CN115916804A - 稳定的冠状病毒刺突蛋白融合蛋白 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了稳定的重组融合前SARS CoV0‑2S蛋白、编码该SARS CoV‑2S蛋白的核酸分子及这些蛋白和核酸分子的用途。
Description
本发明涉及医学领域。本发明特别涉及稳定的重组融合前冠状病毒刺突(S)蛋白，特别是SARS CoV-2 S蛋白，涉及编码所述SARS CoV-2 S蛋白的核酸分子，以及这些蛋白和核酸分子例如在疫苗中的用途。
背景技术
冠状病毒(CoV)是造成人类轻度呼吸道感染和非典型肺炎的有包膜病毒。CoV是属于套式病毒目的有包膜的单链正义RNA病毒的大家族，其可以感染广泛的哺乳动物物种和禽类物种，造成呼吸疾病或肠道疾病。冠状病毒具有大的三聚体刺突糖蛋白(S)，其介导与宿主细胞受体的结合以及病毒和宿主细胞膜的融合。
SARS-CoV-2是2019年从动物宿主到人类中出现的冠状病毒，并在全球迅速传播。SARS-CoV-2是乙型冠状病毒属，如MERS-CoV和SARS-CoV，所有这些病毒均来源于蝙蝠。由该病毒引起的疾病名称是2019冠状病毒病，缩写为COVID-19。在确诊的COVID-19病例中，COVID-19的症状从轻度症状到重度疾病和死亡不等。在SARS-CoV-2的情况下，S蛋白是主要的表面蛋白。S蛋白形成同源三聚体，并由N末端S1亚基和C末端S2亚基组成，分别负责受体结合和膜融合。最近对甲型冠状病毒属、乙型冠状病毒属和丁型冠状病毒属的CoV三聚体S结构的冷冻电镜(cryo-EM)重建揭示S1亚基包含两个不同的结构域：N末端结构域(S1 NTD)和受体结合结构域(S1RBD)。SARS-CoV-2利用其S1 RBD与人血管紧张素转换酶2(ACE2)结合(Hoffmann等人(2020)；Wrapp等人(2020))。
冠状病毒科S蛋白被分类为I类融合蛋白并负责融合。S蛋白通过从不稳定的融合前构象到稳定的融合后构象的不可逆的蛋白质重折叠，将病毒膜和宿主细胞膜融合。与许多其他I类融合蛋白一样，冠状病毒S蛋白需要受体结合和切割以诱导融合和进入所需的构象变化(Belouzard等人(2009)；Follis等人(2006)；Bosch等人(2008)，Madu等人(2009)；Walls等人(2016))。SARS-CoV2的启动涉及通过弗林蛋白酶在S1和S2亚基之间的边界(S1/S2)处的弗林蛋白酶切割位点切割S蛋白，和通过TMPRSS2在融合肽上游的保守位点(S2')切割S蛋白(Bestle等人(2020)；Hoffmann等人(2020))。
为了从融合前构象重折叠到融合后构象，有两个需要重折叠的区域，称为重折叠区1(RR1)和重折叠区2(RR2)(图1)。对于所有I类融合蛋白，RR1包括融合蛋白(FP)和七肽重复序列1(HR1)。在切割和受体结合后，三聚体中所有三个原体的螺旋、环和链的拉伸转化为长而连续的三聚体螺旋卷曲螺旋。然后，位于RR1的N末端区段的FP能够远离病毒膜延伸并插入到靶细胞的近侧膜中。接着，位于RR1的C末端并更靠近跨膜区(TM)且包括七肽重复序列2(HR2)的重折叠区2(RR2)重新定位到融合蛋白的另一侧，并且将HR1卷曲螺旋三聚体与HR2结构域结合以形成六螺旋束(6HB)。
当病毒融合蛋白如SARS CoV-2 S蛋白用作疫苗组分时，蛋白质的融合促进功能并不重要。事实上，只有疫苗组分对病毒的模拟对于诱导可结合病毒的反应性抗体才是重要的。因此，为了开发稳健有效的疫苗组分，期望将亚稳态融合蛋白维持为其融合前构象。据信，融合前构象的稳定融合蛋白如SARS CoV-2 S蛋白可诱导有效的免疫应答。
近年来，已经多次尝试对包括冠状病毒S蛋白在内的各种I类融合蛋白进行稳定处理。证明一种特别成功的方法是在碱基螺旋之前的RR1末端稳定所谓的铰链环(WO2017/037196，Krarup等人(2015)；Rutten等人(2020)，Hastie等人(2017))。该方法也已证明对于冠状病毒S蛋白是成功的，如对于SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV2所示(Pallesen等人(2016)；Wrapp等人(2020))。尽管铰链环中的脯氨酸突变确实增加冠状病毒S蛋白的表达，但S蛋白仍可能存在不稳定性。因此，对于改进的疫苗设计或S蛋白(其可例如用作工具，例如用作单克隆抗体分离的诱饵)，需要进一步稳定。
自2019年底首次在人类中观察到新型SARS-CoV-2病毒以来，COVID-19已感染数百万人，造成超过数十万人死亡，特别是因为SARS-CoV-2和更普遍来说冠状病毒缺乏有效的治疗。此外，目前还没有可用于预防冠状病毒诱导的疾病(COVID-19)的疫苗，这导致大量医疗需求未得到满足。由于新出现的传染病如COVID-19对公共卫生和经济系统构成重大威胁，因此迫切需要可用于例如疫苗中以预防冠状病毒诱导的呼吸道疾病的新型组分。
发明内容
本发明提供了稳定的重组融合前SARS CoV-2 S蛋白(即融合前构象稳定的SARSCoV-2 S蛋白)，及其片段。
在某些实施例中，融合前SARS CoV-2 S蛋白是可溶性蛋白，优选是三聚体可溶性蛋白。
本发明还提供了编码融合前SARS CoV-2 S蛋白及其片段的核酸分子，以及包含此类核酸分子的载体，例如腺病毒载体。
本发明进一步提供了稳定融合前构象的SARS-CoV2 S蛋白的方法，以及可通过所述方法获得的融合前SARS CoV-2 S蛋白。
本发明还提供了包含本文所述的SARS-CoV-2 S蛋白或其片段、核酸分子和/或载体的组合物，优选免疫原性组合物。
本发明还提供了用于诱导针对SARS CoV-2 S蛋白的免疫应答的组合物，特别是这些组合物作为SARS-CoV-2相关疾病如COVID-19的疫苗的用途。
本发明还涉及用于在受试者中诱导针对SARS CoV-2的免疫应答的方法，这些方法包括向受试者施用有效量的本文所述的融合前SARS CoV-2 S蛋白或其片段、编码所述SARSCoV-2 S蛋白的核酸分子、和/或包含所述核酸分子的载体。优选地，诱导的免疫应答的特征在于诱导针对SARS CoV-2病毒的中和抗体和/或针对SARS CoV-2病毒的保护性免疫。
在特定方面，本发明涉及用于在受试者中诱导抗SARS CoV-2 S蛋白抗体的方法，这些方法包括向受试者施用有效量的免疫原性组合物，该免疫原性组合物包含本文所述的融合前SARS CoV-2 S蛋白或其片段、编码所述SARS CoV-2 S蛋白的核酸分子、和/或包含所述核酸分子的载体。
本发明还涉及本文所述的SARS CoV-2 S蛋白或其片段用于从感染的人分离针对SARS CoV-2 S蛋白的单克隆抗体的用途。
还提供了本发明的融合前SARS CoV-2 S蛋白在筛选候选SARS CoV-2抗病毒剂(包括但不限于针对SARS CoV-2的抗体)的方法中的用途。
附图说明
当结合附图阅读时，将更好地理解前述概述以及本发明的以下详述。应理解的是本发明不限于附图中示出的准确实施例。
图1：SARS CoV-2 S蛋白的融合结构域的保守元件的示意图。头部结构域含有N末端(NTD)结构域、受体结合结构域(RBD)和结构域SD1和SD2。融合结构域含有融合肽(FP)、重折叠区1(RR1)、重折叠区2(RR2)、跨膜区(TM)和胞质尾区。S1和S2之间的切割位点和S2'切割位点用箭头指示。
图2：冻融循环后半稳定SARS-CoV-2 S三聚体蛋白的分析型SEC样品。在液氮中闪冻和解冻1次(深色实线)和5次(浅色实线)后根据SEQ ID NO:3的S三聚体蛋白(A)和其中标签替换为C标签的相同蛋白(B)，与未冷冻的S蛋白(虚线)相比。5分钟时的峰对应于S三聚体。
图3：通过AlphaLISA测定中ACE2-Fc结合衡量的以下的比较：具有所指示突变的S蛋白与对照的不稳定的未切割SARS-CoV-2 S(具有弗林蛋白酶位点突变)(SEQ ID NO:2)的S三聚体表达的百分比。所测试的重组S蛋白含有如图所示的点突变或二硫桥，其被引入不稳定的未切割SARS-CoV2 S(SEQ ID NO:2)胞外结构域的骨架中(弗林蛋白酶KO)。对粗细胞培养上清液进行分析。
图4：与具有所指示点突变或二硫桥的变体(实线)相比，示出不稳定的未切割SARS-CoV2-S(SEQ ID NO:2(虚线))的三聚体峰的分析型SEC图。对粗细胞培养上清液进行分析。
具体实施方式
