CN113336861A - 一种以诺如病毒vp1蛋白为载体的嵌合蛋白及其制备方法及病毒样颗粒 - Google Patents

一种以诺如病毒vp1蛋白为载体的嵌合蛋白及其制备方法及病毒样颗粒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种以诺如病毒VP1蛋白为载体的嵌合蛋白及其制备方法及病毒样颗粒，一种以诺如病毒VP1蛋白为载体的嵌合蛋白，是以诺如病毒全长VP1蛋白为载体蛋白，将突环区1的部分氨基酸序列替换为其他氨基酸序列而表达出的嵌合蛋白。该嵌合蛋白融合了与其它不同型别VP1蛋白，其表达量不受影响或者影响很小，而且置换为来源于其它不同病毒的中和抗体结合线性表位后，仍然维持高表达水平，该嵌合蛋白可自组装成病毒样颗粒，对于研究NoV病毒突环区序列进化、受体结合机制、单克隆抗体筛选等都具有重要的意义。

Description

一种以诺如病毒VP1蛋白为载体的嵌合蛋白及其制备方法及 病毒样颗粒
技术领域
本发明属于生物技术技术领域，具体涉及一种以诺如病毒VP1蛋白为载体的嵌合蛋白及其制备方法及病毒样颗粒。
背景技术
诺如病毒（Noroviruses，NoV）是全球范围内引起成人和儿童非细菌性急性胃肠炎暴发流行的重要病原体，同时也是婴幼儿散发性胃肠炎的常见病原（仅次于轮状病毒），近年来其发病率呈逐渐升高的趋势[Ahmed S, Hall A, Robinson A, Verhoef L,Premkumar P, Parashar U, et al. Global prevalence of norovirus in cases ofgastroenteritis: a systematic review and meta-analysis. Lancet Infect Dis.2014;14(8):725-30]。诺如病毒为单正链RNA病毒，基因组全长7.5-7.7kb,有多聚A尾巴。基因组有三个开放阅读框，开放阅读框1,2和3，分别编码多聚蛋白，主衣壳蛋白VP1和次衣壳蛋白VP2。VP1结构上可以分成两个结构域，衣壳区（Shell domain， S区）和突出区（Protruding domain, P区）,其中P区为主要的受体结合位点并含有主要的免疫表位[Prasad B, Hardy M, Dokland T, Bella J, Rossmann M, Estes M. X-raycrystallographic structure of the Norwalk virus capsid. Science. 1999;286(5438):287-90][Lauren A Ford-Siltz, Samantha Wales, KentaroTohma, Yamei Gao,Gabriel I Parra, Genotype-Specific Neutralization of Norovirus Is Mediated byAntibodies Against the Protruding Domain of the Major Capsid Protein, TheJournal of Infectious Diseases, 2020;, jiaa116]。该病毒目前还不能进行体外培养，但是已经证明主衣壳蛋白在真核和原核细胞表达后可以自组装成病毒样颗粒（Virus-likeparticles, VLPs）。用杆状病毒或者大肠杆菌表达诺如病毒的VP1, 所形成的VPLs在形态、结构和抗原特性方面均与野生型病毒类似[Jiang X, Wang M, Graham D, Estes M.Expression, self-assembly, and antigenicity of the Norwalk virus capsidprotein. J Virol. 1992;66(11):6527-32][ Huo Y, Wan X, Ling T, Wu J, Wang W,Shen S. Expression and purification of norovirus virus like particles inEscherichia coli and their immunogenicity in mice. Mol Immunol. 2018;93:278-84]。
VP1蛋白体外表达后自组装的VLPs呈二十面体结构，直径约35nm，180个单体的S区形成内环，P区形成外环，外观看起来P区坐落在S区之上，中间有一定的空隙。研究表明P区可以根据外界因素影响改变其形态。基于X-射线晶体结构解析结果，P区形成的外环上每个单体上有三个突环区。采用原核表达系统，单纯P区序列可以组装成由12个二聚体或24个单体组装而成的亚病毒颗粒，又称为P颗粒。P颗粒也有对应的三个突环区，其中突环区2具有较强的容纳外源蛋白的能力[ Tan Ming,HuangPengwei,Xia Ming et al. Norovirus Pparticle, a novel platform for vaccine development and antibodyproduction.JVirol, 2011, 85: 753-64]。目前已经有大量的利用P颗粒进行外源蛋白表达和疫苗开发的相关报道。后来LigoCyte购买了这个基于“P颗粒”疫苗的专利，2012年武田公司收购了LigoCyte公司，但至今仍没有见到相关的基于P颗粒的疫苗进行临床试验。动物实验表明该P颗粒免疫原性不及病毒样颗粒。此外，该方法制备P颗粒需要进行体外酶切把标签蛋白和目的蛋白进行分离，不仅费时，费力，增加了费用，同时不可避免引入外源蛋白污染，即不能有效酶切的目的蛋白。
