CN108368156A - 线虫传多面体病毒外壳蛋白融合多肽及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及新的融合多肽及其用途。具体来说，本发明涉及源自于线虫传多面体病毒的缀合外壳蛋白、使用这些蛋白制造的病毒样粒子及其用途。本发明的粒子可以暴露和/或禁闭目标分子，并可用于各种不同领域例如制药、农业或兽医领域。

Description

线虫传多面体病毒外壳蛋白融合多肽及其用途
本发明涉及新的融合多肽及其用途。具体来说，本发明涉及源自于线虫传多面体病毒(nepovirus)的缀合外壳蛋白、使用这些蛋白制造的病毒样粒子及其用途。本发明的粒子可以暴露和/或禁闭目标分子，并可用于各种不同领域例如制药、农业或兽医领域。
背景技术
在本领域中，已公开了从病毒衣壳来源的蛋白质制造的病毒样粒子(“VLP”)的使用以及它们用于递送或暴露抗原的用途。
例如，已从动物病毒例如反转录病毒或AAV制造了VLP。然而，这些VLP需要复杂的结构并且不总是便于制造。
也已描述了源自于植物病毒的VLP。例如，Sainsbury等人(Annual Review ofPhytopathology 2010 48:437–455)报道了从豇豆花叶病毒生产VLP。然而，这些构建物需要两种不同亚基(L和S)的共表达和组装或前体多肽和蛋白酶的表达，使得到的VLP难以正确折叠和生产。
Denis等人(Virology 363(2007)59–68)使用番木瓜花叶病毒的衣壳蛋白来暴露短的HCV病毒表位。类似地，Natilla和Hammond(Journal of Virological Methods 178(2011)209–215)从与短肽(8个氨基酸)缀合的玉米雷亚多非纳病毒的衣壳蛋白制备了VLP。报道的其他实例使用了番茄丛矮病毒(Kumar等，2009,Virology 388,185–190)、马铃薯病毒Y(Kalnciema等，2012Molecular Biotechnology 52 2,129)或洋蓟斑点皱纹病毒(Arcangeli等，Journal of Biomolecular Structure and Dynamics Volume 32,Issue4,2014)。
然而，在每个这些构建物中，得到的VLP通常只允许小分子的偶联，和/或需要不同亚基的组装，和/或只允许将肽暴露到所述VLP的外部，和/或产生包含或不包含核酸的大的丝状结构而不是二十面体VLP结构。
本发明提供了源自于线虫传多面体病毒的新的融合分子和VLP，其具有改进的和出人意料的性质。
发明内容
本发明涉及源自于线虫传多面体病毒外壳蛋白的融合分子和VLP及其用途。本发明显示，线虫传多面体病毒的外壳蛋白可用于生产稳定的VLP。本发明还显示，线虫传多面体病毒外壳蛋白是非常通用的蛋白质，其允许将大的外来化合物融合到其N-和/或C-端而不丧失其形成VLP的能力。此外，本发明显示，在所述外壳蛋白的C-端处融合化合物导致所述化合物暴露在VLP的表面上，而将化合物融合到N-端导致它内化到所述VLP中，使所述化合物不可被抗体接近(“禁闭”)。因此，有可能生产具有两种不同性质的VLP：目标化合物的表面暴露和/或通过内化的保护(禁闭)。此外，所述VLP使用单一类型的外壳蛋白生产，尺寸相当小，结构简单并且不含核酸。此外并且有利的是，线虫传多面体病毒的外壳蛋白可以融合到非常大的蛋白质(超过200个氨基酸)而不失去其组装成VLP的能力。据我们所知，在本领域中尚未描述过同时具有所有这些性质的病毒蛋白。
因此，本发明的一个目的在于包含线虫传多面体病毒外壳蛋白或由其构成的病毒样粒子。
本发明的另一个目的是包含与化合物缀合的线虫传多面体病毒外壳蛋白或由其构成的病毒样粒子。缀合可以是共价(例如通过遗传融合或化学偶联)和/或非共价的(例如通过配体介导的结合)。
本发明的另一个目的在于包含与化合物缀合的线虫传多面体病毒外壳蛋白或由其构成的分子。
本发明的另一个目的在于包含如上所定义的一种或多种缀合的线虫传多面体病毒外壳蛋白或一种或多种病毒样粒子的药物组合物。
本发明还涉及线虫传多面体病毒外壳蛋白用于制造病毒样粒子的用途。
本发明还提供了一种生产如上所定义的分子的方法，所述方法包括提供线虫传多面体病毒外壳蛋白并将所述蛋白与化合物缀合。在特定实施方式中，所述方法包括提供编码所述缀合分子的核酸构建物，并在宿主细胞或体外表达系统中表达所述核酸。
本发明还提供了一种生产病毒样粒子的方法，所述方法包括提供线虫传多面体病毒外壳蛋白并允许所述蛋白组装成病毒样粒子。在特定实施方式中，所述方法包括提供与目标化合物缀合的线虫传多面体病毒外壳蛋白并使用这种缀合蛋白(可能与其他外壳蛋白混合)制造所述病毒样粒子。可替选地或另外地，所述方法还包括向所述病毒样粒子添加反应性或活性基团的步骤或在生产或组装期间将反应性或活性基团并入到所述病毒样粒子中的步骤。
本发明还涉及线虫传多面体病毒外壳蛋白用于将化合物递送到对象的用途。
本发明的其他目的包括编码与目标化合物缀合的线虫传多面体病毒外壳蛋白的核酸分子、包含这种核酸的载体以及含有它们的宿主细胞。
本发明在制药工业中具有广泛用途，用于生产例如疫苗、佐剂、药物或成像剂，用于人类或兽医应用，以及用于研究用途。
附图说明
图1：pEAQ载体T-DNA区和从其衍生的构建物的示意图。从右边界(RB)延伸到左边界(LB)的T-DNA区的骨架用灰色阴影表示。目标开放阅读框(ORF)侧接有在花椰菜花叶病毒35S启动子(P35S)控制之下的豇豆花叶病毒非翻译区(CPMV UTR)序列。如示意图所示，通过Gateway克隆引入本源葡萄扇叶病毒(GFLV)外壳蛋白(CP)及其带有TagRFP和EGFP标签的变体。L1对应于7个氨基酸的Gly3-Ser-Gly3连接物序列。L2对应于从Gateway重组产生的15个氨基酸的连接物序列。所表达的蛋白质的完整氨基酸序列提供在本文件的最后(序列)。P19：番茄丛矮病毒P19沉默抑制子。NPTII：新霉素磷酸转移酶II基因。
图2：GFLV CP在本氏烟草(N.benthamiana)叶片中的瞬时表达导致VLP生产。(a)在农杆菌渗入(agroinfiltration)后7天或在感染后14天GFLV CP在本氏烟草(N.benthamiana)叶片中的表达通过DAS-ELISA来确定，使用抗GFLV抗体检测并使用对硝基苯基磷酸酯作为碱性磷酸酶的底物。条表示对每种条件使用3个不同叶片获得的平均吸收值。误差条对应于95％置信区间。当O.D.405nm超过健康对照样品平均值至少3倍时，样品被认为是阳性(+)。(b)从在与通过DAS-ELISA所分析的相同的提取物上进行的观察所得到的ISEM显微照片。只在经GFLV感染和表达CP的样品中检测到约30nm的粒子(箭头)。比例尺：100nm。
图3：TagRFP(TR)与GFLV CP的N-或C-端末端的融合与VLP形成相容。根据分辨率原子结构(PDB编码4V5T，Schellenberger等，2011)，(a)GFLV CP亚基的带状视图和(b)粒子的表面遮盖横截面。CP的N-和C-端的位置分别用红色和绿色指示。五边形、三角形和椭圆形分别象征二十面体的5重、3重和2重二十面体对称轴。横截面平面中的残基显示为白色。(c)在用TR、CPTR或TRCP农杆菌渗入后7天，本氏烟草(N.benthamiana)叶片粗提物中GFLVCP的表达。DAS-ELISA使用抗GFLV抗体来进行，并且当O.D.405nm值超过健康对照样品平均值至少3倍时，样品被认为是阳性(+)。条表示对每种条件使用3个不同叶片获得的平均吸收值。误差条对应于95％置信区间。(d)从在与通过DAS-ELISA所分析的相同的提取物上进行的观察所得到的ISEM显微照片。箭头指向被CPTR和TRCP的澄清叶片提取物中的抗GFLV抗体捕获的VLP。比例尺：100nm。
图4：农杆菌渗入的表达TR、CPTR或TRCP的本氏烟草(Nicotiana benthamiana)叶片的表面荧光宏观图像。用于激发和发射的滤光片如下：λex625-655，λem665-715nm。比例尺：300μm。
图5：涉及VLP纯化的其他信息。(a)TRCP VLP的线性蔗糖梯度离心后的亮粉色带。(b)富含病毒和VLP的级分在线性蔗糖梯度中的位置的示意图示。将收集的2mL级分从1(梯度的顶部)到15(底部)进行编号。通过测量不同级分的O.D.260值来定位含有RNA的毒粒。富含VLP的级分通过半定量ELISA来鉴定。
图6：重组VLP可以从表达CP、CPTR和TRCP的叶片纯化。(a)在最后的超离心阶段从CPTR(左图)和TRCP(右图)纯化得到的粉色离心沉积物。(b)溶液中的纯化的CP、CPTR和TRCP。注意CPTR和TRCP样品的粉红颜色。(c)在SDS-Page后GFLV、CP、CPTR和TRCP的纯化的粒子的考马斯蓝染色的凝胶。在每一道中分离6μg GFLV粒子当量。凝胶中的主要条带从1到8进行编号。(d和e)GFLV、CP、CPTR和TRCP样品的使用抗GFLV抗体(d)或抗TagRFP(TR，e)抗体的相应的蛋白质印迹分析。在每一道中使用0.05μg GFLV粒子当量。白色箭头指示CP的具有预期尺寸的条带。箭头分别指向全长TRCP和CPTR融合体的具有预期尺寸的条带。黑色箭头指向主要的TRCP或CPTR截短的产物。L：分子质量标志物。质量(kDa)标在左侧。
图7：融合到GFLV CP的N-或C-端末端的蛋白质分别被禁闭或暴露到VLP的外表面。纯化的GFLV(a、b、c)、CP VLP(d、e、f)、CPTR VLP(g、h、i)和TRCP VLP(j、k、l)的电子显微照片。对样品进行处理，以仅用于负染色(a、d、g、j)，或使用抗GFLV抗体(b、e、h、k)或抗TR抗体(c、f、i、l)和与用于装饰的10nm胶体金粒子缀合的抗兔抗体进行ISEM。比例尺：200nm。
图8：VLP可以从共表达CPEG和TRCP的本氏烟草(N.benthamiana)叶片来纯化。在免疫金标记后纯化的GFLV(a、b)、CPEG VLP(c、d)和CPEG+TRCP VLP(e、f)的透射电子显微照片。对样品进行处理，使用抗GFLV抗体(a、c、e)或抗EGFP抗体(b、d、f)和使用与10nm胶体金缀合的抗小鼠抗体装饰的粒子，进行ISEM。
图9：在CPEG和TRCP共表达后产生混杂VLP。(a、b)通过非变性琼脂糖凝胶电泳分离的TRCP、CPEG或CPEG+TRCP VLP的荧光成像。成像使用G:box成像系统顺序进行，首先在λex480-540nm激发和λem590-660nm发射下检测TagRFP(a)，然后在λex450-485nm和λem510-540nm下检测EGFP(b)。凝胶中的发荧光VLP用空心箭头指示。(c至f)纯化的TRCP(c)、CPEG(d)、以1:1的比例混合的TRCP和CPEG VLP(e)和共表达的CPEG+TRCP(f)的单粒子显微图像。表面荧光成像顺序进行，在λex455-495nm-λem505-555nm下检测EGFP并在λex532.5-557.5-λem570-640nm下检测TagRFP。白色箭头指向混杂VLP。比例尺：5μm。
图10：纯化的VLP不含核酸。(a和b)在考马斯蓝(a)和溴化乙锭染色(b)后，通过非变性琼脂糖凝胶电泳分离的纯化的GFLV和CP、CPTR和TRCP VLP。箭头指向对应于串扰的条带。(c)纯化的样品的O.D.260/O.D.280比率。
图11.发荧光VLP的分子模型。(a)包含60个在C-端位置中与EGFP融合的CP的CPEGVLP。(b)包含60个在N-端位置中与TR融合的CP的TRCP VLP。(c)包含60个在C-端位置中与EG融合并在N-端位置中与TR融合的CP的TRCPEG VLP。所有VLP在带状图示中以相同取向描绘，其中CP为蓝色，EGFP为绿色，TagRFP为红色并且连接肽为黄色。
图12.GFLV-Nb23复合物的分辨率的冷冻EM结构。a：GFLV-Nb23复合物的全局3D重建，其中Nb23用蓝绿色显示在GFLV外表面上。二十面体边用红色三角形指示。Nb23与病毒衣壳蛋白(CP)形成化学计量比为1:1的复合物，导致每个毒粒结合60个Nb23。b：具有拟合的原子模型的冷冻EM图的详细视图，示出了每二十面体面3个CP和3个Nb23。
