CN102277450A

CN102277450A - 五种检疫性线虫传多面体病毒多重检测用引物及其应用

Info

Publication number: CN102277450A
Application number: CN2011102342584A
Authority: CN
Inventors: 廖富荣; 郭木金; 沈建国; 林石明; 陈红运; 陈青
Original assignee: INSPECTION AND QUARANTINE CENTER OF XIAMEN ENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANTINE BUREAU
Current assignee: INSPECTION AND QUARANTINE CENTER OF XIAMEN ENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANTINE BUREAU
Priority date: 2011-08-16
Filing date: 2011-08-16
Publication date: 2011-12-14
Anticipated expiration: 2031-08-16
Also published as: CN102277450B

Abstract

本发明提供了一种五种检疫性线虫传多面体病毒(南芥菜花叶病毒、桃丛簇花叶病毒、番茄环斑病毒、番茄黑环病毒、烟草环斑病毒)多重RT-PCR检测用引物及其应用，所述引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1～6所示。本发明还进一步提供了检测五种检疫性线虫传多面体病毒的方法，该方法以样品总RNA为模板，利用本发明特异性引物进行RT-PCR扩增，反应结束后凝胶电泳检测扩增产物，根据特异性扩增DNA片段的位置判定结果。本发明引物特异性好，检测方法快速准确，为进出口安全提供了保证。

Description

五种检疫性线虫传多面体病毒多重检测用引物及其应用

技术领域

本发明涉及生物检测技术，具体地说涉及五种检疫性线虫传多面体病毒(Nepovirus)多重RT-PCR检测用引物及其应用。

背景技术

线虫传多面体病毒属(Nepovirus)是类小RNA病毒目(Picornavirales)、伴生豇豆病毒科(Secoviridae)、豇豆花叶病毒亚科(Comovirinae)中的一个病毒属，包含亚组A、B和C等3个亚组，至少有34种病毒。线虫传多面体病毒广泛分布于温带地区，有些病毒种类具有非常广泛的自然寄主，对农业安全生产造成重大威胁。12种病毒通过长针线虫(剑线虫属Xiphinema、长针线虫属Longidorus、或拟长针线虫属Paralongidorus spp)持久性传播、3种通过花粉传播，一种通过螨类传播，其他种类还没有发现传播介体。在线虫传多面体病毒中，种子和/或花粉传播非常普遍，已报道21种病毒可以通过种子传播。根据2007年公布的《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》，该病毒属中被列为检疫性病毒的种类有：南芥菜花叶病毒(Arabis mosaic virus，ArMV)、桃丛簇花叶病毒(Peach rosette mosaic virus，PRMV)、烟草环斑病毒(Tobacco ringspotvirus，TRSV)、番茄黑环病毒(Tomato black ring virus，TBRV)、番茄环斑病毒(Tomato ringspot virus，ToRSV)，共5种。目前，已建立了针对南芥菜花叶病毒、桃丛簇花叶病毒、烟草环斑病毒、番茄黑环病毒、番茄环斑病毒等单个病毒的RT-PCR检测方法，以及同时检测ToRSV和TRSV等2种病毒的多重RT-PCR检测方法(薛杨等，2005；吴兴海等，2006)，Digiaro等(2007)建立了亚组A的TRSV、GFLV、ArMV、GDefV等4种病毒的多重RT-PCR，亚组B的GCMV、AILV、GARSV和TBRV等4种病毒的多重RT-PCR，但还未见报道针对我国5种检疫性线虫传多面体病毒的多重RT-PCR检测方法。本申请发明人根据5种检疫性线虫传多面体病毒RNA1编码的依赖于RNA的RNA聚合酶基因(RNA-dependent RNA polymerase gene，RdRp)序列设计5条特异性引物，并在其下游区域的保守区域设计一条可用于5种检疫性线虫传多面体病毒的简并引物，通过反转录(reverse transcription，RT)和聚合酶链式反应技术(polymerase chainreaction，PCR)建立了ArMV、PRMV、TBRV、ToRSV、TRSV的多重RT-PCR检测方法，反应结束后根据特异性扩增DNA片段的位置判定结果。本发明所建立的多重RT-PCR方法可以同时检测5种检疫性线虫传多面体病毒，极大提高检测效率，降低检测成本，满足多目标检测要求。