现有技术中，申请公布号为CN106220738A的发明专利公开了一种EV71中和抗原表位与诺如病毒P结构域嵌合载体的构建和表达方法，该方法包括以下步骤：设计核苷酸序列：EV71的单个表位通过诺如病毒P结构域LOOP2插入从而形成嵌合基因,即：SP55-L2、SP70-L2和SP28-L2，在每个EV71单个表位核苷酸序列的3’端加CTAGT和5’端加AT；或EV71的3个表位分别进行两两组合或3表位的组合后，通过诺如病毒P结构域LOOP2插入从而形成嵌合基因，即：SP55-SP70-L2、SP55-SP28-L2、SP70-SP28-L2和SP55-SP70-SP28-L2，在组合中的各表位之间通过3个重复的接头序列GGGGS进行串联。根据设计的核苷酸序列，通过人工合成相应的基因后再克隆到P42质粒的P结构域相应位置中，得到7个含EV71中和抗原表位的P结构域嵌合基因的重组质粒。重组质粒转化大肠杆菌细胞中，涂布含有氨苄西林的LB平板并筛选阳性克隆，将阳性克隆进行培养后提取质粒并送测序验证。4)将测序验证为正确的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，涂布含有氨苄西林的LB平板并筛选阳性克隆，培养后加IPTG进行诱导，大量表达出含GST标签的EV17中和抗原表位与诺如病毒P结构域的嵌合蛋白，用GST亲和磁珠纯化表达的嵌合蛋白，并通过抗GST标签抗体和免疫印迹验证融合蛋白的表达。该方法并非以全长的VP1蛋白作为载体蛋白表达外源蛋白。
P颗粒不包括S区序列，由于具有较大的容纳外源蛋白的能力，对于单价和双价疫苗研发具有一定的优势。但是由于P颗粒是由P区组装而成，不包含S区，其功能上可能缺少完整P区和S区组装的VLPs所具有的生理功能，如受体结合后的胞吞，构像改变，以及后续内容物，即核酸的释放。因此P颗粒对于NoV的VLPs的功能研究帮助有限。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种以诺如病毒VP1蛋白为载体的嵌合蛋白，使用全长VP1蛋白作为载体蛋白表达外源蛋白，可以自组装成VLPs。
本发明的第二个目的是提供一种以诺如病毒VP1蛋白为载体的嵌合蛋白的制备方法。
本发明的第三个目的是提供一种以诺如病毒VP1蛋白为载体的嵌合蛋白自组装形成的VLPs。
为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为：
一种以诺如病毒VP1蛋白为载体的嵌合蛋白，是以诺如病毒全长VP1蛋白为载体蛋白，将突环区1的部分氨基酸序列替换为其他氨基酸序列而表达出的嵌合蛋白。
进一步地，被替换的所述氨基酸序列为位于突环区1的289-302位的氨基酸序列。
进一步地，所述载体蛋白为GII.4型诺如病毒全长VP1蛋白。
进一步地，用于替换的所述氨基酸序列为不同于载体蛋白的诺如病毒VP1蛋白的氨基酸序列或其它不同病毒来源序列。
进一步地，不同于所述载体蛋白的诺如病毒VP1蛋白序列为GI.3型诺如病毒 VP1蛋白上的序列或GII.6型诺如病毒 VP1蛋白上的序列。
进一步地，不同病毒来源序列为来源于EV71 VP1的中和表位SP70多肽序列或来源于水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E的中和表位多肽序列。
上述以诺如病毒VP1蛋白为载体的嵌合蛋白的制备方法，包括以下步骤：
1）将所述载体蛋白的突环区1的部分氨基酸序列对应的基因替换为其他氨基酸序列对应的基因，进行基因全合成；
2）将合成的基因连接到pFast-Bac Dual载体上制备质粒，质粒转化DH10B感受态细胞，筛选阳性克隆，制备重组质粒，将制备的重组质粒转染Sf9细胞，培养后纯化得到所述嵌合蛋白。
进一步地，所述纯化是通过聚乙二醇沉淀和氯化铯密度梯度离心纯化。
进一步地，被替换的所述氨基酸序列为位于突环区1的289-302位的氨基酸序列。
上述以诺如病毒VP1蛋白为载体的嵌合蛋白自组装形成的病毒样颗粒。
本发明的有益效果：
本发明的以诺如病毒VP1蛋白为载体的嵌合蛋白，使用全长VP1蛋白作为载体蛋白表达外源蛋白，替换区域位于VP1蛋白的突环区1，将突环区1的289-302位氨基酸与其它不同来源序列进行替换则嵌合蛋白可以得到很好的表达。对比例1中在其它区域插入外源序列进行表达，但构建的嵌合蛋白并没有得到表达或者表达的蛋白水平很低且没有组装成VLPs，说明选择的289-302位氨基酸这个区域具有特异性。
本发明的嵌合蛋白组装的为VLPs，其大小与真病毒相似，不同于P颗粒，P颗粒是利用VP1的P区域序列，即VP1全长序列的一半，进行外源蛋白表达，P颗粒属于一种亚病毒颗粒， P颗粒是原核表达系统，需要酶切和复性，过程繁琐。本发明表达的嵌合蛋白利用重组杆状病毒表达系统，表达的蛋白可以自组装成VLPs，可以通过PEG沉淀进行大量的快速纯化，对于研究NoV病毒突环区序列进化、受体结合机制、单克隆抗体筛选等都具有重要的意义。
附图说明
图1为GII.4-VP1/GI.3嵌合蛋白的间接ELISA实验结果图；
图2为GII.4-VP1/GI.3嵌合蛋白的SDS-PAGE分析结果图；
图3为GII.4-VP1/GI.3嵌合蛋白的电子显微镜结果图；
图4为GII.4-VP1/GII.6嵌合蛋白的间接ELISA实验结果图；
图5为GII.4-VP1/GII.6嵌合蛋白的SDS-PAGE分析结果图；
图6为GII.4-VP1/ GII.6嵌合蛋白的电子显微镜结果图；
图7为GII.4-VP1/EV71嵌合蛋白的间接ELISA实验结果图；
图8为GII.4-VP1/EV71嵌合蛋白的SDS-PAGE分析结果图；
图9为GII.4-VP1/EV71嵌合蛋白的电子显微镜结果图；
图10为GII.4-VP1/VZV嵌合蛋白的间接ELISA实验结果图；
图11为GII.4-VP1/VZV嵌合蛋白的SDS-PAGE分析结果图；
图12为GII.4-VP1/VZV嵌合蛋白的电子显微镜结果图；
图13为GII.4-VP1/IS2嵌合蛋白的间接ELISA实验结果图；
图14为GII.4-VP1/IS2嵌合蛋白的SDS-PAGE分析结果图；
图15为GII.17VP1/GII.13嵌合蛋白的间接ELISA实验结果图；