图13.通过动态光散射(DLS)测量的Nb23介导的TRCP VLP的装饰。所述图对应于单独的(灰色曲线)或用Nb23(红色曲线)、Nb23GFP(蓝色曲线)或Nb23:ALP(绿色曲线)装饰的纯化的TRCP VLP的按照强度的尺寸分布。所有粒子都是单分散的，其直径对于TRCP VLP来说为32.0+/-2nm(平均值+/-SD，n＝3)，对于用Nb23饱和的VLP来说为37.8+/-2nm(平均值+/-SD，n＝3)，对于用Nb23:GFP饱和的VLP来说为43.8+/-2nm(平均值+/-SD，n＝3)，对于用Nb23:ALP饱和的VLP来说为40.0+/-2nm(平均值+/-SD，n＝3)。
图14.TRCP VLP可以用Nb23和Nb23:GFP装饰。在非变性琼脂糖凝胶电泳和考马斯蓝染色后的TRCP VLP。第1道：单独的Nb23。第2道：用Nb23装饰的TRCP VLP。第3道：单独的TRCP VLP。第4道：用Nb23:GFP装饰的TRCP VLP。第5道：Nb23:GFP或单独的Nb23:GFP。注意到VLP在被装饰时的迁移变化(第2和4道与第3道相比)。还注意到迁移取决于复合物的净电荷而不是它们的分子质量。
图15.Nb23ALP在RFP:CP衍生的VLP的表面处的高效展示。在非变性琼脂糖凝胶电泳、考马斯蓝染色和FastRed染色后的TRCP VLP。第1道：单独的TRCP VLP。第2道：用Nb23ALP装饰的TRCP VLP。第3道：单独的Nb23ALP。注意到碱性磷酸酶在结合到VLP后保留功能。
图16.Nb23GFP与病毒衣壳蛋白(CP)形成化学计量比为1:1的复合物。将TRCP VLP在逐渐增加量的Nb23GFP的存在下温育，并通过非变性琼脂糖凝胶电泳分离。GFLV CP与Nb23:GFP之间的分子比例在每条道上方给出。将凝胶在表面荧光照射下(左侧)和考马斯蓝染色后(右侧)成像。注意到TRCP VLP迁移的逐渐变化，其与Nb23GFP分子的添加成比例。还注意到用Nb23GFP完全装饰的TRCP VLP显黄色(第5和6道)，而TRCP VLP为红色并且Nb23GFP为绿色。
具体实施方式
本发明涉及源自于线虫传多面体病毒外壳蛋白的融合分子和VLP及其用途。具体来说，本发明提供了与化合物缀合的线虫传多面体病毒外壳蛋白，以及它们用于生产暴露和/或禁闭所述化合物的无核酸病毒样粒子的用途。本发明显示，可以通过单个线虫传多面体病毒外壳蛋白的组装来生产粒子，使得(i)本源病毒RNA的衣壳化被避免，(ii)第一化合物(例如外来蛋白或肽)被表面暴露和/或(iii)可能与所述第一化合物相同或不同的第二化合物(例如外来蛋白或肽)被禁闭/保护在所述粒子内部。这些缀合的蛋白质和VLP可用于暴露和/或禁闭任何目标化合物，并可用于各种不同领域例如制药、农业或兽医领域。
因此，本发明的一个目的在于包含线虫传多面体病毒外壳蛋白或由其构成或可从其获得的病毒样粒子。
本发明的另一个目的是包含与化合物缀合的线虫传多面体病毒外壳蛋白或可从其获得的病毒样粒子。缀合可以是共价(例如通过遗传或化学偶联)和/或非共价的(例如通过配体介导的结合)。
本发明的另一个目的在于包含与化合物缀合的线虫传多面体病毒外壳蛋白或由其构成的分子。
本发明的另一个目的是可以通过与化合物缀合的线虫传多面体病毒外壳蛋白的组装获得的病毒样粒子。
VLP
术语“病毒样粒子”或“VLP”更具体来说是指本质上通过外壳蛋白的组装制造的粒子。VLP通常不含核酸并且没有感染性。本发明的优选的未修饰的VLP是二十面体。此外，在未修饰的形式下，它们通常是小粒子，具有小于50nm、通常在20-40nm之间、更优选地25-35nm之间例如约30nm的直径。事实上，本发明显示，本发明的线虫传多面体病毒外壳蛋白导致生产尺寸小且结构简单的粒子。这些特征代表了本发明的另一个优点。当然，正如在本申请中公开的，当大的化合物缀合到所述外壳蛋白时，所述VLP的尺寸可以改变。
在一个实施方式中，本发明的VLP本质上由同一线虫传多面体病毒外壳蛋白、优选为与化合物缀合的线虫传多面体病毒外壳蛋白的几个拷贝构成或可以从其获得(同型VLP)。
在另一个实施方式中，本发明的VLP包含不同线虫传多面体病毒外壳蛋白的混合物或由其构成或可以从其获得(异型VLP)。这些异型VLP的实例包括(i)包含线虫传多面体病毒外壳蛋白及其片段的混合物的VLP，或(ii)包含缀合的线虫传多面体病毒外壳蛋白和非缀合的线虫传多面体病毒外壳蛋白的混合物的VLP。
在另一个实施方式中，本发明的VLP包含与第一化合物缀合的线虫传多面体病毒外壳蛋白和与第二化合物缀合的线虫传多面体病毒外壳蛋白的混合物或由其构成或从其获得(混杂VLP)。在优选的混杂VLP中，使用分别融合到第一和第二化合物的同一线虫传多面体病毒外壳蛋白的混合物。最优选的混杂VLP包含在C-端与第一化合物缀合的线虫传多面体病毒外壳蛋白和在N-端与第二化合物缀合的线虫传多面体病毒外壳蛋白的混合物，或从其获得。第二优选的混杂VLP包含所述线虫传多面体病毒外壳蛋白和通过配体介导的缀合与所述粒子表面缀合的暴露的化合物。第三优选的混杂VLP包含N-端缀合到所述线虫传多面体病毒外壳蛋白的禁闭的化合物和通过配体介导的缀合与所述粒子表面缀合的暴露的化合物。
在异型VLP或混杂VLP中，各种不同的外壳蛋白之间的比例可以由专业技术人员根据需要和操作条件改变和调整，而不影响所述VLP的组装。
本发明的VLP可以使用任何线虫传多面体病毒外壳蛋白来制备。就此而言，术语“线虫传多面体病毒外壳蛋白”是指源自于线虫传多面体病毒的任何外壳或衣壳蛋白或多肽，例如从线虫传多面体病毒获得或具有线虫传多面体病毒的外壳蛋白的序列或具有从线虫传多面体病毒的外壳蛋白的序列设计的序列的蛋白或多肽。术语外壳蛋白包括重组蛋白、合成蛋白或纯化的蛋白。所述外壳蛋白可以是具有与线虫传多面体病毒的外壳蛋白一致的氨基酸序列的多肽，或者可以含有结构修饰，例如一个或几个氨基酸残基的突变、缺失和/或插入，只要所述蛋白保留组装成粒子的能力即可。
本发明可以使用源自于任何线虫传多面体病毒的外壳蛋白来进行。本发明可以使用源自于选自GFLV、ArMV、CNSV、BRSV、GBLV、BRV、TRSV、CLRV、RpRSV或由国际病毒命名委员会(International Committee on Taxonomy of Viruses)(ICTV，http://www.ictvonline.org/virustaxonomy.asp)所定义的任何其他线虫传多面体病毒的线虫传多面体病毒的外壳蛋白。源自于不同线虫传多面体病毒的外壳蛋白的氨基酸序列被提供为SEQ ID NO：1-8。
在特定实施方式中，所述线虫传多面体病毒外壳蛋白是包含SEQ ID NOs：1至8任一者的全部或一部分并且能够组装成VLP的多肽。序列的“一部分”优选地是指该序列的至少80％、更优选地至少85％、甚至更优选地至少90％、95％或更多的连续部分。
在优选实施方式中，用于本发明的线虫传多面体病毒外壳蛋白是源自于GFLV的外壳蛋白。在本领域中已经描述并且可以获得几种GFLV毒株，例如GFLV-F13(Viry等，1993)或GFLV-GHu(Vigne等，2004)。作为具体实例，本发明使用源自于任何GFLV毒株例如F13的线虫传多面体病毒外壳蛋白。
在最优选实施方式中，用于本发明的线虫传多面体病毒外壳蛋白是包含SEQ IDNO：1的氨基酸序列的全部或一部分或与SEQ ID NO：1具有至少90％同一性的序列的多肽。当在本文中使用时，对于氨基酸序列而言，术语“同一性”是指两个氨基酸序列之间的对应性程度(所述两个序列之间没有间隙)。换句话说，它是两个氨基酸序列在等同位置处具有相同氨基酸的程度，用百分率表示。同一性％可以通过已知的计算机程序例如BLAST、FASTA等来确定。
外壳蛋白的一个具体实例是包含SEQ ID NO：1或由其构成的蛋白质。
外壳蛋白的另一个具体实例是包含的SEQ ID NO：1的2-505位氨基酸或由其构成的蛋白质。
外壳蛋白的另一个具体实例是包含SEQ ID NO：1的1-504或2-504位氨基酸或由其构成的蛋白质。
外壳蛋白的另一个具体实例是包含SEQ ID NO：1的1-503或2-503位氨基酸或由其构成的蛋白质。
外壳蛋白的另一个实例是包含具有1-5个氨基酸替换的SEQ ID NO：1或由其构成的蛋白质。
用于本发明的外壳蛋白的另一个具体实例是包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的全部或一部分或与SEQ ID NO：2具有至少90％同一性的序列的多肽。外壳蛋白的一个具体实例是包含SEQ ID NO：2或由其构成的蛋白质，其带有或不带有N-端甲硫氨酸残基。
用于本发明的外壳蛋白的另一个具体实例是包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的全部或一部分或与SEQ ID NO：3具有至少90％同一性的序列的多肽。外壳蛋白的一个具体实例是包含SEQ ID NO：3或由其构成的蛋白质，其带有或不带有N-端甲硫氨酸残基。
用于本发明的外壳蛋白的另一个具体实例是包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的全部或一部分或与SEQ ID NO：4具有至少90％同一性的序列的多肽。外壳蛋白的一个具体实例是包含SEQ ID NO：4或由其构成的蛋白质，其带有或不带有N-端甲硫氨酸残基。
用于本发明的外壳蛋白的另一个具体实例是包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的全部或一部分或与SEQ ID NO：5具有至少90％同一性的序列的多肽。外壳蛋白的一个具体实例是包含SEQ ID NO：5或由其构成的蛋白质，其带有或不带有N-端甲硫氨酸残基。
用于本发明的外壳蛋白的另一个具体实例是包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的全部或一部分或与SEQ ID NO：6具有至少90％同一性的序列的多肽。外壳蛋白的一个具体实例是包含SEQ ID NO：6或由其构成的蛋白质，其带有或不带有N-端甲硫氨酸残基。
用于本发明的外壳蛋白的另一个具体实例是包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列的全部或一部分或与SEQ ID NO：7具有至少90％同一性的序列的多肽。外壳蛋白的一个具体实例是包含SEQ ID NO：7或由其构成的蛋白质，其带有或不带有N-端甲硫氨酸残基。
用于本发明的外壳蛋白的另一个具体实例是包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的全部或一部分或与SEQ ID NO：8具有至少90％同一性的序列的多肽。外壳蛋白的一个具体实例是包含SEQ ID NO：8或由其构成的蛋白质，其带有或不带有N-端甲硫氨酸残基。
所述蛋白质可以通过重组技术(即在细胞或体外系统中表达)、通过合成、纯化或其组合来制备。就此而言，所述蛋白质可以通过在植物细胞中、在植株中、在细菌中(例如在大肠埃希氏杆菌中)或在其他真核细胞中表达来生产。可替选地，表达可以在体外系统中进行。此外，所述蛋白质可以被修饰以提高它们的稳定性。具体来说，所述外壳蛋白可以含有一个或多个肽模拟键，例如插入亚甲基(-CH2-)或磷酸(-PO2-)基团、仲胺(-NH-)或氧(-O-)、α-氮杂肽、α-烷基肽、N-烷基肽、膦酰胺酸酯、缩酚酸肽、羟基亚甲基、羟基亚乙基、二羟基亚乙基、羟基乙基胺、反向倒转(retro-inverso)肽、酯类、亚膦酸酯、膦酸化合物、膦酰胺等。
线虫传多面体病毒外壳蛋白可以原样用于生产本发明的VLP。此外，正如以前讨论的，本发明显示，可以将线虫传多面体病毒外壳蛋白与大的化合物缀合而不丧失它们组装成VLP的能力。此外，所述缀合策略允许控制所述化合物的保留/禁闭。此外，可以与非常大的化合物(例如其可以占所述外壳蛋白自身尺寸的至少50％)缀合而不影响所述蛋白组装成VLP的能力。
因此，本发明的一个目的也在于与化合物缀合的线虫传多面体病毒外壳蛋白。
缀合可以是共价或非共价的，直接或间接的(即通过连接物)，和/或化学的、酶的或遗传的。此外，缀合可以包括末端和/或侧向偶联。此外，本发明的缀合外壳蛋白可以包含一个或几个缀合的化合物。
