CN109627295B

CN109627295B - 一种通用型狂犬病相关病毒g蛋白胞外段的制备方法

Info

Publication number: CN109627295B
Application number: CN201811635497.9A
Authority: CN
Inventors: 逯光文; 杨凡力; 叶飞; 林升; 杨婧
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Chengdu weisk biomedical Co.,Ltd.
Priority date: 2018-12-29
Filing date: 2018-12-29
Publication date: 2020-08-04
Anticipated expiration: 2038-12-29
Also published as: CN109627295A

Abstract

本发明公开了一种通用型狂犬病相关病毒G蛋白胞外段的制备方法，属于蛋白质工程和生物制品技术领域。基于本发明的方法所制备的蛋白具有可溶、纯度高和溶液中性质均一等优点，纯化后纯度可达99％以上，突破了现有的狂犬病相关病毒G蛋白一直未能成功在体外重组表达这一瓶颈问题，在疫苗制备和中和抗体筛选等方面均具有重要的潜在应用价值。

Description

一种通用型狂犬病相关病毒G蛋白胞外段的制备方法

技术领域

本发明涉及一种通用型狂犬病相关病毒G蛋白胞外段的制备方法，属于蛋白质工程和生物制品技术领域。

背景技术

狂犬病毒和狂犬病相关病毒(lyssavirus)是一类重要的人兽共患致病原，属于弹状病毒科(Rhabdoviridae)、狂犬病毒属(Lyssavirus)，其绝大多数病毒成员均能感染人类，引起狂犬病(rabies)或狂犬病样疾病(rabies-like disease)。随着基因组测序手段的发展和进步，越来越多的狂犬病相关病毒被相继发现和报道。按照国际病毒分类委员会(ICTV)在2018年对单股负链RNA病毒目(Mononegavirales)分类系统的最新数据，狂犬病毒属目前共包括16个病毒成员，分别是：RABV(rabies virus),KHUV(Khujand lyssavirus),BBLV(Bokeloh bat lyssavirus),ARAV(Aravan lyssavirus),EBLV-1(European bat1lyssavirus),EBLV-2(European bat 2lyssavirus),IRKV(Irkut lyssavirus),DUVV(Duvenhage lyssavirus),ABLV(Australian bat lyssavirus),GBLV(Gannoruwa batlyssavirus),LBV(Lagos bat lyssavirus),SHIBV(Shimoni bat lyssavirus),MOKV(Mokola lyssavirus),WCBV(West Caucasian bat lyssavirus),IKOV(Ikomalyssavirus),和LLEBV(Lleida bat lyssavirus)(见参考文献1)。我们通常所提及的狂犬病毒，又称为传统狂犬病毒，即RABV，是目前造成绝大多数人类狂犬病的致病原；而狂犬病毒属中的其他15种病毒可被统称为狂犬病相关病毒，亦能造成包括人类在内的众多哺乳动物发病，且每大概2-3年既有一种新的狂犬病相关病毒新成员被发现。

人们对狂犬病的记载和认识由来已久，然而时至今日，狂犬病仍然严重威胁着人们的生命财产安全。据世界卫生组织统计，全球每年有5-6万人死于狂犬病，目前临床上仍没有任何有效的治疗方法和手段，人一旦发病，几乎100％死亡，病死率是所有传染病中最高的。目前人类对抗狂犬病的唯一途径仍然是通过疫苗接种来预防病毒感染。随着世界卫生组织提出在全世界范围内消除狂犬病的目标以及狂犬疫苗的广泛应用，由RABV所引起的传统狂犬病发病率已经在多个国家和地区，尤其是发达国家和地区(如北美、欧洲等)，得到了较好的控制。但这里需要指出的是，目前已知的所有狂犬疫苗均是靶向RABV的，而随着RABV所引起的传统狂犬病发病率的下降，由其他狂犬病相关病毒所引起的人类疾病的报道则呈现逐年上升的趋势，而针对RABV之外的其他狂犬病相关病毒，目前仍没有任何可用于疾病预防的疫苗产品。

狂犬病毒和狂犬病相关病毒均为有囊膜包被的RNA病毒，病毒糖蛋白(glycoprotein,G)是病毒囊膜中的唯一蛋白组分，是介导病毒对宿主细胞表面受体识别的唯一分子，也是行使膜融合功能介导病毒侵入的唯一病毒组分，因此，在病毒致病中发挥决定性作用。同时作为唯一暴露于病毒表面的病毒蛋白，G蛋白还是病毒中和抗体的唯一靶点和疫苗的最重要抗原组分。因此，可溶且溶液中性质均一的G蛋白即可被用于疫苗制备，也可被用于中和抗体筛选等，具有重要的潜在应用价值。

然而，针对上述15种狂犬病相关病毒，鲜有其G蛋白的重组表达研究，尤其是目前仍未有任何有效的、可溶且性质均一的G蛋白制备方法被报道。需要指出的是，在狂犬病相关病毒中，其G蛋白按其氨基酸序列组成，由N-端到C-端分别包括信号肽(signalpeptide)、胞外段(ecto-domain)、跨膜区(transmembrane domain)和胞内段(cytoplasmicdomain)共四个功能区段，其中，胞外段是真正暴露于病毒粒子表面的G蛋白区段，是行使受体识别和膜融合的真正功能区段，也是疫苗制备中真正有效的抗原区段以及中和抗体的真正靶点。因此，如何通过基因工程以及蛋白质工程手段，获得一种通用型的狂犬病相关病毒G蛋白胞外段的表达构建策略及制备方法，并得到可溶且性质均一的蛋白，是开发并制备狂犬病相关病毒疫苗等急需解决的问题。

发明内容

本发明中狂犬病相关病毒G蛋白胞外段氨基酸的位点计算方式均以G蛋白去除信号肽后的第一个氨基酸计数为第1位。

本发明的第一个目的是提供一种制备可溶且均一性好的狂犬病相关病毒G蛋白胞外段的方法，所述方法是用GGSGG连接肽分别替换狂犬病相关病毒G蛋白胞外段中的两个融合环区域的多个氨基酸。

在本发明的一种实施方式中，所述狂犬病相关病毒包括KHUV(Khujandlyssavirus),BBLV(Bokeloh bat lyssavirus),ARAV(Aravan lyssavirus),EBLV-1(European bat 1lyssavirus),EBLV-2(European bat 2lyssavirus),IRKV(Irkutlyssavirus),LBV(Lagos bat lyssavirus),SHIBV(Shimoni bat lyssavirus),MOKV(Mokola lyssavirus),WCBV(West Caucasian bat lyssavirus),IKOV(Ikomalyssavirus),DUVV(Duvenhage lyssavirus),ABLV(Australian bat lyssavirus),GBLV(Gannoruwa bat lyssavirus)和LLEBV(Lleida bat lyssavirus)。

在本发明的一种实施方式中，所述G蛋白胞外段为KHUV病毒G蛋白的1-438位氨基酸，BBLV病毒G蛋白的1-438位氨基酸，ARAV病毒G蛋白的1-438位氨基酸，EBLV-1病毒G蛋白的1-438位氨基酸，EBLV-2病毒G蛋白的1-438位氨基酸，IRKV病毒G蛋白的1-439位氨基酸，LBV病毒G蛋白的1-438位氨基酸，SHIBV病毒G蛋白的1-438位氨基酸，MOKV病毒G蛋白的1-436位氨基酸，WCBV病毒G蛋白的1-441位氨基酸，IKOV病毒G蛋白的1-440位氨基酸，DUVV病毒G蛋白的1-438位氨基酸，ABLV病毒G蛋白的1-438位氨基酸，GBLV病毒G蛋白的1-439位氨基酸，LLEBV病毒G蛋白的1-441位氨基酸；所述G蛋白胞外段中的两个融合环区域为KHUV病毒G蛋白胞外段的73-79位氨基酸所在区域和117-125位氨基酸所在区域，BBLV病毒G蛋白胞外段的73-79位氨基酸所在区域和117-125位氨基酸所在区域，ARAV病毒G蛋白胞外段的73-79位氨基酸所在区域和117-125位氨基酸所在区域，EBLV-1病毒G蛋白胞外段的73-79位氨基酸所在区域和117-125位氨基酸所在区域，EBLV-2病毒G蛋白胞外段的73-79位氨基酸所在区域和117-125位氨基酸所在区域，IRKV病毒G蛋白胞外段的73-79位氨基酸所在区域和117-125位氨基酸所在区域，LBV病毒G蛋白胞外段的75-81位氨基酸所在区域和119-127位氨基酸所在区域，SHIBV病毒G蛋白胞外段的73-79位氨基酸所在区域和117-125位氨基酸所在区域，MOKV病毒G蛋白胞外段的73-79位氨基酸所在区域和117-125位氨基酸所在区域，WCBV病毒G蛋白胞外段的75-81位氨基酸所在区域和119-127位氨基酸所在区域，IKOV病毒G蛋白胞外段的74-80位氨基酸所在区域和118-126位氨基酸所在区域，DUVV病毒G蛋白胞外段的73-79位氨基酸所在区域和117-125位氨基酸所在区域，ABLV病毒G蛋白胞外段的73-79位氨基酸所在区域和117-125位氨基酸所在区域，GBLV病毒G蛋白胞外段的73-79位氨基酸所在区域和117-125位氨基酸所在区域，LLEBV病毒G蛋白胞外段的75-81位氨基酸所在区域和119-127位氨基酸所在区域。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是将KHUV病毒的G蛋白胞外段的第73～79位和第117～125位氨基酸所在区域分别替换为GGSGG连接肽。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是将BBLV病毒的G蛋白胞外段的第73～79位和第117～125位氨基酸所在区域分别替换为GGSGG连接肽。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是将ARAV病毒的G蛋白胞外段的第73～79位和第117～125位氨基酸所在区域分别替换为GGSGG连接肽。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是将EBLV-1病毒的G蛋白胞外段的第73～79位和第117～125位氨基酸所在区域分别替换为GGSGG连接肽。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是将EBLV-2病毒的G蛋白胞外段的第73～79位和第117～125位氨基酸所在区域分别替换为GGSGG连接肽。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是将IRKV病毒的G蛋白胞外段的第73～79位和第117～125位氨基酸所在区域分别替换为GGSGG连接肽。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是将LBV病毒的G蛋白胞外段的第75～81位和第119～127位氨基酸所在区域分别替换为GGSGG连接肽。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是将SHIBV病毒的G蛋白胞外段的第73～79位和第117～125位氨基酸所在区域分别替换为GGSGG连接肽。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是将MOKV病毒的G蛋白胞外段的第73～79位和第117～125位氨基酸所在区域分别替换为GGSGG连接肽。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是将WCBV病毒的G蛋白胞外段的第75～81位和第119～127位氨基酸所在区域分别替换为GGSGG连接肽。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是将IKOV病毒的G蛋白胞外段的第74～80位和第118～126位氨基酸所在区域分别替换为GGSGG连接肽。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是将DUVV病毒的G蛋白胞外段的第73～79位和第117～125位氨基酸所在区域分别替换为GGSGG连接肽。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是将ABLV病毒的G蛋白胞外段的第73～79位和第117～125位氨基酸所在区域分别替换为GGSGG连接肽。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是将GBLV病毒的G蛋白胞外段的第73～79位和第117～125位氨基酸所在区域分别替换为GGSGG连接肽。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是将LLEBV病毒的G蛋白胞外段的第75～81位和第119～127位氨基酸所在区域分别替换为GGSGG连接肽。

