CN108504779A - 一种桑花叶卷叶病中线虫传多面体病毒属病毒的试剂盒及其检测方法 - Google Patents

一种桑花叶卷叶病中线虫传多面体病毒属病毒的试剂盒及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种桑花叶卷叶病中线虫传多面体病毒属病毒的试剂盒，包括两条特异性引物，所述试剂盒还包括M‑MLV反转录酶、M‑MLV酶反应缓冲液、dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+和PCR反应缓冲液。本发明还提供一种桑花叶卷叶病病毒的检测方法，其包括以下步骤：(1)提取待测样品总RNA，(2)设计并合成引物，(3)RT‑PCR，(4)电泳检测。本发明提供了一种桑花叶卷叶病中线虫传多面体病毒属病毒的试剂盒与检测方法，利用RT‑PCR方法检测桑花叶卷叶病中线虫传多面体病毒属病毒，节省时间，大大提高了检测的可操作性、灵敏性和可重复性，为桑花叶卷叶病的病毒检测提供了有效方法。

Description

一种桑花叶卷叶病中线虫传多面体病毒属病毒的试剂盒及其 检测方法
技术领域
本发明属于植物病毒检测技术领域，具体涉及一种桑花叶卷叶病中线虫传多面体病毒属病毒的试剂盒及其检测方法。
背景技术
桑花叶卷叶病又称桑花叶型萎缩病、花叶卷缩病等，是桑萎缩病的另一种。主要发生在春季和晚秋，引起桑叶卷缩、发皱、老硬，影响春叶和夏叶的产量及质量。桑花叶卷叶病，初发病时在叶片侧脉间出现浅绿至黄绿色斑块，叶脉附近仍绿色，出现黄绿相间的花叶或成镶嵌状，叶形不正，叶缘常向叶面卷缩，有的裂叶一半无缺刻，叶背脉侧易生小瘤状突起，细脉褐变，病枝细，节间缩短。有时同一枝上的叶片在春末、夏初或秋季出现，有时显症有时不显症的间歇发病情况。发病重时，病叶小，叶面卷起明显，叶脉变褐更明显，瘤状、棘状突起更多，腋芽早发，侧枝多，病株逐渐衰亡，但根系不腐烂。
在桑花叶卷叶病的叶组织中发现一种新的病毒和一种类似类病毒的小分子环状RNA,该病毒可能是线虫传多面体病毒属病毒，目前还没有能确切检测鉴定出桑花叶中线虫传多面体病毒属病毒的有效试剂盒，故亟需一种桑花叶卷叶病中线虫传多面体病毒属病毒的试剂盒及其检测方法。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种桑花叶卷叶病中线虫传多面体病毒属病毒的试剂盒与检测方法。
技术方案：本发明所述的一种桑花叶卷叶病中线虫传多面体病毒属病毒的试剂盒，包括两条特异性引物：
SPLVGV-1：5’-CCAGTCAACGAACAAAGGA-3’；
SPLVGV-2：5’-GGCATAGCGTGCTAACAG-3’。
进一步的，所述试剂盒还包括M-MLV反转录酶、M-MLV酶反应缓冲液、dNTPs、 TaqDNA聚合酶、Mg2+和PCR反应缓冲液。
进一步的，所述试剂盒还包括标准阳性模板。
本发明中还提供一种桑花叶卷叶病病毒的检测方法，其包括以下步骤：
(1)提取待测样品总RNA；
(2)设计并合成引物；
(3)RT-PCR
a.反转录合成cDNA，以桑树小分子总RNA为模板，以SPLVGV-2引物，通过反转录酶合成cDNA
b.PCR扩增，以cDNA为模板，以SPLVGV-1和SPLVGV-2为引物，进行PCR 反应；
(4)电泳检测
吸取2.5μL RT-PCR产物进行0.8-1.5％的琼脂糖凝胶电泳，经核糖染色Goldview，通过凝胶成像仪观察，在感染该线虫传多面体病毒的桑花叶病叶样品中有895bp的核酸条带。
进一步的，所述步骤(1)中总RNA提取法采用的是多糖多酚植物组织的裂解法。
进一步的，所述步骤(3)中PCR扩增阶段的反应条件为：94℃预变性5min； 94℃变性1min；54℃退火1min；72℃延伸1min，共进行35个循环，72℃延伸 7min，4℃保存。
有益效果：本发明提供了一种在检测桑花叶卷叶病中线虫传多面体病毒属病毒的试剂盒与检测方法，利用RT-PCR方法检测桑花叶卷叶病中线虫传多面体病毒属病毒，节省时间，大大提高了检测的可操作性、灵活性和可重复性，为桑花叶卷叶病的病毒检测提供了有效方法。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明作进一步的详细说明，该实施例仅解释本发明，并不构成对本发明保护范围的限定。
实施例
(1)引物设计与合成
根据桑树小分子环状小RNA高通量测序分析结果，设计并合成该桑花叶卷叶病中线虫传多面体病毒的特异性引物：SPLVGV-1(CCAGTCAACGAACAAAGGA)和 SPLVGV-2(GGCATAGCGTGCTAACAG)；
(2)总RNA提取
多肽多酚植物组织裂解法
(3)RT-PCR
a.反转录合成cDNA
以桑树小分子总RNA为模板，以SPLVGV-2引物，通过反转录酶为MLV，合成cDNA，反转录体系为：
轻弹管壁混匀，稍离心后，42℃保温60min，然后置冰上待用；
b.PCR扩增
cDNA 2μL
2×Taq Mix 10μL
SPLVGV-1(10μmol) 2μL
SPLVGV-2(10μmol) 2μL
ddH2O 至10μL
PCR程序为：94℃预变性5min，94℃变性1min，54℃退火1min，72℃延伸 1min，共进行35个循环，72℃延伸7min，4℃保存；
(4)电泳检测
吸取2.5μL RT-PCR产物进行0.8-1.5％的琼脂糖凝胶电泳，经核糖染色Goldview，通过凝胶成像仪观察，有895bp的核酸条带，为受线虫传多面体病毒侵染的桑花叶病叶样品，无条带为健康植株。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效结构变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。