发明内容

本发明目的在于提供用于ArMV、PRMV、TBRV、ToRSV和TRSV等五种检疫性线虫传多面体病毒多重RT-PCR检测的引物序列及其应用。

本发明通过分析已报道的ArMV、PRMV、TBRV、ToRSV和TRSV等5种检疫性线虫传多面体病毒RNA1上的RdRp基因序列设计5条特异性引物，并在其下游区域的保守区域设计一条可用于5种检疫性线虫传多面体病毒的简并引物。所述的引物对由5条正向引物和1条反向引物组成，其5条正向引物序列为ArMV-342：如SEQ ID NO：1所示，即为5’-TCC TGT GAG TAA TCA GCA GC-3’、PRMV-293：如SEQ ID NO：2所示，即为5’-CGC CGC TCTATT TGTGGT-3’、TBRV-256：如SEQ ID NO：3所示，即为5’-TTG TGG TTTGCC CTC TGG A-3’、ToRSV-472：如SEQ ID NO：4所示，即为5’-GGA CGG ACA TTT ATC AGC G-3’、TRSV-695：如SEQ ID NO：5所示，即为5’-GAT GAA TTG CTT GTG GAA CGT-3’；1条反向引物序列为Nep-21R：如SEQ ID NO：1所示，即为5’-YTT RTC MBTVCC ATC MGT AAT-3’，其中，Y＝C/T，V＝G/A/C，R＝A/G，B＝G/T/C，M＝A/C。

本发明还进一步给出了应用上述引物的多重RT-PCR检测方法，其以样品总RNA为模板，进行多重RT-PCR扩增，反应结束后根据特异性扩增的DNA片段判定结果。

较佳地，RT-PCR的反应过程中反转录反应的温度为42℃，PCR扩增的退火温度为52℃，延伸温度为72℃。

其中，ArMV扩增的DNA片段大小为342bp、PRMV为293bp、TBRV为256bp、ToRSV为472bp和TRSV为695bp。

具体地说本发明以样品总RNA为模板，进行RT-PCR反应。RT-PCR反应包括反转录和PCR扩增两个过程。

首先在25μL反应体系进行反转录反应，即在0.6mL的反应管中加入4.0μL RNA，2μL Nep-21R(10μmol/L)，5.0μL DEPC处理水，70℃水浴5min，立即冰浴5min后，加入5μL 5×M-MLVbuffer，1μL M-MLV Reverse Transcriptase，1μL dNTP(各10mmol/L)，0.5μL Ribolock^TM RNase Inhibitor，补充DEPC处理水至25μL，轻轻混匀后42℃水浴1h，70℃灭活10min，合成第一链cDNA，-20℃保存备用。

PCR反应体系为25μL，即在0.2mL的PCR反应管中加入2.0μLcDNA，1.0μL上游引物(10μmol/L)，1.0μL下游引物(10μmol/L)，0.2μL DreamTaq^TM DNA Polymerase，2.5μL 10×DreamTaq^TM PCRbuffer，0.5μL dNTP Mixture(各10mmol/L)，17.80μL灭菌水。反应条件如下：95℃ 3min；94℃ 45s，52℃ 45s，72℃ 1min，35个循环；最后72℃延伸10min。取5μL的PCR产物采用2.0％的琼脂糖凝胶电泳电泳检测。

进一步，还可以将本发明引物及相关试剂组装成试剂盒，以方便使用。

所述的引物在五种检疫性线虫传多面体病毒多重检测中的应用不限于以上所述，例如可以加入其它辅助手段进行联合检测。

本发明根据五种检疫性线虫传多面体病毒RNA1上RdRp基因序列设计引物，该组引物可用于ArMV、PRMV、TBRV、ToRSV、TRSV等五种检疫性线虫传多面体病毒多重RT-PCR检测。本发明检测方法能够快速准确地判断样品是否有检疫性线虫传多面体病毒(ArMV、PRMV、TBRV、ToRSV、TRSV)，为进出口安全提供了保证。