缀合可以通过将所述外壳蛋白和化合物的化学性质和阻碍考虑在内的任何可接受的键合手段来进行。因此，就此而言，偶联可以通过一个或多个共价键、离子键、氢键、疏水键或范德华键、在生理介质中或细胞内可断裂或不可断裂的键来进行。
此外，尽管偶联可以在所述外壳蛋白的任何反应性基团处进行，但应该考虑所述反应性基团在随后的VLP中的可接近性。就此而言，本发明人发现，在所述外壳蛋白的N-端和/或C-端末端处的偶联不影响所述外壳蛋白形成粒子的能力。因此，这种末端偶联对于本发明来说是最优选的。此外，本发明人出人意料地发现，化合物在线虫传多面体病毒外壳蛋白的C-端处的融合引起所述化合物暴露在使用所述缀合物制备的粒子的表面上，而化合物融合到N-端则引起它内化到所述VLP中，使所述化合物不可被抗体接近(“禁闭”)。因此，可以根据化合物的类型调整偶联策略，并且也可以生产具有两种不同性质的VLP：目标化合物的表面暴露和内化(禁闭)保护。
在第一个优选实施方式中，缀合通过共价偶联到所述外壳蛋白来获得，优选地通过遗传融合(即通过在将所述线虫传多面体病毒外壳蛋白和化合物作为遗传融合物编码的适合的核酸构建物系统中表达)，最优选地在所述外壳蛋白的N-端和/或C-端处。
在特定实施方式中，本发明涉及在N-端末端处与化合物缀合的线虫传多面体病毒外壳蛋白(TRCP)。这种缀合物的典型结构是化合物-(连接物)n-外壳蛋白，其中n＝0或1。在N-端末端处的缀合更优选地包含在所述外壳蛋白的第一个N-端氨基酸处的缀合。事实上，本发明显示，在SEQ ID NO：1的氨基酸Met1处或在包含SEQ ID NO：1的2-505位氨基酸的外壳蛋白或其变体的氨基酸Gly1处的缀合，可以产生能够形成VLP并将所述缀合的化合物禁闭在所述VLP内部的分子。
在另一个特定实施方式中，本发明涉及在C-端末端处与化合物缀合的线虫传多面体病毒外壳蛋白(CPTR)。这种缀合物的典型结构是外壳蛋白-(连接物)n-化合物，其中n＝0或1。在C-端末端处的缀合更优选地包含在所述蛋白质的最后3个C-端氨基酸的任一者处的缀合。事实上，本发明显示，在SEQ ID NO：1或其变体的氨基酸Phe503、Pro504或Val505处的缀合，可以产生能够形成VLP并将所述缀合的化合物暴露到所述VLP外部的分子。更优选地，C-端缀合包括缀合到所述外壳蛋白的最后一个C-端氨基酸残基。
所述化合物可以直接地或利用连接物间接地偶联到所述外壳蛋白。共价化学偶联的手段包括例如使用含有例如烷基、芳基、肽或羧基基团的双官能或多官能试剂。连接物的实例包括任何中性氨基酸或肽序列，例如G3S、G3SG3或DPAFLYKVVRSFGPA(SEQ ID NO：13)。
在优选实施方式中，所述化合物被直接地或通过连接物共价连接到所述外壳蛋白。
在另一个优选实施方式中，所述化合物和外壳蛋白直接地或通过连接物通过肽键连接。
在可替选的优选实施方式中，缀合通过向所述粒子的(通常非共价的)配体介导的附连来获得。这种缀合方式允许化合物高效暴露在所述粒子的表面上。这种方式也可以与遗传偶联相组合，以产生混杂VLP。
在这种实施方式中，在粒子组装后，通过向所述VLP添加反应性或活性基团将化合物缀合到所述粒子。所述活性基团可以被连接到配体，并且所述配体允许结合所述粒子，导致附连。
所述配体可以是通过亲和而结合所述外壳蛋白的任何分子。适合的配体的实例包括例如抗外壳蛋白抗体或其保留了抗原特异性的衍生物。这些抗体的实例包括但不限于单克隆抗体、纳米抗体(例如源自于在骆驼科动物中存在的仅仅单链的免疫球蛋白的结构)、单链抗体(即ScFv或VNAR片段)、双体抗体等。
术语纳米抗体(或VHH，Hamers-Casterman等，1993)是指基本上由被4个FR结构域(构架区)分开的3个CDR(互补决定区CDR1、CDR2和CDR3)构成并且基本上不含轻链或恒定结构域的单链多肽。术语“纳米抗体”、“VHH”、“VHH抗体片段”或“单结构域抗体”可互换使用。纳米抗体通常具有下述结构：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。优选地，本发明的纳米抗体是通过重组或化学技术生产的合成分子。纳米抗体表现出高的表位特异性和亲和性。它们比常规的IgG分子小大约10倍。它们是单链多肽，非常稳定，耐极端pH和温度条件。此外，它们可以耐蛋白酶的作用。
可以在本发明中使用的纳米抗体的具体实例是纳米抗体Nb126、Nb101、Nb23、Nbp75和Nbp71，它们已被描述在WO2015/110601中。
这些纳米抗体的氨基酸序列分别被描述为SEQ ID NOs：14-18。
在特定实施方式中，在本发明中使用的纳米抗体包含选自SEQ ID NOs：14-18任一者的序列，或与其具有至少80％序列同一性、优选地与其具有至少90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的氨基酸序列同一性的序列。
适合用于本发明的其他纳米抗体是与SEQ ID NO：14至18任一者的纳米抗体结合相同抗原或抗原性结构域或表位的纳米抗体。
可以生产结合线虫传多面体病毒和/或同源外壳蛋白的其他纳米抗体或抗体。抗体可以通过常规技术，通过用同源病毒或外壳蛋白或其含有表位的片段免疫接种哺乳动物，然后收集抗体产生细胞来制备。所述细胞可用于选择克隆抗体并通过融合产生杂交瘤。然后可以确定所述抗体的序列并将其用于生产重组抗体、单链抗体、Mab、CDR等。抗外壳蛋白纳米抗体可以例如通过用同源病毒或外壳蛋白或含有表位的片段或用纯化的VLP免疫接种骆驼科动物来产生。编码所述纳米抗体的DNA分子可以通过本领域中公知的方法来确定或分离或克隆。具有如上所定义的特定序列的纳米抗体可以通过人工合成或重组DNA技术来生产。然后可以如实施例中所述测试纳米抗体结合所述VLP的能力和/或与Nb126、Nb101、Nb23、Nbp75或Nbp71竞争或不竞争(或置换)的能力。
用于本发明的配体的另一个实例是源自于软骨鱼的重链抗体(IgNAR，“免疫球蛋白新抗原受体”)的单结构域抗体VNAR片段。
所述化合物可以通过例如引起共价或非共价偶联的已知技术例如遗传融合、化学偶联、经由亲和标签(例如Strep标签或PolyHis标签)的亲和结合，连接到所述配体。优选的方式是通过遗传融合或化学偶联，最优选地当所述化合物是多肽时通过遗传融合。在特定实施方式中，将所述化合物在所述配体的末端处偶联到所述配体，最优选共价地偶联，例如通过遗传融合或化学偶联。这种偶联基本上不影响或阻止所述配体结合到所述病毒外壳蛋白或粒子。
因此，在优选实施方式中，本发明涉及包含线虫传多面体病毒外壳蛋白或可以从所述外壳蛋白获得的病毒样粒子，其中所述粒子包含通过配体介导的附连与所述外壳蛋白缀合的至少一种目标化合物。这种化合物被暴露在所述粒子的表面处。通过与相同或不同的配体缀合，所述粒子可以具有暴露在其表面上的几种不同化合物。在优选实施方式中，使用偶联到所述化合物的抗外壳蛋白抗体或其衍生物，甚至更优选地使用纳米抗体来进行缀合。
在另一个优选实施方式中，本发明涉及包含线虫传多面体病毒外壳蛋白或可以从所述外壳蛋白获得的病毒样粒子，其中所述粒子包含与所述外壳蛋白缀合的N-端的被禁闭的化合物，和通过配体介导的附连、更优选地通过抗体介导的附连、甚至更优选地通过纳米抗体介导的附连缀合到所述粒子的表面的暴露的化合物。
根据另一个可替选的实施方式，可以考虑与VLP的化学缀合，例如通过暴露的巯基(Cys)的缀合，将亲和标签(即6组氨酸、Flag标签、Strep标签、SpyCatcher等)附连到所述粒子用于后续化合物的结合，或将非天然氨基酸并入到所述VLP中以及用于点击化学缀合的化合物。
本发明还涉及生产如上所定义的缀合分子的方法，所述方法包括提供线虫传多面体病毒外壳蛋白并将所述蛋白与化合物缀合。在特定实施方式中，提供所述线虫传多面体病毒外壳蛋白包括在宿主细胞或体外表达系统中表达编码所述蛋白的核酸构建物，并收集所表达的蛋白。随后，可以将所述蛋白与化合物缀合。在可替选的途径中，所述缀合蛋白使用重组融合核酸直接表达。就此而言，在特定实施方式中，本发明涉及生产如上所定义的缀合分子的方法，所述方法包括提供编码所述分子的核酸构建物，并在宿主细胞或体外表达系统中表达所述核酸。重组生产可以在任何适合的宿主例如植物细胞、植株、细菌、酵母、昆虫或体外转录系统中进行。所表达的缀合物可以作为游离分子被收集并储存在任何适合的介质或状态中。也可以允许它组装成VLP，然后可以收集所述VLP并将其储存在适合条件下。
本发明的其他目的还在于编码如上所定义的分子的核酸分子(例如DNA、RNA)，包含这种核酸的载体，以及含有这种核酸或载体的宿主细胞。
本发明还提供了一种生产病毒样粒子的方法。所述方法通常包括(i)提供线虫传多面体病毒外壳蛋白，和(ii)使用所述蛋白形成VLP，例如通过允许所述蛋白组装成病毒样粒子。在典型实施方式中，将所述外壳蛋白维持在允许自组装成粒子的条件下。适合的条件包括在溶液中，在通常5至9之间、更通常6至8之间的pH下，以及在4℃至50℃之间、更优选地室温左右的温度下。
在特定实施方式中，所述方法包括(i)提供与目标化合物缀合的线虫传多面体病毒外壳蛋白，和(ii)使用这种缀合的蛋白(可能与其他外壳蛋白混合)来制造病毒样粒子。
所述线虫传多面体病毒外壳蛋白可以通过人工合成、酶法生产/组装、纯化和/或重组技术来提供。就此而言，在优选实施方式中，所述方法包括：
.提供编码线虫传多面体病毒外壳蛋白、优选地与化合物缀合的所述外壳蛋白的核酸构建物，
.在宿主细胞或体外表达系统中表达所述核酸，
.任选地纯化所述蛋白，
.从表达并任选纯化的蛋白形成VLP，以及
.收集或纯化所述VLP。
在特定实施方式中，所述方法包括向所述VLP添加反应性或活性基团以便为所述VLP提供选定性质的另一个步骤。所述活性基团可以被连接到配体，并且所述配体允许结合所述粒子，引起附连。
在另一个特定实施方式中，形成所述VLP的步骤在反应性或活性基团存在下进行，允许将所述基团并入到所述VLP中。
在另一个特定实施方式中，本发明涉及一种生产VLP的方法，所述方法包括：
.提供编码与标签缀合的线虫传多面体病毒外壳蛋白的核酸构建物，
.在宿主细胞或体外表达系统中表达所述核酸，
.任选地纯化所述蛋白，
.从表达并任选纯化的蛋白形成VLP，
.任选地收集或纯化所述VLP，以及
.向所述VLP添加结合所述标签的化合物。
在上述方法中，重组生产可以在任何适合的宿主例如植物细胞、植株、细菌、酵母或体外转录系统中进行。
所述VLP可以通过常规技术来收集和纯化，例如层析、离心等。由于VLP在生理条件下稳定，因此它们可以按照常规技术储存在溶液中或冷冻或冷冻干燥。
化合物
在本发明的缀合物或VLP中使用的化合物，可以是任何目标化合物，例如治疗剂、诊断剂或成像剂。所述化合物也可以是标签，允许随后通过将所述缀合的外壳蛋白或VLP在适合条件下暴露于任何目标试剂来附连所述试剂。
在特定实施方式中，所述化合物是生物学上感兴趣的化学实体，例如小化学分子(例如抗生素、抗病毒剂、免疫调节剂、抗肿瘤剂等)、肽或多肽(例如细胞因子、激素、毒素、抗原)、蛋白质(例如酶、抗体(例如纳米抗体)或抗体的一部分)、核酸(例如siRNA或miRNA)或标志物(例如荧光或化学发光剂)。
在特定实施方式中，所述化合物是蛋白质、多肽或肽。使用这些类型的化合物，本发明的缀合物可以通过遗传融合来生产。
这些化合物的具体实例包括例如抗体或纳米抗体或其片段或衍生物。就此而言，本发明出人意料地显示，线虫传多面体病毒的外壳蛋白可以被融合到非常大的蛋白质(超过200个氨基酸)而不失去其组装成VLP的能力。因此，本发明的缀合物可用于暴露或禁闭非常大的蛋白质。
这些化合物的其他实例包括例如肽或蛋白质抗原。这些化合物通常被缀合在C-端中，以使得它们暴露在得到的粒子的表面处。通过这种方式，所述缀合物或得到的VLP可用作疫苗或免疫原性组合物，以诱导或激发针对所述抗原的免疫应答。
在C-端中缀合的具体实例是非共价(配体介导的)缀合，优选为使用至少一种纳米抗体的缀合。
这些化合物的另一个实例包括对金属或痕量分子例如钆、银、金等具有亲和性的肽或蛋白质。
