标签的暴露。视图(A)显示带有7xHis标签的P-粒子与Talon树脂结合良好。GST-P-结构域-His标签融合蛋白经凝血酶消化，产生P-粒子-His-标签嵌合体(PP-His-标签)、GST以及其他共同纯化的蛋白质的混合物。7xHis-P-粒子加共同纯化的蛋白(上样之前)与Talon树脂共同温育。所有7xHis-P-粒子和少量共同纯化的蛋白结合到树脂上(穿流液)。清洗后，用咪唑将结合的7xHis-P-粒子从树脂上洗脱(洗脱1和2)。标记是预先染色的标准蛋白，条带从上到下代表113、92、50、35、29、21kDa。在视图(B)中，对来自(A)的洗脱液进行的凝胶过滤分析表明，＞98％的被洗脱的7xHis-P-粒子形成了P-粒子。

图8显示了带有暴露的RV VP8的NOR P-粒子。视图A的SDS-PAGE显示通过亲和层析(泳道1)和进一步的凝胶过滤(视图D)纯化的重组RVVP8-P-结构域嵌合体(53.5kDa)，以及P-粒子(泳道2)和P-结构域二聚体(泳道3)级分。视图B和C显示了利用抗VP8(视图B，泳道4和5)或抗NORVLP(视图C，泳道6和7)的抗体对VP8-P-粒子嵌合体进行的Western分析。视图D中，亲和纯化的VP8-P-结构域嵌合体(泳道1)的凝胶过滤表明，该蛋白的主要部分形成了P-粒子(～1300kDa)。视图E显示利用抗VP8的抗体来检测包被的VP8-P-粒子嵌合体(红色，PP-hVP8C)、重组VP8(蓝色，hVP8C)和单独P-粒子(绿色，PP，对照)的酶免疫分析(EIA)结果。泳道M显示预先染色的蛋白标志物，条带从上到下为113、92、52、35、29kDa。

图9显示了带有位于LOOP2的克隆盒的P-粒子载体。P-粒子最外层部分的晶体结构(带状模型)在图的下半部分显示，其中标出了三个表面环，而P-粒子载体的克隆盒的细节显示在图的上半部分。

图10显示了RV VP8-P-粒子嵌合体的产生。Loop2中带有克隆盒的P-粒子载体(视图A)产生了野生型NOR P-粒子(视图B)。当RV VP8的编码序列(视图C)被克隆到P-粒子载体(视图D)中，产生了RV VP8-P-粒子嵌合体(视图E)，图中标出了位于嵌合体最外表面的RV VP8。

图11显示了VP8-P-粒子嵌合体所诱导的抗体对NOR和RV均有反应性，并表现出对NOR VLP结合HBGA受体的阻断。A图显示抗体分别对P-粒子和RV VP8的反应性。B图显示抗体阻断了NOR VLP与其HBGA受体的结合。X轴显示抗血清的稀释(倍数)。

图12显示了构建P-粒子载体、P-粒子平台和嵌合体P-粒子疫苗的流程图。GST、P-结构域和C分别表示谷胱甘肽-S-转移酶(GST)基因、NOR P-结构域和含有半胱氨酸的短肽的编码序列。两端的粗线显示质粒pGEX-4T-1。

图13显示了P-粒子载体的设计。图的底部显示了P-粒子最外部分的晶体结构，其中标出了三个表面环。图的上部显示了P-粒子载体的一个代表性设计选择，其中每个表面环包含了带有不同限制酶识别位点的克隆盒。

图14显示了P-粒子-His标签嵌合体的产生和分析。(A)P-粒子-His标签嵌合体的表达构建体。His标签被插入到Loop 2的N372和D374之间。PGEX-4T-1是GST基因融合系统的表达载体。圈起来的C代表含有半胱氨酸的肽(CDCRGDCFC)。(B)晶体结构(卡通模型)中P-粒子的突起的远端表示两个N373的位置(灰色和青色中的点模型)，那是插入的His-标签的预期位置。(C)P-粒子-His-标签嵌合体的表达和纯化。SDS PAGE分析表明，GST-P-结构域-His标签融合蛋白(GST融合)大约52kDa。融合蛋白在溶液中经凝血酶消化产生GST(～27kDa)和P-结构域-His标签嵌合体(PD-His-标签)(～35kDa，左边视图)。也可以通过凝血酶消化从纯化树脂释放P-结构域-His标签嵌合体(右视图)。M是预先染色的蛋白标记，从顶部到底部的各条带代表113、92、50、35、29、21kDa。(D)凝血酶释放的P-结构域-His标签使用大小排阻柱Sperdex 200进行凝胶过滤层析的洗脱曲线。标出了分别代表空白、P-粒子-His标签和P二聚体-His标签的三个主要峰。这三个峰的大小分别用蓝色葡聚糖2000(～2000kDa，空白)、野生型P-粒子(～830kDa)和野生型P二聚体(～70kDa)进行了校准。(E)凝胶过滤层析(D)的级分通过SDS-PAGE分析进行分析。

图15显示了小鼠对P-粒子呈递的短肽的反应。(A)分别用相同量的P-粒子-His标签嵌合体(PP-His，蓝色)、P二聚体-His标签嵌合体(PD-His，紫色)或野生型P-粒子(WT PP，对照，黑色)免疫后，小鼠血清(n＝5)在EIA中对海栖热袍菌(T.Maritima)重组His标签-α-岩藻糖苷酶的免疫反应性。(B)通过终点稀释法确定(A)中血清的抗体滴度。(C)-(F)，小鼠对P-粒子中未暴露的短肽的抗体反应。(C)用含有内部肽CDCRGDCFC的P-粒子(PP-CDCRGDCFC)免疫后，小鼠血清(n＝5)在EIA中对带有CDCRGDCFC标签的麦芽糖结合蛋白(MBP)(对CDCRGDCFC，紫色)和野生型P-粒子(对WTPP，阳性对照，绿色)的免疫反应性。用P-粒子-His标签免疫后，小鼠血清对(A)中的海栖热袍菌His标签-α-岩藻糖苷酶(PP-His对His-标签，蓝色)的免疫反应性被列入作为比较。(D)通过终点稀释法确定(C)中血清的抗体滴度。(E)用含有内部肽CNGRC的P-粒子免疫后，小鼠血清对带CNGRC标签的MBP(对CNGRC，紫色)和野生型P-粒子(WT PP，阳性对照，绿色)的免疫反应性。用P-粒子-His标签免疫后，小鼠血清对(A)中的海栖热袍菌带His标签的α-岩藻糖苷酶(PP-His，蓝色)的免疫反应性被列入作为比较。(F)通过终点稀释法确定(E)中血清的抗体滴度。5ng/μL的不同抗原[对(A)和(B)，His标签-α-岩藻糖苷酶；对(C)和(D)，CDCRGDCFC标签-MBP；对(E)和(F)，CNGRC标签-MBP；对(C)-(F)，野生型P-粒子]包埋在微量滴定板上进行EIA分析。指明稀释度的相应血清用于测量免疫反应性。^*P＜0.05。

图16显示P-粒子-VP8嵌合体的产生和分析。(A)基于载体pGEX-4T-1的P-粒子-VP8嵌合体的表达构建体，其含有编码P-结构域的cDNA序列。轮状病毒(Wa)VP8抗原通过带有酶切位点SpeI和ClaI/EcoRI的克隆盒被插入到P-结构域Loop2中T368和L375之间。圈起来的C表示含有半胱氨酸的肽(CDCRGDCFC)。(B)P-粒子-VP8嵌合体的表达和纯化。SDS-PAGE分析表明，GST-P-VP8融合蛋白(GST融合)大约80kDa(左视图)。融合蛋白经凝血酶消化得到GST(～27kDa)和P-VP8嵌合体(～52kDa)(中间视图)。也可以通过凝血酶消化从纯化珠上释放游离P-VP8嵌合体(右视图)。泳道M是预先染色的蛋白标记，从顶部到底部条带代表113、92、50、35、29、21kDa。(C)凝血酶释放的P-VP8蛋白经大小排阻柱Sperdex 200进行凝胶过滤层析的洗脱曲线。各个峰的多个级分的SDS PAGE分析显示在顶端。柱子分别用蓝色葡聚糖2000(～2000kDa，空白)、野生型P-粒子(～830kDa)和野生型P二聚体(～70kDa)校准。靠近空白的单个主要峰表明几乎所有的P-VP8蛋白质都形成了嵌合P-粒子。(D)P-VP8蛋白(左侧视图)与抗轮状病毒VP8的抗体(中间视图)和抗诺罗病毒VLP的抗体(右侧视图)反应。

图17显示小鼠对P-粒子呈递VP8的免疫反应。用等摩尔量的P-粒子-VP8嵌合体和游离VP8免疫小鼠，无佐剂的情况下经鼻内免疫(A和B，n＝5-7)，有完全弗氏佐剂的情况下经皮下注射免疫(C，n＝6-7)。游离VP8和GST在EIA抗体滴度测定中用作抗原。(A和B)用游离VP8抗原(游离VP8)以及分别含有Wa VP8(A)和DS1(B)的嵌合P-粒子(PP-VP8)免疫后，小鼠血清抗VP8/GST的抗体滴度。(C)用游离VP8抗原(游离VP8)和含有Wa株VP8的嵌合P-粒子(PP-VP8)免疫后，抗VP8的抗体滴度。共同纯化的GST作为内部对照。^**P＜0.01。

