CN103304642B - 猪轮状病毒δvp8*亚单位重组蛋白及其应用 - Google Patents
猪轮状病毒δvp8*亚单位重组蛋白及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种猪轮状病毒ΔVP8*亚单位重组蛋白以及该蛋白的编码基因。本发明还提供了在该重组蛋白中增加破伤风毒素T细胞表位P2后所形成的重组蛋白以及编码基因。本发明的ΔVP8*蛋白为VP8*中第64-223位氨基酸，能有效刺激机体产生特异性血清抗体，体液免疫应答良好，能够克服VP4基因由于片段过大无法原核表达的问题，且该蛋白体外表达为可溶性蛋白，也克服了VP8*体外表达为包涵体的问题；同时，将破伤风毒素中T细胞表位P2（TT的830-844位氨基酸）引入ΔVP8*亚单位重组蛋白中，可以大大提高该蛋白的免疫效力，可以诱导更快、更强的中和抗体滴度，也可以诱导高滴度的轮状病毒交叉中和抗体。
Description
技术领域
本发明属于动物分子生物学和基因工程领域，涉及一种猪轮状病毒ΔVP8*亚单位重组蛋白及其应用。
背景技术
轮状病毒（Rotavirus，RV）是无囊膜、分节段的双股RNA病毒，属于呼肠孤病毒科，是引起婴幼儿和各种幼龄动物病毒性腹泻的主要病原之一。仔猪轮状病毒腹泻是由猪轮状病毒（porcine rotavirus，PRV）引起的一种以腹泻、厌食、呕吐、脱水为特征的急性传染病。本病多发生于晚秋、冬季和早春，各种年龄的猪皆可感染，感染率最高可达90%～100％。易继发细菌性感染，导致仔猪死亡率升高，造成严重的经济损失。猪轮状病毒感染呈世界范围分布，给养猪业带来了极大的危害。
轮状病毒含有6种结构蛋白（VP1、VP2、VP3、VP4、VP6和VP7），其中VP4和VP7可以独立地诱导中和抗体。VP7蛋白含有的抗原表位大都是构象性的，原核系统的表达产物无法折叠形成VP7蛋白的天然构象，且不能进行蛋白质翻译后的糖基化修饰。而VP4蛋白上的抗原表位多为线性，且该蛋白不需翻译后修饰，这为研制亚单位疫苗提供了理论依据。VP4由基因片段4编码，动物轮状病毒的VP4蛋白由776个氨基酸组成，分子量为88kDa，占病毒蛋白总量的1.5%。VP4经胰蛋白酶作用在241位或247位氨基酸处可裂解为两条长度不等的肽段VP8*和VP5*，其中VP8*靠近氨基端，它能吸附宿主细胞唾液酸，接着羧基端的VP5*在丐粘素和热休克蛋白的共同作用下进入细胞。研究发现，VP8*是一种重要的中和抗原蛋白，其蛋白亚基上含有5个线性B细胞表位，其中3个表位参与病毒的中和反应。VP8*包含了VP4的主要抗原位点，且负责VP4特异性中和反应，而且VP8*片段具有高度的型特异性。由于VP4基因片段较长（2359bp），因此目前原核表达完整的VP4蛋白存在困难，因此，这提示了我们可以利用VP8*蛋白片段来开发新型PRV亚单位疫苗，为基因工程亚单位疫苗的研制奠定基础。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种猪轮状病毒ΔVP8*亚单位重组蛋白及其编码基因。
本发明的第二个目的是提供一种重组蛋白及其编码基因，该重组蛋白是在猪轮状病毒ΔVP8*亚单位重组蛋白中增加破伤风毒素T细胞表位P2。
本发明的第三个目的是提供上述两种重组蛋白的用途。
本发明通过以下技术方案来实现：
一、一种猪轮状病毒ΔVP8*亚单位重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。编码上述的猪轮状病毒ΔVP8*亚单位重组蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。
该重组蛋白的制备方法如下：
（1）以猪轮状病毒OSU株为实验材料，首先获取cDNA；
（2）根据GenBank检索号为X13190.1的序列设计引物，PCR获得目的片段ΔVP8*，其中，引物序列如下：