如上所述，SARS-CoV-2和其他冠状病毒的刺突蛋白(S)参与病毒膜与宿主细胞膜的融合，这是感染所需的。将SARS-CoV-2 S RNA翻译成1273个氨基酸前体蛋白，这些前体蛋白在N末端含有信号肽序列(例如，SEQ ID NO:1的氨基酸残基1-13)，该信号肽序列在内质网中被信号肽酶去除。S蛋白的启动通常涉及宿主蛋白酶在冠状病毒亚组(包括SARS CoV-2)中的S1和S2亚基之间的边界(S1/S2)处和在所有已知冠状病毒中融合肽上游的保守位点(S2')处的切割。对于SARS-CoV-2，弗林蛋白酶在残基685和686之间的S1/S2处切割，随后在815和816位处的残基之间的S2'位点在S2内通过TMPRSS2切割。所提出的融合肽位于S2'位点的C末端，位于重折叠区1的N末端(图1)。
目前还没有可供使用的对抗SARS-CoV-2感染的疫苗。几种疫苗形式是可能的，例如基于基因或基于载体的疫苗，或例如基于纯化S蛋白的亚基疫苗。由于I类蛋白是亚稳态蛋白，因此增加融合蛋白的融合前构象的稳定性可增加蛋白的表达水平，因为较少的蛋白将被错误折叠，而较多的蛋白将成功地通过分泌途径转运。因此，如果I类融合蛋白如SARSCoV-2 S蛋白的融合前构象的稳定性增加，则基于载体的疫苗的免疫原性特性将提高，因为S蛋白的表达更高，并且免疫原的构象类似于有效中和抗体和保护性抗体识别的融合前构象。对于基于亚基的疫苗，稳定融合前S构象甚至是更重要的。除了成功制备疫苗所需的高表达的重要性之外，在制备过程中和在储存过程中随时间维持融合前构象对于基于蛋白质的疫苗都至关重要。此外，对于可溶性的基于亚基的疫苗，SARS CoV-2 S蛋白需要通过缺失跨膜(TM)区和胞质区来截短以产生可溶性的分泌的S蛋白(sS)。因为该TM区负责膜锚定及增加稳定性，所以无锚定的可溶性S蛋白比全长蛋白明显地更不稳定，并且将甚至更容易地重折叠成融合后最终状态。为了获得处于稳定的融合前构象且显示出高表达水平和高稳定性的可溶性S蛋白，因此需要将该融合前构象进行稳定化。还因为全长(膜结合的)SARSCoV-2 S蛋白是亚稳态的，因此对于全长SARS CoV-2 S蛋白(即包括TM区和胞质区)，例如对于任何DNA、RNA、减活或基于载体的疫苗方法，还希望使融合前构象稳定。
因此，本发明提供了稳定的重组融合前SARS CoV-2 S蛋白及其片段，其包含S1和S2结构域，并且包含至少一个突变，该至少一个突变选自由以下组成的组：对应于氨基酸残基941-945的环区中至少一个氨基酸到G的突变、和残基970与999之间的二硫桥，其中氨基酸位置的编号是根据SEQ ID NO:1中的氨基酸位置的编号。根据本发明，已经证明环区中的G和/或二硫桥在指定位置的存在增加了融合前构象的蛋白质的稳定性。根据本发明，通过将该位置的氨基酸取代(突变)为根据本发明的特定氨基酸而引入甘氨酸(G)或二硫桥。根据本发明，蛋白质因此在其氨基酸序列中包含一个或多个突变，即在这些位置的天然存在的氨基酸已被另一氨基酸取代。
蛋白质可能包含对应于氨基酸残基941-945G的环区中至少一个氨基酸的突变和残基970与999之间的二硫桥的组合。
根据本发明，应理解“残基970与999之间的二硫桥”意指在970和999位的氨基酸已突变为C。
在某些实施例中，对应于氨基酸残基941-945的环区中至少一个突变是941位的氨基酸突变为G。
可替代地或另外地，对应于氨基酸残基941-945的环区中至少一个突变是943位的氨基酸突变为G。
可替代地或另外地，对应于氨基酸残基941-945的环区中至少一个突变是944位的氨基酸突变为G。
根据本发明，因此环区中的一个或多个氨基酸可突变为G。
本发明的蛋白质可进一步包含一个或多个另外的突变，该另外的突变选自由以下组成的组：对应于氨基酸残基941-945的环区中至少一个氨基酸到P的突变、892位氨基酸的突变、614位氨基酸的突变、572位的突变、532位的突变、残基880与888之间的二硫桥、以及残基884与893之间的二硫桥，其中这些氨基酸位置的编号再次是根据SEQ ID NO:1中的氨基酸位置的编号。
根据本发明，应理解对应于氨基酸残基941-945的环区中至少一个氨基酸到P的另外的突变意指所述环区中的至少一个还未突变为G的氨基酸的突变。
在某些实施例中，对应于氨基酸残基941-945的环区中至少一个突变是942位的氨基酸突变为P。
可替代地或另外地，对应于氨基酸残基941-945的环区中至少一个突变是941位的氨基酸突变为P。
可替代地或另外地，对应于氨基酸残基941-945的环区中至少一个突变是944位的氨基酸突变为P。
可替代地或另外地，892位的突变是突变为P。
可替代地或另外地，614位的突变是突变为N或G。
可替代地或另外地，532位的突变是突变为P。
可替代地或另外地，572位的突变是突变为I。
在某些实施例中，蛋白质不包含残基880与888之间的二硫桥以及残基884与893之间的二硫桥。
在某些实施例中，SARS CoV-2 S蛋白进一步包含弗林蛋白酶切割位点的缺失。例如通过弗林蛋白酶切割位点中一个或多个氨基酸的突变(使得蛋白质不被弗林蛋白酶切割)实现的弗林蛋白酶切割的缺失会使蛋白质不被切割，这进一步增加其稳定性。缺失弗林蛋白酶切割位点能以本领域技术人员已知的任何合适的方式实现。在某些实施例中，弗林蛋白酶切割位点的缺失包括682位的氨基酸突变为S和/或685位的氨基酸突变为G。
在某些实施例中，蛋白质进一步包含986和987位氨基酸突变为脯氨酸。
在某些实施例中，本发明的SARS CoV-2 S蛋白包含至少两个突变。
在某些实施例中，本发明的SARS CoV-2 S蛋白包含至少三个突变。
在某些实施例中，本发明的SARS CoV-2 S蛋白包含至少四个突变。
在某些实施例中，本发明的SARS CoV-2 S蛋白包含至少五个突变。
在某些实施例中，本发明的SARS CoV-2 S蛋白包含至少六个突变。
根据本发明的氨基酸可以是二十种天然存在的(或“标准”)氨基酸或其变体中的任何一种(例如像D-氨基酸(具有手性中心的氨基酸的D-对映异构体))，或非天然存在于蛋白质中的任何变体(例如像正亮氨酸)。标准氨基酸可以基于它们的特性分成几组。重要的因素是电荷、亲水性或疏水性、大小和官能团。这些特性对于蛋白质结构和蛋白质-蛋白质相互作用是重要的。一些氨基酸具有特殊的特性，例如半胱氨酸，其可以与其他半胱氨酸残基形成共价二硫键(或二硫桥)；脯氨酸，其诱导多肽骨架转动；以及甘氨酸，其比其他氨基酸更具柔性。表1示出了标准氨基酸的缩写和特性。
本领域技术人员将理解可以通过常规的分子生物学程序对蛋白质进行突变。
在某些实施例中，本发明提供了重组SARS-CoV-2 S蛋白或其片段，其中941位的氨基酸是G，943位的氨基酸是G，和/或944位的氨基酸是G，和/或其包含残基970与999之间的二硫桥，其中氨基酸位置的编号是根据SEQ ID NO:1中的氨基酸位置的编号。
在某些实施例中，SARS CoV-2 S蛋白进一步包含弗林蛋白酶切割位点的缺失。例如通过弗林蛋白酶切割位点中一个或多个氨基酸的突变(使得蛋白质不被弗林蛋白酶切割)实现的弗林蛋白酶切割的缺失会使蛋白质不被切割，这进一步增加其稳定性。缺失弗林蛋白酶切割位点能以本领域技术人员已知的任何合适的方式实现。在某些实施例中，弗林蛋白酶切割位点的缺失包括682位的氨基酸突变为S和/或685位的氨基酸突变为G。
在某些实施例中，蛋白质进一步包含986和987位氨基酸突变为脯氨酸。
在某些实施例中，本发明提供了SARS-CoV 2蛋白或其片段，这些蛋白包含选自由SEQ ID NO:8-119组成的组的氨基酸序列。
在优选的实施例中，这些蛋白包含弗林蛋白酶切割位点的缺失、614位的氨基酸突变为N或G、892位的氨基酸突变为P、942位的氨基酸突变为P、943位的氨基酸突变为G、和987位的氨基酸突变为P。当这些突变被引入SARS CoV-2 S胞外结构域的氨基酸序列时，不需要添加异源三聚化结构域，便可获得稳定的可溶性三聚体SARS CoV-2S蛋白。
如本文所用，术语“片段”是指具有氨基末端和/或羧基末端和/或内部缺失的肽，但是其中剩余的氨基酸序列与SARS CoV-2 S蛋白序列(例如SARS CoV-2 S蛋白的全长序列)中的对应位置相同。应当理解，为了诱导免疫应答并且通常出于疫苗接种目的，蛋白质不需要是全长的，也不需要具有其所有野生型功能，并且该蛋白质的片段同样有用。根据本发明的片段是免疫活性片段，并且通常包含SARS CoV-2 S蛋白的至少15个氨基酸或至少30个氨基酸。在某些实施例中，其包含SARS CoV-2 S蛋白的至少50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500或550个氨基酸。在某些实施例中，该片段是SARS CoV2胞外结构域。