图16为GII.17VP1/GII.13嵌合蛋白的SDS-PAGE分析结果图；
图17为GII.17VP1/GII.13嵌合蛋白的电子显微镜结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例以及附图对本发明作进一步说明。
下述实施例中所使用的材料来源如下：
含有GII.4 VP1基因编码序列的载体为自行保存（GenBank登录号为KF306214）。
pFast-Bac Dual载体和DH10B感受态细胞购买于Invitrogen公司。
Sf9细胞为自行保存。
无血清培养基购自于苏州市沃美生物技术有限公司。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。
实施例1
本实施例的以诺如病毒VP1蛋白为载体的嵌合蛋白，是以GII.4型诺如病毒全长VP1蛋白为载体蛋白，将突环区1的289-302位氨基酸序列替换为GI.3型诺如病毒VP1蛋白（Genbank登录号：JN603244）突环区1的如SEQID：2所示的多肽序列而表达出的GII.4-VP1/GI.3嵌合蛋白。GII.4-VP1/GI.3嵌合蛋白编码序列全长为538个氨基酸。GII.4型诺如病毒全长VP1蛋白的序列如SEQID：1所示。
本实施例的以诺如病毒VP1蛋白为载体的嵌合蛋白的制备方法，包括以下步骤：
1）基因合成、载体构建和重组杆状病毒制备：
首先根据昆虫细胞（S. frugiperda）密码子使用频率将和GII.4 VP1突环区1对应的GI.3（Genbank登录号：JN603244）突环区1的如SEQID：2所示的多肽序列进行密码子优化。将优化后的序列替换GII.4 VP1的突环区1对应的289-302位氨基酸后进行全合成，合成的融合基因5′端和3′端分别带有BamH I和EcoR I酶切位点。将合成的带有酶切位点的基因酶切后连接到已经预先酶切的pFast-Bac Dual载体的polyhedrin启动子下游。制备的质粒命名为pFBD-VP1/GI.3。用pFBD-VP1/GI.3转化DH10B感受态细胞，筛选阳性克隆，制备重组质粒。将制备的重组质粒转染Sf9细胞，5-7天后收获细胞培养上清，保存毒种。
2）目的蛋白表达检测
采用间接ELISA方法对目的蛋白表达与否进行鉴定。具体步骤为：用碳酸盐缓冲液（0.05 M， pH9.6)）将收获的细胞培养上清以1:10进行稀释后包被于96孔酶标板中，4℃孵育过夜或者37℃下孵育1小时，然后弃掉包被液，加入封闭液（0.01M PBS + 5% BSA +0.05% Tween-20）37℃下孵育1小时。弃掉封闭液加入1µg/mL的8D8单克隆抗体（特异性识别GI，GII和GIV型NoV的广谱单克隆抗体）[Zheng L, Wang W, Liu J, Chen X, Li S, WangQ, et al. Characterization of a Norovirus-specific monoclonal antibody thatexhibits wide spectrum binding activities. J Med Virol. 2018;90(4):671-6] 37℃下孵育1小时。洗板机上洗涤五次后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG多克隆抗体37℃下孵育30分钟。孵育结束后洗板机上洗涤五次，加入显色剂，显色十分钟后450nm下测定光密度值（optical density, OD）。纯化的GII.4 VLPs以0.2µg/mL进行包被作为阳性对照孔，没有包被目的蛋白的孔作为阴性对照。测定结果如图1所示。由图1可见，上清中存在目的蛋白。
3）蛋白表达、纯化和鉴定
为了获取大量蛋白，将收获的含有重组杆状病毒的上清感染摇瓶中培养的高密度Sf9细胞，感染5-7天后收获细胞。通过聚乙二醇6000（PEG 6000）沉淀蛋白或PEG 6000沉淀和氯化铯（celsium chloride, CsCl）密度梯度离心纯化目的蛋白。具体步骤如下：将收集的培养上清在4℃下以10,000×g离心30分钟去除细胞碎片，在上清中加入终浓度为7％（w/v）的PEG 6000和2％（w/v）的氯化钠，4℃摇床上孵育过夜。将上清4℃下10,000×g离心30分钟收集沉淀的蛋白，用PBS重悬。为了获得更纯的蛋白可以继续将重悬的蛋白与等体积的CsCl（1.6g /ml）混合，4℃下288,000×g离心18-24小时。利用注射器从离心管上方收集蛋白条带，PBS稀释到适当浓度后，4℃下141,000×g离心3小时去除CsCl。用0.22 µm滤膜滤过的PBS重悬沉淀，使用超微量蛋白浓度测定仪测定蛋白浓度，变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）测定纯化蛋白的完整性和纯度。SDS-PAGE分析结果如图2所示。由图2可以看出，在50-60 kD之间出现了目的分子量大小的两个条带，其中下方较小的目的条带为N端降解蛋白[Huo Y, Wan X, Wang Z, Meng S, Shen S. Production of Norovirus VLPs tosize homogeneity. Virus Res. 2015;204:1-5]。结果表明目的蛋白成功表达。
本实施例的以诺如病毒VP1蛋白为载体的嵌合蛋白自组装形成的病毒样颗粒（VLPs），由本实施例的以诺如病毒VP1蛋白为载体的嵌合蛋白自组装而成。
对本实施例的VLPs进行形态观察。将纯化的蛋白稀释到200-400 μg/mL后吸附于铜网，然后采用磷钨酸进行负染，负染后电子显微镜观察VLPs形态。具体步骤为：将纯化的稀释到合适浓度范围的蛋白滴、磷钨酸和超纯水分别加到干净的塑料薄膜上（50µl），用镊子取出铜网将涂有碳支持膜的一面向下覆盖到含有蛋白的液滴上，室温孵育5分钟。用镊子夹起铜网后用干净的滤纸轻轻吸净多余的水分。将铜网转移到磷钨酸液滴上室温孵育5分钟。然后将铜网转移到超纯水液滴上洗涤2-3次，每次用干净的滤纸轻轻吸净多余的水分。最后将铜网置于超净工作台中晾干后，电子显微镜下观察。结果如图3所示。由图3可见，GII.4-VP1/GI.3嵌合蛋白成功组装成了VLPs。