在本发明的一种实施方式中，所述方法将经GGSGG连接肽取代后的狂犬病相关病毒G蛋白胞外段在细胞中表达。

在本发明的一种实施方式中，所述方法在GGSGG连接肽取代后的狂犬病相关病毒G蛋白胞外段的N-端引入GP67信号肽。

在本发明的一种实施方式中，所述方法在GGSGG连接肽取代后的狂犬病相关病毒G蛋白胞外段的C-端引入组氨酸标签。

在本发明的一种实施方式中，所述组氨酸标签为6×His标签。

在本发明的一种实施方式中，所述表达是在昆虫细胞中表达。

在本发明的一种实施方式中，所述昆虫细胞包括但不限于Sf9和Hi5细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述方法对细胞表达的蛋白进行纯化。

在本发明的一种实施方式中，所述方法对分泌表达到细胞培养基上清中的蛋白进行亲和层析粗纯化。

在本发明的一种实施方式中，所述粗纯化的蛋白进行分子筛层析精细纯化和分析，证明所述纯化的蛋白在溶液中性质均一。

本发明的第二个目的是提供应用所述方法制备获得的狂犬病相关病毒G蛋白胞外段。

本发明的第三个目的是提供含有所述狂犬病相关病毒G蛋白胞外段的组合物。

在本发明的一种实施方式中，所述狂犬病相关病毒G蛋白胞外段或其组合物为疫苗候选组分。

在本发明的一种实施方式中，所述狂犬病相关病毒G蛋白胞外段或其组合物为诊断试剂盒抗原组分。

在本发明的一种实施方式中，所述狂犬病相关病毒G蛋白胞外段或其组合物为疫苗抗原含量标定的标准品。

本发明还要求保护所述狂犬病相关病毒G蛋白胞外段在制备包括疫苗候选组分、诊断试剂盒抗原组分、疫苗抗原含量标定的标准品在内的产品方面的应用。

有益效果：本发明利用基因工程手段，针对G蛋白的胞外段(G-ecto)进行了重组改造，将蛋白胞外段中的两个融合环区域分别替换为由5个氨基酸(GGSGG)组成的连接肽，同时在该序列的N-端引入GP67信号肽序列(用于蛋白的胞外分泌表达)，在该序列的C-端引入6xHis标签(用于重组表达蛋白的纯化)，并进一步利用杆状病毒昆虫细胞蛋白表达系统分泌表达该蛋白，利用亲和层析和分子排阻层析进行纯化。基于本发明的方法所制备的蛋白具有可溶、纯度高和溶液中性质均一等优点，纯化后纯度可达99％以上，突破了现有的狂犬病相关病毒G蛋白一直未能成功在体外重组表达这一瓶颈问题，在疫苗制备和中和抗体筛选等方面均具有重要的潜在应用价值。

附图说明

图1：KHUV-G-ecto蛋白的表达与纯化。a图是KHUV-G-ecto在昆虫细胞上清分泌表达的western blot鉴定图；b图是KHUV-G-ecto的分子排阻层析与SDS-PAGE鉴定图。SDS-PAGE图中左侧泳道为KHUV-G-ecto蛋白，右侧泳道为标准分子量marker。

图2：BBLV-G-ecto蛋白的表达与纯化。a图是BBLV-G-ecto在昆虫细胞上清分泌表达的western blot鉴定图；b图是BBLV-G-ecto的分子排阻层析与SDS-PAGE鉴定图。SDS-PAGE图中左侧泳道为BBLV-G-ecto，右侧泳道为标准分子量marker。

图3：ARAV-G-ecto蛋白的表达与纯化。a图是ARAV-G-ecto在昆虫细胞上清分泌表达的western blot鉴定图；b图是ARAV-G-ecto的分子排阻层析与SDS-PAGE鉴定图。SDS-PAGE图中左侧泳道为ARAV-G-ecto，右侧泳道为标准分子量marker。

图4：EBLV-1-G-ecto蛋白的表达与纯化。a图是EBLV-1-G-ecto在昆虫细胞上清分泌表达的western blot鉴定图；b图是EBLV-1-G-ecto的分子排阻层析与SDS-PAGE鉴定图。SDS-PAGE图中左侧泳道为EBLV-1-G-ecto，右侧泳道为标准分子量marker。其中目的蛋白峰前面的为亲和层析粗纯时未能去除的杂蛋白峰。

图5：EBLV-2-G-ecto蛋白的表达与纯化。a图是EBLV-2-G-ecto在昆虫细胞上清分泌表达的western blot鉴定图；b图是EBLV-2-G-ecto的分子排阻层析与SDS-PAGE鉴定图。SDS-PAGE图中左侧泳道为EBLV-2-G-ecto，右侧泳道为标准分子量marker。

图6：IRKV-G-ecto蛋白的表达与纯化。a图是IRKV-G-ecto在昆虫细胞上清分泌表达的western blot鉴定图；b图是IRKV-G-ecto的分子排阻层析与SDS-PAGE鉴定图。SDS-PAGE图中左侧泳道为IRKV-G-ecto，右侧泳道为标准分子量marker。

图7：LBV-G-ecto蛋白的表达与纯化。a图是LBV-G-ecto在昆虫细胞上清分泌表达的western blot鉴定图；b图是LBV-G-ecto的分子排阻层析与SDS-PAGE鉴定图。SDS-PAGE图中左侧泳道为LBV-G-ecto，右侧泳道为标准分子量marker。

图8：SHIBV-G-ecto蛋白的表达与纯化。a图是SHIBV-G-ecto在昆虫细胞上清分泌表达的western blot鉴定图；b图是SHIBV-G-ecto的分子排阻层析与SDS-PAGE鉴定图。SDS-PAGE图中左侧泳道为SHIBV-G-ecto，右侧泳道为标准分子量marker。

图9：MOKV-G-ecto蛋白的表达与纯化。a图是MOKV-G-ecto在昆虫细胞上清分泌表达的western blot鉴定图；b图是MOKV-G-ecto的分子排阻层析与SDS-PAGE鉴定图。SDS-PAGE图中左侧泳道为MOKV-G-ecto，右侧泳道为标准分子量marker。

图10：WCBV-G-ecto蛋白的表达与纯化。a图是WCBV-G-ecto在昆虫细胞上清分泌表达的western blot鉴定图；b图是WCBV-G-ecto的分子排阻层析与SDS-PAGE鉴定图。SDS-PAGE图中左侧泳道为WCBV-G-ecto，右侧泳道为标准分子量marker。因上样量太多，峰高近1200mAU，几乎达到层析柱能承载的蛋白量的极限，因此，峰型有拖尾，对称度稍差。

图11：IKOV-G-ecto蛋白的表达与纯化。a图是IKOV-G-ecto在昆虫细胞上清分泌表达的western blot鉴定图；b图是IKOV-G-ecto的分子排阻层析与SDS-PAGE鉴定图。SDS-PAGE图中左侧泳道为IKOV-G-ecto，右侧泳道为标准分子量marker。其中，目的蛋白峰前面的“肩膀”为亲和层析粗纯时未能去除的杂蛋白的峰。

具体实施方式

在不做特别说明的情况下，本申请中狂犬病相关病毒G蛋白胞外段氨基酸的位点计算方式均以G蛋白去除信号肽后的第一个氨基酸计数为第1位。

在不做特别说明的情况下，对本申请出现的技术术语按如下方式理解：

信号肽(signal peptide)：G蛋白中位于蛋白质N-端的一小段序列，在蛋白翻译过程中，负责将新生蛋白多肽引导入内质网中，由此实现该蛋白的分泌表达。信号肽随后会被宿主的信号肽酶切除，因此，在成熟蛋白中，并不存在信号肽。

胞外段(ecto-domain，G-ecto)：G蛋白中最主要的功能区，位于病毒囊膜外，约占成熟蛋白85％的分子质量。是病毒识别受体和介导膜融合的真正功能区段，也是疫苗制备中真正有效的抗原区段以及中和抗体的真正靶点。在本发明中，我们靶向15种狂犬病相关病毒G蛋白的研究中，其G蛋白胞外段的氨基酸数目分别为：KHUV-G-ecto，1-438位氨基酸；BBLV-G-ecto，1-438位氨基酸；ARAV-G-ecto，1-438位氨基酸；EBLV-1-G-ecto，1-438位氨基酸；EBLV-2-G-ecto，1-438位氨基酸；IRKV-G-ecto，1-439位氨基酸；LBV-G-ecto，1-438位氨基酸；SHIBV-G-ecto，1-438位氨基酸；MOKV-G-ecto，1-436位氨基酸；WCBV-G-ecto，1-441位氨基酸；IKOV-G-ecto，1-440位氨基酸；DUVV-G-ecto，1-438位氨基酸；ABLV-G-ecto，1-438位氨基酸；GBLV-G-ecto，1-439位氨基酸；LLEBV-G-ecto，1-441位氨基酸。