在某些实施例中，根据本发明的蛋白质是可溶性蛋白质，例如S蛋白胞外结构域，并且包含截短的S2结构域。如本文所用，“截短的”S2结构域是指不是全长S2结构域的S2结构域，即其中在N末端或在C末端一个或多个氨基酸残基已经缺失。根据本发明，至少跨膜结构域和胞质结构域缺失以允许表达为可溶性胞外结构域(对应于SEQ ID NO:1的氨基酸1-1208)。为了稳定这种融合前构象的可溶性SARS CoV-2 S蛋白，可以将异源三聚化结构域(例如基于纤维蛋白的三聚化结构域)与冠状病毒S蛋白胞外结构域的C末端融合。这种纤维蛋白结构域或“折叠子”衍生自T4纤维蛋白，并且早期被描述为人工天然三聚化结构域(Letarov等人,(1993)；S-Guthe等人,(2004))。因此，在某些实施例中，跨膜区被异源三聚化结构域替代。在优选的实施例中，异源三聚化结构域是包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的折叠子结构域。然而，应理解，根据本发明，其他三聚化结构域也是可能的。也可能蛋白质不包含异源三聚化结构域。
因此，在某些优选的实施例中，可溶性SARS CoV-2 S蛋白不包含异源三聚化结构域。
根据本发明的融合前SARS CoV-2 S蛋白是三聚体并且是稳定的，即在加工蛋白时，例如像在纯化、冻融循环和/或储存等时，不容易改变为融合后构象。在某些实施例中，融合前SARS CoV-2 S蛋白与没有本发明突变的SARS CoV-2 S蛋白相比具有增加的稳定性，例如增加的熔融温度(通过例如差示扫描荧光测定法测量)所表明的。
根据本发明的蛋白质可以包含信号肽(也称为信号序列或前导肽)，对应于SEQIDNO:1的氨基酸1-13。信号肽是存在于大多数最终去往分泌途径的新合成的蛋白质的N末端的短肽(通常5-30个氨基酸长)。在某些实施例中，根据本发明的蛋白质不包含信号肽。
在某些实施例中，蛋白质包含标签序列，例如HIS标签或C标签。His标签(或多组氨酸标签)是蛋白质中由至少五个组氨酸(H)残基组成的氨基酸基序，优选位于蛋白质的N末端或C末端，通常用于纯化目的。在某些实施例中，根据本发明的蛋白质不包含标签序列。可替代地，其他标签如C标签也可用于这些目的。
本发明还提供了用于稳定SARS CoV-2 S蛋白的方法，所述方法包括在SARS CoV-2S蛋白氨基酸序列中引入至少一个突变，该至少一个突变选自由以下组成的组：对应于氨基酸残基941-945的环区中至少一个氨基酸到G的突变、和残基970与999之间的二硫桥，其中氨基酸位置的编号是根据SEQ ID NO:1中的氨基酸位置的编号。
在某些实施例中，对应于氨基酸残基941-945的环区中至少一个突变是941位的氨基酸突变为G。
可替代地或另外地，对应于氨基酸残基941-945的环区中至少一个突变是943位的氨基酸突变为G。
可替代地或另外地，对应于氨基酸残基941-945的环区中至少一个突变是944位的氨基酸突变为G。
在某些实施例中，这些方法进一步包括缺失弗林蛋白酶切割位点。缺失弗林蛋白酶切割位点能以本领域已知的任何方式实现。在某些实施例中，弗林蛋白酶切割位点的缺失包括引入682位的氨基酸到S的突变和/或685位的氨基酸到G的突变。
在某些实施例中，这些方法进一步包括986和987位氨基酸突变为脯氨酸。
本发明进一步提供了编码根据本发明的SARS CoV-2 S蛋白的核酸分子。本发明中使用的术语“核酸分子”是指核苷酸的聚合形式(即多核苷酸)，并包括DNA(例如cDNA、基因组DNA)和RNA、以及上述的合成形式和混合聚合物。
在优选的实施例中，对编码根据本发明的蛋白的核酸分子进行密码子优化，以在哺乳动物细胞(优选地，人类细胞)或昆虫细胞中表达。密码子优化的方法是已知的并且先前已经描述(例如针对哺乳动物细胞的WO 96/09378)。与野生型序列相比，如果至少一个非优选密码子被更优选的密码子替代，则认为序列是密码子优化的。在本文，非优选密码子是在生物体中不如另一个编码相同氨基酸的密码子经常地使用的密码子，并且更优选的密码子是在生物体中比非优选密码子更经常地使用的密码子。特定生物体的密码子使用频率可见于密码子频率表中，比如http://www.kazusa.or.jp/codon中。优选地多于一个非优选密码子，优选地最多的或所有非优选密码子，被更优选的密码子替代。优选地，在生物体中最经常使用的密码子用于密码子优化的序列。被优选的密码子替代一般促使更高表达。
技术人员将理解，由于遗传密码的简并性，许多不同的多核苷酸和核酸分子可以编码相同的蛋白。还应当理解，技术人员可以使用常规技术制造不影响由核酸分子编码的蛋白序列的核苷酸取代，以反映有待表达蛋白的任何特定宿主生物体的密码子使用。因此，除非另外说明，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此呈简并形式且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白和RNA的核苷酸序列可以包括或可以不包括内含子。
核酸序列可以使用常规的分子生物学技术克隆，或通过DNA合成从头生成，这可以由在DNA合成和/或分子克隆领域具有业务的服务公司(例如基因技术股份公司(GeneArt)、金斯瑞公司(GenScript)、英杰公司(Invitrogen)、欧陆公司(Eurofins))使用常规程序进行。
本发明还提供了包含如上所述的核酸分子的载体。在某些实施例中，因此根据本发明的核酸分子是载体的一部分。此类载体可以通过本领域技术人员熟知的方法容易地操作，并且可以例如被设计为能在原核和/或真核细胞中复制。此外，许多载体可以用于真核细胞的转化并将整个或部分整合到这些细胞的基因组中，产生在其基因组中包含所希望的核酸的稳定的宿主细胞。所使用的载体可以是适于克隆DNA并且可以用于转录目的核酸的任何载体。
在本发明的某些实施例中，载体是腺病毒载体。根据本发明的腺病毒属于腺病毒科，并且优选地是属于哺乳动物腺病毒(Mastadenovirus)属的一种。它可以是人腺病毒，还可以是感染其他物种的腺病毒，包括但不限于牛腺病毒(例如牛腺病毒3，BAdV3)、犬腺病毒(例如CAdV2)、猪腺病毒(例如PAdV3或5)、或猿猴腺病毒(其包括猴腺病毒和猿腺病毒，如黑猩猩腺病毒或大猩猩腺病毒)。优选地，该腺病毒是人腺病毒(HAdV或AdHu)或猿猴腺病毒如黑猩猩或大猩猩腺病毒(ChAd、AdCh、或SAdV)或恒河猴腺病毒(RhAd)。在本发明中，人腺病毒意指如果称为Ad而不指明物种，例如简短符号“Ad26”意指与HAdV26相同，该HAdV26是人腺病毒血清型26。还如本文所用，符号“rAd”意指重组腺病毒，例如，“rAd26”是指重组人腺病毒26。
已使用人腺病毒进行大多数高级研究，并且根据本发明的某些方面，人腺病毒是优选的。在某些优选实施例中，根据本发明的重组腺病毒基于人腺病毒。在优选的实施例中，重组腺病毒基于人腺病毒血清型5、11、26、34、35、48、49、50、52等。根据本发明的特别优选的实施例，腺病毒是人腺病毒血清型26。这些血清型的优点包括在人群中的低血清阳性率和/或低预先存在的中和抗体滴度，以及在临床试验中用于人类受试者的经验。
猿猴腺病毒在人群中通常也具有低血清阳性率和/或低预先存在的中和抗体滴度，并且已经报道了使用黑猩猩腺病毒载体的大量工作(例如US6083716；WO 2005/071093；WO 2010/086189；WO 2010085984；Farina等人,2001,J Virol[病毒学杂志]75:11603-13；Cohen等人,2002,J Gen Virol[普通病毒学杂志]83:151-55；Kobinger等人,2006,Virology[病毒学]346:394-401；Tatsis等人,2007,Molecular Therapy[分子疗法]15:608-17；还参见Bangari和Mittal,2006,Vaccine[疫苗]24:849-62的综述；以及Lasaro和Ertl,2009,Mol Ther[分子疗法]17:1333-39的综述)。因此，在其他的实施例中，根据本发明的重组腺病毒基于猿猴腺病毒，例如黑猩猩腺病毒。在某些实施例中，重组腺病毒基于猿猴腺病毒类型1、7、8、21、22、23、24、25、26、27.1、28.1、29、30、31.1、32、33、34、35.1、36、37.2、39、40.1、41.1、42.1、43、44、45、46、48、49、50或SA7P。在某些实施例中，重组腺病毒基于黑猩猩腺病毒，如ChAdOx 1(参见例如WO 2012/172277)或ChAdOx 2(参见例如WO 2018/215766)。在某些实施例中，重组腺病毒基于黑猩猩腺病毒，如BZ28(参见例如WO 2019/086466)。在某些实施例中，重组腺病毒基于大猩猩腺病毒，如BLY6(参见例如WO 2019/086456)或BZ1(参见例如WO 2019/086466)。