实施例2
本实施例的以诺如病毒VP1蛋白为载体的嵌合蛋白，是以GII.4型诺如病毒全长VP1蛋白为载体蛋白，将突环区1的289-302位氨基酸序列替换为GII.6（Genbank登录号：KU935739）突环区1的如SEQID：3所示的多肽序列而表达出的GII.4-VP1/GII.6嵌合蛋白。GII.4-VP1/GII.6嵌合蛋白编码序列全长为553个氨基酸。
本实施例的以诺如病毒VP1蛋白为载体的嵌合蛋白的制备方法，包括以下步骤：
1）基因合成、载体构建和重组杆状病毒制备
将来源于GII.6（Genbank登录号：KU935739）突环区1的如SEQID：3所示的编码序列替换GII.4 VP1的突环区1对应的289-302位氨基酸编码序列后进行全基因合成，合成的融合基因5′端和3′端分别带有BamHI和EcoR I酶切位点。将合成的带有酶切位点的基因酶切后连接到已经预先酶切的pFast-Bac Dual载体的polyhedrin启动子下游。制备的质粒命名为pFBD-VP1/GII.6。用pFBD-VP1/GII.6转化DH10B感受态细胞，筛选阳性克隆，制备重组质粒。将制备的重组质粒转染Sf9细胞，5-7天后收获细胞培养上清，保存毒种。
2）目的蛋白表达检测
采用间接ELISA方法对目的蛋白表达与否进行鉴定。方法同实施例1。检测结果如图4所示。由图4可见，上清中存在目的蛋白。
3）蛋白表达、纯化和鉴定
采用SDS-PAGE分析分析方法对蛋白表达进行鉴定，方法同实施例1。
SDS-PAGE分析结果如图5所示。由图5可以看出，在50-60 kD之间出现了目的分子量大小的两个条带，其中下方较小的目的条带为N端降解蛋白，结果表明目的蛋白成功表达。
本实施例的以诺如病毒VP1蛋白为载体的嵌合蛋白自组装形成的病毒样颗粒，由本实施例的以诺如病毒VP1蛋白为载体的嵌合蛋白自组装而成。
对本实施例的VLPs进行形态观察。
具体方法同实施例1。电子显微镜下观察VLPs形态。结果如图6所示。由图6可见，GII.4-VP1/GI.3嵌合蛋白成功组装成了VLPs。
实施例3
本实施例的以诺如病毒VP1蛋白为载体的嵌合蛋白，是以GII.4型诺如病毒全长VP1蛋白为载体蛋白，将突环区1的289-302位氨基酸序列替换为来源于EV71 VP1的如SEQID：4所示的中和表位SP70多肽序列[Liu Chia-Chyi., Chou Ai-Hsiang., Lien Shu-Pei., Lin Hsiao-Yu., Liu Shih-Jen., Chang Jui-Yuan., Guo Meng-Shin., ChowYen-Hung., Yang Wun-Syue., Chang Kate Hsuen-Wen., Sia Charles., Chong Pele.(2011). Identification and characterization of a cross-neutralization epitopeof Enterovirus 71. Vaccine, 29(26), 4362-72]而表达出的GII.4-VP1/EV71嵌合蛋白。GII.4-VP1/EV71嵌合蛋白编码序列全长为542个氨基酸。
本实施例的以诺如病毒VP1蛋白为载体的嵌合蛋白的制备方法，包括以下步骤：
1）基因合成、载体构建和重组杆状病毒制备
将来源于EV71 VP1的如SEQID：4所示的中和表位SP70多肽序列进行密码子优化，然后将优化后的序列替换GII.4 VP1的突环区1对应的289-302位氨基酸后进行全合成，合成的融合基因5′端和3′端分别带有BamH I和EcoR I酶切位点。将合成的带有酶切位点的基因酶切后连接到已经预先酶切的pFast-Bac Dual载体的polyhedrin启动子下游。制备的质粒命名为pFBD-VP1/EV71。用pFBD-VP1/EV71转化DH10B感受态细胞，筛选阳性克隆，制备重组质粒。将制备的重组质粒转染Sf9细胞，5-7天后收获细胞培养上清，保存毒种。
2）目的蛋白表达检测
采用间接ELISA方法对目的蛋白表达与否进行鉴定。方法同实施例1。检测结果如图7所示。由图7可见，上清中存在目的蛋白。
3）蛋白表达、纯化和鉴定
采用SDS-PAGE分析分析方法对蛋白表达进行鉴定，方法同实施例1。
SDS-PAGE分析结果如图8所示。由图8可以看出，在50-60 kD之间出现了目的分子量大小的单一条带，结果表明目的蛋白成功表达。
本实施例的以诺如病毒VP1蛋白为载体的嵌合蛋白自组装形成的病毒样颗粒，由本实施例的以诺如病毒VP1蛋白为载体的嵌合蛋白自组装而成。
对本实施例的VLPs进行形态观察。
具体方法同实施例1。电子显微镜下观察VLPs形态。结果如图9所示。由图9可见，GII.4-VP1/EV71嵌合蛋白成功组装成了VLPs。
实施例4
本实施例的以诺如病毒VP1蛋白为载体的嵌合蛋白，是以GII.4型诺如病毒全长VP1蛋白为载体蛋白，将突环区1的289-302位氨基酸序列替换为水痘-带状疱疹病毒（Varicella-zoster, VZV）糖蛋白E（glycoprotein E，gE）的如SEQID：5所示的中和表位多肽序列（SAQEDLGDDTGIHVIL）[Zhu Rui., Liu Jian., Chen Chunye., Ye Xiangzhong.,Xu Longfa., Wang Wei., Zhao Qinjian., Zhu Hua., Cheng Tong., Xia Ningshao.(2016). A highly conserved epitope-vaccine candidate against varicella-zostervirus induces neutralizing antibodies in mice. Vaccine, 34(13), 1589-1596]而表达出的GII.4-VP1/VZV嵌合蛋白。GII.4-VP1/VZV嵌合蛋白编码序列全长为541个氨基酸。