图18显示通过用P-粒子-VP8嵌合体免疫诱导的小鼠血清对轮状病毒的中和。(A)来自用无佐剂的P-粒子-VP8(Wa，[P]8)嵌合体经鼻内免疫的小鼠的血清对相同Wa株显示出强烈的中和反应(PP-VP8血清，蓝色)，而来自用游离VP8免疫的小鼠的血清显示显著更低的中和作用(VP8血清，黑色)。来自未接受抗原的小鼠的血清作为阴性对照(对照血清，紫色)。(B)来自用P-粒子VP8(DS1，[P]4)嵌合体免疫的小鼠的血清对Wa显示弱的交叉中和反应(PP-VP8血清，蓝色)，而来自用游离DS1 VP8免疫的小鼠的血清(VP8血清)和阴性对照血清未表现出中和作用(黑色和紫色)。(C)来自用游离Wa VP8(VP8血清，黑色)和P-粒子-VP 8(Wa)嵌合体(PP-VP8血清，蓝色)与弗氏佐剂一起皮下免疫的小鼠的血清对VP8的免疫反应性。两种抗原诱导对游离VP8(Wa)类似的抗体反应。无抗原血清作为阴性对照(对照血清，紫色)。(D)来自(C)中因用P-粒子-VP8嵌合体免疫小鼠而诱导的血清对轮状病毒(Wa)的中和滴度(PP-VP8血清，蓝色)比用游离VP8免疫所诱导的血清的中和滴度(VP8血清，黑色)显著更高。来自未接受抗原的小鼠的对照血清作为阴性对照(对照血清，紫色)。星号表示两种形式的VP8诱发的血清中和之间的P值：^*P＜0.05；^**，P＜0.005，和^***，P＜0.0005。

图19显示小鼠用P-粒子-VP8嵌合疫苗免疫后，抗小鼠诺罗病毒感染的保护作用。用四种不同疫苗接种并用鼠轮状病毒(EDIM)攻击后，测量小鼠的轮状病毒排毒量(μg/ml)。WT PP，小鼠用野生型诺罗病毒P-粒子(载体对照，n＝7)免疫接种。PP-hVP8，小鼠用P-粒子-VP8(Wa)嵌合体接种(n＝5)。游离mVP8，小鼠用游离鼠VP8(EDIM)抗原接种(n＝5)。PP-mVP8，小鼠用P-粒子-VP8(EDIM)嵌合体接种(N＝5)。数据计算和统计分析如表1所示。

图20显示了用P-粒子-VP8嵌合体免疫而诱导的抗体能够阻断诺罗病毒VLP与HBGA受体的结合。(A)用P-粒子-VP8(Wa)嵌合体免疫后的小鼠血清对诺罗病毒P-粒子(PP-VP8)强烈反应，而游离VP8诱导的血清未表现出这样的反应性(游离VP8)。(B)来自(A)的小鼠血清阻断了诺罗病毒VLP与HBGA受体(A型，唾液，PP-VP8血清，蓝色)的结合，而用游离VP8免疫接种后获得的血清未表现出这种阻断(VP8血清，黑色)。

发明详述

本文中，名词“诺罗病毒”、“NOR”、“诺瓦克样病毒”或“NLV”是指任何诺罗病毒家族的病毒，包括但不限于以下：诺罗病毒(“NV”)、MOH、Mexico、VA 207、VA 387、02-1419、C59、VA 115、Hawaii、Snow Mountain、Hillington、Toronto、Leeds、Amsterdam、Idaho Falls、Lordsdale、Grimsby、Southampton、Desert Shield、Birmingham和White Rivercap。

本文中，名词“P结构域单体”和“P-粒子”分别是指野生型诺罗病毒的P结构域单体和野生型诺罗病毒的P-粒子。

本文中，名词“改造过的P-结构域单体”和“改造过的P-粒子”(分别)是指被这样改造过的诺罗病毒P-结构域单体和P-粒子，即通过分子克隆，给每个P-结构域单体上存在的三个表面环中的一或多个里面插入一或多个限制性位点(通常成对插入)，从而在表面环中形成便于后续插入外来抗原、配体、药物偶联物或信号肽的克隆盒。

本文中，名词“取代的P-结构域单体”和“取代的P-粒子“(分别)是指这样的诺罗病毒P-结构域单体和P-粒子，所述单体和粒子包含通过分子克隆插入到每个P-结构域单体上存在的三个表面环中的一或多个里面的至少一个外来抗原、配体、药物偶联物或信号肽。

本文中，名词“抗原-P-结构域单体”或“抗原-诺罗病毒P结构域单体”是指取代的P-结构域单体，其中P-结构域单体上存在的三个表面环中的一或多个插入有外来抗原。

本文中，名词“抗原-P-粒子”或“抗原-诺罗病毒P-粒子”是指取代的P-粒子，其中每个P-结构域单体上存在的三个表面环中的一或多个插入有外来抗原。

4种独特的非感染性NOR颗粒，即病毒样颗粒(VLPs)、S粒子、P-粒子、小P-粒子都是代表了可供多功能基因工程的优秀候选者的病毒蛋白笼，在Tan et al.，2004，“The P-domain of norovirus capsid protein forms dimer andbinds to histo-blood group antigen receptors”，J Virol 78：6233-42和Tan et al.，2005，“The p domain of norovirus capsid protein forms a subviral particle thatbinds to histo-blood group antigen receptors”，J Virol 79：14017-30中有描述，两篇文献的公开内容通过引用全部并入本文。这些颗粒的分子量在420kDa(小P-粒子)-10.5mDa(VLP)的范围，尺寸在14-37nm。NOR VLP是由180个完整衣壳蛋白(VP1)构成，而三个亚病毒颗粒由VP1的部分构成。S粒子由壳(S)结构域构成、P-粒子由突起(P)结构域构成、小P-粒子由相同的P-结构域构成但在N-端有一个额外的Flag标签。当体外表达蛋白时，所有这些颗粒都自发组装，正如以下文章的描述：Tan et al.，2004，同前；Tan et al.，2004，“E.coli-expressed recombinant norovirus capsid proteins maintain authenticantigenicity and receptor binding capability”，J Med Virol 74：641-9；和Xia et al.，2007，“Norovirus capsid protein expressed in yeast forms virus-like particles andstimulates systemic and mucosal immunity in mice following an oraladministration ofraw yeast extracts”，J Med Virol 79：74-83，这些文献的公开内容通过引用全部并入本文。

野生型NOR衣壳由55-60kDa的单一主要结构蛋白(VP1)组成，该蛋白在昆虫细胞中表达时自组装成病毒样颗粒(VLPs)(图2)。VLPs与天然病毒颗粒在形态学和抗原性方面完全相同，但没有感染性。基于诺瓦克病毒的X射线晶体结构，衣壳由90个VP1二聚体构成，表现出T＝3的二十面体对称。每个VP1单体(530个氨基酸[aa])包含一个短的N-端区域(aa 1-49)，后面是壳(S)结构域(aa 50-225)和突起(P)结构域，所述P-结构域可分为两个亚结构域：P1(aa 226-278和406-520)和P2(aa 279-405)。N-末端/壳(N/S)结构域形成衣壳的内核心，是VP1最保守的部分，而P-结构域形成衣壳的突起拱形，并且更加多样化。位于衣壳表面的P2亚结构域在NOR株的基因组中变异程度最高。它包含病毒株特异性和受体结合的决定因素以及潜在的中和抗体识别位点。

根据原子结构，NOR衣壳蛋白的壳(S)结构域和突起(P1，P2)结构域(图2)由8-10个氨基酸的铰链连接在一起。正如Tan et al.，2004，“The P domain ofnorovirus capsid protein forms dimer and binds to histo-blood group antigenreceptors”，J Virol 78：6233-42中的描述，已对P-粒子衣壳蛋白(VP1)的受体结合区进行了作图，该文献通过引用全部并入本文。

已知NORs能够识别人组织血型抗原(human histo-blood group，HBGA)作为感染的宿主受体。表达S-结构域形成不具有与宿主受体结合功能的平滑颗粒，而表达P-结构域和铰链能够形成具有受体结合功能的二聚体，但结合亲和力低。当表达P-结构域不带有铰链时，自发形成亚病毒P-粒子(图1)，其受体结合亲和力显著提高，与VLP的类似。P-粒子由排列成12个二聚体的24个P-结构域单体组成。P-粒子可以与相应的HBGAs结合，并且显示出对NOR VLP与HBGAs结合的强烈阻断。在多种NOR病毒株，包括VA387株、MOH和诺瓦克病毒(NV)中都曾观察到P-粒子的自发形成。在电镜(EM)下，这些P-粒子显示为带有中间空腔的环型图像，并在凝胶过滤中形成了分子量～830kDa的单峰。P-粒子非常稳定，可以很容易地在大肠杆菌和酵母表达系统中高产量产生，正如Tan et al.，2005，“The p domain of noroviruscapsid protein forms a subviral particle that binds to histo-blood group antigenreceptors”，J Virol 79：14017-30和Tan et al.，2006，“C-terminal arginine clusteris essential for receptor binding of norovirus capsid protein”，J Virol 80：7322-31中描述的，以上文献通过引用全部并入本文。

NOR P-粒子是NOR的共有特征，这由人NOR的两个主要遗传组的不同基因型构建NOR P-粒子来显示。到目前为止，已构建了超过40种P-粒子，它们代表了不同的NOR基因型，包括GI-1(诺瓦克病毒)、GI-4(Koblenz433)、GI-8(Boxer)、GII-2(Melksham)，GII-3(Brattleboro321)、GII-4、GII-5(MOH)、GII-9(VA207)。对于引起全球65-85％的NOR胃肠炎的主导NOR类型(GII-4)，已制成了25种P-粒子。这代表了过去25年中传播的25个病毒株。

P-粒子的三维结构通过冷冻电镜进行了重建，分辨率达到

如图1和3所示。P-粒子是对称八面体，其包含组织成12个P二聚体的24个P-结构域单体。P二聚体的方向与野生型NOR衣壳中的类似，野生型衣壳中P1亚结构域相对中心空腔是向内的，而P2亚结构域相对P-粒子的最外表面是向外的。P二聚体晶体结构(图4)拟合到P-粒子的电镜密度图中表明HBGA受体结合界面位于P-粒子的最外表面。这与观察到的P-粒子保留了强烈结合HBGA受体的功能是一致的。

通过X射线晶体学(图4)在诺瓦克病毒原型和优势GII-4(VA387)株中阐明了P二聚体的原子结构。这些晶体结构可以很好地拟合到P-粒子的冷冻电镜密度图中(图1)。每个P单体最远端鉴定到三个表面环，对应拱形P二聚体的顶部(6个表面环/P二聚体，图3)，或者NOR衣壳和P-粒子的最外表面。这些表面环提供了极好的外来抗原呈递位点，详细的晶体结构为基于结构设计本文公开的P-粒子疫苗平台提供了坚实的基础。