这些化合物的另一个实例包括优选地在到达靶组织之前不应被暴露在生物体中的毒素、酶或有毒分子。这些有毒化合物的实例包括例如半胱天冬酶、胞嘧啶脱氨酶和尿嘧啶磷酸核糖基转移酶Fcy和Fur、核糖体失活蛋白以及细菌和植物毒素，其通过在真核细胞中抑制蛋白质合成而起作用。志贺毒素和蓖麻毒素家族的毒素通过N-糖苷键断裂来失活60S核糖体亚基，所述断裂从28S rRNA的糖-磷酸酯骨架释放出特定的腺嘌呤碱基。所述家族的成员包括志贺毒素和志贺样毒素，以及I型(例如天花粉蛋白和丝瓜籽蛋白)和II型(例如蓖麻毒素、凝集素和相思豆毒素)核糖体失活蛋白(RIP)。所有这些毒素都在结构上相关。由于它们的潜在用途，与单克隆抗体的缀合，作为免疫毒素治疗癌症，RIP已引起相当大的兴趣。此外，已显示天花粉蛋白对HIV-1感染的T细胞和巨噬细胞具有强大活性。
这些化合物的另一个实例包括细胞靶向配体。这些化合物允许特异性或靶向结合到细胞受体或结构，因此允许将所述缀合物或VLP靶向到优选的靶细胞或组织。这些靶向配体的实例包括细胞表面受体的配体或细胞表面蛋白的受体或抗体(例如纳米抗体)或其片段。
这些化合物的另一个实例包括细胞穿透肽和转导结构域。这些化合物允许缀合物或VLP内化到细胞中。这些肽的实例包括HIV-1的tat肽。
在特定实施方式中，本发明的缀合物包含在C-端末端处与靶向配体缀合并在N-端末端处与有毒化合物缀合的线虫传多面体病毒外壳蛋白。这些缀合物允许形成使所述靶向配体暴露在表面处并使所述有毒化合物被禁闭的VLP。
药物组合物和方法
本发明还涉及包含如上所定义的至少一种VLP和优选地一种或多种可药用赋形剂的药物组合物。
本发明还涉及包含如上所定义的至少一种线虫传多面体病毒外壳蛋白和优选地一种或多种可药用赋形剂的药物组合物。
取决于结合到所述外壳蛋白的化合物或活性基团的存在与否及其本质，本发明的组合物可以具有各种不同用途，例如治疗性组合物、疫苗、佐剂、诊断组合物、免疫原性组合物、研究样品等。
有利情况下，本发明的组合物包含可药用载体或赋形剂。所述可药用赋形剂可以根据所述组合物的形式选自任何适合且常规的赋形剂。具体来说，对于固体组合物例如片剂、丸剂、粉剂或颗粒剂来说，所述组合物可以包含例如乳糖、右旋糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇。也可以向所述组合物进一步添加润滑剂例如滑石或硬脂酸，粘合剂例如淀粉或明胶，崩解剂例如琼脂，和/或甜味剂。对于半固体组合物来说，所述赋形剂可以是例如乳液或油状悬液。液体组合物、特别是可注射的或包含在软胶囊中的液体组合物，可以包含稀释剂或溶剂例如水、生理盐水溶液、右旋糖水溶液、醇、油及其类似物。
本发明的组合物或缀合物可以通过任何适合的途径给药，例如但不限于通过肠胃外(例如皮下、静脉内或肌肉内途径)、口服、直肠、眼或鼻内途径。所述药物组合物通常包含有效剂量的VP或缀合物或化合物，例如对于给定病症和给药日程安排来说给出治疗效果的任何剂量。
取决于缀合到所述外壳蛋白的化合物的本质，本发明的VLP和组合物可用于治疗、预防、诊断或成像各种不同疾病。
就此而言，本发明涉及如上所定义的VLP或缀合物，其用作药物。
本发明涉及如上所定义的VLP或缀合物，其用作疫苗。
本发明涉及如上所定义的VLP，其用作佐剂或免疫调节剂。事实上，从例如未缀合的线虫传多面体病毒外壳蛋白制备的本发明的VLP可以用作适合的佐剂或免疫调节性组合物，以在哺乳动物中激发免疫应答。
本发明涉及如上所定义的VLP或缀合物，其用作诊断剂。
本发明涉及如上所定义的VLP或缀合物，其用作示踪剂。
本发明还涉及使用线虫传多面体病毒外壳蛋白来减少化合物在体内的暴露。
本发明还涉及使用线虫传多面体病毒外壳蛋白来提高化合物在体内的暴露。
本发明的其他方面和优点将在下面的实验部分中公开，所述实验部分应该被认为是说明性的。
实施例
A.实验程序
二元质粒的构建
按照制造商的说明书(New England Biolabs,Thermo Fisher Scientific,Massachusetts)使用Phusion高保真DNA聚合酶，分别使用pVec2ABC(Viry等，1993；Schellenberger等，2010；Vigne等，2013)、pTagRFP-C(Evrogen,Russia)和pEGFP-N1(Clontech,California)作为模板，通过PCR扩增GFLV-CPF13、TagRFP和EGFP的编码序列。分别对应于GFLV-CPF13的N-或C-端与TagRFP融合的翻译融合体TRCP和CPTR，使用上述PCR产物作为模板并使用编码Gly3-Ser-Gly3肽连接物序列的重叠引物，通过重叠PCR(Ho等，1989)来获得。将侧接有attB的CP、TR、CPTR和TRCP PCR产物通过Gateway重组克隆到pDONR/Zeo入口载体(Invitrogen,Thermo Fisher Scientific,Massachusetts)中并进一步重组到pEAQ-HT-DEST1二元质粒(Sainsbury等，2009)中。对于其中GFLV-CPF13的C-端被融合到EGFP的CPEG来说，使用含有无终止密码子的CP编码序列的pDONRTM/Zeo载体，通过重组在源自于pEAQ-HT-DEST1(Sainsbury等，2009)载体的自制Gateway表达载体中，通过将EGFP编码序列(Clontech,California)引入到attR2重组位点的下游进行克隆。重组导致将DPAFLYKVVRSFGPA连接肽引入到GFLV-CPF13C-端残基与EGFP之间(图1和序列表)。纳米抗体来源的构建物的序列可以在WO2015/110601中找到。
植物材料、病毒感染和病毒样粒子生产
将昆诺藜(C.quinoa)和本氏烟草(N.benthamiana)植株在22/18℃(日/夜)温度下生长在温室中。使用源自于pMV13+pVecAcc65I2ABC感染的材料(Schellenberger等，2010)的GFLV-CPF13感染性粗汁液机械接种大量3周龄昆诺藜(C.quinoa)植株。在接种后14天收获植株并用于病毒纯化。对于本氏烟草(N.benthamiana)的机械接种来说，将3周龄植株用纯化的GFLV-CPF13接种。在本氏烟草(N.benthamiana)叶片的农杆菌渗入后，通过瞬时表达来生产VLP。二元质粒通过电穿孔引入并维持在根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株GV3101::pMP90中。将培养物在含有适合的抗生素的Luria-Bertani培养基中生长至稳定期，离心收集，然后单独地或对于共表达来说以1:1的比例重悬浮在无菌水中，至600nm下的最终光密度为0.5。使用2ml塑料注射器使悬液渗入到4周龄本氏烟草(N.benthamiana)叶片中。将健康、感染和农杆菌渗入的本氏烟草(N.benthamiana)植株维持在生长室中7天，所述生长室设定在14/10光周期(4800lx)下，温度设定为21/18℃(日/夜)，然后收获叶片。
农杆菌渗入的叶片的观察
荧光蛋白可视化在农杆菌渗入后5天实现。叶片使用AxioZoom V16巨视显微镜(Zeiss,Germany)成像，对于EGFP成像来说使用450-490nm和500-550nm的激发和发射波长滤光片，对于TagRFP可视化来说使用625-655nm和665-715nm的激发和发射波长滤光片。图像使用ImageJ(Schneider等，2012)和GNU图像操作程序(GIMP,www.gimp.org)软件进行处理。
DAS-ELISA
将健康、感染和农杆菌渗入的叶片以1:5w/v的比例在HEPES100mM pH8中磨碎，并以3000g澄清5min。GFLV或VLP检测使用商品化DAS-ELISA试剂盒(Bioreba,Switzerland)，按照制造商的说明书来进行。简单来说，将板用在包被缓冲液中以1:1000稀释的多克隆抗GFLV抗体包被，与澄清的提取液温育，然后添加在缀合缓冲液中以1:1000稀释的与碱性磷酸酶偶联的抗GFLV单克隆抗体。在DAS-ELISA程序的每个步骤之间进行3次清洗。检测使用对硝基苯基磷酸酯作为底物来实现，所述底物在碱性介质中产生黄色水溶性反应产物。使用Titertek Multican MCC/340读板器(Labsystems,France)测量在405nm下的吸光度。在底物温育时间段后，当所述吸光值超过对照样品至少3倍时，样品被认为是阳性的。
负染色、免疫捕获和免疫吸附电子显微术(ISEM)
将健康、感染和农杆菌渗入的叶片在100mM pH 8HEPES缓冲液中磨碎，通过以3000g离心5min进行澄清，然后进行处理以用于简单负染色、用于免疫捕获或用于ISEM。对于所有格网来说，负染色在用碳涂层的Formvar(Electron Microscopy Science,Pennsylvania)覆盖的300目镍格网上，通过与1％钼酸铵溶液温育90sec来进行。对于在澄清的汁液上进行的免疫捕获来说，将格网用1:100稀释的多克隆抗体(Bioreba,Switzerland)包被，在4℃下与植物提取物温育2h，在HEPES 25mM pH 8缓冲液中清洗，最后进行处理以用于负染色。对于在纯化的CP、CPTR和TRCP VLP上的ISEM来说，将格网用0.05mg/mL浓度的针对GFLV的自制单克隆抗体包被，并在室温下与VLP温育1h。在用22.5mMHEPES pH 8中的2％w/v BSA、10％v/v正常山羊血清、0.05％Triton-X100阻断后，将格网与1:100稀释的抗GFLV抗体(Bioreba,Switzerland)或浓度为0.01mg/mL的抗TR多克隆抗体(Evrogen,Russia)在室温下进一步温育1h。免疫金标记使用1:50稀释的与10nm胶体金粒子缀合的抗兔抗体(British Biocell International,Wales)来进行。在所有步骤之间使用25mM pH 8HEPES缓冲液进行清洗。在纯化的CPEG和CPEG+TRCP VLP上的ISEM以类似的方式进行，区别在于将针对GFLV的多克隆抗体(Bioreba,Switzerland))用于捕获，并将针对GFLV的自制单克隆抗体混合物或单克隆抗EG抗体(Roche,Germany)用于检测。最后，免疫金标记使用与10nm胶体金粒子缀合的抗小鼠抗体(British Biocell International,Wales)来进行。观察使用Philips EM208透射电子显微镜来实现。基于胶片的照片在Kodak电子图像胶片SO-163(Electron Microscopy Science,Pennsylvania)上获取，并使用适合的化学品(Electron Microscopy Science,Pennsylvania)来呈现。最后，将照片扫描以获得数字电子显微镜图像，并用GNU图像操作程序(GIMP,www.gimp.org)来处理。
GFLV-CP结构图示和分析
CP亚基和衣壳图示使用以前的分辨的GFLV-F13原子结构(PDB ID：4V5T，Schellenberger,Sauter等，2011)，使用UCSF Chimera软件包(Pettersen等，2004)来制作。CP亚基末端可接近性数据使用VIPERdb(Carrillo-Tripp等，2009)获得。
病毒和病毒样粒子纯化
从昆诺藜(C.quinoa)感染的植物，按照Schellenberger等，2011来纯化GFLV-CPF13病毒粒子。从农杆菌渗入的本氏烟草(N.benthamiana)叶片按照相同的实验程序纯化VLP，区别在于省略最后的不连续蔗糖梯度。简单来说，将最少350克叶片在提取缓冲液中磨碎，过滤，与膨润土温育，最后通过以1900g离心15min进行澄清。然后通过添加PEG-20000和氯化钠，从澄清的粗汁液沉淀VLP。污染的元件通过在蔗糖垫层上离心然后通过蔗糖密度梯度分级来移除。收集2ml级分，从其对以1:500、1:5000和1:10000稀释的等分试样进行处理，用于半定量DAS-ELISA测定以鉴定富含VLP的级分，将其进一步合并，然后最后以290,000g超离心2小时。在重悬浮在HEPES25mM pH8中之后，将VLP等分试样稀释，使用GFLV-CPF13病毒粒子作为标准品，通过定量DAS-ELISA测定法(Vigne等，2013)进行定量。