优选地，该腺病毒载体是复制缺陷型重组病毒载体，如rAd26、rAd35、rAd48、rAd5HVR48等。
在本发明的优选的实施例中，这些腺病毒载体包括来自罕见血清型的衣壳蛋白，例如包括Ad26。在典型实施例中，该载体是rAd26病毒。“腺病毒衣壳蛋白”是指在腺病毒(例如，Ad26、Ad35、rAd48、rAd5HVR48载体)的衣壳上的蛋白质，该腺病毒衣壳蛋白参与确定特定的腺病毒的血清型和/或趋向性。腺病毒衣壳蛋白典型地包括纤维、五邻体和/或六邻体蛋白。如本文所用，用于特定腺病毒的“衣壳蛋白”(如“Ad26衣壳蛋白”)可以是例如包括至少一部分Ad26衣壳蛋白的嵌合的衣壳蛋白。在某些实施例中，该衣壳蛋白是Ad26的整个衣壳蛋白。在某些实施例中，该六邻体、五邻体和纤维都是Ad26的。
本领域的普通技术人员将认识到衍生自多个血清型的元件可以被组合在单一的重组腺病毒载体中。因此，可以产生组合了来自不同血清型的所希望特性的嵌合腺病毒。因此，在一些实施例中，本发明的嵌合腺病毒可以将第一血清型的预先存在的免疫的缺失与以下特征相结合：如温度稳定性、组装、锚定、产量、重定向或改善的感染、靶细胞中DNA的稳定性等。参见例如WO 2006/040330的嵌合腺病毒Ad5HVR48，其包括具有来自Ad48的部分衣壳的Ad5骨架，并参见例如WO 2019/086461的嵌合腺病毒Ad26HVRPtr1、Ad26HVRPtr12和Ad26HVRPtr13，其包括分别具有Ptr1、Ptr12和Ptr13的部分衣壳蛋白的Ad26病毒骨架。
在某些实施例中，本发明中有用的重组腺病毒载体主要或完全衍生自Ad26(即，该载体是rAd26)。在一些实施例中，该腺病毒是复制缺陷型腺病毒，例如，因为它包含基因组的E1区域中的缺失。对于衍生自非类群C的腺病毒(如Ad26或Ad35)的腺病毒，典型地是将腺病毒的E4-orf6编码序列与人类亚群C(如Ad5)的腺病毒的E4-orf6交换。这允许在表达Ad5的E1基因的熟知的补充细胞系中此类腺病毒的繁殖，例如像293细胞、PER.C6细胞等(参见，例如Havenga,等人.,2006,J Gen Virol[普通病毒学杂志]87:2135-43；WO 03/104467)。然而，这样的腺病毒将不能在不表达Ad5的E1基因的非补充细胞中复制。
重组腺病毒载体的制备在本领域是熟知的。例如在WO 2007/104792中和在Abbink等人,(2007)Virol[病毒学]81(9):4654-63中描述了rAd26载体的制备。Ad26的示例性基因组序列见于GenBank登录号EF 153474中和WO 2007/104792的SEQ ID NO:1中。可用于本发明的载体的实例例如包括描述于WO 2012/082918中的那些，将其披露内容通过引用以其全文并入本文。
典型地，使用包含整个重组腺病毒基因组的核酸来产生本发明中有用的载体(例如，质粒、粘粒、或杆状病毒载体)。因此，本发明还提供了分离的核酸分子，这些分离的核酸分子编码本发明的腺病毒载体。本发明的核酸分子可以呈RNA形式或呈DNA形式，其通过克隆而获得或以合成方式而产生。DNA可以是双链的或单链的。
本发明中有用的这些腺病毒载体典型地是复制缺陷型载体。在这些实施例中，病毒通过使对病毒复制关键的区域(例如E1区域)缺失或失活而成为复制缺陷型。通过例如在区域内插入目的基因，如编码SARS-CoV2 S蛋白的基因(通常连接至启动子)可以使这些区域基本上缺失或失活。在一些实施例中，本发明的载体可以包含其他区域如E2、E3或E4区域中的缺失，或这些区域中的一个或多个内的连接至启动子的异源基因的插入。对于E2-和/或E4-突变的腺病毒，通常使用E2-和/或E4补充细胞系来产生重组腺病毒。该腺病毒的E3区域中的突变不需要被细胞系补充，因为E3不是复制需要的。
通常使用包装细胞系来生产足够量的用于在本发明中使用的腺病毒载体。包装细胞是包含那些在复制缺陷型载体中缺失或失活的基因的细胞，因此允许病毒在细胞中复制。E1区具有缺失的腺病毒的合适包装细胞系包括例如PER.C6、911、293和E1 A549。
在本发明的优选的实施例中，该载体是腺病毒载体，并且更优选地是rAd26载体，最优选地是在该腺病毒基因组的E1区域内具有至少一个缺失的rAd26载体，例如像在Abbink,J Virol[病毒学杂志],2007.81(9):第4654-63页中描述的，将其通过引用并入本文。典型地，将编码稳定的SARS-CoV2 S蛋白的核酸序列克隆入该腺病毒基因组的E1和/或E3区域。
包含编码融合前SARS CoV-2 S蛋白的核酸分子的宿主细胞也构成本发明的一部分。融合前SARS CoV-2 S蛋白可以通过重组DNA技术产生，该重组DNA技术涉及在宿主细胞(例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、肿瘤细胞系、BHK细胞、人类细胞系(如HEK293细胞、PER.C6细胞)或酵母、真菌、昆虫细胞等)、或转基因动物或植物中表达这些分子。在某些实施例中，细胞来自多细胞生物体，在某些实施例中，它们来源于脊椎动物或无脊椎动物。在某些实施例中，细胞是哺乳动物细胞，例如人细胞或昆虫细胞。通常，在宿主细胞中生产重组蛋白(如本发明的融合前SARS CoV-2 S蛋白)包括将编码该蛋白的异源核酸分子以可表达形式引入宿主细胞，在有助于核酸分子表达的条件下培养这些细胞，以及使蛋白在所述细胞中表达。可表达形式的编码蛋白质的核酸分子可以是表达盒的形式，并且通常需要能够引起核酸表达的序列，例如一种或多种增强子、启动子、聚腺苷酸化信号等。本领域技术人员知道不同启动子可以用于实现基因在宿主细胞中的表达。启动子可以是组成型或调节型的，并且可以从不同来源(包括病毒、原核或真核来源)获得，或是人工设计的。
细胞培养基可从不同的供应商获得，并且可以常规地选择适合的培养基用于宿主细胞以表达目的蛋白，在此是融合前SARS CoV-2 S蛋白。适合的培养基可以含有或可以不含血清。
“异源核酸分子”(本文也称为“转基因”)是不天然存在于宿主细胞中的核酸分子。例如通过标准分子生物学技术将其引入载体。通常，转基因可操作地连接至表达控制序列。这可以例如通过将编码一种或多种转基因的核酸置于启动子的控制下来完成。可以添加另外的调节序列。许多启动子可用于表达一种或多种转基因并且是技术人员已知的，例如这些可以包含病毒启动子、哺乳动物启动子、合成启动子等。用于在真核细胞中实现表达的合适启动子的非限制性实例是CMV启动子(US 5,385,839)，例如CMV立即早期启动子，例如包含来自CMV立即早期基因增强子/启动子的核苷酸-735至+95。聚腺苷酸化信号(例如牛生长激素聚A信号(US5,122,458))可以存在于一种或多种转基因之后。可替代地，几种广泛使用的表达载体在本领域中可获得并且可获自商业来源，例如英杰公司的pcDNA和pEF载体系列、来自碧迪科学公司(BD Sciences)的pMSCV和pTK-Hyg、来自斯曲杰公司(Stratagene)的pCMV-Script等，它们可以用于重组表达目的蛋白，或用于获得适合的启动子和/或转录终止子序列、聚A序列等。
细胞培养物可以是任何类型的细胞培养物，包括贴壁细胞培养物，例如，附着于培养容器表面或微载体的细胞，以及悬浮培养物。大部分的大规模悬浮培养物是作为分批工艺或分批补料工艺操作，因为它们的操作和规模扩大最直接了当。如今，基于灌注原理的连续工艺正变得愈发常见并且也是适合的。适合的培养基也是技术人员熟知的，并且通常可以从商业来源大量获得，或者根据标准方案定制。例如，可以使用分批、分批补料、连续系统等在培养皿、滚瓶或生物反应器中进行培养。用于培养细胞的合适条件是已知的(参见例如Tissue Culture[组织培养],Academic Press[学术出版社],Kruse和Paterson编辑,(1973)，以及R.I.Freshney,Culture of animal cells:A manual of basic technique[动物细胞培养：基本技术手册],第四版(Wiley-Liss Inc.[威利利斯公司],2000,ISBN 0-471-34889-9))。