跨膜区(transmembrane domain)：G蛋白中位于胞外段之后的一小段序列，是锚定糖蛋白到病毒囊膜中的关键区域。

胞内段(cytoplasmic domain)：G蛋白中位于蛋白质C-端的一段氨基酸序列，在子代病毒粒子的装配过程中发挥重要作用。

融合环(fusion loop，FL)：G蛋白胞外段中的两段具有一定疏水性质的区域，在病毒侵入过程中，融合环可插入到宿主细胞膜中，由此在病毒囊膜与宿主细胞膜的膜融合过程中发挥作用。因其具有较强的疏水性质，因此常常导致重组蛋白在溶液中发生聚集而影响蛋白在溶液中的均一性。在G蛋白中，其两个融合环(fusion loop 1and 2，FL1和FL2)均较小，约17-19个氨基酸左右，分别位于G蛋白胞外段的约67-83以及约110-128位氨基酸区域内；因其在整个G蛋白胞外段中所占比例很小(<5％)，因此其取代通常不会影响整个G蛋白胞外段的折叠及其抗原性等。在本发明中，我们靶向15种狂犬病相关病毒G蛋白的研究中，为得到可溶且性质均一的重组G蛋白胞外段，我们同时针对两个融合环区域内的氨基酸(KHUV-G-ecto，73-79位氨基酸和117-125位氨基酸；BBLV-G-ecto，73-79位氨基酸和117-125位氨基酸；ARAV-G-ecto，73-79位氨基酸和117-125位氨基酸；EBLV-1-G-ecto，73-79位氨基酸和117-125位氨基酸；EBLV-2-G-ecto，73-79位氨基酸和117-125位氨基酸；IRKV-G-ecto，73-79位氨基酸和117-125位氨基酸；LBV-G-ecto，75-81位氨基酸和119-127位氨基酸；SHIBV-G-ecto，73-79位氨基酸和117-125位氨基酸；MOKV-G-ecto，73-79位氨基酸和117-125位氨基酸；WCBV-G-ecto，75-81位氨基酸和119-127位氨基酸；IKOV-G-ecto，74-80位氨基酸和118-126位氨基酸；DUVV-G-ecto，73-79位氨基酸和117-125位氨基酸；ABLV-G-ecto，73-79位氨基酸和117-125位氨基酸；GBLV-G-ecto，73-79位氨基酸和117-125位氨基酸；LLEBV-G-ecto，75-81位氨基酸和119-127位氨基酸)进行取代，将其替换为柔性且具有一定亲水性的连接肽。

连接肽：我们将一段柔性且具有一定亲水性的氨基酸序列称为连接肽，依据其连接的两个氨基酸之间的距离长短，连接肽长度通常可以为3-30个氨基酸，通常为多G(甘氨酸)和/或多S(丝氨酸)的组合。在本发明中，我们使用由5个氨基酸组成的连接肽(GGSGG)取代G蛋白胞外段中的两个融合环区域。

以下为具体实施方式中涉及的G蛋白信息：

Khujand lyssavirus(KHUV)：GenBank:AAP86779.1；

Bokeloh bat lyssavirus(BBLV)：GenBank:AEL79468.1；

Aravan lyssavirus(ARAV)：GenBank:AAP86775.1；

European bat 1 lyssavirus(EBLV-1)：GenBank:ABZ81180.1；

European bat 2 lyssavirus(EBLV-2)：GenBank:ABO65251.1；

Irkut lyssavirus(IRKV)：GenBank:AAR03480.1；

Lagos bat lyssavirus(LBV)：GenBank:ABZ81170.1；

Shimoni bat lyssavirus(SHIBV)：GenBank:ADD84510.1；

Mokola lyssavirus(MOKV)：GenBank:AAB26292.1；

West Caucasian bat lyssavirus(WCBV)：GenBank:AAR03484.1；

Ikoma lyssavirus(IKOV)：GenBank:AFQ62097.1；

Duvenhage lyssavirus(DUVV)：GenBank:ABZ81215.1；

Australian bat lyssavirus(ABLV)：GenBank:AAN05309.1；

Gannoruwa bat lyssavirus(GBLV)：GenBank:APD77637.1；

Lleida bat lyssavirus(LLEBV)：GenBank:AOZ21306.1。

实施例1狂犬病相关病毒G蛋白胞外段的表达克隆构建、重组表达及纯化

(1)序列合成及表达载体构建鉴于G蛋白胞外段是真正的功能区段，因此我们针对其胞外段，将其中两段融合环区域的氨基酸替换为GGSGG的柔性连接肽，在蛋白的C-端引入6xHis标签以用于重组蛋白的纯化，由此获得改造后的重组G蛋白胞外段表达构建，并通过全基因合成的方式获得对昆虫细胞进行了密码子优化的表达构建序列。相应狂犬病相关病毒重组G蛋白胞外段(融合环替换为连接肽)的表达构建编码核酸序列请见SEQ ID NO.1-NO.15。其中，KHUV-G-ecto表达构建的编码核酸序列见SEQ ID NO.1，BBLV-G-ecto表达构建的编码核酸序列见SEQ ID NO.2，ARAV-G-ecto表达构建的编码核酸序列见SEQ ID NO.3，EBLV-1-G-ecto表达构建的编码核酸序列见SEQ ID NO.4，EBLV-2-G-ecto表达构建的编码核酸序列见SEQ ID NO.5，IRKV-G-ecto表达构建的编码核酸序列见SEQ ID NO.6，LBV-G-ecto表达构建的编码核酸序列见SEQ ID NO.7，SHIBV-G-ecto表达构建的编码核酸序列见SEQ ID NO.8，MOKV-G-ecto表达构建的编码核酸序列见SEQ ID NO.9，WCBV-G-ecto表达构建的编码核酸序列见SEQ ID NO.10，IKOV-G-ecto表达构建的编码核酸序列见SEQ IDNO.11，DUVV-G-ecto表达构建的编码核酸序列见SEQ ID NO.12，ABLV-G-ecto表达构建的编码核酸序列见SEQ ID NO.13，GBLV-G-ecto表达构建的编码核酸序列见SEQ ID NO.14，LLEBV-G-ecto表达构建的编码核酸序列见SEQ ID NO.15。

为实现蛋白的分泌表达，将上述合成的表达构建编码核酸序列分别克隆到含GP67信号肽的pFastBac1载体中(GP67信号肽的编码核酸序列见SEQ ID NO.16)，由此获得对应的重组表达质粒。

(2)狂犬病相关病毒G蛋白胞外段的重组表达和纯化

将步骤(1)中所得重组表达质粒分别转化感受态细胞DH10Bac，然后在含50μg/ml卡那霉素、7μg/ml庆大霉素、10μg/ml四环素以及100μg/ml X-gal和40μg/ml IPTG的LB平板上涂布，37℃培养48h后，挑取白色菌落，培养后使用质粒提取试剂盒提取对应的重组Bacmid。

将上述提取的重组Bacmid转染sf9昆虫细胞，培养72h收获P1代重组杆状病毒。通过将重组杆状病毒在sf9细胞中传代培养，扩增至P3代，而后通过western blot鉴定培养基上清中分泌表达的G蛋白胞外段。

将上述P3代重组杆状病毒接种Hi5昆虫细胞进行表达。在接种病毒48h后，收获细胞上清。用HisTrap亲和层析柱(GE Healthcare)进行亲和层析初步纯化，然后再通过分子排阻层析进行精细纯化。亲和层析纯化中，首先将收获的含有G蛋白胞外段的培养基上清通过HisTrap亲和层析柱，而后以10倍柱体积的buffer A(20mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH8.0)清洗层析柱，然后以含200mM咪唑的buffer A(20mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH 8.0，200mM imidazole)将目的蛋白从亲和层析柱上洗脱下来，由此得到粗纯的G蛋白胞外段。而后将该蛋白进一步以Superdex 200Increase 10/300(GE Healthcare)层析柱进行精细纯化，并最终将蛋白换液至buffer A中。

实施例2 KHUV病毒G蛋白胞外段(KHUV-G-ecto)的表达与纯化

参照实施例1所述方法对KHUV-G-ecto蛋白进行表达并用western blot鉴定。结果显示KHUV-G-ecto在昆虫细胞培养基上清中分泌表达(图1a)。参照实施例1所述方法对所表达的KHUV-G-ecto蛋白进行纯化，并用SDS-PAGE鉴定，表明蛋白纯度达到99％，分子排阻层析显示蛋白在14.5ml处洗脱，出峰对称，证明蛋白具有均一的分子大小，在溶液中性质均一(图1b)。

实施例3 BBLV病毒G蛋白胞外段(BBLV-G-ecto)的表达与纯化

参照实施例1所述方法对BBLV-G-ecto蛋白进行表达并用western blot鉴定。结果显示BBLV-G-ecto在昆虫细胞培养基上清中分泌表达(图2a)。参照实施例1所述方法对所表达的BBLV-G-ecto蛋白进行纯化，并用SDS-PAGE鉴定，表明蛋白纯度达到99％，分子排阻层析显示蛋白在14.5ml处洗脱，出峰对称，证明蛋白具有均一的分子大小，溶液中性质均一(图2b)。

实施例4 ARAV病毒G蛋白胞外段(ARAV-G-ecto)的表达与纯化

参照实施例1所述方法对ARAV-G-ecto蛋白进行表达并用western blot鉴定。结果显示ARAV-G-ecto在昆虫细胞培养基上清中分泌表达(图3a)。参照实施例1所述方法对所表达的ARAV-G-ecto蛋白进行纯化，并用SDS-PAGE鉴定，表明蛋白纯度达到99％，分子排阻层析显示蛋白在14.4ml处洗脱，出峰对称，证明蛋白具有均一的分子大小，溶液中性质均一(图3b)。

实施例5 EBLV-1病毒G蛋白胞外段(EBLV-1-G-ecto)的表达与纯化

参照实施例1所述方法对EBLV-1-G-ecto蛋白进行表达并用western blot鉴定。结果显示EBLV-1-G-ecto在昆虫细胞培养基上清中分泌表达(图4a)。参照实施例1所述方法对所表达的EBLV-1-G-ecto蛋白进行纯化，并用SDS-PAGE鉴定，表明蛋白纯度达到99％，分子排阻层析显示蛋白在14.8ml处洗脱，出峰对称，证明蛋白具有均一的分子大小，溶液中性质均一(图4b)。其中，目的蛋白峰前面的为亲和层析粗纯时未能去除的杂蛋白的峰。