本实施例的以诺如病毒VP1蛋白为载体的嵌合蛋白的制备方法，包括以下步骤：
1）基因合成、载体构建和重组杆状病毒制备
将来源于水痘-带状疱疹病毒（Varicella-zoster, VZV）糖蛋白E（glycoproteinE，gE）的如SEQID：5所示的中和表位多肽序列进行密码子优化，然后将优化后的序列替换GII.4 VP1的突环区1对应的289-302位氨基酸后进行全合成，合成的融合基因5′端和3′端分别带有BamH I和EcoR I酶切位点。将合成的带有酶切位点的基因酶切后连接到已经预先酶切的pFast-Bac Dual载体的polyhedrin启动子下游。制备的质粒命名为pFBD-VP1/VZV。用pFBD-VP1/VZV转化DH10B感受态细胞，筛选阳性克隆，制备重组质粒。将制备的重组质粒转染Sf9细胞，5-7天后收获细胞培养上清，保存毒种。
2）目的蛋白表达检测
采用间接ELISA方法对目的蛋白表达与否进行鉴定。方法同实施例1。检测结果如图10所示。由图10可见，上清中存在目的蛋白。
3）蛋白表达、纯化和鉴定
采用SDS-PAGE分析分析方法对蛋白表达进行鉴定，方法同实施例1。
SDS-PAGE分析结果如图11所示。由图11可以看出在50-60 kD之间出现了目的分子量大小的条带，结果表明目的蛋白成功表达。
本实施例的以诺如病毒VP1蛋白为载体的嵌合蛋白自组装形成的病毒样颗粒，由本实施例的以诺如病毒VP1蛋白为载体的嵌合蛋白自组装而成。
对本实施例的VLPs进行形态观察。
具体方法同实施例1。电子显微镜下观察VLPs形态。结果如图12所示。由图12可见，GII.4-VP1/VZV嵌合蛋白成功组装成了VLPs。
对比例1
本对比例的以诺如病毒VP1蛋白为载体的嵌合蛋白，是以GII.4型诺如病毒全长VP1蛋白为载体蛋白，将突环区1的327-344位氨基酸序列替换为GII.3 VP1（Genbank登录号：KY767665）的如SEQID：6所示的受体结合区域序列而表达出的GII.4-VP1/GII.3嵌合蛋白。
本对比例的以诺如病毒VP1蛋白为载体的嵌合蛋白的制备方法，包括以下步骤：
1）基因合成、载体构建和重组杆状病毒制备
将来源于GII.3 VP1（Genbank登录号：KY767665）的如SEQID：6所示的受体结合区域序列进行密码子优化，然后将优化后的序列替换GII.4 VP1对应的327-344位氨基酸后进行全合成，合成的融合基因5′端和3′端分别带有BamH I和EcoR I酶切位点。将合成的带有酶切位点的基因酶切后连接到已经预先酶切的pFast-Bac Dual载体的polyhedrin启动子下游。制备的质粒命名为pFBD-VP1/IS2。用pFBD-VP1/IS2转化DH10B感受态细胞，筛选阳性克隆，制备重组质粒。将制备的重组质粒转染Sf9细胞，5-7天后收获细胞培养上清，保存毒种。
2）目的蛋白表达检测
采用间接ELISA方法对目的蛋白表达与否进行鉴定。方法同实施例1。检测结果如图13所示。由图13可见，上清中未检测到目的蛋白。
3）蛋白表达、纯化和鉴定
采用SDS-PAGE分析分析方法对蛋白表达进行鉴定，方法同实施例1。
SDS-PAGE分析结果如图14所示。由图14可以看出在50-60 kD之间未观察到目的分子量大小的条带。结果表明目的蛋白未表达。
对比例2
本对比例的以诺如病毒VP1蛋白为载体的嵌合蛋白，是以GII.17型诺如病毒全长VP1蛋白为载体蛋白，将突环区1的289-303位氨基酸序列替换为GII.13 VP1（Genbank登录号：KJ196276）中的如SEQID：8所示的序列而表达出的GII.17VP1/GII.13嵌合蛋白。GII.17VP1/GII.13嵌合蛋白编码序列全长为541个氨基酸。GII.17型诺如病毒全长VP1蛋白的序列如SEQID：7所示。
本对比例的以诺如病毒VP1蛋白为载体的嵌合蛋白的制备方法，包括以下步骤：
1）基因合成、载体构建和重组杆状病毒制备
将来源于GII.17 VP1（Genbank登录号：LC037415）的突环区1的289-303位氨基酸序列替换成来源于同区域的GII.13 VP1（Genbank登录号：KJ196276）的如SEQID：8所示的序列，然后根据昆虫细胞密码子使用频率进行密码子优化后进行全合成，合成的融合基因5′端和3′端分别带有BamH I和EcoR I酶切位点。将合成的带有酶切位点的基因酶切后连接到已经预先酶切的pFast-Bac Dual载体的polyhedrin启动子下游。制备的质粒命名为pFBD-GII.17VP1/GII.13。用pFBD-GII.17VP1/GII.13转化DH10B感受态细胞，筛选阳性克隆，制备重组质粒。将制备的重组质粒转染Sf9细胞，5-7天后收获细胞培养上清，保存毒种。
2）目的蛋白表达检测
采用间接ELISA方法对目的蛋白表达与否进行鉴定。方法同实施例1。检测结果如图15所示。由图15可见，上清中存在目的蛋白。
3）蛋白表达、纯化和鉴定
采用SDS-PAGE分析分析方法对蛋白表达进行鉴定，方法同实施例1。
SDS-PAGE分析结果如图16所示。由图16可以看出在50-60 kD之间出现了目的分子量大小的单一条带，结果表明目的蛋白成功表达。
本对比例的以诺如病毒VP1蛋白为载体的嵌合蛋白自组装形成的病毒样颗粒，由本实施例的以诺如病毒VP1蛋白为载体的嵌合蛋白自组装而成。
对本实施例的VLPs进行形态观察。
具体方法同实施例1。电子显微镜下观察VLPs形态。结果如图17所示。由图17可见，GII.17-VP1/GII.13嵌合蛋白未成功组装VLPs或者组装效率较低。