P-粒子依赖其最外表面与HBGA受体结合。当野生型P-结构域单体的表面环中被插入任何一或多个限制性内切酶位点、抗原、配体、信号肽或药物偶联物时，根据所述限制性内切酶位点、抗原、配体、信号肽或药物偶联物的大小，它会部分或全部覆盖所形成的P-粒子的最外层部分，因此可能或者阻碍接近一或多个改造过的或取代的环，或者改变改造过的或取代的环的蛋白结构，从而形成的P-粒子可能会失去其结合HBGA受体的能力。我们还没有系统地分析环需要改变多少P-粒子才不能再结合HBGAs。但我们知道当限制性位点被添加到P-结构域单体的中间环2时，改造过的P-粒子不会与HBGAs结合。

通过诺瓦克病毒和VA387中P二聚体与A或B-三糖(诺罗病毒受体)形成的复合体的结晶显示了病毒受体结合界面的识别，如图4所示。图4显示了与B-三糖复合体(球状模型)相连的NOR P二聚体(带状模型)的晶体结构。受体结合界面位于拱形P二聚体的顶部，等同于NOR衣壳和P-粒子的最外表面。在三糖和P二聚体的氨基酸之间观察到大量的氢键连接。如Tan et al.，2008，“Elucidation of strain-specific interaction of a GII-4norovirus with HBGAreceptors by site-directed mutagenesis study”，Virology 379：324-334(该文献通过引用全部并入本文)所述，通过定点突变已证明这些氨基酸的重要性，预计它们与病毒受体发生相互作用。

在四个NOR颗粒(VLP、S粒子、P-粒子和小P-粒子)中，P-粒子是最稳定和最易于产生的。它具有高度免疫原性，并容忍大范围内的温度、pH、化学和物理条件。P-粒子的冷冻电镜3-D结构(图1)和P二聚体的原子结构(图2)显示，三个表面环高度暴露在P-粒子的24个单体或12个P二聚体中每一个的最外表面(图1、3和4)，如Cao et al.，2007，“Structural basis for therecognition of blood group trisaccharides by norovirus”，J Virol 81：5949-57和Tan，2008，“Noroviral P-particle：Structure，function and applications invirus-host interaction”，Virology，Vol.382，Issue 1，5December 2008，Pages115-123中所述，这些文献的公开内容通过引用全部并入本文。基于结构的序列比对表明，这些暴露的环能够容忍大的序列插入。

本发明的一个方面中，当蛋白或多肽抗原表位被插入在这些环(即环1(I293-H297)、环2(T371-D374)或环3(D391-N394))中一个之上或者之内时，抗原-P-结构域单体或二聚体的自发自组装使得组装成的抗原-P-粒子表面上呈递二十四(24)个抗原表位。本发明的这一特点带来了抗原呈递方面的优势，因此如下文讨论的，本发明提供了疫苗。已阐明的P二聚体原子结构给基于结构设计这种抗原插入提供了坚实和详细的信息。

与野生型P-结构域单体和二聚体一样，抗原-P-结构域单体形成二聚体的过程以及二聚体形成抗原-P-粒子的过程，根据P二聚体的浓度，都可以动态地转换或达到平衡。与野生型P-结构域单体和二聚体还一样的是，当抗原-P-结构域单体末端连接上半胱氨酸时，由此产生的抗原-P-粒子比那些没有半胱氨酸尾巴的，变得更加稳定和较不依赖抗原-P-结构域单体的浓度。每个抗原-P二聚体在与周围的五个抗原-P二聚体相互作用时具有相同的方向，沿着五重轴形成一个五边形。因此，P2亚结构域形成了抗原-P-粒子的外层，与诺罗病毒衣壳的拱形结构类似，而内层是由P1亚结构域形成，给P2拱形提供支撑。与其他二十面体病毒颗粒一样，抗原-P-粒子内有一个空腔。

与野生型P-结构域单体和二聚体一样，本发明的抗原-P-结构域单体和二聚体可以通过众所周知的手段进行变性，以防止它们在体外自发形成抗原-P-粒子。同样地，本发明的抗原-P-粒子可以被变性从而自发地分解成各自的抗原-P-结构域单体和二聚体。这使得能够在体外调和或混合多种抗原型的抗原-P-结构域单体，任选与野生型P-结构域单体形成各种分子比率，然后可以在除去变性影响时自发地形成抗原-P-粒子。

本发明的取代的或抗原-P-粒子，与野生型NOR P-粒子一样，是有吸引力的用于抗原展示的候选物，因为它很稳定并能通过已知方法在大肠杆菌和酵母中容易地产生，比如Tan et al.，2004，J Virol 78：6233-42和Tan et al.，2005，Virol 79：14017-30(同前)中描述的方法。虽然现有技术中的Manayani等的嵌合体FHV颗粒和Chatterji等的嵌合体CPMV颗粒分别能够感染昆虫和植物，对人类的影响未知，而非感染性野生型NOR P-粒子来自人类病毒，已被确定为人用疫苗的候选者。

多种独特属性使本发明的抗原-P-粒子与野生型NOR P-粒子一样成为可作为疫苗平台的宝贵商业产品。首先，基本的NOR P-粒子是多价的，大小接近理想的亚单位疫苗尺寸(～840kDa，Φ＝20nm)，并且比完整的病毒样颗粒(VLP)更容易制备，比单一多肽或蛋白抗原的免疫原性更高。其次，抗原-P-粒子可以很容易地在大肠杆菌中生产，产量高成本低，这对发展中国家尤其有意义。第三，P-结构域单体的多个(3个)表面环和它们允许插入外来抗原的高容纳能力(高达至少～238aa)使得能够插入多个不同抗原。因此，这样产生的嵌合取代的P-粒子疫苗可以提供对抗许多传染病甚至是非传染性疾病的广泛应用。第四，只需要简单的几个基因工程步骤来生成同质的嵌合取代的P-粒子，所述P-粒子包含至少24份插入的外来抗原。因此，可以迅速地开发这些疫苗，对于改变很快的病毒家族，比如流感病毒特别有用。第五，表面环中含有克隆盒(包括限制性位点)的P-结构域单体载体，提供了便于使用的载体和方便的疫苗平台。第六，抗原-P-粒子是抗腹泻和其他传染病的优秀候选人NOR疫苗。

除了对重大传染病，P-结构域载体和P-粒子疫苗平台对于抗原呈递和/或作为治疗包括癌症、过敏和自身免疫性疾病的非传染性疾病的药物的载体和药物递送媒介也很有价值。在一个实施方案中，药物可以通过化学反应借助暴露在表面的赖氨酸和半胱氨酸插入P-粒子的环中。这种情况中，取代的P-粒子可以作为药物的载体。在另一个实施方案中，可以向至少一个表面环中插入配体或信号肽，也可以在至少一个表面环中插入药物的偶联物。这些取代的P-粒子提供了将药物定靶到特定组织或器官的药物递送系统。

本发明的P-粒子可与其他药物递送方法相结合来进一步提高药物递送的特异性和利用本领域的有益进展。其中一个例子包括某些前药，所述前药不具有生物活性，除非并且直至病原体感染或者特定化学或酶法裂解在吞噬性哺乳动物细胞内将前药转化为活性药物形式。这种实施方案可能特别涉及开发前药-P-粒子，其中所述前药只在感染了特定微生物的细胞内或者罹患特定肿瘤的细胞内被活化。

P-粒子载体的独特性能允许疫苗平台具有广阔的应用前景。它可用于生产许多带有已知保护性抗原表位的疫苗。因此，P-粒子载体疫苗平台的应用可能给多种临床情况带来助益。此外，这种纳米颗粒平台的灵活性易于推广。例如，可以开发这样的粒子，使得P-结构域单体或P-粒子的一个表面环表达信号肽(配体)，所述信号肽将P-粒子引向带有特异受体的特定组织或器官，而疫苗或药物可与第二个表面环连接从而被递送产生效果。例如，替代的带有肽CNGRC(5个氨基酸的链)的P-粒子可能能够前往CNGRC受体(CD 13)大量表达的肿瘤组织(即癌)。肽基元CNGRC是膜结合金属蛋白酶CD13的配体，它可以与促血管生成脉管系统的表达CD13的内皮细胞结合，诱导表达CD13的内皮细胞的凋亡，从而抑制肿瘤相关血管生成。

此外，可以制备多种效价的疫苗使得2个或更多环表达来自相同或不同病原体的不同抗原。取代的P-粒子可以由不同抗原-P-结构域单体的混合物(包括野生型P-结构域单体和抗原-P-结构域单体)组装形成异质抗原-P-粒子。各种外来抗原可以插入到三个环中的同一个或不同个中，以便提供各种各样的异质抗原-P-粒子。因此，P-粒子和P-结构域单体载体平台的商业价值非常广泛。

本发明的实施例可以包括作为抗NORs和轮状病毒(RVs)的疫苗使用的抗原-P-粒子。抗原P-粒子的一个例子是RV VP8-P-粒子嵌合体。轮状病毒(RVs)和NORs都是在全球造成巨大医疗负担的常见病原体。这种抗原-P-粒子在单个疫苗中提供了既抗NOR又抗RV的有效疫苗，而没有回复或重新排列组合产生毒力株的风险。

野生型P-结构域单体可以在对一或多个环进行改造之前，通过在P-结构域的任意一端添加半胱氨酸从而加强和稳定P-粒子的形成，和通过给P-结构域的C-末端添加短肽(CDCRGDCFC)来影响对可能使P-粒子去稳定的胰蛋白酶的抗性。此外P-结构域单体完整的C-末端是P-粒子形成所必需的，并且C-末端的精氨酸群对于P-粒子形成和作为疫苗平台的稳定性非常重要。