实施例6 EBLV-2病毒G蛋白胞外段(EBLV-2-G-ecto)的表达与纯化

参照实施例1所述方法对EBLV-2-G-ecto蛋白进行表达并用western blot鉴定。结果显示EBLV-2-G-ecto在昆虫细胞培养基上清中分泌表达(图5a)。参照实施例1所述方法对所表达的EBLV-2-G-ecto蛋白进行纯化，并用SDS-PAGE鉴定，表明蛋白纯度达到99％，分子排阻层析显示蛋白在14.5ml处洗脱，出峰对称，证明蛋白具有均一的分子大小，溶液中性质均一(图5b)。

实施例7 IRKV病毒G蛋白胞外段(IRKV-G-ecto)的表达与纯化

参照实施例1所述方法对IRKV-G-ecto蛋白进行表达并用western blot鉴定。结果显示IRKV-G-ecto在昆虫细胞培养基上清中分泌表达(图6a)。参照实施例1所述方法对所表达的IRKV-G-ecto蛋白进行纯化，并用SDS-PAGE鉴定，表明蛋白纯度达到99％，分子排阻层析显示蛋白在14.8ml处洗脱，出峰对称，证明蛋白具有均一的分子大小，溶液中性质均一(图6b)。

实施例8 LBV病毒G蛋白胞外段(LBV-G-ecto)的表达与纯化

参照实施例1所述方法对LBV-G-ecto蛋白进行表达并用western blot鉴定。结果显示LBV-G-ecto在昆虫细胞培养基上清中分泌表达(图7a)。参照实施例1所述方法对所表达的LBV-G-ecto蛋白进行纯化，并用SDS-PAGE鉴定，表明蛋白纯度达到99％，分子排阻层析显示蛋白在14.4ml处洗脱，出峰对称，证明蛋白具有均一的分子大小，溶液中性质均一(图7b)。

实施例9 SHIBV病毒G蛋白胞外段(SHIBV-G-ecto)的表达与纯化

参照实施例1所述方法对SHIBV-G-ecto蛋白进行表达并用western blot鉴定。结果显示SHIBV-G-ecto在昆虫细胞培养基上清中分泌表达(图8a)。参照实施例1所述方法对所表达的SHIBV-G-ecto蛋白进行纯化，并用SDS-PAGE鉴定，表明蛋白纯度达到99％，分子排阻层析显示蛋白在14.8ml处洗脱，出峰对称，证明蛋白具有均一的分子大小，溶液中性质均一(图8b)。

实施例10 MOKV病毒G蛋白胞外段(MOKV-G-ecto)的表达与纯化

参照实施例1所述方法对MOKV-G-ecto蛋白进行表达并用western blot鉴定。结果显示MOKV-G-ecto在昆虫细胞培养基上清中分泌表达(图9a)。参照实施例1所述方法对所表达的MOKV-G-ecto蛋白进行纯化，并用SDS-PAGE鉴定，表明蛋白纯度达到99％，分子排阻层析显示蛋白在14.7ml处洗脱，出峰对称，证明蛋白具有均一的分子大小，溶液中性质均一(图9b)。

实施例11 WCBV病毒G蛋白胞外段(WCBV-G-ecto)的表达与纯化

参照实施例1所述方法对WCBV-G-ecto蛋白进行表达并用western blot鉴定。结果显示WCBV-G-ecto在昆虫细胞培养基上清中分泌表达(图10a)。参照实施例1所述方法对所表达的WCBV-G-ecto蛋白进行纯化，并用SDS-PAGE鉴定，表明蛋白纯度达到99％，分子排阻层析显示蛋白在14.6ml处洗脱，因上样量太多，峰高近1200mAU，几乎达到层析柱能承载的蛋白量的极限，因此，峰型有拖尾，对称度稍差。但其出峰位置与其他狂犬病相关病毒G蛋白的出峰位置高度一致，表明蛋白分子大小与预期相符，溶液中性质较均一(图10b)。

实施例12 IKOV病毒G蛋白胞外段(IKOV-G-ecto)的表达与纯化

参照实施例1所述方法对IKOV-G-ecto蛋白进行表达并用western blot鉴定。结果显示IKOV-G-ecto在昆虫细胞培养基上清中分泌表达(图11a)。参照实施例1所述方法对所表达的IKOV-G-ecto蛋白进行纯化，并用SDS-PAGE鉴定，表明蛋白纯度达到99％，分子排阻层析显示蛋白在14.8ml处洗脱，出峰对称，证明蛋白具有均一的分子大小，溶液中性质均一(图11b)。其中，目的蛋白峰前面的“肩膀”为亲和层析粗纯时未能去除的杂蛋白的峰。

实施例13 DUVV病毒G蛋白胞外段(DUVV-G-ecto)的表达与纯化

参照实施例1所述方法制备DUVV-G-ecto，并对制备获得的G蛋白进行纯化及鉴定，结果显示，蛋白的纯度达99％以上，蛋白在溶液中性质均一。

实施例14 ABLV病毒G蛋白胞外段(ABLV-G-ecto)的表达与纯化

参照实施例1所述方法制备ABLV-G-ecto，并对制备获得的G蛋白进行纯化及鉴定，结果显示，蛋白的纯度达99％以上，蛋白在溶液中性质均一。

实施例15 GBLV病毒G蛋白胞外段(GBLV-G-ecto)的表达与纯化

参照实施例1所述方法制备GBLV-G-ecto，并对制备获得的G蛋白进行纯化及鉴定，结果显示，蛋白的纯度达99％以上，蛋白在溶液中性质均一。

实施例16 LLEBV病毒G蛋白胞外段(LLEBV-G-ecto)的表达与纯化

参照实施例1所述方法制备LLEBV-G-ecto，并对制备获得的G蛋白进行纯化及鉴定，结果显示，蛋白的纯度达99％以上，蛋白在溶液中性质均一。

参考文献

1.G.K.Amarasinghe,N.G.Arechiga Ceballos,A.C.Banyard,C.F.Basler,S.Bavari,A.J.Bennett,K.R.Blasdell,T.Briese,A.Bukreyev,Y.Cai,C.H.Calisher,C.Campos Lawson,K.Chandran,C.A.Chapman,C.Y.Chiu,K.S.Choi,P.L.Collins,R.G.Dietzgen,V.V.Dolja,O.Dolnik,L.L.Domier,R.Durrwald,J.M.Dye,A.J.Easton,H.Ebihara,J.E.Echevarria,A.R.Fooks,P.B.H.Formenty,R.A.M.Fouchier,C.M.Freuling,E.Ghedin,T.L.Goldberg,R.Hewson,M.Horie,T.H.Hyndman,D.Jiang,R.Kityo,G.P.Kobinger,H.Kondo,E.V.Koonin,M.Krupovic,G.Kurath,R.A.Lamb,B.Lee,E.M.Leroy,P.Maes,A.Maisner,D.A.Marston,S.K.Mor,T.Muller,E.Muhlberger,V.M.N.Ramirez,S.V.Netesov,T.F.F.Ng,N.Nowotny,G.Palacios,J.L.Patterson,J.T.Paweska,S.L.Payne,K.Prieto,B.K.Rima,P.Rota,D.Rubbenstroth,M.Schwemmle,S.Siddell,S.J.Smither,Q.Song,T.Song,M.D.Stenglein,D.M.Stone,A.Takada,R.B.Tesh,L.M.Thomazelli,K.Tomonaga,N.Tordo,J.S.Towner,N.Vasilakis,S.Vazquez-Moron,C.Verdugo,V.E.Volchkov,V.Wahl,P.J.Walker,D.Wang,L.F.Wang,J.F.X.Wellehan,M.R.Wiley,A.E.Whitfield,Y.I.Wolf,G.Ye,Y.Z.Zhang,J.H.Kuhn,Taxonomy of the order Mononegavirales:update 2018.Archives of virology 163,2283-2294(2018)；published online EpubAug(10.1007/s00705-018-3814-x).

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川大学

<120> 一种通用型狂犬病相关病毒G蛋白胞外段的制备方法

<160> 16

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1314

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aagttcccta tctacaccat ccccgacaag ctgggtcctt ggagccccat cgacatccac 60

cacctgtcct gccctaacaa cctggtggtc gaggacgacg gttgcactac tctgtccggt 120

ttcacttaca tggaactgaa ggtcggttac atcactacta tcaaggtgga cggtttcact 180

tgcactggca tcgtgaccga agctgaaacc tacaccggcg gcagcggtgg tactactttc 240

aagcgcaagc acttccgccc tggcccctcc gcttgccgtg acgcttacaa ctggaaggct 300

gctggtgacc cccgctacga ggagtccctg cacaacccct acggcggcag cggcggaacc 360

accactaagg agagcctgct gatcatctcc ccctccgtcg tggacatgga cgcttacgac 420

aagtccctgc tgtccaagat cttccccaac ggtaaatgcc ctggtgtgtc catcgctagc 480

cctttctgct ctaccaacca cgactacacc atctggatgc ccgagaacac caagactggc 540

atgtcctgcg acatcttcac tacctccaag ggtaaacgcg ctactaagga cggcaagctg 600

tgcggcttcg tcgacgagcg cggtctgtac aagtccctga agggtagctg caagctgaag 660

ctgtgcggtg tgtccggtct gcgtctgatg gacggtagct gggtcagcat ccagaaccac 720

gaggaagcca agtggtgccc ccccgaccag ctggtgaacg tgcacgactt ccacagcgac 780

gaaatcgagc acctgatcgt cgaggagctg gtcaagaagc gcgaagagtg cctggacgct 840

ctggaaagca tcatgaccac taagtccatc agcttccgtc gcctgtccca cctgcgtaag 900

ctggtccccg gtttcggtaa agcctatact atcatcaaca agaccctgat ggaagctgac 960

gctcactaca agagcatccg tgagtggtcc gaaatcatcc ctagcaaggg ctgcctggtc 1020

gccggtggtc gttgctacca ccaccacaac ggtgtcttct tcaacggtat catcctgagc 1080

cccgacggtc acgtgctgat ccctgaaatg cagagcgctc tgctgcaaca gcacatcgag 1140

ctgctggaaa gcagcgtcat ccccctgatg caccccctgg ccgaccctag caccgtgttc 1200

aagggtgacg acggcgctga ggacttcgtc gaggtgcacc tgcccgacgt gcagaagcag 1260

atctccggta tcgacctggg cctgcctgaa tggaagcacc accaccacca tcac 1314

<210> 2

<211> 1314

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aagttcccta tctacaccat ccctgacaag ctgggtccct ggtcccctat cgacatcaac 60