本发明进一步提供了包含如上所述的融合前SARS CoV-2 S蛋白和/或核酸分子和/或载体的组合物。本发明还提供了包含编码这种融合前SARS CoV-2 S蛋白的核酸分子和/或载体的组合物。本发明进一步提供了包含如上所述的融合前SARS CoV-2 S蛋白、和/或核酸分子、和/或载体的免疫原性组合物。本发明还提供了根据本发明的稳定的融合前SARS CoV-2 S蛋白、核酸分子、和/或载体用于在受试者中诱导针对SARS CoV-2 S蛋白的免疫应答的用途。进一步提供了用于在受试者中诱导针对SARS CoV-2 S蛋白的免疫应答的方法，这些方法包括向该受试者施用根据本发明的融合前SARS CoV-2 S蛋白、和/或核酸分子、和/或载体。还提供了根据本发明的融合前SARS CoV-2 S蛋白、核酸分子和/或载体，用于在受试者中诱导针对SARS CoV-2 S蛋白的免疫应答。进一步提供了根据本发明的融合前SARS CoV-2 S蛋白、和/或核酸分子、和/或载体用于制备用于在受试者中诱导针对SARSCoV-2 S蛋白的免疫应答的药物的用途。在某些实施例中，核酸分子是DNA和/或RNA分子。
本发明的融合前SARS CoV-2 S蛋白、核酸分子或载体可以用于预防(防治，包括暴露后防治)SARS CoV-2感染。在某些实施例中，可以针对易感SARS CoV-2感染和/或有相应感染风险或已经被诊断为SARS CoV-2感染的患者群组实施预防。此类目标群组包括但不限于例如老年人(例如≥50岁、≥60岁、优选≥65岁)、住院治疗的患者以及已经用抗病毒化合物进行治疗但是已经显示出不充分抗病毒反应的患者。在某些实施例中，目标群体包括2月龄起的人类受试者。
根据本发明的融合前SARS CoV-2 S蛋白、核酸分子和/或载体可以用于例如由SARS CoV-2所引起的疾病或病症的独立治疗和/或防治，或与其他防治和/或治疗性治疗(如(现有或将来的)疫苗、抗病毒剂和/或单克隆抗体)组合。
本发明进一步提供了用于利用根据本发明的融合前SARS CoV-2 S蛋白、核酸分子和/或载体在受试者中预防和/或治疗SARS CoV-2感染的方法。在特定实施例中，用于在受试者中预防和/或治疗SARS CoV-2感染的方法包括向有需要的受试者施用有效量的如上所述的融合前SARS CoV-2 S蛋白、核酸分子和/或载体。治疗有效量是指蛋白质、核酸分子或载体的有效用于预防、缓解和/或治疗因感染SARS CoV-2所引起的疾病或病症的量。预防涵盖抑制或减少SARS CoV-2的传播或者抑制或减少与SARS CoV-2感染相关的一种或多种症状的发作、发展或进展。如本文所用，缓解可以指减少SARS CoV-2感染的可见或可察觉的疾病症状、病毒血症、或任何其他可测量的表现形式。
为向受试者(例如人类)施用，本发明可以采用药物组合物，这些药物组合物包含如本文所述的融合前SARS CoV-2 S蛋白、核酸分子、和/或载体、以及药学上可接受的载剂或赋形剂。在本上下文中，术语“药学上可接受的”意指该载剂或赋形剂在所采用的剂量和浓度下不会在它们施用的受试者中引起任何不必要或不良的影响。此类药学上可接受的载剂和赋形剂是本领域熟知的(参见Remington's Pharmaceutical Sciences[雷明顿制药科学],第18版,A.R.Gennaro编辑,Mack Publishing Company[麦克出版公司][1990]；Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins[肽和蛋白质的药物配制品开发],S.Frokjaer和L.Hovgaard编辑,Taylor&Francis[泰勒弗朗西斯公司][2000]；和Handbook of Pharmaceutical Excipients[药用赋形剂手册],第3版,A.Kibbe编辑,Pharmaceutical Press[医药出版社][2000])。尽管还可以运用冻干制剂，但CoV S蛋白或核酸分子优选地是作为无菌溶液配制和施用。无菌溶液是通过无菌过滤或通过本领域中自身已知的其他方法制备。然后将这些溶液冻干或填充到医药剂量容器中。溶液的pH通常在pH 3.0至9.5(例如pH 5.0至7.5)的范围内。CoV S蛋白典型地在具有适合的药学上可接受的缓冲液的溶液中，并且该组合物还可以含有盐。任选地，稳定剂(如白蛋白)可以存在。在某些实施例中，添加洗涤剂。在某些实施例中，可以将CoV S蛋白配制成可注射制剂。
在某些实施例中，根据本发明的组合物进一步包含一种或多种佐剂。佐剂在本领域中已知可进一步提高对所施加的抗原决定簇的免疫应答。术语“佐剂”和“免疫刺激剂”在本文中可互换地使用，并且被定义为引起免疫系统刺激的一种或多种物质。在此上下文中，使用佐剂来增强对本发明的SARS CoV-2 S蛋白的免疫应答。合适的佐剂的实例包括铝盐，如氢氧化铝和/或磷酸铝；油-乳液组合物(或水包油组合物)，包括角鲨烯-水乳液，如MF59(参见例如WO 90/14837)；皂苷配制品，例如像QS21和免疫刺激复合物(ISCOMS)(参见，例如US 5,057,540；WO 90/03184、WO 96/11711、WO 2004/004762、WO 2005/002620)；细菌或微生物衍生物，其实例是单磷酰脂质A(MPL)、3-O-脱酰基MPL(3dMPL)、含CpG基序的寡核苷酸、ADP-核糖基化细菌毒素或其突变体，如大肠杆菌热不稳定肠毒素LT、霍乱毒素CT等；真核蛋白(例如，其抗体或片段(例如，针对抗原本身或CD1a、CD3、CD7、CD80)和受体的配体(例如，CD40L、GMCSF、GCSF等))，其在与受体细胞相互作用时刺激免疫应答。在某些实施例中，本发明的组合物包含作为佐剂的铝，例如氢氧化铝、磷酸铝、磷酸铝钾或其组合的形式，浓度为0.05-5mg，例如每剂量铝含量为0.075-1.0mg。
融合前SARS CoV-2 S蛋白还可以与纳米颗粒(例如像聚合物、脂质体、病毒体、病毒样颗粒)组合或缀合来施用。SARS CoV-2 S蛋白可以在含或不含佐剂的情况下与纳米颗粒组合、或包裹在纳米颗粒中、或与纳米颗粒缀合。封装在脂质体内描述于例如US 4,235,877中。与大分子缀合披露于例如US 4,372,945或US 4,474,757中。
在其他实施例中，这些组合物不包含佐剂。
在某些实施例中，本发明提供了用于制备针对SARS CoV-2病毒的疫苗的方法，这些方法包括提供根据本发明的组合物并且将其配制成药学上可接受的组合物。术语“疫苗”是指含有在受试者中有效诱导一定程度的对抗某一病原体或疾病的免疫力的活性组分的药剂或组合物，它将至少引起与被该病原体或该疾病感染相关的症状的严重程度、持续时间或其他表现形式的降低(多至完全没有)。在本发明中，疫苗包含有效量的融合前SARSCoV-2 S蛋白和/或编码融合前SARS CoV-2 S蛋白的核酸分子和/或包含所述核酸分子的载体，它引起针对SARS CoV-2的S蛋白的免疫应答。这提供了在受试者中预防引起住院的严重下呼吸道疾病并且降低由SARS CoV-2感染和复制引起的并发症(如肺炎和细支气管炎)的频率的方法。根据本发明的术语“疫苗”表示它是药物组合物，并且因此典型地包括药学上可接受的稀释剂、载剂或赋形剂。它可以包含或可以不包含另外的活性成分。在某些实施例中，其可以是组合疫苗，其进一步包含诱导针对SARS CoV-2(例如针对SARS CoV-2的其他抗原蛋白)的免疫应答的另外组分，或可以包含不同形式的相同抗原组分。组合产品还可以包含针对其他感染因子(例如其他呼吸道病毒，包括但不限于流感病毒或RSV)的免疫原性组分。另外的活性组分的施用可以例如通过分开(例如同时)施用或在初免-加强设置下或通过施用本发明的疫苗与另外的活性组分的组合产物来进行。
可以将组合物施用至受试者，例如人类受试者。用于单独施用的组合物中的SARSCoV-2 S蛋白的总剂量可以是例如约0.01μg至约10mg，例如1μg-1mg，例如10μg-100μg。确定所推荐的剂量将通过实验进行并且对本领域技术人员来说是常规的。
根据本发明的组合物的施用可以使用标准施用途径执行。非限制性实施例包括胃肠外施用，如皮内、肌内、皮下、经皮、或粘膜施用，例如鼻内、经口等。在一个实施例中，通过肌内注射来施用组合物。技术人员已知施用组合物(例如疫苗)以诱导对疫苗中的一种或多种抗原的免疫应答的不同可能性。
如本文所用，受试者优选地是哺乳动物，例如啮齿动物，例如小鼠、棉鼠、或非人类灵长类动物或人类。优选地，该受试者是人类受试者。