当小肽标签(DYKDDDDK，FLAG-标签)附着到P-结构域的C末端时，NOR P结构单体还形成了被称为小P-粒子的另一种复合体。该小P-粒子显示四面体对称性，其含有组织成6个P二聚体的12个P单体(图6)。P二聚体晶体结构拟合到小P-粒子冷冻电镜密度图中显示P二聚体的方向与P-粒子类似。体外HBGA结合实验表明小P-粒子有类似于NOR VLP和P-粒子的结合特性。小P-粒子的发现给我们的P-粒子系统提供了一个额外的候选物，如果小P-粒子是特定应用所必需的。

本发明基于NOR的抗原-P-粒子可以构建成每个P-结构域二聚体或单体亚基中的一或多个呈递环中携带外来抗原。如图9所示，P-粒子的环1(I293-H297)、环2(T371-D374)或环3(D391-N394)中的一或多个可以插入多种多肽和生物相关抗原表位，包括但不限于His标签(7x组氨酸)、鼠巨细胞病毒(MCMV)Tcell表位(9个氨基酸)、假单胞菌表位Epi8(14个氨基酸)和作为RV表面抗原的两个RV VP8核心蛋白(各159个氨基酸)，而不影响取代的P-粒子的形成和稳定。这一点如图7视图B和图8视图D所示，通过凝胶过滤在环2中得到证实。His标签的暴露通过它对Talon树脂的高亲和力得以显示(图7，视图A)。VP8的暴露利用抗RV VP8的抗体经EIA(图8，视图E)和利用冷冻电镜对VP8-P-粒子嵌合体3D结构的重建(图10，视图E)得以显示。这些数据支持了我们的假想，即P-粒子可以发展为有效的疫苗平台用于呈递多样化的外来抗原。

抗原-P-粒子载体可以构建成带有克隆盒。在P二聚体的晶体结构的基础上，可以在P-粒子载体的一或多个环中放置含有限制性位点的克隆盒，包括放置到环的尖端。图9显示了被放置在P-粒子载体中环2的尖端的克隆盒，其中含有SpeI位点和ClaI位点。该含有克隆盒的P-粒子载体被用于成功地将RV VP8和GFP插入到P-粒子的表面上，如图8和10所示。

限制性位点的例子，包括罕见和独特的限制性位点，以及将限制性位点插入P-结构域单体或P-粒子中任何一或多个表面环的方法，是本领域技术人员已知的，并在Reed等的美国专利公开2004/0185556和2008/0085553中有描述，所述文献的公开内容通过引用全部并入本文。这些限制性位点由DNA分子所编码，通常包含双链的回文序列。对于某些限制性内切酶，少至4-6个核苷酸即足以提供限制性位点，而一些限制性内切酶需要8个或更多个核苷酸的限制性位点。例如，酶EcoR1识别6核苷酸序列：5’GAATTC3’，其中5′表示按照惯例被称为“上游”末端的分子末端，同样3′表示“下游”末端。限制性位点的互补链是其反平行链，³’＝G-A-A-T-T-C-⁵′。

NOR P-粒子可以容忍大的外来抗原插入。仅作为一个例子，绿色荧光蛋白(GFP，238个氨基酸)曾被插入到NOR P-粒子的环2中，由此产生的嵌合体颗粒通过凝胶过滤分析确定是高度稳定的。GFP的暴露利用GFP特异抗体和荧光显微镜经EIA得以证实(数据未示出)。

在方法的实施方案中，改造过的NOR P-粒子被用来诱发对NOR和外来抗原的抗体反应。在一个特定的非限制性例子中，RV VP8-P-粒子被用来诱发与RV和NOR均有反应性的抗体。用VP8-P-粒子嵌合体免疫的哺乳动物得到与NOR P-粒子和RV VP8均反应的抗体水平，能够阻断NOR VLP与HBGA受体的结合，并能中和RV的复制。

已建立了NOR“中和”分析和RV攻击的小鼠模型。NORs仍然很难在细胞培养物中培养，并且没有有效的NORs复制的动物模型。为了确定某抗体抗NOR感染的潜在的保护作用，开发了HBGA受体阻断检验法来测量抗体防止NOR与其宿主受体结合的能力。该检验法建立在高度敏感和特异的基于唾液或寡糖的受体结合实验的基础上。

还建立了成年小鼠模型来确定疫苗抗RV感染的保护效果，并用于研究RV疫苗开发。接种了候选疫苗的小鼠然后用鼠RV株进行攻击。免疫组中的RV粪便排毒量与对照或未免疫组的排毒量进行比较用于衡量疫苗效力。对疫苗的免疫反应也可通过测量抗体水平和T细胞反应来确定。

本发明还涉及形成含有多个或多价外来抗原呈递的抗原-P-粒子。在两个环(即在环1和2，环2和3，或环1和3)上含有两个克隆盒的改造过的P-粒子载体，可以通过将外来抗原插入到各种组合的两个盒中来构建并进行评价。三种结合的非限制性例子包括：1)环1和2中的His标签和Flag标签(YDKDDDDK)；2)环1和2中的His标签和VP8抗原；3)环1和2中的两个VP8s。这些实施方案可以提供均在同一取代的P-粒子上有效地呈递的两种不同的小抗原，或一个小抗原和一个较大的抗原，或者两个较大的抗原。嵌合P-粒子的形成可以通过凝胶过滤确定，而插入抗原的暴露情况可以利用特异性抗体通过EIA进行检验。

在所有三个环(环1、2和3)上含有三个克隆盒的改造过的P-粒子载体，可以通过将外来抗原插入到各种组合的三个盒中来构建并进行评价。非限制性例子包括：1)三个7xHis标签；2)一个7xHis标签、myc标签(EQKLISEEDL)和Flag标签。第一种组合在取代的P-粒子的每个P-结构域单体中所有三个环上呈递相同的小抗原表位，给P-粒子带来72(3x24)拷贝的抗原。第二种组合在每个P-结构域单体亚基上同时呈递三个不同的小抗原表位，得到三种不同抗原的三价P-粒子疫苗。

因此本发明提供了用于方便和多样化抗原插入的P-粒子载体。改造过的P-粒子载体的一个实施方案可以包括三个P-结构域单体载体，每个改造过的P-结构域单体在三个表面环中每一个分别含有单个独特的克隆盒。改造过的P-粒子载体的另一个实施方案包括在所有三个环中任何一个或两个(例如，在环1和环2中)或者全部三个环中含有两个克隆盒的P-结构域单体载体。改造过的P-粒子载体的再一个实施方案可以在每个P-结构域单体的所有三个环中含有三个克隆盒。如图13所示，可以根据克隆目标抗原DNA序列的需要对每个克隆盒的酶识别位点进行改造。这些载体可用于单一抗原的单一呈递，或者相同或不同抗原的多重呈递。通过本领域已知的定点突变可以构建带有不同克隆盒的P-粒子载体。

突变和重组DNA克隆程序。制备不同的改造过或取代的P-粒子载体通常由如图12所示的野生型P-粒子表达构建体开始，所述野生型P-粒子表达构建体在合适的质粒(具体来说，例如质粒pGEX-4T-1，可从AmershamBiosciences公司获得)中包含编码NOR(具体来说，例如病毒株VA387)P-结构域和带有半胱氨酸的短肽的序列。利用已知手段，通过定点突变将克隆盒逐一引入P-结构域序列中表面环的特定位点(如图13所示)，所述已知手段包括Tan et al.，2003，“Mutations 448within the P2domain of norovirus capsidaffect binding to human histo-blood group 449antigens：evidence for a bindingpocket”，J Virol 77：12562-71、Tan et al.，2006，“C-terminal arginine cluster isessential for receptor binding of norovirus capsid protein”，J Virol 80：7322-31、Tan et al.，2005，“The p domain of norovirus capsid protein forms a subviralparticle that binds to histo-blood group antigen receptors”，J Virol 79：14017-30和Tan et al.，2008，“Elucidation of strain-specific interaction of a GII-4noroviruswith HBGA receptors by site-directed mutagenesis study”，Virology 379：324-334中描述的，这些文献的公开内容通过引用全部并入本文。晶体学研究确定的三个表面环的位置、组成和序列在Bu et al.，2008，“Structural basis for thereceptor binding specificity of Norwalk virus”，J Virol 82：5340-7和Cao et al.，2007，“Structural basis for the recognition of blood group trisaccharides bynorovirus”，J Virol 81：5949-57中有描述，所述文献的公开内容通过引用全部并入本文。

基于该结构和序列信息可以设计和合成特异引物，所述特异引物中在合适的位置插入了特定酶识别位点作为克隆盒。通常，可以选择表面环尖端的两个氨基酸(最暴露的位置)，通过取代这两个氨基酸或者插入到两个氨基酸之间来插入克隆盒的序列。众所周知地，可以使用QuikChange Site-DirectedMutagenesis试剂盒(Stratagene)将克隆盒引入环。引入特定抗原的确切位置可能需要进行改造以提高所得到的抗原-P-粒子嵌合体的稳定性或效力。对于插入序列较长的克隆盒，可以进行逐步定点突变以达到最佳插入。定点突变后得到的取代的P-粒子载体质粒然后可以通过常规的克隆程序扩增，即通过共知手段将质粒转化到大肠杆菌中和利用质粒DNA制备试剂盒(Qiagen)进行质粒DNA制备。通过共知手段经测序确认插入的克隆盒后，可以测试抗原-P-粒子载体对抗原插入的容纳能力、嵌合体P-粒子形成的稳定性以及作为有用和有效疫苗的抗原呈递效果。

可以通过确定正确的嵌合体P-粒子形成来评估P-粒子载体抗原呈递的能力和效率。向P-粒子平台插入抗原表位(即向P-结构域单体插入抗原或抗原表位，然后P-结构域单体组装成二聚体，然后组装成抗原-P-粒子)后，可以利用(例如，Akta高效液相层析(FPLC，HE healthcare)带动的)大小排阻柱，通过凝胶过滤来分析所产生的每个嵌合蛋白的目标抗原-P-粒子嵌合体的形成。正确形成的目标嵌合体在预期的分子量(MW)，即单体MW的大约24倍处产生单峰。例如，His标签-P-粒子的MW为870kDa；VP8-P-粒子的分子量为1240kDa；GFP-P-粒子的分子量为1450kDa。多重呈递抗原的P-粒子遵循这一计算。形成的嵌合体P-粒子具有预期的MW是抗原成功插入的一个重要指标。嵌合体P-粒子形成的其他证据包括EM观察和借助冷冻电镜的3-D结构重建(参见图10)。稳定形成的改造过的抗原-P-粒子通常会导致抗原具有优良免疫原性，会是有前景的抗相应病原体的候选疫苗。