cacctgagct gccctaacaa cctggtggtg gaagacgaag gttgcactaa cctgtccggt 120

ttcacctaca tggagctgaa ggtgggctac atcaccacca tcaaggtgtc cggcttcact 180

tgcactggcg tggtgaccga agccgagacc tacaccggcg gctccggtgg aactaccttc 240

aagcgcaagc acttccgccc ccgccctgac gcttgcaggg aagcctatga ctggaagact 300

gccggtgacc cccgctacga ggaatccctg cacaaccctt acggtggcag cggtggcacc 360

actaccaagg aatccctgct gatcatcggt ccttccgtgg ccgacatgga cgcctacgac 420

aagtccctgt actccaagat cttccctgac ggtaaatgca gcggcatctc cgctgtgtcc 480

cccttctgcc ccaccaacca cgagtacact atctggatgt ccgaaaacca gaagcccggt 540

atgagctgcg acatcttcac cacctccaag ggtaaaaagg ctaccaagaa cggcaagatg 600

tgcggcttcg tggacgagcg tggtctgtac aagagcctga agggtgcttg caagctgaag 660

ctgtgcggtg tctccggtct gcgtctgatg gacggctcct gggtcagcgt gcagaacccc 720

gaggacgcta agtggtgctc ccctgaccag ctggtcaaca tccacgactt ccacagcgac 780

gaggtggagc acctgatcgt ggaagagctg gtcaagaagc gtgaagagtg cctggacgct 840

ctggaaagca tcatgactac caagagcgtc agcttccgtc gcctgtccca cctgcgcaag 900

ctggtgcctg gcttcggtaa agcctatacc atcatcaaca agactctgat ggaggccgac 960

gctcactaca agagcatccg ccagtggacc gagatcatcc ctagcaaggg ttgcctgatg 1020

gctggcggcc gctgctaccc tcaccacaac ggcgtcttct tcaacggtat catcctgagc 1080

cctgacggtc acgtgctgat ccccgagatg cagtccgctc tgctgcaaca gcacatcgag 1140

ctgctggagt cctccgtgat ccccctgatg caccccctgg ctgaccccag cactgccctg 1200

aagggtggtg acggcgccga ggacttcgtg gaaatccacc tgcccgacgt gcagaagcag 1260

atctccggta tcgacctggg tctgcctgag tggaagcacc accaccacca tcac 1314

<210> 3

<211> 1314

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aagttcccca tctacaccat ccctgacaag atcggtcctt ggagccctat cgacatcaac 60

cacctgtcct gccccaacaa cctggtggtg gaagacgaag gctgcactac cctgaccgcc 120

ttctcctaca tggagctgaa ggtcggttac atcactacta tcaaggtgag cggcttcact 180

tgcactggcg tggtcactga ggctgaaacc tacactggtg gcagcggcgg tactactttc 240

cgtcgcaagc acttccgtcc taccgcctcc gcttgccgtg aagcctataa ctggaaggct 300

actggtgacc ctcgctacga ggaatccctg cacaacccct acggtggttc cggtggtaaa 360

accaccaagg agtccctgct gatcatctcc ccctccgtgg ctgacatgga cgcttacgac 420

aaggctctgt actccaagat cttccccaac ggcaagtgcc tgggcgtctc cctgtcctcc 480

cccttctgct ccaccaacca cgactacact ctgtggatgc ctgagaaccc taagcccggc 540

gtgtcctgcg acatcttcac cacctccaag ggtaaaaagg ctactaagga cggtaaactg 600

tgcggcttcg tggacgagcg cggtctgtac aagtccctga agggcgcctg caagctgaag 660

ctgtgcggtg tgatgggcct gcgcctgatg gacggcagct gggtcagcct gcaaaagacc 720

gaagagtccg aatggtgctc ccctaaccag ctgatcaaca tccacgactt ccactccgac 780

gaaatcgaac acatggtggt ggaagaactg gtgaagaagc gtgaagaatg cctggacgct 840

ctggagagca tcatgactac taagagcatc tccttccgtc gtctgagcca cctgcgcaag 900

ctggtccctg gtttcggcaa ggcttacacc ctgatcaaca agactctgat ggaggctgac 960

gcccactaca agtccgtccg cgaatggact gaggtcatcc ccagcaaggg ctgcctgaag 1020

gctggtggtg gctgctaccc ccactacaac cgtgtcttct tcaacggtat catcctgagc 1080

cctgacggtc acgtcctgat ccccgagatg cagagcgctc tgctgcaaca gcacatcgaa 1140

ctgctggagt ccagcgtcat ccccctgcgt caccctctgg ctgacccttc caccgtgttc 1200

aagggtgacg acgaggctga ggaatttgtc gaggtccacc tgcctgacac tcagaagcag 1260

atctccggta tcgacctggg tctgcccgaa tggaagcacc accaccacca tcac 1314

<210> 4

<211> 1314

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aagttcccta tctacaccat ccccgacaag atcggtcctt ggtcccctat cgacatcaac 60

cacctgagct gccccaacaa cctgatcgtg gaggacgagg gttgcaccac cctgaccccc 120

ttctcctaca tggagctgaa ggtcggctac atcaccacca tcaagatcga aggcttcact 180

tgcaccggtg tcatcactga agctgaaacc tacactggtg gtagcggtgg caccactttc 240

aagcgtaagc acttccgtcc taccgtgtcc gcctgccgtg acgcctacaa ctggaagatc 300

accggcgacc ctcgctacga agaatccctg cacaaccctt acggtggtag cggaggcaag 360

accactaagg agtccctgct gatcatctcc cctagcgtgg tcgacatgga cgcttacgac 420

aagaacctgt actccaagat gttccccaac ggtaaatgcc tggctagccc cccctccgcc 480

acctgttgcc caactaacca cgactacact atctggattc ctgaaaaccc caagcccggc 540

ctgagctgcg acatcttcac tacctccaag ggtaaaaagg ctaccaagga cggcaagctg 600

tgcggcttcg tcgacgagcg cggtctgtac aagtccctga agggtgcttg caagctgcgc 660

ctgtgcggcg tgcccggtat gaggctgatg gacggtagct gggtgtccct gcaaaagacc 720

gaggctcctg aatggtgcag ccctgaccag ctggtcaaca tccacgactt ccacaccgac 780

gaaatcgagc acctggtcgt ggaggagctg gtgaagaagc gcgaggagtg cctggacgcc 840

ctggagacca tcatcaccac caagagcatc agcttccgcc gcctgagcca cttccgtaag 900

ctggtccccg gcttcggtaa agcctatacc ctgatcaaca agactctgat ggaggccgac 960

gcccactaca agagcgtccg tgagtggacc gaagtgatcc ctagcaaggg ctgcctgatg 1020

gctggcggtc gttgccaccc ccactactcc ggcatcttct tcaacggtat catcctgagc 1080

cctggcggcg acgtgttcat ccctgaaatg cagagcgctc tgctgcaaca gcacatcgag 1140

ctgctggaat ccagcatgat ccctctgcgc caccctctgg ccgaccctag cactgtcttc 1200

aagcgcgacg acgaagccga agacttcgtc gaggtccacc tgcctgacac tcagaagctg 1260

atctccggca tcgacctggg cttccctgag tggaagcacc accaccacca tcac 1314

<210> 5

<211> 1314

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

aagttcccca tctacactat ccccgacaag ctgggccctt ggtcccccat cgacatccac 60

cacctgagct gccccaacaa catcgtggtg gaggacgagg gctgcaccac cctgaccgtc 120

ttcagctaca tggaactgaa ggtgggctac atcactacca tcaaggtcaa cggcttcacc 180

tgcaccggtg tggtgactga agctgaaact tacaccggtg gctccggtgg tactactttc 240

aagcgcaagc acttccgccc cagcccctcc gcttgccgtg acgcttacag ctggaagact 300

gctggcgacc ctcgctacga agaaagcctg cacaacccct acggtggtag cggtggtact 360

accaccaagg aaagcgtgct gatcatctcc ccttccgtgg ccgacatgga cgcctacgac 420

aagaccctgt actccaagat cttcctgaac ggcaagtgca gcggcgtgtc ccaggtctcc 480

cccttctgct ccaccaacca cgactacact atctggatgc ctgaaaaccc caaccctggt 540

gtgagctgcg acatcttcac cacttccaag ggcaagaagg ctactaagga cggcaagctg 600

tgcggcttcg tcgacgagcg cggtctgtac aagagcctga agggtgcttg caagctgaag 660

ctgtgcggta tctccggtat gcgtctgatg gacggcagct gggtcagcat ccagaaccac 720

gacgaggcta agtggtgcag ccccgaccag ctggtgaaca tccacgactt ccactccgac 780

gaagtggagc acctgatcgc tgaagagctg gtcaagaagc gcgaagaatg cctggacgcc 840

ctggaatcca tcatgactac caagtccatc tccttccgcc gtctgtccca cctgcgtaag 900

ctggtgcccg gcttcggcaa ggcctacact atcatcaaca agaccctgat ggaggccgac 960

gctcactaca agagcatccg tgaatggact gacgtcatcc ccagcaaggg ttgcctgatg 1020

gctggcggtc gctgctaccc ccaccacaac ggcgtcttct tcaacggcat catcctgagc 1080

cctgacggcc acgtcctgat ccctgaaatg cagagcgcta tgctgcaaca gcacatcgaa 1140

ctgctggaat cctccgtcat ccctctgatg caccctctgg ctgaccctag cactatcttc 1200

aagaaggacg acggcgctga ggacttcgtc gaagtgcacc tgcctgacgt gcagaagcag 1260

atctccggca tcgacctggg cctgcctgaa tggaagcacc accaccacca tcac 1314

<210> 6

<211> 1317

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aagttcccta tctacaccat ccctgacaag atcggtcctt ggagccccat cgacatcaac 60