Claims (6)

1.一种桑花叶卷叶病中线虫传多面体病毒属病毒的试剂盒，其特征在于，包括两条特异性引物：
SPLVGV-1：5’-CCAGTCAACGAACAAAGGA-3’；
SPLVGV-2：5’-GGCATAGCGTGCTAACAG-3’。
2.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括M-MLV反转录酶、M-MLV酶反应缓冲液、dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+和PCR反应缓冲液。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准阳性模板。
4.一种桑花叶卷叶病中线虫传多面体病毒属病毒的检测方法，其特征在于，其包括以下步骤：
(1)提取待测样品总RNA；
(2)设计并合成引物；
(3)RT-PCR
a.反转录合成cDNA，以甘薯总RNA为模板，以SPLVGV-2引物，通过反转录酶合成cDNA
b.PCR扩增，以cDNA为模板，以SPLVGV-1和SPLVGV-2为引物，进行PCR反应；
(4)电泳检测
吸取2.5μL RT-PCR产物进行0.8-1.5％的琼脂糖凝胶电泳，经核糖染色Goldview，通过凝胶成像仪观察，在感染该桑花叶卷叶病病毒的甘薯样品中有895bp的核酸条带。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中总RNA提取法采用的是多糖多酚植物组织的裂解法。
6.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中PCR扩增阶段的反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性1min；54℃退火1min；72℃延伸1min，共进行35个循环，72℃延伸7min，4℃保存。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112094951A (zh) * 2020-10-23 2020-12-18 安康学院 一种桑树线虫传多面体病毒的定量检测方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0574345A2 (en) * 1992-06-12 1993-12-15 Instituto Nacional De Investigacion Y Tecnologia, Agraria Y Alimentaria Procedure for the detection and identification of viral and subviral pathogens
CN102277450A (zh) * 2011-08-16 2011-12-14 厦门出入境检验检疫局检验检疫技术中心 五种检疫性线虫传多面体病毒多重检测用引物及其应用
WO2017042367A1 (en) * 2015-09-11 2017-03-16 Institut National De La Recherche Agronomique Nepovirus coat protein fusion polypeptides and their use

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0574345A2 (en) * 1992-06-12 1993-12-15 Instituto Nacional De Investigacion Y Tecnologia, Agraria Y Alimentaria Procedure for the detection and identification of viral and subviral pathogens
CN102277450A (zh) * 2011-08-16 2011-12-14 厦门出入境检验检疫局检验检疫技术中心 五种检疫性线虫传多面体病毒多重检测用引物及其应用
WO2017042367A1 (en) * 2015-09-11 2017-03-16 Institut National De La Recherche Agronomique Nepovirus coat protein fusion polypeptides and their use

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
卢全有: "桑树中一种新病毒和一种小分子环状RNA的研究", 《中国博士学位论文全文数据库 农业科技辑》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112094951A (zh) * 2020-10-23 2020-12-18 安康学院 一种桑树线虫传多面体病毒的定量检测方法
CN112094951B (zh) * 2020-10-23 2023-05-09 安康学院 一种桑树线虫传多面体病毒的定量检测方法

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