实施例2证明了本发明的载体蛋白突环区位点不仅可以容纳同基因组型（GII型）对应区域来源的序列，实施例1证明了本发明的载体蛋白突环区位点也可以容纳来源于不同基因组型（GI型）对应区域来源的序列，实施例3和4则证明本发明的载体蛋白突环区位点还可以容纳不同病毒来源的序列，表明该区域可以作为外源蛋白的通用插入位点，由于该位点位于突环区，表达的外源序列位于组装VLPs的外围，可以很好的被对应的靶分子或者免疫细胞识别，可以用来研究蛋白相互作用或者制备针对该位点的单克隆抗体的免疫原。同时突环区位点不同亚型之间变异较大，对该位点序列进行序列替换可以用来研究诺如病毒进化机制。对比例1可以看出即使相近亚型之间的对应序列也不是都可以进行替换，说明本发明选择的替换位点具有特异性。从对比例2可以看出，其它型别的VP1蛋白也可以作为骨架表达外源序列，但VLP组装效率较低。综上所述，我们找到了一种以GII.4 VP1蛋白为载体的外源蛋白表达方法，具有较高的科研和应用价值。
序列表
<110> 郑州市第六人民医院
<120> 一种以诺如病毒VP1蛋白为载体的嵌合蛋白及其制备方法及病毒样颗粒
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 540
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Lys Met Ala Ser Ser Asp Ala Asn Pro Ser Asp Gly Ser Ala Ala
1 5 10 15
Asn Leu Val Pro Glu Val Asn Asn Glu Val Met Ala Leu Glu Pro Val
20 25 30
Val Gly Ala Ala Ile Ala Ala Pro Val Ala Gly Gln Gln Asn Val Ile
35 40 45
Asp Pro Trp Ile Arg Asn Asn Phe Val Gln Ala Pro Gly Gly Glu Phe
50 55 60
Thr Val Ser Pro Arg Asn Ala Pro Gly Glu Ile Leu Trp Ser Ala Pro
65 70 75 80
Leu Gly Pro Asp Leu Asn Pro Tyr Leu Ser His Leu Ala Arg Met Tyr
85 90 95
Asn Gly Tyr Ala Gly Gly Phe Glu Val Gln Val Ile Leu Ala Gly Asn
100 105 110
Ala Phe Thr Ala Gly Lys Val Ile Phe Ala Ala Val Pro Pro Asn Phe
115 120 125
Pro Thr Glu Gly Leu Ser Pro Ser Gln Val Thr Met Phe Pro His Ile
130 135 140
Val Val Asp Val Arg Gln Leu Glu Pro Val Leu Ile Pro Leu Pro Asp
145 150 155 160
Val Arg Asn Asn Phe Tyr His Tyr Asn Gln Ser Asn Asp Pro Thr Ile
165 170 175
Lys Leu Ile Ala Met Leu Tyr Thr Pro Leu Arg Ala Asn Asn Ala Gly
180 185 190
Asp Asp Val Phe Thr Val Ser Cys Arg Val Leu Thr Arg Pro Ser Pro
195 200 205
Asp Phe Asp Phe Ile Phe Leu Val Pro Pro Thr Val Glu Ser Arg Thr
210 215 220
Lys Pro Phe Ser Val Pro Val Leu Thr Val Glu Glu Met Thr Asn Ser
225 230 235 240
Arg Phe Pro Ile Pro Leu Glu Lys Leu Phe Thr Gly Pro Ser Ser Ala
245 250 255
Phe Val Val Gln Pro Gln Asn Gly Arg Cys Thr Thr Asp Gly Val Leu
260 265 270
Leu Gly Thr Thr Gln Leu Ser Pro Val Asn Ile Cys Thr Phe Arg Gly
275 280 285
Asp Val Thr His Ile Thr Gly Ser Arg Asn Tyr Thr Met Asn Leu Ala
290 295 300
Ser Gln Asn Trp Asn Asn Tyr Asp Pro Thr Glu Glu Ile Pro Ala Pro
305 310 315 320
Leu Gly Ala Pro Asp Phe Val Gly Lys Ile Gln Gly Val Leu Thr Gln
325 330 335
Thr Thr Arg Thr Asp Gly Ser Thr Arg Gly His Lys Ala Thr Val Tyr
340 345 350
Thr Gly Ser Ala Asp Phe Ala Pro Lys Leu Gly Arg Val Gln Phe Glu
355 360 365
Thr Asp Thr Asp His Asp Phe Glu Val Asn Gln Asn Thr Lys Phe Thr
370 375 380
Pro Val Gly Val Ile Gln Asp Gly Gly Thr Thr His Arg Asn Glu Pro
385 390 395 400
Gln Gln Trp Val Leu Pro Ser Tyr Ser Gly Arg Asn Thr Pro Asn Val
405 410 415
His Leu Ala Pro Ala Val Ala Pro Thr Phe Pro Gly Glu Gln Leu Leu