上游引物：5'-GATCCATATGTTATTAGATGGCCCATACCAACC-3'（SEQ ID No.3），斜体划线部分为NdeI酶切位点；
下游引物：5'-ATAGAAAGCTTTCCATGATTGATATACTCAGTAC-3'（SEQ IDNo.4），斜体划线部分为HindIII酶切位点；
（3）将目的片段ΔVP8*克隆至pET28a载体中，获得表达载体pET28a-ΔVP8*；
（4）将上述表达载体转化至大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)pLysS，IPTG诱导表达获得重组蛋白。
三、一种重组蛋白，该重组蛋白是在猪轮状病毒ΔVP8*亚单位重组蛋白的氨基酸增加破伤风毒素T细胞表位P2，其氨基酸序列如SEQ ID No.6所示。编码上述重组蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。
该重组蛋白的制备方法如下：
（1）以猪轮状病毒OSU株为实验材料，首先获取cDNA；
（2）根据GenBank检索号为X13190.1的序列设计引物，PCR获得目的片段P2-ΔVP8*，其中，引物序列如下：
上游引物：5'-AATTCCATATGCAGTACATCAAAGCAAATTCTAAGTTTATTGGTATCACGGAGCTCGGAGGTGGCGGATCTTTATTAGATGGCCCATACCAACCAACC-3'（SEQ ID No.7），斜体划线部分为NdeI酶切位点，粗体字部分为编码破伤风毒素T细胞表位P2的序列；
下游引物：5'-ATAGAAAGCTTTCCATGATTGATATACTCAGTAC-3'（SEQ IDNo.8），斜体划线部分为HindIII酶切位点；
（3）将目的片段P2-ΔVP8*克隆至pET28a载体中，获得表达载体pET28a-P2-ΔVP8*；
（4）将上述表达载体转化至大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)pLysS，IPTG诱导表达获得重组蛋白。
三、上述两种重组蛋白在制备轮状病毒疫苗中的应用。
采用上述技术方案的积极效果：本发明中的ΔVP8*蛋白为截短的VP8*蛋白，具有VP8*中第64-223位氨基酸，该蛋白片段能有效刺激机体产生特异性血清抗体，体液免疫应答良好，能够有效克服VP4基因由于片段过大无法原核表达的问题，并且，该蛋白体外表达为可溶性蛋白，适于用作制备疫苗，也克服了VP8*体外表达为包涵体的问题；作为本发明的进一步改进，将破伤风毒素中T细胞表位P2（TT的830-844位氨基酸）引入轮状病毒ΔVP8*重组亚单位疫苗中，可以大大提高ΔVP8*亚单位疫苗的免疫效力，可以诱导更快、更强的中和抗体滴度，而且可以诱导高滴度的轮状病毒交叉中和抗体。
附图说明
图1是ΔVP8*基因的PCR电泳图；
图中，1Marker，2目的片段；
图2是pET28a-ΔVP8*重组质粒双酶切电泳图；
图中，1Marker，2pET28a-ΔVP8*双酶切产物；
图3是ΔVP8*重组蛋白SDS-PAGE电泳图；
图中，1:pET28a(+)诱导前；2:pET28a(+)诱导后；M:Marker；3:pET28a-ΔVP8*诱导前；4:pET28a-ΔVP8*诱导后菌体裂解沉淀；5:pET28a-ΔVP8*诱导后菌体裂解上清；
图4是ΔVP8*重组蛋白Western Blot检测图；
图中，1Marker，2ΔVP8*重组蛋白；
图5是ΔVP8*重组蛋白纯化电泳图；
图中，1Marker，2纯化的ΔVP8*重组蛋白；
图6是P2-ΔVP8*基因的PCR电泳图；
图中，1Marker，2目的片段；
图7是pET28a-P2-ΔVP8*重组质粒双酶切电泳图；
图中，1Marker，2pET28a-P2-ΔVP8*双酶切产物；
图8是P2-ΔVP8*重组蛋白SDS-PAGE电泳图；