SDS-Page电泳、蛋白质印迹和质谱分析
对于SDS-Page分析来说，将来自于每种纯化的样品的6μg GFLV粒子当量在8％丙烯酰胺凝胶上分离，并使用Instant Blue(Expedeon,England)进行考马斯蓝染色。对于质谱分析来说，将目标SDS-Page带切下，将蛋白脱色，还原，烷基化，胰蛋白酶消化过夜，糜蛋白酶(chemotrypsin)消化，最后进行处理用于在nanoU3000(Dionex,Thermo FisherScientific,Massachusetts)-ESI-MicroTOFQII(Bruker,Massachusetts)上进行nanoLC-MSMS分析。质谱数据在Mascot(Matrix Science Limited,England)和Proteinscape(Bruker,Massachusetts)的帮助下进行分析。对于蛋白质印迹分析来说，将0.05μg的每种样品在8％丙烯酰胺凝胶上分离，并将变性的蛋白质电转移到Immobilon PVDF膜上。将膜与1:1000稀释的兔多克隆抗GFLV抗体或1:5000稀释的商品化多克隆抗TR抗体(Evrogen,Russia)温育。蛋白质在与1:12500稀释的与辣根过氧化物酶缀合的山羊抗兔抗体(ThermoFisher Scientific,Massachusetts)和Lumi-Light溶液(Roche,Germany)温育后，通过化学发光来呈现。图像使用G:Box成像系统(Syngene,England)获取，使用GeneTools(Syngene,England)进行分析，并且最后用GIMP(www.gimp.org)处理。
单粒子表面荧光显微术
将来自TRCP、CPEG或CPEG+TRCP样品的纯化的粒子在HEPES 25mM pH8中稀释，以便在装备有Orca Flash4.0相机(Hamamatsu,Japan)和Spectra X光引擎(Lumencor,Oregon)的倒置表面荧光显微镜Axio Abserver Z1(Zeiss,Germany)上成像时获得单个斑点。激发和发射波长滤光片对于EGFP来说是455-495nm和505-555nm，对于TagRFP来说是532.5-557.5nm和570-640nm。图像最后使用ImageJ(Schneider等，2012)和GIMP软件(www.gimp.org)进行处理。
非变性琼脂糖凝胶电泳
纯化的病毒粒子和VLP的非变性凝胶电泳在范围在8.0至9.0之间的pH下，在0.5XTris乙酸EDTA(TAE)或Tris乙酸(TA)缓冲液中，在1％w/v琼脂糖凝胶中进行。对于核酸检测来说，将5μg病毒粒子或VLP在增补有0.1μg/mL的EtBr的载样缓冲液(10％v/v甘油，HEPES25mM pH 8)中稀释。在电泳分离后，将EtBr预染色的凝胶首先进行处理，使用装备有302nm激发光源和用于发射的520-640nm带通滤光片的Gel Doc系统(Bio-Rad,California)分析核酸含量。在第二步中，将凝胶如前所述进行处理以用于考马斯蓝染色。
对于非变性凝胶的荧光成像来说，将3μg纯化的VLP样品在载样缓冲液中稀释，并在不存在EtBr的情况下进行非变性凝胶电泳。成像使用装备有用于EGFP可视化的450-485nm激发LED模块和发射用510-540nm带通滤光片的G:Box成像系统(Syngene,England)来进行。TR激发使用480-540nm LED模块来实现，并在通过590-660nm带通滤光片过滤后收集荧光发射。对于FastRed染色，按照制造商的说明书(Sigma)将凝胶在1mM MgCl2存在下在FastRed溶液中温育。
建模
使用GFLV(PDBid 4V5T)、EG(PDBid 1GFL)和TR(PDBid 3M22)的晶体结构为CPEG、TRCP或TRCPEG VLP建模。嵌合的CP通过将连接物和相应的的FP序列附连到分别指向VLP的外部和内部的CP的游离C-和N-端末端，使用Modeller(Eswar等，2006)来生成。完整的衣壳使用PyMOL(The PyMOL Molecular Graphics System,Version 1.7.4LLC)中的二十面对称体来重建。使用Coot(Emsley等，2010)调整FP在TRCP衣壳中的位置以避免空间冲突。
动态光散射(DLS)
单独的或复合到Nb23或Nb23:EGFP或Nb23:ALP的TRCP VLP的平均粒子直径和多分散性，使用Zetasizer NanoZS(Malvern)和Nanostar(Wyatt)，通过DLS来估算。使用三个独立的病毒和蛋白制备物进行5次连续测量，所述制备物在Tris缓冲液(50mM Tris,100mMNaCl,pH 8.3)中含有0.1mg/ml病毒、0.2mg/ml Nb23、0.5mg/ml Nb23:EGFP和1mg/ml Nb23:ALP。分别用DTS软件(6.01版)或DYMAMICS(7.1.8.93版)在20℃下记录散射强度并进行数据处理。所有粒子都是单分散的。
B.结果
1.GFLV外壳蛋白自组装成病毒样粒子
为了探讨GFLV外壳蛋白(CP)在植物中产生VLP的能力，将编码GFLV分离株F13的CP的序列(不带N-端甲硫氨酸的SEQ ID NO：1)引入到pEAQ-HT-DEST1二元载体(Sainsbury等，2009)(图1)中，并用于在农杆菌渗入后的本氏烟草(Nicotiana benthamiana)叶片中瞬时表达。在农杆菌渗入后7天(dpi)通过直接双抗体夹心ELISA(DAS-ELISA)分析样品，使用在接种后14天(dpi)来自于GFLV-F13感染的植物的本氏烟草(N.benthamiana)叶片作为阳性对照，并使用7dpi时pEAQ-HT-DEST1驱动的TagRFP(TR，Merzlyak等，2007)农杆菌渗入的叶片和健康叶片作为阴性对照。在表达CP和经GFLV感染的样品两者中检测到强烈的阳性信号，但在来自于TR渗入的或健康叶片材料的提取物中没有(图2a)。为了测试瞬时表达的CP自组装成VLP的能力，在使用与用于DAS-ELISA中的包被相同的多克隆抗体作为捕获抗体免疫捕获在格网上之后，通过透射电子显微术(TEM)对同样的叶片提取物进行进一步分析。负染色材料的观察(图2b)揭示出在表达CP的样品中存在直径约30nm的二十面体粒子，但在TR渗入的或健康的阴性对照中不存在(图2b)。尽管在格网上不是非常丰富，但在表达CP的粗样品中看到的二十面体粒子与在相同条件下观察到的GFLV-F13粒子非常相似(图2b)。这表明GFLV CP在本氏烟草(N.benthamiana)中瞬时表达后能够自组装成VLP。
2.GFLV CP在将其N-或C-端末端融合到外来蛋白之后维持其组装成VLP的能力
GFLV原子结构的分析(Schellenberger等，2011b)揭示出GFLV CP的氨基端残基Gly1和3个羧基端残基Phe502、Pro503和Val504对病毒衣壳的最终四级结构没有贡献，并且分别暴露在GFLV粒子的内表面和外表面处(图3a和3b)。就此而言，试验了在两端添加额外的残基以及它们对CP形成衣壳的影响。为了试验这种假说，产生了融合到TR的N-或C-端CP融合体，并在后文中分别命名为TRCP(SEQ ID NO：10)和CPTR(SEQ ID NO：9)(图1)。两种融合体都包括Gly3-Ser-Gly3连接肽(图1)以维持CP与TR结构域之间的柔性(Zilian和Maiss，2011)，并在本氏烟草(N.benthamiana)叶片中瞬时表达。通过表面荧光巨视术分析样品在5dpa的TR表达(图4)，在两天后通过DAS-ELISA分析CP表达(图3c)并通过TEM分析VLP(图3d)。尽管在所有样品中都观察到TR荧光(图4)，表明了不同蛋白质的正确表达，但只在CPTR和TRCP粗提液中通过DAS-ELISA检测到CP(图3c)，这与在TEM上所观察到的VLP的存在相关(图3d)。这些结果表明，GFLV CP在将其N-或C-端末端融合到TR后保留了形成VLP的能力。
为了验证我们的结果并洞悉这些VLP的生物化学性质，在本氏烟草(N.benthamiana)叶片中进行了大规模生产，然后使用标准的GFLV纯化程序进行纯化，所述程序包括在不存在蛋白酶抑制剂的情况下的澄清和离心步骤(参见方法)。平行地，在14dpi从感染的昆诺藜(C.quinoa)纯化GFLV-CPF13毒粒。在线性蔗糖梯度后，在TRCP梯度中观察到亮粉色带(图5a)以及在CPTR梯度中观察到弱粉色带(未示出)，但在感染的样品中没有(未示出)。收集2mL蔗糖梯度级分，并通过半定量DAS-ELISA鉴定富含VLP的级分。尽管真正的GFLV粒子朝向梯度的底部沉降在级分8-10中，但其他粒子(CP、CPTR和TRCP)分别位于更轻的级分3-5、4-6和6-8中(图5b)。这与以前的报告相一致，所述报告表明从感染的植物纯化的空GFLV粒子表现出比本源的含有RNA的毒粒更低的密度(Quacquarelli等，1976)。将DAS-ELISA阳性级分进一步合并并处理，用于最后通过超离心进行浓缩。显然，在TRCP和CPTR样品两者中观察到粉色沉淀物(图6a)。纯化的材料的最终浓度(图6b)使用纯化的GFLV-CPF13毒粒作为标准品，通过定量DAS-ELISA来确定。对于三次纯化来说，得率在每kg新鲜叶片386至445μg GFLV粒子当量的范围内，这与来自感染的本氏烟草(N.benthamiana)的纯化GFLV的得率在同一数量级上(Schellenberger,Demangeat等，2011)。
为了评估它们的质量和纯度，将纯化的样品通过SDS-PAGE后的考马斯蓝染色(图6c)、使用抗GFLV或抗TR抗体的免疫印迹(图6d和6e)和质谱术(数据未示出)进行分析。对于考马斯蓝染色来说，将6μg粒子当量的每种样品装载在SDS变性凝胶上。与VLP的纯化相一致，在来自于表达CP的叶片的纯化的样品中存在实测质量为57kDa并且与GFLV的CP(计算质量为56kDa)共同迁移的一种主要蛋白质(图6c，条带1和2)。对于CPTR和TRCP样品来说，概况更加复杂，检测到实测分子质量约为87、73和57kDa的三种主要蛋白质(图6c，对于CPTR来说条带3-5，对于TRCP来说条带6-8)，但比例相反：对于TRCP来说较大的产物最为丰富并且较短的产物最不丰富(相应的丰度分别为大约69％、24％和7％)，对于CPTR来说相反(分别为大约2％、35％和63％)。在用抗GFLV抗体免疫印迹后，CPTR样品中存在的较短产物(图6c，条带5)被清楚地揭示(图6d)，强烈表明条带5对应于GFLV的CP并可能代表了CPTR的断裂产物。在TRCP样品中，较大的产物(图6c，条带6)清楚地与抗GFLV抗体免疫反应(图6d)。考虑到这个条带与TRCP的预期尺寸(计算质量：82.8kDa)相近，我们的结果表明全长TRCP是纯化的TRCP样品中存在的主要蛋白。因此，条带6在用抗TR抗体免疫检测后也给出强烈信号(图6e)。抗TR抗体也与CPTR样品中存在的较大产物(条带3)并与CPTR和TRCP样品中观察到的73kDa的截短产物发生免疫反应，但是反应微弱(图6e)。合在一起，我们的结果表明纯化的TRCP和CPTR样品中存在的主要蛋白质源自于GFLV CP，并因此可能代表VLP。
为了洞悉纯化产物的组成，对考马斯蓝染色的条带进行质谱分析，导致对于所有被分析的条带来说，鉴定到覆盖几乎整个CP的肽(图6c，数据未示出)。仅对于条带3、4、6和7来说观察到对应于TR的肽，并且CPTR或TRCP蛋白的几乎完全的覆盖严格限于条带3和6。对应于条带4和7的73kDa产物只表现出TR的部分覆盖，因此代表了CPTR或TRCP的截短的版本，这可能是由在不存在蛋白酶抑制剂的情况下进行的纯化过程期间的蛋白水解作用造成的。合在一起，我们的结果证实全长的嵌合蛋白CPTR或TRCP可以按照标准的病毒纯化程序来纯化，并因此与VLP生产完全相容。它们也揭示出CPTR融合体比TRCP更不稳定，这可能是N-或C-端融合后TR分别朝向VLP的内表面或外表面的不同取向的结果。
3.N-端和C-端CP融合体分别朝向VLP的内部或外部