420 425 430
Phe Phe Arg Ser Thr Met Pro Gly Cys Ser Gly Tyr Pro Asn Met Asp
435 440 445
Leu Asp Cys Leu Leu Pro Gln Glu Trp Val Gln Tyr Phe Tyr Gln Glu
450 455 460
Ala Ala Pro Ala Gln Ser Asp Val Ala Leu Leu Arg Phe Val Asn Pro
465 470 475 480
Asp Thr Gly Arg Val Leu Phe Glu Cys Lys Leu His Lys Ser Gly Tyr
485 490 495
Val Thr Val Ala His Asn Gly Gln His Asp Leu Val Ile Pro Pro Asn
500 505 510
Gly Tyr Phe Arg Phe Asp Ser Trp Val Asn Gln Phe Tyr Thr Leu Ala
515 520 525
Pro Met Gly Asn Gly Thr Gly Arg Arg Arg Ala Leu
530 535 540
<210> 2
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Thr Val Tyr His Ala Thr Gly Gly Gln Gly Leu Asn
1 5 10
<210> 3
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Thr Leu Ile Ser Gln Thr Ser Arg Ser Ala Asp Ser Thr Asp Ser Ala
1 5 10 15
Pro Arg Ala Arg Asn His Pro Leu His Val Gln
20 25
<210> 4
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Tyr Pro Thr Phe Gly Glu His Lys Gln Glu Lys Asp Leu Glu Tyr Cys
1 5 10 15
<210> 5
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Ser Ala Gln Glu Asp Leu Gly Asp Asp Thr Gly Ile His Val Ile Leu
1 5 10 15
<210> 6
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Arg Gly Lys Val Phe Gly Val Ala Ser Gln Arg Asn Pro Asp Ala Thr
1 5 10 15
Thr
<210> 7
<211> 540
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Met Lys Met Ala Ser Asn Asp Ala Ala Pro Ser Asn Asp Gly Ala Ala
1 5 10 15
Gly Leu Val Pro Glu Gly Asn Asn Glu Thr Leu Pro Leu Glu Pro Val
20 25 30
Ala Gly Ala Ala Ile Ala Ala Pro Val Thr Gly Gln Asn Asn Ile Ile
35 40 45
Asp Pro Trp Ile Arg Thr Asn Phe Val Gln Ala Pro Asn Gly Glu Phe
50 55 60
Thr Val Ser Pro Arg Asn Ser Pro Gly Glu Ile Leu Leu Asn Leu Glu
65 70 75 80
Leu Gly Pro Asp Leu Asn Pro Tyr Leu Ala His Leu Ser Arg Met Tyr
85 90 95
Asn Gly Tyr Ala Gly Gly Val Glu Val Gln Val Leu Leu Ala Gly Asn
100 105 110
Ala Phe Thr Ala Gly Lys Ile Leu Phe Ala Ala Val Pro Pro Asn Phe
115 120 125
Pro Val Glu Phe Leu Ser Pro Ala Gln Ile Thr Met Leu Pro His Leu
130 135 140
Ile Val Asp Val Arg Thr Leu Glu Pro Ile Met Ile Pro Leu Pro Asp
145 150 155 160
Val Arg Asn Thr Phe Phe His Tyr Ser Asn Gln Pro Asn Ser Arg Met
165 170 175
Arg Leu Val Ala Met Leu Tyr Thr Pro Leu Arg Ser Asn Gly Ser Gly
180 185 190
Asp Asp Val Phe Thr Val Ser Cys Arg Val Leu Thr Arg Pro Thr Pro
195 200 205
Asp Phe Glu Phe Thr Tyr Leu Val Pro Pro Ser Val Glu Ser Lys Thr
210 215 220
Lys Pro Phe Ser Leu Pro Ile Leu Thr Leu Ser Glu Leu Thr Asn Ser
225 230 235 240
Arg Phe Pro Val Pro Ile Asp Ser Leu Phe Thr Ala Gln Asn Asn Val
245 250 255