蛋白质、核酸分子、载体、和/或组合物还可以在同源或异源初免-加强方案中作为初次来施用或作为加强来施用。如果执行加强疫苗接种，则典型地，这种加强疫苗接种将在该组合物第一次向受试者(在此类情况下称为“初次疫苗接种”)施用后一周与一年之间，优选地在两周与四个月之间的某个时间点施用至同一受试者。在某些实施例中，施用包括至少一次初次施用和至少一次加强施用。
SARS CoV-2 S蛋白还可以用于从生物样品中分离单克隆抗体，例如从已免疫动物或感染的人中获得的生物样品(如血液、血浆或细胞)。因此，本发明还涉及SARS CoV-2蛋白作为诱饵用于分离单克隆抗体的用途。
还提供了本发明的融合前SARS CoV-2 S蛋白在筛选候选SARS CoV-2抗病毒剂(包括但不限于针对SARS CoV-2的抗体)的方法中的用途。
此外，本发明的蛋白质可以用作诊断工具，例如通过确定这种个体的血清中是否存在能够结合本发明的蛋白质的抗体来测试个体的免疫状态。因此，本发明还涉及用于检测受试者体内是否存在正在进行的或既往的CoV感染的体外诊断方法，所述方法包括以下步骤：a)使获得自所述受试者的生物样品与根据本发明的蛋白接触；以及b)检测抗体-蛋白复合物的存在。
实例
实例1：半稳定SARS-CoV2 S蛋白的不稳定性
基因艺术公司(Gene Art)(生命技术公司(Life Technologies)，加利福尼亚州卡尔斯巴德(Carlsbad,CA))合成对应于(Wrapp等人,Science[科学]2020,弗林蛋白酶KO+PP，根据SEQ ID NO:3)描述的半稳定SARS-CoV2 S蛋白的质粒并进行密码子优化。对具有HIS标签的变体和具有C标签的变体进行纯化。将这些构建体克隆到pCDNA2004中或通过该领域内公知的标准方法(包括定点诱变和PCR)产生，并且测序。使用的表达平台是Expi293F细胞。根据制造商说明书使用ExpiFectamine(生命技术公司)对细胞进行瞬时转染，并在37℃和10％ CO2下培养6天。收获培养上清液，并以300g旋转5分钟以去除细胞和细胞碎片。随后使用0.22um真空过滤器无菌过滤旋转过的上清液，并在4℃储存直至使用。
SARS-CoV2 S三聚体用两步纯化方案纯化，包括用于C标签蛋白的CaptureSelectTMC标签亲和柱或对于HIS标签蛋白，通过cOmplete His标签5mL(罗氏公司(Roche))。使用HiLoad Superdex 200 16/600柱(通用电气医疗集团(GE Healthcare))通过尺寸排阻色谱法进一步纯化两种蛋白质。C标签和HIS标签S三聚体在重复的冷冻/解冻循环后是不稳定的(图2A，2B)。纯化的HIS标签S三聚体和C标签三聚体在使用液氮进行1次特别是5次闪冻循环后显示出衰变(图2A，2B)。
实例2：用AlphaLISA和分析型SEC分析稳定性突变
为了稳定SARS-CoV2 S蛋白的不稳定融合前构象，使941、943和/或944位的氨基酸残基(根据SEQ ID NO:1编号)突变为G并且引入残基970与999之间的二硫桥。在Expi293F细胞中表达编码在C末端融合到折叠子的重组SARS-CoV-2 S蛋白胞外结构域(SEQ ID NO:4)的质粒，并在转染后3天，使用AlphaLISA检测上清液与ACE2-Fc的结合(图3)。
对于AlphaLISA测定，制备含有接头，随后是分选酶A标签，随后是Flag标签，随后是柔性(G4S)7接头并以His标签结束(位于S蛋白的C端的标签的序列在SEQ ID NO:2中提供)的pcDNA2004载体中的SARS-CoV2 S变体。转染后三天，在AlphaLISA缓冲液(PBS+0.05％Tween-20+0.5mg/mL BSA)中将粗上清液稀释300倍。然后将10μL的每种稀释液转移到96孔板中，并与40μL受体珠粒、供体珠粒和ACE2-Fc混合。将供体珠粒与ProtA(目录号：AS102M，珀金埃尔默公司(Perkin Elmer))缀合，其结合至ACE2Fc。将受体珠粒与结合至构建体的His标签的抗His抗体(目录号：AL128M，珀金埃尔默公司)缀合。
将含有表达的S蛋白、ACE-2-Fc、供体珠粒和受体珠粒的上清液的混合物在室温下无振荡孵育2小时。随后，用Ensight读板器仪器(珀金埃尔默公司)测量化学发光信号。从针对每种SARS-CoV-2 S变体测量的AlphaLISA计数中减去归因于模拟转染细胞的平均背景信号。然后，将整个数据集除以针对具有S骨架序列信号的SARS CoV-2 S蛋白测量的信号，以将针对测试的每种S变体的信号归一化为骨架。
与具有C末端折叠子结构域的可溶性未切割S变体(SEQ ID NO:2)相比，具有在941、943和944位的稳定性氨基酸取代或具有残基970与999之间的二硫化物的S变体显示出更高的ACE2-Fc结合(图3)。
使用分析型SEC来分析用不稳定未切割SARS CoV-2 S蛋白转染的细胞培养上清液，以及具有在941、943和/或944位的氨基酸取代和具有残基970与999之间的二硫化物的变体的细胞培养上清液(图4)。超高效液相色谱系统(Vanquish，赛默飞世尔科技公司(Thermo Scientific))和与OptilabμT-rEX折射率检测器(怀雅特公司(Wyatt))耦合的μDAWN TREOS仪器(怀雅特公司)与在线Nanostar DLS读数器(怀雅特公司)组合用于进行分析型SEC实验。将澄清的粗细胞培养上清液以0.35mL/min施加到SRT-10C SEC-500 15cm柱(赛分科技股份有限公司(Sepax)目录号235500-4615)上，该柱具有在流动缓冲液(150mM磷酸钠、50mM NaCl，pH 7.0)中平衡的相应保护柱(赛分科技股份有限公司)。当分析上清液样品时，μMALS检测器是离线的，并且使用Chromeleon 7.2.8.0软件包对分析型SEC数据进行分析。从S转染的细胞的上清液的信号中减去未转染细胞的上清液的信号。当使用SEC-MALS分析纯化的蛋白质时，mMALS检测器是在线的并使用Astra 7.3软件包分析数据。对于蛋白质组分，使用0.1850的dn/dc(mL/g)值，对于聚糖组分，使用0.1410的值。根据培养上清液的分析型SEC，与具有C末端折叠子结构域的可溶性未切割S变体相比，具有氨基酸取代T941G、S943G、A944G和残基970与999之间的二硫化物的变体显示出更高的三聚体含量。
表1.标准氨基酸、缩写和特性
| 氨基酸 | 三字母 | 单字母 | 侧链极性 | 侧链电荷(pH 7.4) |
| 丙氨酸 | Ala | A | 非极性 | 中性 |
| 精氨酸 | Arg | R | 极性 | 正 |
| 天冬酰胺 | Asn | N | 极性 | 中性 |
| 天冬氨酸 | Asp | D | 极性 | 负 |
| 半胱氨酸 | Cys | C | 非极性 | 中性 |
| 谷氨酸 | Glu | E | 极性 | 负 |
| 谷氨酰胺 | Gln | Q | 极性 | 中性 |
| 甘氨酸 | Gly | G | 非极性 | 中性 |
| 组氨酸 | His | H | 极性 | 正(10％)中性(90％) |
| 异亮氨酸 | Ile | I | 非极性 | 中性 |
| 亮氨酸 | Leu | L | 非极性 | 中性 |
| 赖氨酸 | Lys | K | 极性 | 正 |
| 甲硫氨酸 | Met | M | 非极性 | 中性 |
| 苯丙氨酸 | Phe | F | 非极性 | 中性 |
| 脯氨酸 | Pro | P | 非极性 | 中性 |
| 丝氨酸 | Ser | S | 极性 | 中性 |
| 苏氨酸 | Thr | T | 极性 | 中性 |
| 色氨酸 | Trp | W | 非极性 | 中性 |
| 酪氨酸 | Tyr | Y | 极性 | 中性 |
| 缬氨酸 | Val | V | 非极性 | 中性 |
参考文献
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S-Guthe et al.(2004),J.Mol.Biol.337:905-915
序列
SEQ ID NO 1：全长S蛋白(下划线信号肽、双下划线TM和可溶性形式中缺失的胞质结构域)
SEQ ID NO 2：可溶性S蛋白(具有弗林蛋白酶KO、下划线信号肽、双下划线接头、折叠子、标签等)
SEQ ID NO 3：具有弗林蛋白酶KO和在铰链环中具有双脯氨酸的可溶性S蛋白。(下划线信号肽、双下划线接头、折叠子、标签等)
SEQ ID NO 4：折叠子
GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL
SEQ ID NO 5：WT可溶性S(胞外结构域)
SEQ ID NO 6：WT全长S+弗林蛋白酶KO
SEQ ID NO 7：WT可溶性S+弗林蛋白酶KO
SEQ ID NO 8：SEQ ID NO 1+T941G
SEQ ID NO 9：SEQ ID NO 1+S943G
SEQ ID NO 10：SEQ ID NO 1+D614N+A892P+A942P+T941G
SEQ ID NO 11：SEQ ID NO 1+D614N+A892P+A942P+S943G
SEQ ID NO 12：SEQ ID NO 1+D614N+A892P+A942P+T941G+S943G
SEQ ID NO 13：SEQ ID NO 1+D614N+A892P+A942P+T941G+A944P
SEQ ID NO 14：SEQ ID NO 1+D614N+A892P+A942P+S943G+A944P
SEQ ID NO 15：SEQ ID NO 1+T941G+K986P
SEQ ID NO 16：SEQ ID NO 1+S943G+K986P
SEQ ID NO 17：SEQ ID NO 1+D614N+A892P+A942P+T941G+K986P
SEQ ID NO 18：SEQ ID NO 1+D614N+A892P+A942P+S943G+K986P
SEQ ID NO 19：SEQ ID NO 1+D614N+A892P+A942P+T941G+S943G+K986P
SEQ ID NO 20：SEQ ID NO 1+D614N+A892P+A942P+T941G+A944P+K986P
SEQ ID NO 21：SEQ ID NO 1+D614N+A892P+A942P+S943G+A944P+K986P
SEQ ID NO 22：SEQ ID NO 1+T941G+V987P
SEQ ID NO 23：SEQ ID NO 1+S943G+V987P
SEQ ID NO 24：SEQ ID NO 1+D614N+A892P+A942P+T941G+V987P
SEQ ID NO 25：SEQ ID NO 1+D614N+A892P+A942P+S943G+V987P
SEQ ID NO 26：SEQ ID NO 1+D614N+A892P+A942P+T941G+S943G+V987P
SEQ ID NO 27：SEQ ID NO 1+D614N+A892P+A942P+T941G+A944P+V987P
SEQ ID NO 28：SEQ ID NO 1+D614N+A892P+A942P+S943G+A944P+V987P
SEQ ID NO 29：SEQ ID NO 1+T941G+K986P+V987P
SEQ ID NO 30：SEQ ID NO 1+S943G+K986P+V987P
SEQ ID NO 31：SEQ ID NO 1+D614N+A892P+A942P+T941G+K986P+V987P
SEQ ID NO 32：SEQ ID NO 1+D614N+A892P+A942P+S943G+K986P+V987P
SEQ ID NO 33：SEQ ID NO 1+D614N+A892P+A942P+T941G+S943G+K986P+V987P
SEQ ID NO 34：SEQ ID NO 1+D614N+A892P+A942P+T941G+A944P+K986P+V987P
SEQ ID NO 35：SEQ ID NO 1+D614N+A892P+A942P+S943G+A944P+K986P+V987P
SEQ ID NO 36：SEQ ID NO 6+T941G
SEQ ID NO 37：SEQ ID NO 6+S943G
SEQ ID NO 38：SEQ ID NO 6+D614N+A892P+A942P+T941G
SEQ ID NO 39：SEQ ID NO 6+D614N+A892P+A942P+S943G
SEQ ID NO 40：SEQ ID NO 6+D614N+A892P+A942P+T941G+S943G
SEQ ID NO 41：SEQ ID NO 6+D614N+A892P+A942P+T941G+A944P
SEQ ID NO 42：SEQ ID NO 6+D614N+A892P+A942P+S943G+A944P
SEQ ID NO 43：SEQ ID NO 6+T941G+K986P
SEQ ID NO 44：SEQ ID NO 6+S943G+K986P
SEQ ID NO 45：SEQ ID NO 6+D614N+A892P+A942P+T941G+K986P
SEQ ID NO 46：SEQ ID NO 6+D614N+A892P+A942P+S943G+K986P
SEQ ID NO 47：SEQ ID NO 6+D614N+A892P+A942P+T941G+S943G+K986P
SEQ ID NO 48：SEQ ID NO 6+D614N+A892P+A942P+T941G+A944P+K986P
SEQ ID NO 49：SEQ ID NO 6+D614N+A892P+A942P+S943G+A944P+K986P
SEQ ID NO 50：SEQ ID NO 6+T941G+V987P
SEQ ID NO 51：SEQ ID NO 6+S943G+V987P
SEQ ID NO 52：SEQ ID NO 6+D614N+A892P+A942P+T941G+V987P
SEQ ID NO 53：SEQ ID NO 6+D614N+A892P+A942P+S943G+V987P
SEQ ID NO 54：SEQ ID NO 6+D614N+A892P+A942P+T941G+S943G+V987P
SEQ ID NO 55：SEQ ID NO 6+D614N+A892P+A942P+T941G+A944P+V987P
SEQ ID NO 56：SEQ ID NO 6+D614N+A892P+A942P+S943G+A944P+V987P
SEQ ID NO 57：SEQ ID NO 6+T941G+K986P+V987P
SEQ ID NO 58：SEQ ID NO 6+S943G+K986P+V987P
SEQ ID NO 59：SEQ ID NO 6+D614N+A892P+A942P+T941G+K986P+V987P
SEQ ID NO 60：SEQ ID NO 6+D614N+A892P+A942P+S943G+K986P+V987P
SEQ ID NO 61：SEQ ID NO 6+D614N+A892P+A942P+T941G+S943G+K986P+V987P
SEQ ID NO 62：SEQ ID NO 6+D614N+A892P+A942P+T941G+A944P+K986P+V987P
SEQ ID NO 63：SEQ ID NO 6+D614N+A892P+A942P+S943G+A944P+K986P+V987P
SEQ ID NO 64：SEQ ID NO 5+T941G
SEQ ID NO 65：SEQ ID NO 5+S943G
SEQ ID NO 66：SEQ ID NO 5+D614N+A892P+A942P+T941G
SEQ ID NO 67：SEQ ID NO 5+D614N+A892P+A942P+S943G
SEQ ID NO 68：SEQ ID NO 5+D614N+A892P+A942P+T941G+S943G
SEQ ID NO 69：SEQ ID NO 5+D614N+A892P+A942P+T941G+A944P
SEQ ID NO 70：SEQ ID NO 5+D614N+A892P+A942P+S943G+A944P
SEQ ID NO 71：SEQ ID NO 5+T941G+K986P
SEQ ID NO 72：SEQ ID NO 5+S943G+K986P
SEQ ID NO 73：SEQ ID NO 5+D614N+A892P+A942P+T941G+K986P
SEQ ID NO 74：SEQ ID NO 5+D614N+A892P+A942P+S943G+K986P
SEQ ID NO 75：SEQ ID NO 5+D614N+A892P+A942P+T941G+S943G+K986P
SEQ ID NO 76：SEQ ID NO 5+D614N+A892P+A942P+T941G+A944P+K986P