图中，1:pET28a(+)诱导前；2:pET28a(+)诱导后；M:Marker；3:pET28a-P2-ΔVP8*诱导前；4:pET28a-P2-ΔVP8*诱导后菌体裂解沉淀；5:pET28a-P2-ΔVP8*诱导后菌体裂解上清；
图9是P2-ΔVP8*重组蛋白Western Blot检测图；
图中，1Marker，2P2-ΔVP8*重组蛋白；
图10是P2-ΔVP8*重组蛋白纯化电泳图；
图中，1Marker，2纯化的P2-ΔVP8*重组蛋白。
具体实施方式
下面结合实施例和对比例对本发明的技术方案做进一步的说明，但不应理解为对本发明的限制：
本发明中生物材料的来源：
1、猪轮状病毒OSU株（基因型G4P[7]）购于ATCC；
2、原核表达载体pET-28a购自Novagen公司；
3、E.coli BL21(DE3)购自Novagen公司；
4、所用引物为自行设计并委托苏州金维智生物科技有限公司合成。
实施例1
本实施例用于说明含有目的片段的表达载体的构建。
所用材料为猪轮状病毒OSU株。猪轮状病毒OSU株为经典毒株，是用原代非洲绿猴肾（AGMK）细胞进行培养。所用培养基为EMEM，其中添加胰酶至终浓度为0.5μg/ml，青霉素100IU/ml，链霉素100μg/ml，两性霉素B2.5μg/ml。EMEM培养基配方如表1：
通过TRIzol-LS（Invitrogen）法提取猪轮状病毒OSU株RNA，将所提取的RNA用RT-PCR反转录成cDNA。其中所用的引物是根据猪轮状病毒OSU株VP4（GenBank检索号分别为：X13190.1）的RNA片段4的基因序列进行设计的。扩增ΔVP8*的引物如下：
上游引物：5'-GATCCATATGTTATTAGATGGCCCATACCAACC-3'（SEQ ID No.3），斜体划线部分为NdeI酶切位点；
下游引物：5'-ATAGAAAGCTTTCCATGATTGATATACTCAGTAC-3'（SEQ IDNo.4），斜体划线部分为HindIII酶切位点；
用Superscript III反转录酶反转录VP8*cDNA，反应参数设置如下：
50-200ng基因组RNA与终浓度为15%的DMSO混合，95℃变性3min，然后立即置于冰上，反应体系如下：2pmol基因特异性引物，10pg-5μg总RNA，1μL10mMdNTP，去离子水补足至13μL，65℃变性5min，冰山孵育至少1min；加入4μL5×First-Strand buffer，1μL100mM DTT，1μL RNaseOUT RNase抑制剂，1μL SuperScriptIII(200U/μL)。50℃30-60min，70℃15min，cDNA链形成。cDNA链形成。以cDNA为模板，通过iProof高保真PCR系统（Bio-Rad）扩增特异性ΔVP8*融合片段。PCR反应体系：pfu buffer with MgSO42.5μl，dNTP(2mM)2.5μl，上、下游引物（20μM）各1μl，模板质粒pCR4-VP40.5μl，pfu DNA Polymerase0.25μl，ddH2O补足至25μl。PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃1min，56℃1min，72℃1.5min，30个循环；最后72℃延伸10min。扩增产物用2%的琼脂糖凝胶电泳鉴定，PCR检测结果如图1。
ΔVP8*基因扩增产物经凝胶纯化回收后，与质粒载体pET28a(+)分别用限制酶NdeI和HindIII双酶切。二者的双酶切产物经纯化回收后在下列反应体系中连接：ΔVP8*基因酶切回收产物4.5μl，pET28a（+）酶切回收产物0.5μl，高效连接液Solution I5μl，混匀后16℃连接2h。连接产物全量转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布含卡那霉素30μg/mL的LB平板过夜培养。次日随机挑取单个菌落，编号后接种于3mL含卡那霉素30μg/mL的LB液体培养基中，37℃振摇培养12h，抽提质粒进行双酶切鉴定，双酶切检测结果如图2。对所构建的质粒进行DNA测序，鉴定所构建质粒的完整性和正确性。