cacctgtcct gccccaacaa cctggaggtg gaggacgaag gctgcaccac tctgaccgcc 120

ttcaactaca tggaactgaa ggtgggctac atcacctcca tcaaggtcga cggtttcact 180

tgcaccggcg tcgtgaccga agctgagacc tacaccggtg gttccggtgg tactaccttc 240

aagcgcaagc acttccgccc taacgtgagc gcttgccgtg ccgctttctc ctggaagact 300

gctggcgacc ctcgctacga ggaaagcctg cacaacccct acggtggttc cggaggtact 360

actaccaagg agtccctgct gatcatctcc cccagcgtcg tggacatgga cgcttacgac 420

aagaccctgt actccaagat gttccccaac ggtaaatgct tcccccccat cagcgactcc 480

cccttctgct ctactaacca cgactacacc ctgtggctgc ctgagaagga gaagctgagc 540

atgagctgca acatcttcgt ctcctccaag ggtaaaaagg ctactaagga cggccgtctg 600

tgcggtttcg tcgacgaacg tggcctgtac aagtccctga agggcgcttg caagctgaag 660

ctgtgcggta tggctggtat gcgcctgatg gacggctcct gggtgtccct gcaacgtgcc 720

gacgctcccg aatggtgccc cccaggtgct ctggtgaacg tgcacgactt ccactccgac 780

gagatcgctc acttcgtcgt ggaggaactg atcaagaagc gcgaggagtg cctggacacc 840

ctggagacca tcctgaccac taagtccatc tccttccgcc gcctgtccca cttccgtaag 900

ctggtccccg gtctgggtaa agcctacacc ctgatcaaca acactctgat ggaggctgaa 960

gcccactaca agtccatccg tgagtggaag gagatcatcc cttccaaggg ttgcctgaag 1020

gctggcggtc gctgccaccc ccactacgac ggaatcttct tcaacggcat catcctgggc 1080

cccaacggcg acgtcctgat ccctgagatg cagagcagcc tgctgcaaca gcacatcgaa 1140

ctgctggagt ccagcatgat ccccctgcgt caccccctgg ccgactcctc agctatcttc 1200

cgttccgaca acgaagccga agacttcgtg gacgtccacc tgcccgacac ccagaagcag 1260

gtgtccgaca tcgacctggg tttccccgaa tggaagcgcc accaccacca ccatcac 1317

<210> 7

<211> 1314

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gtggaagact tccccctgta caccatcccc gagaagatcg gtccttggac ccccatcgac 60

ctgatccacc tgtcctgccc caacaacctg caatccgagg acgagggctg cggtacttcc 120

agcgtgttct cctacgtcga gctgaagacc ggctacctga ctcaccagaa ggtgtccggt 180

ttcacctgca ctggtgtcgt gaacgaggct gtgacctaca ccggcggttc cggcggcact 240

accttcaagc gcaagcactt caagcctacc gctctggcct gccgcgacgc ctaccactgg 300

aagatcagcg gtgacccccg ctacgaggaa tccctgcaca ccccttacgg cggttccggt 360

ggcaccacta ccaaggagtc cctggtcatc atcagcccta gcatcgtgga gatggacgtc 420

tactcccgta ccctgcacag ccctatgttc cccaccggta cttgctcccg tttctacccc 480

tcctccccta gctgcgctac taaccacgac tacactctgt ggctgcccga cgaccctaac 540

ctgagcctgg cttgcgacat cttcgtcacc tccaccggca agaagtccat gaacggtagc 600

cgcatgtgcg gcttcactga cgagcgtggt tactaccgca ccatcaaggg tgcctgcaag 660

ctgaccctgt gcggtaaacc cggtctgcgt ctgttcgacg gcacttggat cagcttcacc 720

cgtcccgagg tcactactcg ctgcctgccc aaccagctgg tcaacatcca caacaaccgt 780

atcgacgagg tcgaacacct gatcgtggaa gacctgatcc gcaagcgtga agaatgcctg 840

gacaccctgg aaaccgtgct gatgtccaag agcatcagct tccgccgcct gtcccacttc 900

cgtaagctgg tccccggtta cggtaaagcc tacaccatcc tgaacggctc cctgatggaa 960

accaacgtgc actacctgaa ggtcgacaac tggagcgaaa tcctgccctc caagggttgc 1020

ctgaagatca acaaccagtg cgtggctcac tacaagggtg tcttcttcaa cggtatcatc 1080

aagggccccg acggtcacat cctgatccct gaaatgcaga gctccctgct gaagcagcac 1140

atggacctgc tgaaggctgc cgtgttccct ctgcgtcacc ccctgatcga gcccggtagc 1200

ctgttcaaca aggacggtga cgccgacgaa tttgtggacg tccacatgcc cgacgtccac 1260

aagctggtca gcgacgtgga cctgggtctg cctgaccacc accaccacca tcac 1314

<210> 8

<211> 1314

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gacttccctc tgtacactat ccccgaaaag atcggccctt ggacccctat cgacctgacc 60

cacctgtcct gccccaacaa cctgctgtcc gaggacgacg gctgctcctc ctcctccact 120

ttctcctaca tcgagctgcg cactggctac ctgacccacc agaaggtctc cggcttcact 180

tgcaccggtg tgatcaacga ggccgtcacc tacaccggtg gtagcggtgg tactaccttc 240

aagcgtaagc acttcaagcc caccgcctcc gcttgccgcg acgcttacca ctggaagatc 300

agcggtgacc cccgctacga agagtccctg cacaccccct acggtggcag cggcggtact 360

actactaagg aatccctgct gatcatcagc ccctccatcg tcgagatgga catctactcc 420

cgctccctgc actcccccat gttccccacc ggccgctgct acgacttcta caagtccact 480

cccagctgcc tgaccaacca cgactacacc atctggctgc ctgacgacgc taacgtgcgc 540

ctgacttgcg acatcttcgt cacctccacc ggcaagaaga gcatgaacgg tagcaagatg 600

tgcggtttca ccgacgaacg cggcctgtac cgcactctga agggcgcctg caagctgact 660

ctgtgcggta aacctggtct gcgcctgttc gacggtactt ggatctccat cacccgccct 720

gaaatcgtca tgtggtgcag ccccaaccag ctggtgaacg tgcacaacaa ccgtgtggac 780

gagatcgagc acctgatcgt gggtgacctg atccgtcgcc gtgaagaatg cctggacact 840

ctggaaactg tcctgatgag caagtccgtc tccttccgcc gtctgtccca cttccgcaag 900

ctggtccctg gtttcggtaa agcctatact atcgctaacg gttccctgat ggaaaccaac 960

gtgcactaca agcgcgtcga ccgttgggaa gaaatcctgc cctccaaggg ctgcctgaag 1020

ctgaacgaca agtgcctgaa ccctgaaaac ggtgtgttct tcaacggtat catcaagggt 1080

cccgacggcc aggtgctgat ccccgagatg cagagctccc tgctgaagca gcacatggac 1140

ctgctgaagg ccagcgtgtt ccctctgcgt caccctctga tcgaccagac cagcatcttc 1200

aagaaggacg gcgaggctga cgacttcgtg gacgtgcaca tgcccgaccc ccacaagagc 1260

atctccaaca tcgacctggg cctgcctgac tggggtcacc accaccacca tcac 1314

<210> 9

<211> 1308

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gaatttcccc tgtacaccat ccccgagaag atcgaaaagt ggactcccat cgacatgatc 60