确定嵌合体P-粒子载体上抗原的暴露情况是P-粒子载体用于抗原呈递的容量和效率的另一个重要指标。特异抗体EIA和Talon树脂结合法中的任一种或者两者都可用于这种确定。抗体特异性EIA在Huang et al.，“Noroviruses bind to human ABO，Lewis，and secretor histo blood groupantigens：identification of 4distinct strain specific patterns，”2003，J Infect Dis188：19-31和Huang et al.，“Norovirus and histo-blood group antigens：demonstration of a wide spectrum of 23strain specificities and classification oftwo major binding groups among multiple 24binding patterns，”2005，J Virol79：6714-22中有描述，这些文献的公开内容通过引用全部并入本文，并在图8视图E和图11视图A中显示。纯化的嵌合体抗原-P-粒子可以包埋在微量滴定板上，用无脂牛奶封闭。暴露的抗原/表位可以通过相应的抗体来检测。与二抗-HRP偶联物，然后与HRP底物温育后，以光密度(OD)记录信号强度。抗抗原(例如，His-、Flag-、和myc标签各自)的特异单克隆抗体可以从CellSignaling购买，而抗RV VP8和NOR P-粒子的特异性抗体已由本申请人制备并提供，如图8和11所示。对于检测暴露的His标签的另一种强大的方法，可以使用Talon树脂结合法，其中Talon树脂(Clontech公司)可以特异结合His标签(图7)。由于结合在树脂上的His标签-P-粒子嵌合体可以很容易地利用咪唑(Sigma)释放，这个方法一直是从含杂质的蛋白中纯化His标签-P-粒子嵌合体的简单方法(见图7)。

实验

嵌合P-粒子的制备。使用了先前制备的含有人的[P]型8株VP8的RVVP8-P(图8，图10视图E)。用于小鼠RV攻击研究的含有鼠VP8的嵌合疫苗，VP8-P-粒子嵌合体中的人VP8被鼠(EDIM)VP8所替代。利用成熟的程序在大肠杆菌中产生人和小鼠RV嵌合P-粒子。通过GST-亲和力柱子(Glutathione Sepharose 4Fast Flow，HE Healthcare)进行部分纯化后，嵌合P-粒子用大小排阻柱经FPLC系统(GE Healthcare)进一步纯化。得到的嵌合P-粒子制品达到高纯度(～95％)，被作为免疫原用于免疫小鼠。由图8可见，视图A的SDS PAGE显示了经亲和柱(泳道1)纯化的重组RV VP8-P-结构域嵌合体(53.5kDa)，进一步经凝胶过滤纯化的(视图D)，含有P-粒子(泳道2)和P-结构域二聚体(泳道3)级分。视图B和C中显示了利用抗VP8(视图B，泳道4和5)或抗NOR VLP(视图C，泳道6和7)的抗体对VP8-P-粒子嵌合体进行的Western分析。在视图D中，亲和纯化的VP8-P-结构域嵌合体的凝胶过滤(泳道1)表明绝大部分蛋白形成了P-粒子(～1300kDa)。视图E显示了利用抗VP8的抗体检测包埋的VP8-P-粒子嵌合体(PP-hVP8C)、重组VP8(蓝色，hVP8C)和单独的P-粒子(PP，对照)的酶免疫分析(EIA)结果。泳道M显示了预先染色的蛋白标记物，条带从上到下为113、92、52、35、29kDa。图10显示了RV VP8-P-粒子嵌合体的产生。在环2中含有克隆盒的P-粒子载体(视图A)产生了野生型NOR P-粒子(视图B)。当RV VP8编码序列(视图C)被克隆到P-粒子载体中(视图D)，产生了RV VP8-P-粒子嵌合体(视图E)，其中标出了嵌合体最外表面的RV VP8。

小鼠的免疫接种。6周龄雌性BALB/c小鼠(Charles River Labs)用高度纯化的RV VP8-P-粒子嵌合体以不同剂量在有和没有佐剂[LT(R 192G)]的情况下经口或鼻内进行免疫。野生型P-粒子作为对照。对于疫苗接种的鼻内途径，将三种起始剂量(5，15和45μg/小鼠，三剂)的野生型P-粒子和VP8-P-粒子嵌合体在50μL体积内给药(每鼻孔25μL)。对于经口途径，使用接在1ml注射器上的20G不锈钢喂养针将总共200μL相同量的疫苗直接通过胃内插管递送到胃内。监测动物(12只小鼠/组)的总体外观和重量损失以便评估疫苗可能产生的不利影响。采集处理前和恢复期的血清样品，并用重组NOR VLP和RV VP8作为抗原经EIA测试对NOR和RV的抗体反应。采集粪便样品测试抗NOR和RV的分泌型IgA。A组小鼠(N＝5)用表达谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的细菌免疫作为阴性对照。

经体外检测法评估免疫反应。采集小鼠在经不同给药方案给予疫苗之前和之后的血清，利用型特异性抗体检测EIA确定血清抗NOR和RV的特异性抗体滴度，如Huang et al.，2003，J Infect Dis 188：19-31和Huang et al.，2005，J Virol 79：6714-22，同前中描述的。检验粪便样品中分泌IgA确定对NOR和RV的反应作为粘膜免疫的指标。对于RV，对血清样品进行中和试验确定细胞培养物中RV复制的抑制。对于NORs，进行NOR-受体阻断实验来衡量抗体通过可能的“中和”活性对NOR VLP与其HBGA受体结合的抑制。

使用了抗相同VA387VLP或P-粒子的相应抗体反应，因为VA387代表了造成全球65-85％NOR相关胃肠炎的优势GII-4基因型。NOR-受体结合的体外阻断检测用于评价抗体对NORs的可能中和作用。来自不同VP8-P-粒子疫苗给药方案的小鼠血清经检验确定血清对NOR VLP与其HBGA受体结合的阻断作用。同样，抗体的阻断效应在相应株VA387VLP与其HBGA(A、B、H、Lewis B和Lewis Y抗原)的结合上进行了检验。简单地说，将研究完善的含有已知HBGAs或合成寡糖的唾液包埋在微量滴定板上。用无脂牛奶封闭后，向板中加入已与抗体温育30分钟的NOR VLP。通过抗特异VA387VLP的豚鼠超免疫血清来检测与HBGA受体结合的VLP，然后加入偶联HRP的山羊抗豚鼠IgG(ICN，Aurora，OH)。用ELISA平板读数仪读取450nm波长的信号强度。通过比较有和没有抗体处理的结合情况来确定阻断效果。

进行了利用细胞培养物测量噬斑减少的中和检测法以便检验小鼠中诱发的抗VP8-P-粒子嵌合体的抗体。使用发明人实验室已有的不同RV株测试了VP8-P-粒子嵌合体[P]型与其他RV型的交叉中和。使用了已适应组织培养的Wa株、鼠RV EDIM株和MA104绿猴肾细胞系。简单来说，MA104细胞被培养在6孔板中，通过系列稀释RV接种物来确定形成～50噬斑/孔的RV滴度。为了这项检测，RV以特定稀释度与血清温育60分钟，将混合物加给6孔板中的细胞(MA104)。2小时后，将培养板清洗，然后覆盖上含有0.8％琼脂的培养基。于37℃温育4-5天后，数每孔中的噬斑数量。与未处理孔相比，含有血清的孔中噬斑数量的减少决定了血清中存在的中和抗体的量。

鼠RV攻击模型。如Choi et al.，“Functional mapping of protective domainsand epitopes in the rotavirus VP6 protein，”2000，J Virol 74：11574-80；Choi et al.，“Functional mapping of protective epitopes within the rotavirus VP6 protein inmice belonging to different haplotypes，”2003，Vaccine 21：761-7以及McNeal etal.，1999，J Virol 73：7565-73.41中的描述(这些文献的公开内容通过引用全部并入本文)建立该RV攻击模型以便检验疫苗的保护效力。无RV抗体的6周龄BALB/c小鼠(Harlan-Sprague-Dawley，Indianapolis，Ind.)用VP8-P-粒子嵌合体疫苗经口或经鼻内免疫。最后一次免疫后2到4周，小鼠用鼠RV EDIM株以4×104FFU(病灶形成单位)的剂量经口(经管饲法，通常通过将饲料管经鼻子或嘴送入食道来实施)攻击，所述剂量等同于100个50％排毒剂量。为了确定粪便中的RV抗原，在EDIM攻击后，给每个小鼠采集两个粪团，进行7天或更多天，保存在1ml Earle′s平衡盐溶液中。样品冷冻保存直至用于分析，进行分析时，将它们匀浆并离心去除残渣。粪便样品中的RV抗原量如前所述通过ELISA确定。

结果.结果显示VP8-P-粒子在处理小鼠中诱发了RV-和NOR特异性抗体，并且抗体阻断了NOR VLP与其HBGA受体的结合，中和了细胞培养中RV的复制并在小鼠攻击模型中提供了免疫保护作用。VP8-P-粒子疫苗未表现出细胞毒性或副作用。