实施例2
本实施例用于说明猪轮状病毒亚单位重组蛋白的表达。
分别挑取阳性重组菌和空载体对照菌的单菌落，接种于3mL含卡那霉素30μg/mL的LB液体培养基中，37℃振摇培养12～16h。接着按1%的比例将菌液转接至10mL新鲜的LB液体培养基中（含卡那霉素30μg/mL），37℃、200rpm振荡培养至OD600≈0.6时，各取出1mL菌液作为诱导前对照，再分别向剩余菌液中加入IPTG至终浓度为0.5mM，将温度降至22℃，过夜诱导表达。分别取1mL诱导后菌液和1mL诱导前菌液，离心收集菌体，将菌体用0.01M PBS（pH7.4）重悬后冰浴超声破碎至清亮不粘稠。裂解后产物12000rpm离心1min，分别收集上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳，结果如图3所示。
实施例3
本实施例用于说明重组蛋白的纯化。
用含蛋白酶抑制剂混合物（Roche）的BugBuster Master Mix(Novagen)破坏E.Coli细胞的细胞壁，收集可溶性产物，-80℃贮存备用。用ProBond nickel-NTA琼脂亲和层析（Invitrogen），按照厂商所给步骤对每种蛋白进行纯化。用含不同浓度咪唑（20-100mM）的wash buffer洗去细胞蛋白后，250mM咪唑洗脱重组蛋白。SDS-PAGE分析重组蛋白的纯度，然后用离心过滤装置(Millipore)除去溶液中的咪唑。按照BCA定量试剂盒（Thermo）厂商说明，用BCA定量试剂盒确定纯化后的重组蛋白浓度。纯化后的重组蛋白-80℃保存备用。检测结果如图4所示。
实施例4
本实施例用Western blot方法对蛋白进行检测。
蛋白样品经SDS-PAGE电泳后，电转移至硝酸纤维素膜上。PBST洗膜3次，用含5%脱脂乳的PBST将膜于37℃摇晃封闭2h。封闭结束，PBST洗膜3次，用含1%BSA的PBST稀释鼠源抗His tag mAb（1:4000），将膜于4℃孵育过夜。PBST洗膜3次，用5%脱脂乳的PBS稀释HRP（辣根过氧化物酶）标记的羊抗鼠IgG抗体（1:5000），37℃孵育1h。PBST洗膜4次，DAB显色后，将膜置于滤纸上干燥，显色后出现单一且特异的清晰目的条带，说明该蛋白具有良好的免疫学活性，结果如图5所示。
实施例5
本实施例用于说明动物免疫试验。
将30只6～8周龄的雌性Balb/c小鼠随机分为3组，每组10只，其中一组为对照组，另两组为实验组。实验组分别于后肢肌肉注射重组蛋白ΔVP8*。每只小鼠的注射剂量为10μg重组蛋白加600μg Al(OH)3佐剂。对照组每只小鼠仅注射600μg Al(OH)3佐剂。共三次免疫，中间间隔两周。分别于免疫前和免疫后14d、28d、42d割尾采集小鼠血液，分离血清，-20℃保存，测定不同免疫时期的血清抗体水平。
用优化好的抗原包被浓度及二抗稀释度检测免疫后小鼠的血清抗体水平，间接ELISA的操作步骤如下：用0.05M pH9.6的碳酸盐包被缓冲液分别将纯化的重组蛋白ΔVP8*（6μg/mL）按每孔100μl包被96孔ELISA板，4℃包被过夜后，用含5%脱脂乳的PBST于37℃封闭2h。将待检血清做倍比系列稀释后加入孔中，同时设阴性对照，每孔100μl，37℃作用1h。每孔加入HRP（辣根过氧化物酶）标记的羊抗鼠IgG抗体（1:5000稀释）100μl，37℃作用1h。TMB室温避光显色15min，2mol/L浓硫酸终止反应，酶标仪测定OD450nm值。以P/N值大于或等于2.1为阳性阈值。
结果表明，与仅注射Al(OH)3佐剂的对照组相比，重组蛋白加Al(OH)3佐剂的免疫组从初免后其血清抗体效价开始出现（14d，＜1:50），二免后缓慢上升（28d），三免后迅速大幅度升高（42d）；而对照组自始至终检测不到抗体效价。