SEQ ID NO 77：SEQ ID NO 5+D614N+A892P+A942P+S943G+A944P+K986P
SEQ ID NO 78：SEQ ID NO 5+T941G+V987P
SEQ ID NO 79：SEQ ID NO 5+S943G+V987P
SEQ ID NO 80：SEQ ID NO 5+D614N+A892P+A942P+T941G+V987P
SEQ ID NO 81：SEQ ID NO 5+D614N+A892P+A942P+S943G+V987P
SEQ ID NO 82：SEQ ID NO 5+D614N+A892P+A942P+T941G+S943G+V987P
SEQ ID NO 83：SEQ ID NO 5+D614N+A892P+A942P+T941G+A944P+V987P
SEQ ID NO 84：SEQ ID NO 5+D614N+A892P+A942P+S943G+A944P+V987P
SEQ ID NO 85：SEQ ID NO 5+T941G+K986P+V987P
SEQ ID NO 86：SEQ ID NO 5+S943G+K986P+V987P
SEQ ID NO 87：SEQ ID NO 5+D614N+A892P+A942P+T941G+K986P+V987P
SEQ ID NO 88：SEQ ID NO 5+D614N+A892P+A942P+S943G+K986P+V987P
SEQ ID NO 89：SEQ ID NO 5+D614N+A892P+A942P+T941G+S943G+K986P+V987P
SEQ ID NO 90：SEQ ID No5+D614N+A892P+A942P+T941G+A944P+K986P+V987P
SEQ ID NO 91：SEQ ID NO 5+D614N+A892P+A942P+S943G+A944P+K986P+V987P
SEQ ID NO 92：SEQ ID NO 7+T941G
SEQ ID NO 93：SEQ ID NO 7+S943G
SEQ ID NO 94：SEQ ID NO 7+D614N+A892P+A942P+T941G
SEQ ID NO 95：SEQ ID NO 7+D614N+A892P+A942P+S943G
SEQ ID NO 96：SEQ ID NO 7+D614N+A892P+A942P+T941G+S943G
SEQ ID NO 97：SEQ ID NO 7+D614N+A892P+A942P+T941G+A944P
SEQ ID NO 98：SEQ ID NO 7+D614N+A892P+A942P+S943G+A944P
SEQ ID NO 99：SEQ ID NO 7+T941G+K986P
SEQ ID NO 100：SEQ ID NO 7+S943G+K986P
SEQ ID NO 101：SEQ ID NO 7+D614N+A892P+A942P+T941G+K986P
SEQ ID NO 102：SEQ ID NO 7+D614N+A892P+A942P+S943G+K986P
SEQ ID NO 103：SEQ ID NO 7+D614N+A892P+A942P+T941G+S943G+K986P
SEQ ID NO 104：SEQ ID NO 7+D614N+A892P+A942P+T941G+A944P+K986P
SEQ ID NO 105：SEQ ID NO 7+D614N+A892P+A942P+S943G+A944P+K986P
SEQ ID NO 106：SEQ ID NO 7+T941G+V987P
SEQ ID NO 107：SEQ ID NO 7+S943G+V987P
SEQ ID NO 108：SEQ ID NO 7+D614N+A892P+A942P+T941G+V987P
SEQ ID NO 109：SEQ ID NO 7+D614N+A892P+A942P+S943G+V987P
SEQ ID NO 110：SEQ ID NO 7+D614N+A892P+A942P+T941G+S943G+V987P
SEQ ID NO 111：SEQ ID NO 7+D614N+A892P+A942P+T941G+A944P+V987P
SEQ ID NO 112：SEQ ID NO 7+D614N+A892P+A942P+S943G+A944P+V987P
SEQ ID NO 113：SEQ ID NO 7+T941G+K986P+V987P
SEQ ID NO 114：SEQ ID NO 7+S943G+K986P+V987P
SEQ ID NO 115：SEQ ID NO 7+D614N+A892P+A942P+T941G+K986P+V987P
SEQ ID NO 116：SEQ ID NO 7+D614N+A892P+A942P+S943G+K986P+V987P
SEQ ID NO 117：SEQ ID NO 7+D614N+A892P+A942P+T941G+S943G+K986P+V987P
SEQ ID NO 118：SEQ ID NO 7+D614N+A892P+A942P+T941G+A944P+K986P+V987P
SEQ ID NO 119：SEQ ID NO 7+D614N+A892P+A942P+S943G+A944P+K986P+V987P
Claims (23)
1.一种重组融合前SARS CoV-2S蛋白或其片段，该蛋白或其片段包含S1和S2结构域，并且包含至少一个突变，该至少一个突变选自由以下组成的组：对应于氨基酸残基941-945的环区中至少一个氨基酸到G的突变、和残基970与999之间的二硫桥，其中这些氨基酸位置的编号是根据SEQ ID NO:1中的氨基酸位置的编号。
2.根据权利要求1所述的蛋白，其中该对应于氨基酸残基941-945的环区中至少一个突变是941位的氨基酸突变为G。
3.根据权利要求1或2所述的蛋白，其中该对应于氨基酸残基941-945的环区中至少一个突变是943位的氨基酸突变为G。
4.根据权利要求1、2或3所述的蛋白，其中该对应于氨基酸残基941-945的环区中至少一个突变是944位的氨基酸突变为G。
5.根据前述权利要求中任一项所述的蛋白，其进一步包含弗林蛋白酶切割位点的缺失。
6.根据权利要求5所述的蛋白，其中该弗林蛋白酶切割位点的缺失包括682位的氨基酸突变为S和/或685位的氨基酸突变为G。
7.根据前述权利要求中任一项所述的蛋白，其进一步包含986和/或987位的氨基酸突变为P。
8.根据前述权利要求中任一项所述的蛋白，其包含氨基酸序列或其片段，该氨基酸序列选自由SEQ ID NO:8-119组成的组。
9.根据前述权利要求中任一项所述的蛋白，其中该蛋白不包含信号肽或标签序列。
10.根据前述权利要求中任一项所述的蛋白，其包含截短的S2结构域。
11.根据权利要求10所述的蛋白，其中已去除跨膜和胞质结构域。
12.根据权利要求10或11所述的蛋白，其中异源三聚化结构域与该截短的S2结构域连接。
13.根据权利要求12所述的蛋白，其中该异源三聚化结构域是包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的折叠子结构域。
14.一种核酸分子，其编码根据前述权利要求1-13中任一项所述的蛋白。
15.根据权利要求14所述的核酸，其中该核酸分子是DNA或RNA。
16.一种载体，其包含根据权利要求14或15所述的核酸。
17.根据权利要求16所述的载体，其中该载体是人重组腺病毒载体。
18.一种组合物，其包含根据权利要求1-13中任一项所述的蛋白、根据权利要求14所述的核酸和/或根据权利要求16或17所述的载体。
19.一种COVID-19疫苗，其包含根据权利要求1-13中任一项所述的蛋白、根据权利要求14或15所述的核酸和/或根据权利要求16或17所述的载体。
20.一种用于预防COVID-19的方法，该方法包括向该受试者施用根据权利要求19所述的疫苗。
21.一种用于减少受试者中SARS-CoV-2感染和/或复制的方法，该方法包括向该受试者施用根据权利要求18所述的组合物或根据权利要求19所述的疫苗。
22.一种分离的宿主细胞，其包含根据权利要求14所述的核酸。
23.一种分离的宿主细胞，其包含血清型26的重组人腺病毒，该血清型26的重组人腺病毒包含根据权利要求14所述的核酸。
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