cacctgagct gccccaacaa cctgctgtcc gaggaagaag gttgcaacgc cgaaagctcc 120

ttcacctact tcgaactgaa gagcggttac ctggctcacc agaaggtgcc cggtttcacc 180

tgcactggtg tcgtcaacga agccgagact tacaccggcg gttccggtgg cactaccttc 240

aagcgcaagc acttccgccc taccgtcgct gcttgccgcg acgcttacaa ctggaaggtg 300

agcggcgacc ctcgttacga ggagtccctg cacacccctt acggcggtag cggcggcact 360

accactaagg agtccctgct gatcatctcc ccctccatcg tggaaatgga catctacggt 420

cgtactctgc actcccccat gttcccttcc ggcgtgtgct ccaacgtcta cccttccgtg 480

ccttcctgcg agaccaacca cgactacacc ctgtggctgc ctgaggaccc ctccctgagc 540

ctggtctgcg acatcttcac cagcagcaac ggcaagaagg ctatgaacgg tagccgtatc 600

tgcggcttca aggacgagcg cggtttctac cgttccctga agggcgcttg caagctgact 660

ctgtgcggcc gtcctggtat ccgtctgttc gacggtactt gggtctcctt cactaagcct 720

gacgtccacg tgtggtgcac tcccaaccag ctgatcaaca tccacaacga ccgcctggac 780

gagatcgaac acctgatcgt cgaggacatc atcaagaagc gcgaagaatg cctggacacc 840

ctggaaacca tcctgatgtc ccagagcgtg tccttccgtc gcctgtccca cttccgcaag 900

ctggtgcccg gttacggtaa agcctatacc atcctgaacg gttccctgat ggagaccaac 960

gtgtactaca agcgcgtcga caagtgggcc gacatcctgc cctccaaggg ctgcctgaag 1020

gtcggtcagc agtgcatgga acctgtgaag ggtgtgctgt tcaacggtat catcaagggt 1080

cctgacggtc agatcctgat ccctgaaatg cagagcgagc agctgaagca gcacatggac 1140

ctgctgaagg ccgctgtctt ccccctgcgc caccccttga tctcccgtga ggccgtgttc 1200

aagaaggacg gtgacgccga cgacttcgtg gacctgcaca tgcccgacgt ccacaagtcc 1260

gtgtccgacg tggacctggg tctgccccac caccaccacc atcaccac 1308

<210> 10

<211> 1323

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

caaggcctct tccctctgta tactatcccc gaccatttag gcccttggac tcctattgat 60

ctctcccatt tacactgccc caacaacctc tacaccgacg ctagctattg caccactgag 120

cagagcatta cctacaccga actgaaggtg ggttccagcg tgtcccaaaa gatccccggt 180

tttacttgta ctggcgtgcg caccgagagc gtcacctaca ctggcggttc cggcggtact 240

accttcaaga agaagcactt ccctcccaag tcccgtgact gccgcgaggc ctacgaacgt 300

aagaaggctg gtgacccccg ctacgaggag agcctcgctc acccttacgg cggtagcggt 360

ggtactacca ccaaggacag ctgggtgatc atcgagccta gcgtggtcga gctcgacatc 420

tacaccagcg ctctgtacag ccccctcttc aaggacggta cttgcagcaa gagccgtacc 480

tacagccctt actgccccac caaccacgac ttcactatct ggatgcccga gtccgagaac 540

attcgtagcg cttgtaattt attctccact tcccgtggta agctggtgcg caaccgcact 600

agcacttgcg gcatcatcga cgagcgcggc ctcttccgct ccgtgaaagg tgcttgtaag 660

atctccatct gcggccgcca aggtattcgc ctcgtcgatg gcacttggat gagcttccgt 720

tactccgagt atttacccgt gtgttcccct agccaactga tcaacaccca cgatatcaag 780

gtggacgagt tagaaaacgc catcgtgctg gatttaatcc gtcgccgcga ggagtgttta 840

gatactttag agactatttt aatgtccggc tccgtgagcc accgtcgtct gtcccacttc 900

cgcaagctgg tgcccggttc cggcaaggcc tactcctaca tcaatggcac tttaatggag 960

agcgacgctc actacatcaa agtggagaac tggtccgagg tcatccccca caagggttgt 1020

ttaatggtgg gcggcaagtg ttacgagccc gtcaacgacg tgtacttcaa cggcatcatc 1080

cgcgacagca ataatcagat cctcatcccc gagatgcagt cctctttact gcgtgaacac 1140

gtcgatttac tgaaggccaa catcgtgcct ttccgccatc ctatgctgct gcgctccttc 1200

acctccgaca ccgaggagga cattgtggag ttcgtgaacc cccacctcca agacacccag 1260

aagctggtca gcgacatgga cctcggtctg agcgactgga agcgtcatca ccatcatcat 1320

cac 1323

<210> 11

<211> 1320

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ggaatcttcc ctatgtacac catccctgaa ggcctgggtc cttggacccc tatcgacctg 60