表达构建体.基于pGEX-4T-1[谷胱甘肽-S-转移酶(GST)Gene fusionSystem，GE Healthcare life sciences]的P-粒子表达载体(含有VA387诺罗病毒(GII.4)P-结构域编码序列和含半胱氨酸的肽)被用作构建多种嵌合P-粒子的模板。为了制备P-粒子-His标签嵌合体，将His标签编码序列通过定点突变插入环2的N372和D374之间(图7和图14A)(见下文).对于含有人轮状病毒VP8的嵌合P-粒子，首先通过定点突变将带有SpeI和ClaI/EcoRI酶位点的克隆盒引入环2中替代T369到D374的序列(图16A)。[P]8株(Wa，L65-L223，GenBank登录号：VPXRWA)和[P]4株(DS1，L65-1223，GenBank登录号：VPXRDS)的VP8抗原cDNA序列被克隆到盒中。为了将鼠轮状病毒(EDIM)VP8抗原(L65-L222，GenBank登录号：AF039219)的cDNA序列克隆到P-粒子中，在N372和N373之间插入带有XbaI和Bgl II位点的另一个克隆盒。为了制备P二聚体-His标签嵌合体，将His标签连接到带有铰链的P-结构域N末端。为了制备含有肽CNGRC或CDCRGDCFC的嵌合麦芽糖结合蛋白(MBP)，将所述肽融合到pGEX-4T-1中MBP的N末端。基于pDEST17(Gateway，Invitrogen)(29)的带有His标签的海栖热袍菌α-L-岩藻糖苷酶(GenBank accession：TM0306)的表达构建体由Henrissat和Bourne博士(Architecture et Fonction des Macromole′cules Biologiques，UMR 6098，CNRS，and Universite′s Aix-Marseille I and II，31Chemin J.Aiguier，F-13402Marseille，Cedex 20，France)惠赠。

重组蛋白的表达和纯化.按照其他地方描述的，用0.25mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)于室温(～25℃)下诱导过夜，在大肠杆菌(BL21)中表达重组蛋白。重组GST融合蛋白的纯化利用Glutathione Sepharose 4FastFlow的树脂(GE Healthcare life Sciences)按照生产商的说明进行。在珠子或溶液(磷酸缓冲液，PBS，pH7.4)中经凝血酶(GE Healthcare life Sciences)切割从目标蛋白上去除GST，然后经凝胶过滤层析进一步纯化。带His标签的蛋白的纯化用TALON His-tag Purification Resins(Clontech，Mountain View，CA)按照生产商的使用说明进行。用含有250mM咪唑(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)的PBS从树脂上洗脱带His标签的蛋白。树脂纯化过的蛋白的进一步纯化通过凝胶过滤层析进行。

凝胶过滤层析利用AKTA FPLC System(GE Healthcare life Sciences)按照先前的描述进行。简单来说，将亲和柱纯化的蛋白上样到AKTA FPLCsystem(model 920，GE Healthcare life Sciences)驱动的大小排阻柱Superdex200(GE Healthcare life Sciences)上。洗脱级分的分子量借助Gel FiltrationCalibration Kits(GE Healthcare life Sciences)进行校准。替代地，空隙体积、嵌合P-粒子和P二聚体、诺罗病毒VA387(GII.4)的野生型P-粒子(830kDa)和野生型P二聚体的峰可以分别通过蓝色葡聚糖(～2000kDa，GE Healthcarelife Sciences)确定。目标蛋白级分通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS PAGE)和/或Western印迹分析进一步分析。

SDS PAGE和Western印迹分析.重组蛋白用10％凝胶经SDS PAGE分析。重组蛋白的具体组成用抗诺罗病毒VLP(VA387，GII.4，1∶3000)或轮状病毒VP8抗原(Wa，1∶3000)的超免疫血清按照其他地方描述的通过Western印迹分析来检测。点样后的膜用5％无脂牛奶进行封闭。使用二抗-HRP(辣根过氧化物酶)偶联物(1∶5,000，ICN Pharmaceuticals，Costa Mesa，CA)，通过ECL Eastern Blotting Detection Reagents(GE Healthcare life Sciences，Buckinghamshire，England)检测HRP。ECL信号用Hyperfilm ECL(GEHealthcare life Sciences，Buckinghamshire，England)捕获。

定点突变如前面的描述，按照生产商提供的QuikChange Site-DirectedMutagenesis Kit(Stratagene，La Jolla，CA)的使用程序进行以便将His标签和构建克隆盒插入诺罗病毒P-结构域的环2中。使用引物对：caccactgacacaaaccaccaccaccatcatcaccacgatcttcaaactggcc/ggccagtttgaagatcgtggtgatgatggtggtggtggtttgt gtcagtggtg将7组氨酸串插入环2的N372和D374之间(图7和图14A)。此外，利用引物对gttcaatacaccactagtacaaacatcgatatccttcaaactggc/gccagtttgaaggatatcgatgtttgtactagtggtgtattgaac构建在诺罗病毒P-结构域环2中含有三个酶位点(Spe I和Cla I/EcoRI)的克隆盒，以便协助人轮状病毒VP8抗原编码序列的插入。利用另一个引物对tacaccactgacavaaactctagacacagatctaatgatcttcaaactgg/ccagtttgaagatcattagatctgtgtctagagtttgt gtcagtggtgta构建含有XbaI和B glII位点的另一个克隆盒，以便协助鼠轮状病毒VP8抗原编码序列的插入。

冷冻电镜(cryo-EM)技术.

冷冻电镜图像采集.我们先前的研究中所描述的野生型P-粒子结构重建程序经改进用于本文。简单来说，小份(3-4μl)纯化的P-粒子-VP8(Wa)嵌合体被速冻到放在液态乙烷中的Quantifoil网格上，所述液态乙烷通过液氮进行冷却。样品格加到显微镜中，用CM200冷冻显微镜在胶片上记录低电子剂量图像(～20e/A²)，场发射枪在200KV操作。在x 50,000的标称放大率和2.0到4.0μm的离焦范围摄取图像。挑选图像并用Nikon Super CoolScan9000ED扫描仪以6.35μm/像素的步长进行数字化。将扫描的图像的像素尺寸缩小(binned)，最终得到

/像素的图像，以备进一步的图像处理和3-D重构。

冷冻电镜图像处理和3-D重构.利用EMAN’s boxer程序挑选嵌合P-粒子的图像。选中的图像人工过滤以消除假阳性。利用EMAN’s ctfit程序人工确定来自相同图像的粒子图像组所关联的对比传递函数(CTF)参数。利用EMAN’s startoct程序生成嵌合P-粒子的初始模式。然后利用EMAN’s refine程序迭代地确定原始嵌合粒子的中心和方向，并通过EMAN make3d程序由2-D图像重构3-D图像直至会聚。嵌合体P-粒子的重构过程中施加八面体对称。

冷冻电镜模型的评价和分析.轮状病毒VP8抗原(Wa，2DWr，L65-L223)的晶体结构利用UCSF Chimera软件拟合到P-粒子-VP8(Wa)嵌合体3D结构的延伸突起中。考虑简单的刚体运动来找到X射线结构和嵌合P-粒子3D结构的最佳匹配。

酶免疫分析(EIA)被用来测量P-粒子-抗原嵌合体所诱导的小鼠抗血清的免疫反应性和抗体效价。对各种抗血清使用不同抗原：带His标签的海栖热袍菌α-L-盐藻糖苷酶给P-粒子-His标签嵌合体诱导的血清；MPB-CNGRC和MPB-CDCRGDCFC给含有内部肽CNGRC或CDCRGDCFC的P-粒子诱导的血清；游离VP8给P-粒子-VP8嵌合体诱导的血清；以及GST给P-粒子-VP8嵌合体诱导血清，GST作为内对照。将抗原包埋在96孔微量滴定板(Dynex Immulon；Dynatech，Franklin，Mass)上。用5％无脂牛奶封闭后，指定稀释度的血清与包埋抗原一起温育。如其他地方的描述，通过二抗-HRP偶联物检测结合的抗体。抗体抗抗原的效价定义为截至信号强度为0.15时的终点稀释度。来自用野生型P-粒子或PBS免疫的动物的血清作为阴性对照。

HBGA结合和阻断分析.基于唾液的结合分析法基本按照其他地方描述的进行。简单来说，含有已知HBGA表现型的煮沸的唾液样品被稀释1000倍，包埋在96孔微量滴定板(Dynex Immulon；Dynatech，Franklin，MA)上。用5％无脂牛奶封闭后，加入VLPs或诺罗病毒的P-粒子(VA387，GII.4)。利用自制的兔抗VA387VLP抗血清(1∶3,300)和之后加入的偶联HRP的山羊抗兔IgG(ICN，Pharmaceuticals，Costa Mesa，CA)来检测结合的VLPs/P-粒子。P-粒子-VP8嵌合体所诱导的小鼠血清对诺罗病毒VLP-唾液结合的阻断效果通过VLP与稀释血清预温育30分钟，然后给包埋唾液加上VLP来测量。通过比较用来自免疫动物的小鼠血清阻断和没有阻断情况下测量到的OD来计算阻断率。来自游离VP8免疫小鼠的血清的阻断率作为阴性对照。

为抗体反应而免疫小鼠.6周龄雌性BALB/c小鼠(Harlan-Sprague-Dawley，Indianapolis，IN)用剂量为5-15μg/小鼠的纯化嵌合P-粒子或游离抗原以两周的间隔免疫3到4次。为了比较对P-粒子-或P二聚体-呈递His标签的免疫反应，将5μg/小鼠的重组P-粒子-His标签嵌合体和P二聚体-His标签或野生型P-粒子给予小鼠(n＝5)。为了比较对内部肽的免疫反应，将5μg/小鼠含有内部肽CNGRC或CDCRGDCFC的重组P-粒子给予小鼠。免疫原与弗氏佐剂一起经皮下给予4次。为了比较对P-粒子-呈递的VP8和游离VP8的免疫反应，将5μg/小鼠游离VP8和15μg/小鼠P-粒子-VP8嵌合体(两种免疫原中有相同摩尔量的VP8)在没有佐剂情况下鼻内给予小鼠，或者与弗氏佐剂一起经皮下给予小鼠(n＝5-7)，共三个剂量。给免疫原加入等摩尔量的GST作为内对照。给小鼠免疫接种P-粒子-VP8疫苗以便获得保护如下文描述。在免疫接种之前和最后一次接种后两周通过刺穿眼球后毛细血管丛采血。4℃过夜放置并离心后，由血液加工得到血清。