为了洞悉N-和C-端CP融合体的取向，对VLP进一步进行负染色和免疫吸附电子显微术分析。正如预期，将纯化的材料直接包被在镍格网上然后进行负染色，揭示出在所有样品中存在大量VLP(图7d，7g和7j)，其明显类似于GFLV粒子(图7a)。在这些条件下，CP和CPTR粒子显得电子致密(图7d和7g)，与GFLV毒粒相似(图7a)。相反，TRCP粒子是电子密度低的(图7j)，可能反映出TR朝向TRCP VLP内部的取向可能提高粒子的内部密度并降低对重金属的穿透性(图7a和7b)。为了验证这些假说，使用抗GFLV抗体(图7b、7e、7h和7k)或抗TR抗体(图7c、7f、7i和7l)进行了装饰测定。尽管正如预期，所有纯化的粒子都被抗GFLV抗体标记(图7b、7e、7h和7k)，但只有CPTR粒子被抗TR抗体装饰(图7i)，尽管与CPTR粒子相比在TRCP粒子中存在明显更大比例的全长嵌合蛋白(图6)。这清楚地证实了CPTR和TRCP两者都与VLP形成相容，但区别在于结构体系。在CPTR VLP中，TR可以被抗TR抗体接近，凸显了所述蛋白暴露到粒子的外表面。相反，在TRCP VLP中，TR完全不可被抗TR抗体接近，这最可能是TR被禁闭在粒子内部的结果。可能最重要的是，我们的结果还清楚地显示，GFLV CP可以容纳大到占其自身长度的50％的荧光蛋白的外来蛋白的融合，而不改变所述蛋白自组装成VLP的能力。
4.可以生产混杂VLP
根据我们的结果，接下来我们试验了在共表达N-和C-端CP融合体后GFLV CP形成混杂VLP的能力。为此，选择EGFP作为报告蛋白并将其如图1中所示融合到CP N-端(构建物CPEG，SEQ ID NO：11)。与前相同，将农杆菌渗入的本氏烟草(N.benthamiana)叶片用于表达测定和在不存在蛋白酶抑制剂的情况下进行的VLP纯化。表达CPEG的叶片被用作阴性对照并与共表达CPEG和TRCP的叶片(CPEG+TRCP)进行比较。与我们以前的结果相符，CPEG VLP可以被纯化并且可以定位到与CPTR VLP相同的线性蔗糖梯度级分(图5b)。共表达的CPEG和TRCP也能够纯化在线性蔗糖梯度中与CPEG VLP共沉降的DAS-ELISA免疫反应性材料(图5b)。ISEM分析证实在CPEG和CPEG+TRCP样品两者中存在明显地与抗GFLV和抗EGFP抗体两者免疫反应的VLP(图8)，与预计的EGFP朝向VLP外表面的暴露非常相符。考虑到TR在融合到CPN-端后在ISEM中不可被抗体接近，我们通过在非变性琼脂糖凝胶上通过电泳分离的VLP的荧光成像，进一步评估了EGFP和TagRFP的存在(图9)。在这些条件下，在TRCP、CPEG和CPEG+TRCP样品中检测到具有特定迁移轮廓的不同条带，TRCP VLP仅在红色通道(λ激发480-540/λ发射590-660nm，图9a)中可见，CPEG VLP仅在绿色通道(λ激发450-485/λ发射510-540nm，图9b)中可见，并且CPEG+TRCP VLP正如对混杂粒子所预期的在两个通道中发射(图9a和9b，空心箭头)。
为了证实真正的混杂VLP的产生以及因此同时发射绿光和红光的粒子的存在，将纯化的样品进一步处理，用于通过表面荧光显微术进行单粒子成像。通过这种方式，观察到大量TRCP VLP，其表现为仅在红色通道中发射的个体斑点(图9c)。同样地，也检测到仅在绿色通道中发射并对应于CPEG VLP的个体斑点，但密度更低(图9d)，可能反映出在纯化的CPEG VLP样品中全长蛋白的低丰度(图6c)。重要的是，分开纯化的CPEG和TRCP VLP的混合物导致观察到总是排他性地红色或绿色的个体VLP(图9e)。相反，在CPEG+TRCP VLP中清楚地检测到黄色粒子(图9f，实心箭头)。合在一起，我们的结果证实GFLV CP与混杂VLP的生产完全相容，其中大到荧光蛋白的外源蛋白通过将它们融合到CP的N-或C-端，可以被同时暴露到个体VLP的外表面并禁闭在其内腔中。
5.GFLV VLP不含核酸
为了检查VLP的内容物，进行非变性琼脂糖凝胶电泳，并将凝胶用考马斯蓝染色以检测蛋白质内容物(图10a)或用溴化乙锭(EtBr)染色以检测核酸(图10b)。正如在非变性琼脂糖凝胶中VLP的荧光成像(图9a和9b)后已经注意到的，CP、CPTR和TRCP VLP以及纯化的GFLV的迁移情况显著不同(图10a)，这可能是各种不同粒子的净电荷、密度和质量存在差异的结果。可能是由于TagRFP当暴露在粒子的外表面时相当不稳定的本质，CPTR VLP在凝胶上形成模糊条带而不是对其他样品观察到的清晰条带(图10a)。在EtBr染色后在UV照射下，在GFLV毒粒中清楚地检测到核酸，并且在CP VLP中核酸低于可检测水平，表明这些粒子在这种测定法的检测极限内是无核酸的(图10b)。相反，在相同条件下，CPTR和TRCP VLP两者产生微弱信号，这可能是在UV照射下TR蛋白质的轻微激发(Merzlyak等，2007)和使用的滤光片与TR和核酸光谱的充分辨别不相容，而不是存在核酸的结果(图10b，箭头)。就此而言，只有纯化的病毒产生与核酸的存在相容的高的O.D.260/O.D.280值，而对不同VLP(CP、CPTR、TRCP、CPEG和CPEG+TRCP)测量到的该值在0.89至1.07的范围内，指示了它们非常低的核酸含量或没有核酸(图10c)。
6.GFLV CP衍生的VLP与多达120个FP的同时衣壳化和暴露相容
为了估算在遗传融合到CP后可以并入到VLP中的FP的最大数目，我们对CPEG和TRCP衍生的粒子进行建模(参见实验程序)。两种融合体被证明与VLP的形成完全相容(图11)。根据我们的模型，包含gateway衍生的连接肽的CPEG导致形成具有的表观直径的VLP，其中FP均匀分布并漂浮在粒子的外表面处(图11a)。相反，TRCP导致形成具有与毒粒相一致的的外径的VLP，但是其中FP在粒子内部形成紧密堆积的层(图11b)。我们也对TRCPEG(SEQ ID NO：19)这种两个末端与FP融合的理论CP(1000个残基)进行了建模(图11c)，揭示出至少在计算机中，GFLV CP与FP的同时衣壳化和暴露相容，代表了每个VLP总共120个FP。这种TRCPEG VLP的计算质量(6.69MDa)几乎为仅仅CP的VLP(3.37MDa)的两倍。
7.纳米抗体是用于在GFLV CP衍生的VLP的表面处展示外来蛋白的通用工具
已在WO2015/110601中描述的Nb23可以高效结合到纯化的GFLV粒子，允许通过单粒子冷冻电子显微术以的分辨率确定GFLV-Nb23复合物的结构(图12；所述原子模型的Cryo-EM图谱和坐标已被保存在pdb登记号5FOJ下)。所述结构揭示出Nb23结合在5重轴附近的GFLV的表面处(图12a和12b)。GFLV-Nb23重建的外部等高线表面(图12a和12b)显示，Nb23分子置于彼此足够远离的位置，允许每个毒粒附连60个所述分子，并与CP达到完全的1:1化学计量结合，而不桥接相邻的CP。
为了试验GFLV CP衍生的VLP是否与病毒粒子相似地与Nb23的结合相容，进行了动态光散射(dls)和非变性琼脂糖凝胶电泳分析。dls揭示出单独的TRCP VLP是单分散的，粒子直径为32.0nm±2nm(平均值±SD)，而在饱和浓度的Nb23存在下，TRCP VLP的直径增加到37.8±2nm(图13)。非变性凝胶电泳揭示出向TRCP VLP添加Nb23引起VLP迁移率的显著改变(图14，第1至3道)，我们推测这是在Nb23结合到VLP后各种不同粒子的净电荷密度和质量改变的结果。合在一起，我们的结果证实，TRCP VLP可以被Nb23高效装饰。它们也揭示出Nb23表位是保守的，表明TRCP VLP外表面在结构上与GFLV粒子的外表面一致。
为了评估VLP是否可以用更大的分子装饰，将TRCP VLP在存在融合到EGFP(27kDa)(SEQ ID NO：20)或融合到细菌碱性磷酸酶(ALP)(SEQ ID NO：21)的纯化的Nb23的情况下温育，所述ALP是每个单体约58kDa的同二聚体蛋白(Muller等，2001)，并通过dls和非变性琼脂糖凝胶电泳进行试验。与我们以前使用Nb23的结果相似，在Nb23:GFP(43.8+/-2nm(平均值+/-SD，n＝3))或Nb23ALP(40.0+/-2nm(平均值+/-SD，n＝3))存在下观察到VLP的表观直径的显著增加(图13)。与正如我们的dls结果所表明的Nb23:GFP和Nb23ALP与TRCP VLP的高效结合相一致，在用Nb23:GFP(图14，第3至5道)或Nb23ALP(图15)装饰VLP后也观察到VLP的迁移率的显著变化。在这些条件下，ALP仍然具有酶活性，如通过装饰的VLP的特异性FastRed染色所观察到的(图15)。
最后，我们可以证实Nb23:GFP与VLP的结合是可饱和的，因为在添加逐渐增加量的Nb23:GFP后，VLP迁移率的变化逐渐增加(图16)。在GFLV CP与Nb23:GFP之间的分子比例约为一比一时观察到最大的迁移率变化，表明每个个体VLP可以结合多达60个Nb23:GFP分子。通过荧光成像观察凝胶进一步揭示出被禁闭的TagRFP和暴露的EGFP两者都保留荧光，证实了Nb23介导的结合活性不影响后来蛋白质的活性和完整性。
合在一起，我们的结果证实纳米抗体允许在GFLV CP衍生的VLP的表面处高效且快速地展示外来蛋白。它们也显示，大到Nb23:GFP 和Nb23:ALP(在单体形式下)的分子可以结合到VLP而不丧失活性。
序列
SEQ ID NO：1：GFLV外壳蛋白的氨基酸序列
MGLAGRGVIYIPKDCQANRYLGTLNIRDMISDFKGVQYEKWITAGLVMPTFKIVIRLPANAFTGLTWVMSFDAYNRITSRITASADPVYTLSVPHWLIHHKLGTFSCEIDYGELCGHAMWFKSTTFESPRLHFTCLTGNNKELAADWQAVVELYAELEEATSFLGKPTLVFDPGVFNGKFQFLTCPPIFFDLTAVTALRSAGLTLGQVPMVGTTKVYNLNSTLVSCVLGMGGTVRGRVHICAPIFYSIVLWVVSEWNGTTMDWNELFKYPGVYVEEDGSFEVKIRSPYHRTPARLLAGQSQRDMSSLNFYAIAGPIAPSGETAQLPIVVQIDEIVRPDLSLPSFEDDYFVWVDFSEFTLDKEEIEIGSRFFDFTSNTCRVSMGENPFAAMIACHGLHSGVLDLKLQWSLNTEFGKSSGSVTITKLVGDKAMGLDGPSHVFAIQKLEGTTELLVGNFAGANPNTRFSLYSRWMAIKLDQAKSIKVLRVLCKPRPGFSFYGRTSFPV
SEQ ID NO：2：TRSV外壳蛋白的氨基酸序列
MGGSWQEGTEAAYLGKVTCAKDAKGGTLLHTLDIIKECKSQNLLRYKEWQRQGFLHGKLRLRCFIPTNIFCGHSMMCSLDAFGRYDSNVLGASFPVKLASLLPTEVISLADGPVVTWTFDIGRLCGHGLYYSEGAYARPKIYFLVLSDNDVPAEADWQFTYQLLFEDHTFSNSFGAVPFITLPHIFNRLDIGYWRGPTEIDLTSTPAPNAYRLLFGLSTVISGNMSTLNANQALLRFFQGSNGTLHGRIKKIGTALTTCSLLLSLRHKDASLTLETAYQRPHYILADGQGAFSLPISTPHAATSFLEDMLRLEIFAIAGPFSPKDNKAKYQFMCYFDHIELVEGVPRTIAGEQQFNWCSFRNFKIDDWKFEWPARLPDILDDKSEVLLRQHPLSLLISSTGFFTGRAIFVFQWGLNTTAGNMKGSFSARLAFGKGVEEIEQTSTVQPLVGACEARIPVEFKTYTGYTTSGPPGSMEPYIYVRLTQAKLVDRLSVNVILQEGFSFYGPSVKHFKKEVGTPSATLGTNNPVGRPPENVDTGGPGGQYAAALQAAQQAGKNPFGRG
SEQ ID NO：3：ArMV外壳蛋白的氨基酸序列