Leu Gln Val Gln Cys Gln Asn Gly Arg Cys Thr Leu Asp Gly Glu Leu
260 265 270
Gln Gly Thr Thr Gln Leu Leu Pro Thr Gly Ile Cys Ala Phe Arg Gly
275 280 285
Arg Val Thr Ala Gln Ile Asn Gln Arg Asp Arg Trp His Met Gln Leu
290 295 300
Gln Asn Leu Asn Gly Thr Thr Tyr Asp Pro Thr Asp Asp Val Pro Ala
305 310 315 320
Pro Leu Gly Thr Pro Asp Phe Lys Gly Val Val Phe Gly Met Val Ser
325 330 335
Gln Arg Asn Val Gly Asn Asp Ala Pro Gly Ser Thr Arg Ala Gln Gln
340 345 350
Ala Trp Val Ser Thr Tyr Ser Pro Gln Phe Val Pro Lys Leu Gly Ser
355 360 365
Val Asn Leu Arg Ile Ser Asp Asn Asp Asp Phe Gln Phe Gln Pro Thr
370 375 380
Lys Phe Thr Pro Val Gly Val Asn Asp Asp Asp Asp Gly His Pro Phe
385 390 395 400
Arg Gln Trp Glu Leu Pro Asn Tyr Ser Gly Glu Leu Thr Leu Asn Met
405 410 415
Asn Leu Ala Pro Pro Val Ala Pro Asn Phe Pro Gly Glu Gln Leu Leu
420 425 430
Phe Phe Arg Ser Phe Val Pro Cys Ser Gly Gly Tyr Asn Gln Gly Ile
435 440 445
Ile Asp Cys Leu Ile Pro Gln Glu Trp Ile Gln His Phe Tyr Gln Glu
450 455 460
Ser Ala Pro Ser Gln Ser Asp Val Ala Leu Ile Arg Tyr Val Asn Pro
465 470 475 480
Asp Thr Gly Arg Thr Leu Phe Glu Ala Lys Leu His Arg Ser Gly Tyr
485 490 495
Ile Thr Val Ala His Ser Gly Asp Tyr Pro Leu Val Val Pro Ala Asn
500 505 510
Gly His Phe Arg Phe Asp Ser Trp Val Asn Gln Phe Tyr Ser Leu Ala
515 520 525
Pro Met Gly Thr Gly Asn Gly Arg Arg Arg Ala Gln
530 535 540
<210> 8
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Arg Thr Val Ala Asn Asn Gly Asp Asn Trp Asp Gln Asn Leu Leu Gln
1 5 10 15

Claims (10)

1.一种以诺如病毒VP1蛋白为载体的嵌合蛋白，其特征在于，是以诺如病毒全长VP1蛋白为载体蛋白，将突环区1的部分氨基酸序列替换为其他氨基酸序列而表达出的嵌合蛋白。
2.根据权利要求1所述的以诺如病毒VP1蛋白为载体的嵌合蛋白，其特征在于，被替换的所述氨基酸序列为位于突环区1的289-302位的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的以诺如病毒VP1蛋白为载体的嵌合蛋白，其特征在于，所述载体蛋白为GII.4型诺如病毒全长VP1蛋白。
4.根据权利要求1或2所述的以诺如病毒VP1蛋白为载体的嵌合蛋白，其特征在于，用于替换的所述氨基酸序列为不同于载体蛋白的诺如病毒VP1蛋白的氨基酸序列或其它不同病毒来源序列。
5.根据权利要求4所述的以诺如病毒VP1蛋白为载体的嵌合蛋白，其特征在于，不同于所述载体蛋白的诺如病毒VP1蛋白序列为GI.3型诺如病毒 VP1蛋白上的序列或GII.6型诺如病毒 VP1蛋白上的序列。
6.根据权利要求4所述的以诺如病毒VP1蛋白为载体的嵌合蛋白，其特征在于，不同病毒来源序列为来源于EV71 VP1的中和表位SP70多肽序列或来源于水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E的中和表位多肽序列。
7.如权利要求1所述的以诺如病毒VP1蛋白为载体的嵌合蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）将所述载体蛋白的突环区1的部分氨基酸序列对应的基因替换为其他氨基酸序列对应的基因，进行基因全合成；
2）将合成的基因连接到pFast-Bac Dual载体上制备质粒，质粒转化DH10B感受态细胞，筛选阳性克隆，制备重组质粒，将制备的重组质粒转染Sf9细胞，培养后纯化得到所述嵌合蛋白。
8.根据权利要求7所述的以诺如病毒VP1蛋白为载体的嵌合蛋白的制备方法，其特征在于，所述纯化是通过聚乙二醇沉淀和氯化铯密度梯度离心纯化。
9.根据权利要求7所述的以诺如病毒VP1蛋白为载体的嵌合蛋白的制备方法，其特征在于，被替换的所述氨基酸序列为位于突环区1的289-302位的氨基酸序列。
10.如权利要求1所述的以诺如病毒VP1蛋白为载体的嵌合蛋白自组装形成的病毒样颗粒。
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