结果显示，免疫前各组小鼠抗体水平皆为零。在免疫后第14d，重组蛋白ΔVP8*免疫组的GMT（抗体几何平均滴度）为1:20。在免疫后第28d，重组蛋白ΔVP8*免疫组的GMT为1:200。在免疫后第42d，ΔVP8*免疫组的GMT为1:9180，而对照组各时期的抗体检测水平皆为0。说明该重组蛋白可以有效的诱导免疫应答，适于制备轮状病毒疫苗。
实施例6
本实施例说明P2-ΔVP8*的检测实验。
扩增P2-ΔVP8*的上游引物：
5'-AATTCCATATGCAGTACATCAAAGCAAATTCTAAGTTTATTGGTATCACGGAGCTCGGAGGTGGCGGATCTTTATTAGATGGCCCATACCAACCAACC-3'（SEQ ID No.7），斜体划线部分为NdeI酶切位点，粗体字部分为编码破伤风毒素T细胞表位P2的序列；
下游引物：5'-ATAGAAAGCTTTCCATGATTGATATACTCAGTAC-3'（SEQ IDNo.8），斜体划线部分为HindIII酶切位点。其他实验方法同实施例1-5。PCR扩增结果如图6，重组质粒双酶切检测结果如图7，P2-ΔVP8*重组蛋白SDS-PAGE电泳结果如图8，重组蛋白的纯化电泳如图9，重组蛋白Western blot检测如图10。
对比例1
采用500-550g/只的远交系雌性Hartley豚鼠。每个实验的全程，豚鼠都饲养于动物生物安全二级条件的隔离鼠笼中。每两周给豚鼠肌内注射（IM）免疫一次，ΔVP8*、P2-ΔVP8*每次免疫10μg或20μg（加或不加磷酸铝（AP）佐剂）(ADJU-PHOSTM,Brenntag Biosector)（每剂含100μg铝），共免疫3次，每次免疫前和末次免疫7天后采血。为进行中和实验，每两周给豚鼠肌内注射免疫10μg或20μgP2-ΔVP8*+磷酸铝佐剂，共免疫3次，每次免疫前及末次免疫2、4、6个月后采血。
用纯化的重组蛋白P2-ΔVP8*（6μg/mL）包被96孔板，以HRP（辣根过氧化物酶）标记的羊抗鼠IgG抗体为二抗，经间接ELISA方法，检测血清抗体水平。结果表明，与仅注射Al(OH)3佐剂的对照组相比，重组蛋白加Al(OH)3佐剂的免疫组从初免后其血清抗体效价开始出现（14d，＜1:50），二免后缓慢上升（28d），三免后迅速大幅度升高（42d）；而Al(OH)3佐剂对照组自始至终检测不到抗体效价。
实验证明，免疫前各组小鼠抗体水平皆为零。在免疫后第14d，重组蛋白P2-ΔVP8*免疫组的GMT（抗体几何平均滴度）为1:40，而重组蛋白ΔVP8*免疫组的GMT检测结果为零。在免疫后第28d，重组蛋白P2-ΔVP8*免疫组的GMT均为1:635，高于重组蛋白ΔVP8*免疫组（1:200）。在免疫后第42d，各免疫组的抗体水平都迅速大幅度升高，P2-ΔVP8*免疫组的GMT为1:34455，高于ΔVP8*免疫组（1:9180），且差异极显著（P＜0.01）。
结果显示，破伤风毒素T细胞表位P2的引入可以大大提高ΔVP8*亚单位疫苗的免疫效力，可以诱导更快、更强的中和抗体滴度，而且可以诱导高滴度的轮状病毒交叉中和抗体，适合于制备轮状病毒疫苗。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (3)
1.一种重组蛋白，其特征在于：所述的重组蛋白是在猪轮状病毒ΔVP8*亚单位重组蛋白中增加破伤风毒素T细胞表位P2，其氨基酸序列如SEQ ID No.6所示。
2.编码权利要求1所述的重组蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。
3.权利要求1或2所述的重组蛋白在制备轮状病毒疫苗中的应用。
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