agccacctga agtgccccga caacacttac ttcgctgagg agggctgcaa cgaaggcagc 120

aaggtgagct acctggagct gaagcccagc ttccacagcc agaacaaggt gcagggcttc 180

acttgcaccg gcatcatcaa catggccact acttacactg gcggttccgg tggcactacc 240

ttccagcgca gccacttcat ccctaaccag cgcgactgcc gtcaggcccg tgagtggaag 300

aaggaaggcg accctcgtta cgaggagtcc ctgaccaccc cttacggcgg tagcggcggc 360

actacttcca aggagtcctg gctgatcctg gaccctgctg tggtggaaat ggacatctac 420

aacaagacta tgttctcccc tgtgctgcgt aacggctact gcaacttctc ccctgagaac 480

cctgacttct gcgaaaccaa ccaccagcac agcatctgga ttcctgagga cgaaggccgt 540

ggtatcacct gcgacatctt ccaggctagc actggcatcc tgctgaagaa cggcagcaag 600

gtctgcggtt tccaggacga gcgcggtctg ttccgtagca tcaagggcgc ctgcaagatg 660

atcatctgcg gtaaatccgg cgtgcgcctg tacgacggta cttgggtgtc ctacaactcc 720

gtggacaacc tgcgcatgtg ctcccgtagc aagatggtca acaagcacac tgtcaagctg 780

gacaacatcg aagaaagcat cgtccgcgac ctgatcaaga agcgtgaaga atgcctggac 840

gctctggagg aggtcatgct gactcgcagc atctccttcc gcaagctgag cctgttccgc 900

aagcaggtcc ccggccgtgg ctacgtgtac actatgatca acaacaccat gatggaagct 960

actggtcact acaagagcgt cgacaactgg actgacatcc tgcccaaccc tatctgcctg 1020

atggtggacg gcaagtgcca ccccggttac gacggcgtcc tgttcaacgg tatcatccgt 1080

gactcccgcg gtaaaatcct gatccctgaa atgcagtccc acctgctgcg tgaccacctg 1140

gaactgctga agcgcaactc catcccctgg cgtcaccctc tggtgcacta cagcgagaac 1200

ggtgaagacg gtagcgacct gaccagcttc gcccagctgt acatcaagga ccctcacctg 1260

agcgtgtccg acatcgacat cggcttcccc tcctggaaga agcaccacca ccaccatcac 1320

<210> 12

<211> 1314

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

aagttcccca tctacaccat ccccgacaag ctgggtccct ggtcccccat cgacatccac 60

cacctgtcct gccccaacaa cctggtggtg gaggacgagg gttgcaccac cctgaccccc 120

ttctcctaca tggagctgaa ggtgggttac atcacctcca tcaaggtgtc cggtttcacc 180

tgcaccggtg tggtgaccga ggctgagacc tacaccggtg gttccggtgg taccaccttc 240

cgtcgtcgtc acttccgtcc ctccgtgaac tcctgccgtg acgcttacaa ctggaagatc 300

gctggtgacc cccgttacga ggagtccctg cacaacccct acggtggttc cggtggtaag 360

accaccaagg agtccctgct gatcatctcc ccctccgtgg ctgacatgga cgcttacgac 420

aagaagctgt actccaagat gttccccaac ggtcgttgct ccgagatctc ccccggttcc 480

cccttctgcc ccaccaacca cgagtacacc atctggatgc ccgagtcctc caaccccggt 540

atctcctgcg acatcttcac ccgttccatg ggtaagaagg ctaccaagga cggtcagctg 600

tgcggtttcg tggacgagcg tggtctgtac aagtccctga agggtgcttg ccgtctgcgt 660

ctgtgcggta tctccggtct gcgtctgatg gacggttcct gggtgtccct gccccaggtg 720

aacaactccg agtggtgctc ccccgaccag ctggtgaaca tccacgactt ccactccgac 780

gagatcgagc acctggtggc tgacgagctg gtgaagaagc gtgaggactg cctggacgct 840

ctggagacca tcatcttcac caagtccatc tccttccgtc gtctgtcccg tctgcgtaag 900

ctggtgcccg gtttcggtaa ggcttacacc atcatcaacc gtaccctgat ggaggctgag 960

gctcactaca agtccgtgcg tgagtggaag gagatcatcc cctccaaggg ttgcctgaag 1020

gctggtggtc gttgctaccc ccaccacaac ggtatcttct tcaacggtat catcctgggt 1080

cccggtggtg agatcctgat ccccgagatg cagtccgctc tgctgcagca gcacatcgag 1140

ctgctggagt cctccgtggt gcccctgaag caccccctgg ctgacccctc caccgtgttc 1200

aagaacgacg acgaggctga gtccttcgtg gacgtgcacc tgcccgacac caaccagaag 1260

atctccggta tcgacctggg tctgcccgag tggaagcacc accaccacca tcac 1314

<210> 13

<211> 1314

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

aagttccctt tatacaccat ccccgataag ctgggccctt ggagccccat cgacatccac 60

catttatctt gtcccaacaa tttaattgtc gaggacgagg gttgcacctc tttaagcggt 120

ttcagctaca tggagctgaa ggtgggcttc atcaccacca tcaaggtgag cggcttcact 180

tgtactggtg tcgtcaccga atccgagacc tacaccggtg gttccggcgg caccaccttt 240

aagcgcaagc acttccgtcc tacccccgag ttttgccgta acgcctacaa ctggaaggtc 300

gctggcgacc ctcgttacga agaatccctc cacaacccct atggtggttc cggcggcact 360

accaccaagg aatctttact gatcatctcc ccttccgtgg tggatatgga cccctacgac 420

aagtctttac acagcaagat gttccctaaa ggcacttgta gcggcgcttc cgtgccctcc 480

atcttctgct ccaccaacca cgactatact ttatggatgc ccgaaaaccc caagcccggt 540

atgagctgcg acatcttcac cacttccaag ggcaagaagg cctccaaagg cggcaaggtc 600

tgcggcttcg tcgacgagcg tggtttatac aagtccctca agggcgcttg taagctgaag 660

ctgtgcggca tttccggtct gcgtttaatg gacggctctt gggtgagcat ccagaaccac 720

gaggaggcca agtggtgctc ccccgatcag ctggtgaaca tccacgattt ccatagcgac 780

gagatcgagc atttaatcgt ggaggagctg gtgcgcaagc gtgaggagtg tttagacgct 840

ttagagtcca tcatgactac taagtccgtc tccttccgcc gtttaagcca tttacgtaaa 900

ctggtccccg gtttcggtaa ggcctacacc atcgtgaaca agactttaat ggaggctgac 960

gctcactaca agagcgtgcg tacttggaac gaaatcatcc ccagcaaggg ctgcctcaag 1020

gtgcgtgagc gctgccaccc cccttacaat ggcgtgttct tcaacggcat cattttatcc 1080

cccgacggcc acgttttaat tcccgaaatg cagagctctt tactccagca gcacgtcgaa 1140

ctgctggagt cctccgtcat ccctttaatc catcctttag ccgatcccag caccgtgttc 1200

aagcgcgacg acgaggctga agacttcatc gaggtgcacc tccccgacgt gcagaagcaa 1260

gtgtccggca tcgatttagg tttaagcgaa tgggaacatc accatcatca tcac 1314

<210> 14

<211> 1317

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

aagttcccca tctacaccat ccccgacaag ctgggtccct ggtcccccat cgacatccac 60

cacctgtcct gccccaacaa cctgatcgtg gaggacgagg gttgcacctc cctgtccggt 120

ttctcctaca tggagctgaa ggtgggttac atcaccacca tcaaggtgtc cggtttcacc 180

tgcaccggtg tggtgaccga ggctgagacc tacaccggtg gttccggtgg taccaccttc 240

aagcgtaagc acttccgtcc cacccccgac ggttgccgta acgcttacaa ctggaagacc 300

gctggtgacc cccgttacga ggagtccctg cacaacccct acggtggttc cggtggtacc 360

accaccaagg agtccctgct gatcatctcc ccctccgtgg tggacatgga cccctacgac 420

aagtccctgc actccaaggt gttccccacc ggtcgttgct ccggtatctc cgtgtcctcc 480

acctcctgct ccaccaacca cgactacacc ctgtggctgc ccgaggaccc caagcccggt 540

tcctcctgcg acatcttcac cacctccaag ggtaagaagg cttccaaggg tggtaagatc 600

tgcggtttcg tggacgagcg tggtctgtac aagtccctga agggttcctg caagctgaag 660

ctgtgcggta tctccggtct gcgtctgatg gacggttcct gggtgtccat ccagaacccc 720

gaggacacca agtggtgctc ctccgaccag ctggtgtcca tccacgactt ccactccgac 780

gagatcgagc acctggtggt ggaggagctg gtgaagaagc gtgaggagtg cctggacgct 840

ctggagtcca tcgtgaccac caagtccgtg tccttccgtc gtctgtccca cctgcgtaag 900

ctggtgcccg gtttcggtaa ggcttacacc atcgtgaaca agaccctgat ggaggctgac 960

gctcactaca agtccgtgcg tgcttggaac gagatcatcc cctccaaggg ttgcctgaag 1020

gtgggtgagc gttgctaccc ccccttcaac ggtgtgttct tcaacggtat catcctgggt 1080

cccgacggtc acgtgctgat ccccgagatg cagtcctccc tgctgcagca gcacatggag 1140

ctgctggagt cctccatgat ccccctgatg caccccctgg ctgacccctc caccgtgttc 1200

cgtggtgacg acgaggctga ggacttcgtg gaggtgcacc tgcccgacgt gcagaagcag 1260

atctccggtg tggacctggg tctgtccgag tgggagcgtc accaccacca ccatcac 1317

<210> 15

<211> 1323

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

caggacatct tccccctgta caccatcccc gactccatcg gtccctggac ccccatcgac 60

ctgtcccacc tgaagtgccc cgacaacgct ttcatcgtgg acgagaactg caccgaccac 120

ggtgagatca actactccga gctgaagccc tccttccact cccagtccaa ggtgcccggt 180

ttcacctgca ccggtatcgt gacccaggct gtgacctaca ccggtggttc cggtggtacc 240

accttccagc gttcccactt cgtgcccaac ccccgtgagt gccgtgctgc tcaggagtgg 300

aagtccaagg gtgacccccg ttacgaggac tccctgcaga acccctacgg tggttccggt 360

ggtaccacca cccgtgagtc cctgctgatc atcgagcccg ctatcgctga gatggacatc 420

tacaacaaga ccatgttctc ctccgtgttc cgtggtggtc tgtgcgactt ctcccgtggt 480

aaccccgact actgcgagac ctcccactcc tactccatct ggatgcccta cgaggagtcc 540

cgtggtatca cctgcgacat cttccagtcc tccaccggtc gtctgttcaa gaaggacgac 600

caggtgtgcg gtatccagga cgagcgtggt atgttcaagt ccacccgtgg tgcttgcaag 660

atgaccatct gcggtaagtc cggtgtgcgt ctgtacgacg gtacctggat ctcctacaac 720

accatcgaca acctgaaggt gtgcccccgt tccgctatgg tgaacatgca caccaccaag 780

ctggacgctc tggaggaggc tgtggtgcgt gacctggtga agaagcgtga ggagtgcctg 840

aacgctttcg aggagatcat catcaccaac tccatctcct tccgtaagat gtccctgttc 900

cgtaagatgg tgcccggttc cggtctggtg tacaccatga tcaacaagac cctgatggag 960

gctcacggtc actacaagtc cgtgtccaac tggtccgaga tcctgcccac ccccatctgc 1020

ctgctggtga agggtaagtg ctaccaggac cacgacggtg tgctgttcaa cggtatcgtg 1080

aaggaccacc gtggtaaggt gctgatcccc gagatgcagt cccacctgct gcaggaccac 1140

ttcgagctgc tgcgttccaa caccatcccc tggcgtcacc ccctggtgca ctaccccgac 1200

gacaccgacc cctcctccga gaccgctgag ttcatccagc tgcacatgcg tgaccccgct 1260

aaggtgacct ccgacatcga cttcggtctg tcctcctgga agcgtcacca ccaccaccat 1320

cac 1323

<210> 16

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

atgctactag taaatcagtc acaccaaggc ttcaataagg aacacacaag caagatggta 60

agcgctattg ttttatatgt gcttttggcg gcggcggcgc attctgcctt tgcggcggat 120

Claims

1.一种制备可溶且均一性好的狂犬病相关病毒G蛋白胞外段的方法，其特征在于，所述方法是用GGSGG连接肽分别替换狂犬病相关病毒G蛋白胞外段中的两个融合环区域的多个氨基酸；

所述狂犬病相关病毒包括KHUV(Khujand lyssavirus),BBLV(Bokeloh batlyssavirus),ARAV(Aravan lyssavirus),EBLV-1(European bat 1lyssavirus),EBLV-2(European bat 2lyssavirus),IRKV(Irkut lyssavirus),LBV(Lagos bat lyssavirus),SHIBV(Shimoni bat lyssavirus),MOKV(Mokola lyssavirus),WCBV(West Caucasian batlyssavirus),IKOV(Ikoma lyssavirus),DUVV(Duvenhage lyssavirus),ABLV(Australianbat lyssavirus),GBLV(Gannoruwa bat lyssavirus)或LLEBV(Lleida bat lyssavirus)；

所述G蛋白胞外段中的两个融合环区域的多个氨基酸为KHUV病毒G蛋白胞外段的73-79位氨基酸所在区域和117-125位氨基酸所在区域，

或BBLV病毒G蛋白胞外段的73-79位氨基酸所在区域和117-125位氨基酸所在区域，

或ARAV病毒G蛋白胞外段的73-79位氨基酸所在区域和117-125位氨基酸所在区域，

或EBLV-1病毒G蛋白胞外段的73-79位氨基酸所在区域和117-125位氨基酸所在区域，

或EBLV-2病毒G蛋白胞外段的73-79位氨基酸所在区域和117-125位氨基酸所在区域，

或IRKV病毒G蛋白胞外段的73-79位氨基酸所在区域和117-125位氨基酸所在区域，

或LBV病毒G蛋白胞外段的75-81位氨基酸所在区域和119-127位氨基酸所在区域，

或SHIBV病毒G蛋白胞外段的73-79位氨基酸所在区域和117-125位氨基酸所在区域，

或MOKV病毒G蛋白胞外段的73-79位氨基酸所在区域和117-125位氨基酸所在区域，

或WCBV病毒G蛋白胞外段的75-81位氨基酸所在区域和119-127位氨基酸所在区域，

或IKOV病毒G蛋白胞外段的74-80位氨基酸所在区域和118-126位氨基酸所在区域，

或DUVV病毒G蛋白胞外段的73-79位氨基酸所在区域和117-125位氨基酸所在区域，

或ABLV病毒G蛋白胞外段的73-79位氨基酸所在区域和117-125位氨基酸所在区域，

或GBLV病毒G蛋白胞外段的73-79位氨基酸所在区域和117-125位氨基酸所在区域，

或LLEBV病毒G蛋白胞外段的75-81位氨基酸所在区域和119-127位氨基酸所在区域。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述G蛋白胞外段为KHUV病毒G蛋白的1-438位氨基酸，或BBLV病毒G蛋白的1-438位氨基酸，或ARAV病毒G蛋白的1-438位氨基酸，或EBLV-1病毒G蛋白的1-438位氨基酸，或EBLV-2病毒G蛋白的1-438位氨基酸，或IRKV病毒G蛋白的1-439位氨基酸，或LBV病毒G蛋白的1-438位氨基酸，或SHIBV病毒G蛋白的1-438位氨基酸，或MOKV病毒G蛋白的1-436位氨基酸，或WCBV病毒G蛋白的1-441位氨基酸，或IKOV病毒G蛋白的1-440位氨基酸，或DUVV病毒G蛋白的1-438位氨基酸，或ABLV病毒G蛋白的1-438位氨基酸，或GBLV病毒G蛋白的1-439位氨基酸，或LLEBV病毒G蛋白的1-441位氨基酸。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在GGSGG连接肽取代后的狂犬病相关病毒G蛋白胞外段的N-端引入GP67信号肽。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在GGSGG连接肽取代后的狂犬病相关病毒G蛋白胞外段的C-端引入组氨酸标签。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述组氨酸标签为6×His标签。

6.根据权利要求1～5任一所述的方法，其特征在于，在昆虫细胞中表达所述狂犬病相关病毒G蛋白胞外段。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述昆虫细胞为Sf9或Hi5细胞。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，对昆虫细胞表达的蛋白进行纯化。

9.应用权利要求1～8任一所述方法制备获得的狂犬病相关病毒G蛋白胞外段。

10.含有权利要求9所述狂犬病相关病毒G蛋白胞外段的组合物。

11.一种疫苗候选组分，其特征在于，含有权利要求9所述狂犬病相关病毒G蛋白胞外段，或含有权利要求10所述的狂犬病相关病毒G蛋白胞外段的组合物。

12.一种诊断试剂盒抗原组分，其特征在于，含有权利要求9所述狂犬病相关病毒G蛋白胞外段，或含有权利要求10所述的狂犬病相关病毒G蛋白胞外段的组合物。

13.一种用于疫苗抗原含量标定的标准品，其特征在于，含有权利要求9所述的狂犬病相关病毒G蛋白胞外段，或含有权利要求10所述的狂犬病相关病毒G蛋白胞外段的组合物。

14.权利要求9所述的狂犬病相关病毒G蛋白胞外段在生物、医药领域制备产品方面的应用。