MGLAGRGSVQVPKDCQAGRYLKTLDLRDMVSGFSGIQYEKWITAGLVMPDFKVVIRYPANAFTGITWVMSFDAYNRITSSITTTASPAYTLSVPHWLLHHKNGTTSCDIDYGELCGHAMWFNATTFESPKLHFTCLTGNNKELAADWEFVVELYAEFEAAKTFLGRPNFVYSADAFNGSFKFLTIPPLEYDLSTTSAYKSVSLLLGQTLIDGTHKVYNYNNTLLSYYLGIGGVVKGRVHICSPCTYGIVLRVVSEWNGVTNNWNQLFKYPGCYIGEDGNFEIEIRSPYHRTPLRLLDAQAASAFTSTLNFYAISGPIAPSGETAKMPVVVQIDEIALPDLSVPSFPNDYFLWVDFSAFTVDAEEYVIGSRFFDISSTTSTVHLGDNPFAHMIACHGLHHGILDLKLMWDLEGEFGKSSGGVTITKLCGDKATGMDGASRVCALQNMGCETELYIGNFAGANPNSALSLYSRWLAIKLDKARSMKMLRILCKPRGNFEFYGRTCFRV
SEQ ID NO：4：TRSV2外壳蛋白的氨基酸序列
MAVTVVPDPTCCGTLSFKVPKDAKKGKHLGTFDIRQAIMEYGGLHSQEWCAKGIVNPTFTVRMHAPRNAFAGLSIACTFDDYKRIDLPALGNECPPSEMFELPTKVFMLKDADVHEWQFNYGELTGHGLCNWANVVTQPTLYFFVASTNQVTMAADWQCIVTMHVDMGPVIDRFELVPTMTWPIQLGDTFAIDRYYEAKEIKLDGSTSMLSISYNFGGPVKHSKKHAISYSRAVMSRNLGWSGTISGSVKSVSSLFCTASFVIFPWEHEAPPTLRQVLWGPHQIMHGDGQFEIAIKTRLHSAATTEEGFGRLGILPLSGPIAPDAHVGSYEFIVHIDTWRPDSQVHPPMFSSAELYNWFTLTNLKPDANTGVVNFDIPGYIHDFASKDATVTLASNPLSWLVAATGWHYGEVDLCISWPRSKQAQAQEGSVSITTNYRDWGAYWQGQARIYDLRRTEAEIPIFLGSYAGATPSGALGKQNYVRISIVNAKDIVALRVCLRPKSIKFWGRSATLF
SEQ ID NO：5：CNSV外壳蛋白的氨基酸序列
MSAENFVFTQLITVPAASTKGNVLAGVDILANARTTMSGFYMRWLQKGYIDTNLKLICHLPRAPFAGMSFFVLIDGTGYLAKDAPTSLNEEEILSYPLHLVTTSDVSSYEFVLDWHRYIGQVPFAEENAFLRPTLFLVACVSSTLALSAKVEFYLEAQSVGEELPRTLAPSPVLSYPFQNSFLEDLDLFLPPKRLTLGERETTIIPLSFAKSKKSGDAVLYSHAAARLAHFQGIGGVLHGVVYLVGSQLVASQSRISMWSKEQHIQHQAVNVHVDTDTGVAFDLPIKDAFYASSVYGDSGAVIQVTCLCSPMSPNAIKAPFDMIFKIRGFTPDAPMCRTINFTQRFGWFAVEPTTSTGAIKLKIWPVSNHLESEDMKVTGYTNAFLQMCQTSTMHFGSVIIHFSWTLFGGTTNAATAGGVVTIAEGFGPEEENFRGHCRNLSIYEGRATVPLELGTFAGPTPLKKLDFKYRNWIRFTTPKGRNISSIFCAIEVLPGFSFYGRTGSPRLSVVGTTVPPTADASTSNSQGGDMKILEINILLPWAGGEDEARVQDQAPLGLMFLGIS
SEQ ID NO：6：GBLV外壳蛋白的氨基酸序列
MGWCPKDATAGRVLEAINLREEIATGDNLVKYDWLAKGMIEPDMSVRLTVGQNPFVGISIGVCCDFSGRLAQYYDGATAIPIEICNQLPNFVCPISERSVFVHKINMLLAGYNLFQTQKHFADPYILVYIIDTNTLSASDEWGYTIELCVHSSVHTTQFARTPFLTLPGTFDGTLPLDLWRGPFSFKTGKSAPREERIGINFGSKRTYNSGAKEFYSLPAAHIQLLQSVGGILHGSVIQTGSRAISCELYMILQPDKTANNLEQAVKLPGCRVPTGGGPFSLRIQSAFLRSQIYETGVQLVIYALGGPLGAATISAPYQYMVHFSHITEEEGFVPRPIGTILEFNWATLAQLTLKDRFQIPARLSDLVIPGVSVHMRSNPLASIIGACGFFRGHVTFILQWSLNVEHVKPKTYMQVQTCVGTFIPAPVKHSQILQSWVVPISQRFELRVPFDLVDYPGFNSSGGIGLDHMQPFIDIACGDFSQLEYFNINVELKPGFEIYGRSVTPLK
SEQ ID NO：7：BRV外壳蛋白的氨基酸序列
MSGLVADTTLAFAKMYQCKKDAKAGHVLATIDIQECVFEDNRRVALDWLAHGLASFKYDLQLTVDSNPFVGVTLGITVDAFDRLLPQISDEVIAVPLAFQLPTYLFPISKKGTFTQTIDFAAIAGYNFFPHVAAFGRPKIIVYIVSDNDLPASDTWMCLVELHMTRLESSTLACSPTLVLPQAFGGDLPLDLWRGPYTFPLGGGTKRLSTSLDIGTSTTTVSGWRTVSFPAAYALFLQGHGGSLVGEVVHTGSAAVSCALHLCISFGGAPPTLEEALVFPGFRLPSGEGKFHIKVQTPYGRLSTLTPDCALYVYLAGGPIAVAPMSVPYQFCIHLERLVDDGAPPRTIGLIREFNWATINNFKSDDITFAIPARLSDLVLTCGDVTMSTNPLALLIGSCGFFRGNLTVVLEWATFLKAGDKEGTVQLTTCRGMINNVKGVRNAIQKKVVNLSLVGSVSRYLNVGDFTGFAQSGGQVGYDEIFLEFSTNKAKQIRYLNINVELDENFELYGRTIIPLKNTAPAFASTSASAPNES
SEQ ID NO：8：BRSV外壳蛋白的氨基酸序列
MAGGSYAFGETIELPATVTPGTVLAVFNIFDKIQETNTKVCSKWLEQGYVSQNLTAISHLAPNAFSGIAIWYIFDAYGKIPGDVTTTFELEMARSFDPHVQVLRDVSTSTWVIDFHKICGQTLNFSGQGYCVPKIWVIAASTFQLARSTATKFRLEFYTRGEKLVRGLAEQPLSYPIEARHLTDLNLMLAPKQIAVGTYAMITFPVSLAAKLQSTSGRTAYSYAAGLLSHFLGVGGTIHFVVRTTSSAFVTSKLRIALWGTVPETDQLAQMPHVDVEVNVDASLQIQSPFFSTANFGNSGSAFYVSTLCAPMAPETVETGSEYYIQIKGIEANPGLCREINYKQRFAWCLLECLDNSKASPIKVKIPSRIGNLSSKHVKVTNFVNALAILCATTGMHHGNCTIHFSWLWHPAELGKQLGRLKFVQGMGINNEHIGDTMCYNSLSNTHSVPFQFGSFAGPITSGGKADEAENWIEIQSPDFSWVASLHVSIEVHEGFKFYGRSAGPLTIPATVADVSAVSGS
SEQ ID NO：9：CPTR
粗体：连接物
下划线：外壳蛋白
SEQ ID NO：10：TRCP
粗体：连接物
下划线：外壳蛋白
SEQ ID NO：11：CPEG
粗体：连接物
下划线：外壳蛋白
SEQ ID NO：12：TR
MSELIKENMHMKLYMEGTVNNHHFKCTSEGEGKPYEGTQTMRIKVVEGGPLPFAFDILATSFMYGSRTFINHTQGIPDFFKQSFPEGFTWERVTTYEDGGVLTATQDTSLQDGCLIYNVKIRGVNFPSNGPVMQKKTLGWEANTEMLYPADGGLEGRSDMALKLVGGGHLICNFKTTYRSKKPAKNLKMPGVYYVDHRLERIKEADKETYVEQHEVAVARYCDLPSKLGHN
SEQ ID NO：13：连接物
DPAFLYKVVRSFGPA
SEQ ID NO：14：Nb126
SEQ ID NO：15：Nb101
SEQ ID NO：16：Nb23
SEQ ID NO：17：Nb75
SEQ ID NO：18：Nb71
SEQ ID NO：19：TRCPEG
蛋白质重量为111.52千道尔顿。粗体为GFLV的CP。
SEQ ID NO：20：Nb23EGFP
粗体为EGFP的序列。下划线：Nb23
SEQ ID NO：21：Nb23ALP
粗体为ALP的序列。下划线：Nb23
参考文献
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序列表
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斯特拉斯堡大学
法国国家科学研究中心
<120> 线虫传多面体病毒外壳蛋白融合多肽及其用途
<130> B2092
<160> 21
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 505
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> GFLV外壳蛋白
<400> 1
Met Gly Leu Ala Gly Arg Gly Val Ile Tyr Ile Pro Lys Asp Cys Gln
1 5 10 15
Ala Asn Arg Tyr Leu Gly Thr Leu Asn Ile Arg Asp Met Ile Ser Asp
20 25 30
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35 40 45
Pro Thr Phe Lys Ile Val Ile Arg Leu Pro Ala Asn Ala Phe Thr Gly
50 55 60
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65 70 75 80
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Thr Ser Phe Leu Gly Lys Pro Thr Leu Val Phe Asp Pro Gly Val Phe
165 170 175
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Ser Cys Val Leu Gly Met Gly Gly Thr Val Arg Gly Arg Val His Ile
225 230 235 240
Cys Ala Pro Ile Phe Tyr Ser Ile Val Leu Trp Val Val Ser Glu Trp
245 250 255
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Arg Phe Phe Asp Phe Thr Ser Asn Thr Cys Arg Val Ser Met Gly Glu
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Phe Ser Leu Tyr Ser Arg Trp Met Ala Ile Lys Leu Asp Gln Ala Lys
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Ser Ile Lys Val Leu Arg Val Leu Cys Lys Pro Arg Pro Gly Phe Ser
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> TRSV外壳蛋白