轮状病毒噬斑检测法被用于确定含有轮状病毒VP8抗原的嵌合P-粒子所诱导的抗血清对轮状病毒在细胞培养物中的复制的中和作用。本项检测中使用了生长在MA104猴肾细胞中的适于组织培养的轮状病毒Wa株。MA104细胞培养在6孔板中，滴度大约50噬斑/孔的轮状病毒被用作接种物。对于该项检测，轮状病毒与给定稀释度的小鼠血清温育60分钟。然后将混合物加给6孔板中的MA104细胞。2小时后，清洗培养板然后用含有5μg/ml胰蛋白酶(Invitrogen，Carlsbad，CA)和0.8％琼脂的培养基覆盖。在37℃温育4-5天后，计数每个孔中噬斑的数量。血清里的中和抗体的量通过抗血清处理孔中噬斑数量相对未处理孔噬斑数量的减少来确定。

鼠轮状病毒攻击模型.按照先前研究中描述的轮状病毒攻击模型来检验P-粒子-VP8疫苗的保护效果。无轮状病毒抗体的六周龄BALB/c小鼠(n＝5-7)(Harlan-Sprague-Dawley，Indianapolis，IN)用含有鼠轮状病毒(EDIM)VP8抗原的嵌合P-粒子(15μg/小鼠)在没有佐剂的情况下经鼻内免疫接种三次。游离鼠轮状病毒VP8株(5μg/小鼠)和含有人轮状病毒(Wa)VP8抗原的嵌合P-粒子(15μg/小鼠)被包括在内用于比较。此外，给予野生型P-粒子(载体对照)和PBS作为阴性对照。最后一次免疫后两周，小鼠用鼠轮状病毒EDIM株以4×10⁴FFU(病灶形成单位)(等同于10⁵50％排毒剂量)的剂量通过口饲进行攻击。为了测量粪便中轮状病毒的排毒量，EDIM攻击后每天采集每只小鼠的2个粪团，共6天，保存在1ml Earle′s平衡盐溶液(EBSS)中。样品冷冻保存直至用于分析，分析时将它们匀浆并离心除去残渣。粪便样品中轮状病毒抗原的量(μg/ml)如前所述通过ELISA确定。

统计分析.利用Windows适用的GraphPad Prism 5.00版本(GraphPadSoftware，San Diego CA)和Microsoft Office Excel 2007制作图线。用Windows适用的GraphPad Prism 5.00版本对数据组进行t检验来确定P值。

结果

含有His标签的嵌合P-粒子的产生.我们的研究开始是将小抗原表位、多聚组氨酸(His)标签插入到P-粒子的环2(图3和14)。利用GST基因融合系统在大肠杆菌中表达和纯化该嵌合P蛋白产生高产量(＞10mg/升培养物)的所述蛋白，在通过凝血酶将蛋白消化去除GST标签(～27kDa)后，其大小符合预期(～35kDa)(图14C)。通过凝胶过滤层析和之后的SDS PAGE和Western印迹分析显示嵌合P蛋白形成了P-粒子，凝胶过滤层析中嵌合P-粒子在～840kDa处形成了主要峰(图14D和E，数据未示出)。嵌合P-粒子上插入的His标签的暴露可以通过它与Talon树脂的特异结合和之后用250mM咪唑洗脱来证实(图7A，洗脱1和2)，产生高纯度的嵌合P-粒子制品。因此，也可以利用亲和Talon树脂从大肠杆菌中纯化P-粒子-His标签嵌合体(数据未示出)。

P-粒子载体对His标签的免疫增强作用.这是通过在接种P-粒子His标签嵌合体后，检验小鼠(n＝5)中对His标签的免疫反应来确定的。在接种了P-粒子呈递的His标签的小鼠中检测到比接种了P二聚体呈递的His标签显著高的抗体效价(P＜0.05，图15A和B)。融合到P-结构域N-(CNGRC)或C-(CDCRGDCFC)末端的两个短肽诱发的免疫反应比P-粒子呈递的His标签诱发的免疫反应明显弱(图15C到F)。这两个肽已被证明隐藏在P-粒子内部，说明插入抗原适当地暴露在P-粒子表面对免疫增强很重要。正如预期，所有血清与诺罗病毒P-粒子平台有强烈反应(图15，数据未示出)。

含有轮状病毒VP8抗原的嵌合P-粒子的开发.接下来，我们通过插入含有159个氨基酸的轮状病毒(Wa)VP8抗原检验了P-粒子平台容纳较大多肽的能力。构建了在P-粒子环2中带有3个酶位点(Spe I和Cla I/EcoRI)的克隆盒(图16A)来协助VP8的插入。该构建体在大肠杆菌中的表达得到高产量(＞15mg/升培养物)的GST-P-VP8融合蛋白(～78kDa，图16B，左侧视图)。在溶液中或者在纯化珠子(图16B，分别是中间和右侧的视图)上用凝血酶对GST融合蛋白进行消化获得释放的P-VP8嵌合体(～52kDa)。凝胶过滤层析展示了P-VP8嵌合蛋白形成P-粒子的高比率(＞95％)(图16C)。Western印迹分析显示P-VP8嵌合蛋白与抗诺罗病毒VLP(VA387)和轮状病毒(Wa)VP8的抗体都发生反应(图16D)。

冷冻电镜和3-维图像重构显示P-粒子-VP8嵌合体象野生型P-粒子一样，保持八面体对称性，但嵌合P-粒子明显更大(图1A和B)。延伸的突起很可能是能作为与P二聚体的分界线而被缺口识别的VP8插入物。相同Wa株(2)的轮状病毒VP8抗原的晶体结构与嵌合体延伸突起的密度图的拟合证实了延伸突起的确是VP8(图1C到E)。

P-粒子增强了对VP8的免疫反应.然后我们研究了小鼠中对P-粒子呈递的VP8抗原的免疫反应。用相同摩尔量的P-粒子-VP8嵌合体和游离VP8免疫后，得到的小鼠血清用游离VP8作为抗原经EIA进行检验。没有佐剂的情况下经鼻内免疫后，抗P-粒子呈递的VP8的抗体效价比抗游离VP8的抗体效价显著更高(P＜0.005)。与它们对应的游离VP8相比，在分别含有轮状病毒Wa和DS-1的VP8抗原的两个嵌合P-粒子中观察到的结果相当(图17A和B)。在这些动物中只检测到了微弱的抗游离GST的抗体效价，进一步证实对P-粒子呈递的VP8的特异免疫增强作用。还研究了以上抗原与弗氏佐剂一起经皮下免疫小鼠后的免疫反应，在游离VP8和P-粒子呈递的VP8处理组之间观察到的对VP8的抗体效价差别没有那么大(图17C)。

P-粒子-VP8嵌合体诱发了抗轮状病毒的中和抗体.由P-粒子-VP8(Wa，[P]8)嵌合体经鼻内免疫诱发的超免疫抗血清(图17A)极大减少了同源轮状病毒(Wa)在细胞培养物中的复制。该中和效价比用游离VP8免疫所诱发的中和效价显著更高(P＜0.0002)(图18A)。用P-粒子-VP8(DS-1，[P]4)免疫后，还观察到对Wa的低水平交叉中和作用(P＜0.05，图18B)。相反，来自用DS-1的游离VP8免疫的动物的血清没有表现出这种交叉中和。此外，还测量了来自用弗氏佐剂经皮下免疫的动物的血清的中和效价。令我们惊讶的是，EIA中对游离VP8抗原具有类似免疫反应性的4对小鼠血清中(图18C)，来自用P-粒子-VP8(Wa)免疫的动物的所有血清显示出比来自用相同Wa株游离VP8免疫的小鼠的血清明显高的中和效价(P＜0.005，FIG.18D)。这些数据表明嵌合P-粒子上的VP8可能被更好地呈递，并且保持中和表位所需要的合适的构象。

接种P-粒子-VP8嵌合体导致鼠轮状病毒攻击后的排毒量减少.接着我们利用鼠轮状病毒模型(EDIM株)检验了P-粒子-VP8嵌合体疫苗是否能够在体内提供保护作用。为此，如材料与方法中描述的构建了含有EDIM VP8抗原的嵌合P-粒子并给予小鼠(N＝5-7)。用相同摩尔量的游离EDIM VP8、带有人VP8(Wa)的嵌合P-粒子或者野生型P-粒子免疫的动物也包括在内作为对照。最后一次免疫后两周，用鼠EDIM轮状病毒攻击动物。攻击后收集6天粪便样品，通过EIA检测排毒量(表1，图19)。接种P-粒子-VP8(EDIM)嵌合体的小鼠排出来最低量的病毒抗原。6天内排毒量减少89％(P＜0.05)。用EDIM攻击后第1天减少99.2％。用游离鼠VP8免疫的小鼠的排毒量第二低，平均保护率为77％(P＜0.05，第2到5天)。用含有人轮状病毒(Wa)VP8的嵌合P-粒子疫苗进行免疫接种对排毒量影响小，减少了23％，表明抗EDIM的某些交叉保护。这组中第6天，排毒量有显著下降(63％，P＜0.05)。

表1

鼠轮状病毒株(EDIM)攻击后，免疫接种小鼠的粪便中的轮状病毒排出量1

¹小鼠按照材料与方法中描述的经鼻内免疫。最后一次免疫后两周，小鼠用10⁵50％排毒剂量的鼠EDIM攻击。攻击后给每只小鼠收集6天的粪便，分析轮状病毒抗原量。

²每组中每天每只小鼠的平均排出量。

³保护率是与对照组相比排出量每天或者6天内的减少百分比。

⁴通过与对照组(野生型P-粒子)进行比较计算P值。星号表示统计学显著的，双星号则表示统计学非常显著的。

用P-粒子-VP8嵌合体免疫所诱发的抗体阻断诺罗病毒与HBGAs的结合.用P-粒子-VP8(Wa)嵌合体免疫后，还检验了P-粒子骨架在小鼠免疫反应中的作用。正如预期，在EIAs中确定嵌合体诱发的抗体与诺罗病毒VLP和P-粒子强烈反应(图20A，数据未示出)。这些血清还阻断了诺罗病毒VLP与HBGA受体的结合(A型唾液，图20B)。作为阴性对照，来自用游离VP8(Wa)免疫的动物的血清未显示这种阻断作用。这一结果表明P-粒子-VP8嵌合体可以作为抗轮状病毒和诺罗病毒的双重疫苗。