<400> 2
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115 120 125
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145 150 155 160
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165 170 175
Val Pro Phe Ile Thr Leu Pro His Ile Phe Asn Arg Leu Asp Ile Gly
180 185 190
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195 200 205
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325 330 335
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340 345 350
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370 375 380
Glu Val Leu Leu Arg Gln His Pro Leu Ser Leu Leu Ile Ser Ser Thr
385 390 395 400
Gly Phe Phe Thr Gly Arg Ala Ile Phe Val Phe Gln Trp Gly Leu Asn
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420 425 430
Gly Lys Gly Val Glu Glu Ile Glu Gln Thr Ser Thr Val Gln Pro Leu
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<213> 人工
<220>
<223> ArMV外壳蛋白
<400> 3
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Ala Asp Trp Glu Phe Val Val Glu Leu Tyr Ala Glu Phe Glu Ala Ala
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Lys Thr Phe Leu Gly Arg Pro Asn Phe Val Tyr Ser Ala Asp Ala Phe
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Ser Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly Gly Val Val Lys Gly Arg Val His Ile
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Cys Ser Pro Cys Thr Tyr Gly Ile Val Leu Arg Val Val Ser Glu Trp
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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Ala Leu Ala Leu Leu Pro Leu Leu Phe Thr Pro Val Thr Lys Ala Arg
145 150 155 160
Thr Pro Glu Met Pro Leu Gln Thr Gln Ala Thr Ser Arg Glu Glu Pro
165 170 175
Pro Arg Leu Pro Ser Lys His Arg Pro Gly Val Lys Thr Gln Ala Thr
180 185 190
Ser Arg Glu Glu Pro Pro Arg Leu Pro Ser Lys His Arg Pro Gly Val
195 200 205
Lys Thr Gln Ala Thr Ser Arg Glu Glu Pro Pro Arg Leu Pro Ser Lys
210 215 220
His Arg Pro Gly Val Lys Thr Gln Ala Thr Ser Arg Glu Glu Pro Pro
225 230 235 240
Arg Leu Pro Ser Lys His Arg Pro Gly Val Lys Thr Gln Ala Thr Ser
245 250 255
Leu Glu Val Leu Glu Asn Arg Ala Ala Gln Gly Asp Ile Thr Ala Pro
260 265 270
Gly Gly Ala Arg Arg Leu Thr Gly Asp Gln Thr Ala Ala Leu Arg Asp
275 280 285
Ser Leu Ser Asp Lys Pro Ala Lys Asn Ile Ile Leu Leu Ile Gly Asp
290 295 300
Gly Met Gly Asp Ser Glu Ile Thr Ala Ala Arg Asn Tyr Ala Glu Gly
305 310 315 320
Ala Gly Gly Phe Phe Lys Gly Ile Asp Ala Leu Pro Leu Thr Gly Gln
325 330 335
Tyr Thr His Tyr Ala Leu Asn Lys Lys Thr Gly Lys Pro Asp Tyr Val
340 345 350
Thr Asp Ser Ala Ala Ser Ala Thr Ala Trp Ser Thr Gly Val Lys Thr
355 360 365
Tyr Asn Gly Ala Leu Gly Val Asp Ile His Glu Lys Asp His Pro Thr
370 375 380
Ile Leu Glu Met Ala Lys Ala Ala Gly Leu Ala Thr Gly Asn Val Ser
385 390 395 400
Thr Ala Glu Leu Gln Asp Ala Thr Pro Ala Ala Leu Val Ala His Val
405 410 415
Thr Ser Arg Lys Cys Tyr Gly Pro Ser Ala Thr Ser Glu Lys Cys Pro
420 425 430
Gly Asn Ala Leu Glu Lys Gly Gly Lys Gly Ser Ile Thr Glu Gln Leu
435 440 445
Leu Asn Ala Arg Ala Asp Val Thr Leu Gly Gly Gly Ala Lys Thr Phe
450 455 460
Ala Glu Thr Ala Thr Ala Gly Glu Trp Gln Gly Lys Thr Leu Arg Glu
465 470 475 480
Gln Ala Gln Ala Arg Gly Tyr Gln Leu Val Ser Asp Ala Ala Ser Leu
485 490 495
Asn Ser Val Thr Glu Ala Asn Gln Gln Lys Pro Leu Leu Gly Leu Phe
500 505 510
Ala Asp Gly Asn Met Pro Val Arg Trp Leu Gly Pro Lys Ala Thr Tyr
515 520 525
His Gly Asn Ile Asp Lys Pro Ala Val Thr Cys Thr Pro Asn Pro Gln
530 535 540
Arg Asn Asp Ser Val Pro Thr Leu Ala Gln Met Thr Asp Lys Ala Ile
545 550 555 560
Glu Leu Leu Ser Lys Asn Glu Lys Gly Phe Phe Leu Gln Val Glu Gly
565 570 575
Ala Ser Ile Asp Lys Gln Asp His Ala Ala Asn Pro Cys Gly Gln Ile
580 585 590
Gly Glu Thr Val Asp Leu Asp Glu Ala Val Gln Arg Ala Leu Glu Phe
595 600 605
Ala Lys Lys Glu Gly Asn Thr Leu Val Ile Val Thr Ala Asp His Ala
610 615 620
His Ala Ser Gln Ile Val Ala Pro Asp Thr Lys Ala Pro Gly Leu Thr
625 630 635 640
Gln Ala Leu Asn Thr Lys Asp Gly Ala Val Met Val Met Ser Tyr Gly
645 650 655
Asn Ser Glu Glu Asp Ser Gln Glu His Thr Gly Ser Gln Leu Arg Ile
660 665 670
Ala Ala Tyr Gly Pro His Ala Ala His His His His His His
675 680 685

Claims (20)

1.一种病毒样粒子，其包含与化合物缀合的线虫传多面体病毒外壳蛋白。
2.权利要求1的粒子，其中所述化合物通过所述外壳蛋白的C-端和/或N-端中的共价偶联与所述外壳蛋白缀合。
3.权利要求1的粒子，其中所述化合物通过配体介导的附连与所述外壳蛋白缀合。
4.权利要求3的粒子，其中所述化合物通过抗外壳蛋白抗体或抗体衍生物与所述外壳蛋白缀合。
5.权利要求4的粒子，其中所述抗体衍生物是纳米抗体或ScFv。
6.权利要求1至2任一项的粒子，其包含在C-端与化合物缀合的线虫传多面体病毒外壳蛋白和在N-端与化合物缀合的线虫传多面体病毒外壳蛋白的混合物。
7.权利要求1至5任一项的粒子，其包含与所述外壳蛋白的N-端缀合的被禁闭的化合物和通过抗体介导的附连与所述粒子的表面缀合的被暴露的化合物。
8.前述权利要求任一项的粒子，其是无核酸的。
9.前述权利要求任一项的粒子，其中所述线虫传多面体病毒是GFLV。
10.前述权利要求任一项的粒子，其中所述外壳蛋白包含SEQ ID NO：1或与SEQ ID NO：1具有至少80％、优选地至少90％同一性的序列。
11.前述权利要求任一项的粒子，其中所述化合物是治疗剂、诊断剂或成像剂或标签，优选为多肽或肽。
12.一种分子，其包含与化合物缀合的线虫传多面体病毒外壳蛋白，优选地在所述外壳蛋白的C-端或N-端与化合物缀合的线虫传多面体病毒外壳蛋白。
13.一种药物组合物，其包含一种或多种根据权利要求1至11任一项所述的病毒样粒子或权利要求12的分子。
14.与化合物缀合的线虫传多面体病毒外壳蛋白的用途，其用于生产病毒样粒子。
15.一种生产病毒样粒子的方法，所述方法包括(i)提供线虫传多面体病毒外壳蛋白，其任选地与化合物缀合，以及(ii)允许所述蛋白单独地或与其他蛋白混合地组装成病毒样粒子。
16.权利要求15的方法，其还包括步骤(iii)优选地通过非共价的配体介导的附连向所述病毒样粒子添加反应性或活性基团。
17.权利要求15或16的方法，其包括：
(i)提供线虫传多面体病毒外壳蛋白，其任选地在N-端与第一化合物缀合，
(ii)允许所述蛋白单独地或与其他蛋白混合地组装成病毒样粒子，以及
(iii)使用与至少一种第二化合物缀合的抗外壳蛋白抗体或其衍生物，通过抗体介导的附连将(ii)的所述粒子偶联到所述第二化合物。
18.一种核酸分子，其编码权利要求12的分子。
19.一种载体，其包含权利要求18的核酸。
20.一种重组宿主细胞，其含有权利要求18的核酸或权利要求19的载体。
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