我们先前的研究显示诺罗病毒P-粒子很容易产生，极其稳定并且是高免疫原性的，可以作为抗诺罗病毒的亚单位疫苗。我们进一步展示了P-粒子还可以作为新的疫苗平台用于外来抗原的免疫增强作用。我们证明了：1)P-粒子的表面环是外来抗原的优良插入位点，不会影响P-粒子的形成和产生，2)P-粒子能够耐受高达至少159个氨基酸的外来抗原，3)体外和体内中和与保护试验显示的对插入抗原的增强的免疫反应。P-粒子-VP8嵌合体还提供了有前景的抗轮状病毒和诺罗病毒的双重疫苗。因此，嵌合粒子制备程序的简单化和多个表面环带来的插入多价外来抗原的潜力使P-粒子成为有吸引力的疫苗平台，用于感染性疾病或可能得益于有效疫苗的其他状况的抗原呈递。

本发明的一个主要目的是检验P-粒子是否能够增强那些通常不具有免疫原性的小多肽抗原的免疫原性。我们使用His标签作为模型研究了这一问题并取得极好的结果。观察到的免疫增强可能是由多拷贝数和插入抗原的表面暴露这两个主要因素造成的。P-粒子由24拷贝的P单体构成，这可能解释了与融合到P二聚体上的His标签相比，它造成的增强的免疫反应(图15A)。被连接到P-结构域N-或C-末端的两个隐藏肽引起的低免疫反应显示了抗原暴露在表面的重要性(图15B和C)。因此，P-粒子仰仗其大尺寸(830kDa)和对本来低免疫原性的外来抗原的适当呈递可能发挥佐剂的作用。每个粒子中抗原的多拷贝增加是可能解释增强的免疫反应的另一个特性。

除了His标签肽，我们还成功地将多种其他小肽插入到P-粒子上，包括鼠巨细胞病毒的T细胞表位(9aa)、假单胞菌的Epi8表位(14aa)和A型流感的M2胞外表位(23aa)(Tan and Jiang，未发表的结果)。这些数据表明P-粒子可能用于许多小多肽抗原的免疫增强。不同轮状病毒VP8成功插入P-粒子极大地扩展了P-粒子平台在更广泛的较大外来抗原中的应用。轮状病毒VP8是病毒衣壳上的刺突蛋白，被认为对于轮状病毒的感染性至关重要。它也是诱发中和抗体的两种抗原之一。VP8蛋白上已鉴定到多个中和表位。P-粒子-VP8嵌合体成功地诱发中和抗体反应和给小鼠提供抗轮状病毒排毒的保护表明P-粒子载体上保留了这些表位。

尽管最近上市的两种轮状病毒疫苗非常有效，仍可能需要针对新涌现的病毒的新一代疫苗。非感染性亚单位疫苗没有当前的疫苗存在的回复为毒性株的风险。开发轮状病毒的VLP疫苗已设想了多年。轮状病毒VLP疫苗遇到的挑战是低表达效率和高生产成本，因为需要给杆状病毒宿主共转染多个衣壳基因。相反，P-粒子-VP8嵌合体的生成只需要常规的基于大肠杆菌的克隆和表达程序，而这些程序效率高成本低。此外，VP8上的交叉中和表位已有描述。本文中我们显示了用含有来自P[4]病毒的VP8的嵌合P-粒子免疫小鼠具有抗P[8]轮状病毒的交叉中和作用。含有最少P型数量的混合物疫苗也有可能是成本效益高的。

P-粒子-VP8嵌合体所诱发的抗体阻断诺罗病毒VLP与HBGA结合的能力是很意外的。如图1所示，P二聚体的远端表面，包括P-粒子的HBGA结合界面最有可能被插入的VP8遮盖。这使得嵌合体失去与HBGA受体的结合能力(数据未示出)。对于我们看到的得以持续的阻断能力，一个可能是P-粒子-VP8嵌合体的HBGA结合界面虽然被插入的VP8抗原遮盖，但对于抗体诱导仍是可接近的。替代地，观察到的碳水化合物阻碍可能是由于碳水化合物结合位点附近的抗体结合。无论涉及的是哪种机制，嵌合体所诱导的抗体对诺罗病毒VLP与HBGA的结合的阻断能力赋予了P-粒子平台附加的价值。P-粒子-VP8嵌合体作为抗诺罗病毒和轮状病毒的双重疫苗对于存在两种感染风险的特定群体尤其有价值。

虽然本研究中只检验了环2，我们预期在其他两个环中进行抗原插入也会成功，这正在我们实验室中进行验证。每个P单体存在的三个表面环提供了进行多能疫苗设计的机会。例如，为了增强免疫反应，可以在所有三个环中插入相同的表位或抗原从而达到每个粒子有72拷贝抗原。通过插入各个抗原的串联重复甚至可以形成更高的拷贝数。替代地，可以给三个环中每一个插入不同抗原，得到抗不同病原体(或者对于轮状病毒，得到抗不同VP8抗原)的多价疫苗。还可以通过插入用途不同的功能标签来产生其他疫苗模板。例如，插入His标签能够进一步简化纯化过程。也可以使用特殊的配体或信号分子通过将疫苗定靶到宿主的特定器官、组织或细胞来刺激免疫反应。

P-粒子平台的其他应用是产生抗小肽的抗体以便用于研究和诊断用途。已鉴定到多种疾病生物标记物(主要是肽表位)，抗这些生物标记物的抗体对诊断目的很重要。小肽可以通过简单的DNA克隆步骤很容易地插入P-粒子的环中。我们建立了含有能够进一步协助该过程的克隆盒的方便的P-粒子载体。重组嵌合P-粒子在细菌中表达后，按照本研究中确立的程序通过免疫实验动物可以诱导针对插入抗原肽的高效价特异抗体。这样产生的抗体可以避免肽合成和为了增强免疫将肽与高分子(比如钥孔

血蓝蛋白(KLH))进行偶联的高成本步骤。由于诺罗病毒P-结构域具有和任何其他蛋白没有同源性的独特序列，不必担心与其他蛋白的交叉反应。因此P-粒子疫苗平台可以在许多生物医学研究领域中作为产生抗体的方便工具。

本发明虽然通过对其实施方案的描述得以阐述，且实施方案的描述相当详细，但这并不意味着所附权利要求的范围被局限于或者限制到这些细节。其他优势和可进行的改动对本领域技术人员是显而易见的。因此本发明更广泛的方面不限于特定细节、代表性系统和方法、以及文中显示和描述的实施例。相应地，可以在不脱离发明范围或精神的情况下做出对这些细节的变更。

Claims (16)

1.抗原-P-结构域单体，其包含带有至少一个表面环的诺罗病毒(NOR)P-结构域单体和插入到所述至少一个表面环中的蛋白或多肽抗原。

2.权利要求1所述的抗原-P-结构域单体，其中所述至少一个表面环包括环1(I293-H297)、环2(T371-D374)和环3(D391-N394)中的至少一者。

3.权利要求1所述的抗原-P-结构域单体，其中所述抗原是轮状病毒(RV)VP8抗原。

4.权利要求1所述的抗原-P-结构域单体，其中所述蛋白或多肽抗原包括至少两种类似或不同的抗原。

5.由24个单体组成的抗原-P-粒子，所述P-粒子包括至少一个权利要求1所述的抗原-P-结构域单体，和任选的一或多个野生型NOR P-结构域单体，其中所述抗原-P-粒子与单独的该抗原相比，可以使抗原的免疫原性增强。

6.P-结构域单体载体，其包含带有至少一个表面环的NOR P-结构域单体，其中所述至少一个表面环包括至少一对限制性位点。

7.权利要求6所述的P-结构域单体载体，其中所述至少一个表面环包括环1(I293-H297)、环2(T371-D374)和环3(D391-N394)中的至少一个。

8.权利要求6所述的P-结构域单体载体，其中所述至少一个表面环包括间隔分子来延伸所述至少一个表面环的长度和暴露情况。

9.给哺乳动物提供抗病毒性抗原的免疫保护作用的方法，其包括将权利要求5所述的抗原-P-粒子作为疫苗给予哺乳动物的步骤。

10.权利要求9所述的方法，其中所述抗原是RV VP8抗原，其中P-粒子-VP8嵌合体作为抗轮状病毒和诺罗病毒的双重疫苗。

11.权利要求1所述的抗原-P-结构域单体，其中所述至少一个表面环是三个环，且其中该单体的三个环上插入多个不同的抗原，以防止诸如RV VP8之类大抗原遮盖带有较小外来抗原的相邻环、而使小表位难以在该环上呈递。

12.权利要求1所述的抗原-P-结构域单体，其中所述P-结构域单体的一或多个表面环中被插入配体或信号肽，导致自发形成在一或多个远端表面上带有插入的配体或信号肽的取代的P-粒子。

13.权利要求12所述的抗原-P-结构域单体，其中所述插入的配体或信号肽使得取代的P-粒子能够靶向具体器官或组织中的相应受体、并前往这些位置。

14.权利要求13所述的抗原-P-结构域单体，其中所述取代的P-粒子有肽CNGRC(5个氨基酸)插入到该P-结构域单体的一或多个表面环中。

15.权利要求1所述的抗原-P-结构域单体，其中所述取代的P-粒子单体，及其二聚体和其P-粒子，具有通过化学反应借助暴露在表面的赖氨酸和半胱氨酸插入到P-粒子环中的药物偶联物以便作为药物载体。

16.权利要求1所述的抗原-P-结构域单体，其中所述取代的P单体，及由其形成的二聚体和P-粒子，具有插入在至少一个表面环中的配体或信号肽、以及插入在至少一个表面环中的药物偶联物，从而提供了药物递送系统将药物定靶到患病的具体组织或器官。

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