附图说明

图1是ArMV、PRMV、TBRV、ToRSV、TRSV等五种检疫性线虫传多面体病毒单重及多重RT-PCR方法检测结果。1为空白对照，2-6分别为TBRV、PRMV、ArMV、ToRSV和TRSV的单重RT-PCR扩增结果，7为五种检疫性线虫传多面体病毒的多重RT-PCR检测结果。

图2是ArMV、PRMV、TBRV、ToRSV、TRSV等五种检疫性线虫传多面体病毒多重RT-PCR方法的特异性试验结果。1为阳性对照，2-11分别为同属病毒蓝莓叶斑驳病毒(BLMoV)、樱桃卷叶病毒(CLRV)、葡萄扇叶病毒(GFLV)、悬钩子环斑病毒(RpRSV)以及葡萄、黄瓜、桃子、菜豆、普通烟、苋色藜等健康寄主叶片。

图3是ArMV、PRMV、TBRV、ToRSV、TRSV等五种检疫性线虫传多面体病毒多重RT-PCR方法的灵敏度试验结果。M：100bpDNA Marker；1：5⁰倍稀释；2：5^-1倍稀释；3：5^-2倍稀释；4：5^-3倍稀释；5：5^-4倍稀释；6：5^-5倍稀释；7：5^-6倍稀释；8：空白对照。

具体实施方式

下面实施例用于对本发明的进一步说明，但不用来限制本发明的范围。

实施例15种检疫性线虫传多面体病毒多重RT-PCR方法的建立

1.引物设计和合成

根据5种检疫性线虫传多面体病毒RNA1上的RdRp基因序列保守区域设计5条特异性引物，并在其下游区域的保守区域设计一条可用于5种检疫性线虫传多面体病毒的简并引物。

特异引物(正向)序列为：

ArMV-342(SEQ ID NO：1)：5’-TCC TGT GAG TAA TCA GCA GC-3’

PRMV-293(SEQ ID NO：2)：5’-CGC CGC TCT ATT TGT GGT-3’

TBRV-256(SEQ ID NO：3)：5’-TTG TGG TTT GCC CTC TGG A-3’

ToRSV-472(SEQ ID NO：4)：5’-GGA CGG ACA TTT ATC AGC G-3’

TRSV-695(SEQ ID NO：5)：5’-GAT GAA TTG CTT GTG GAA CGT-3’

简并引物(反向)序列为：

Nep-21R(SEQ ID NO：6)：5’-YTT RTC MBT VCC ATC MGT AAT-3’

其中，Y＝C/T，V＝G/A/C，R＝A/G，B＝G/T/C，M＝A/C。

2.总RNA的提取

1)取0.1g发病叶片，用液氮研磨成粉末状，移入灭菌的1.5ml离心管中，然后加入1ml的Trizol试剂，剧烈震荡摇匀；

2)室温下保持5min，加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15s，然后在室温下保持10min后，4℃，12000g离心15min；

3)将上层水相转移到新的1.5ml离心管中，加入0.5ml异丙醇，颠倒混匀，室温下保持10min；

4)4℃，12000g离心10min，RNA就会在管的侧壁和底部形成沉淀；

5)倒掉上清液，加入1ml 75％的乙醇洗涤沉淀，然后4℃，7500g离心5min(如沉淀悬浮起来，则用12000g)，弃去乙醇；

6)沉淀于室温下充分干燥后，溶于40μL dH₂O(DEPC处理)中，55℃水浴10min后，-20℃保存备用。

3.5种检疫性线虫传多面体病毒多重RT-PCR扩增方法的建立

以总RNA为模板，进行RT-PCR反应。即在0.6mL的反应管中加入4.0μL RNA，2μL Nep-21R(10μmol/L)，5.0μL DEPC处理水，70℃水浴5min，立即冰浴5min后，加入5μL 5×M-MLVbuffer，1μL M-MLV Reverse Transcriptase，1μL dNTP(各10mmol/L)，0.5μL Ribolock^TM RNase Inhibitor，补充DEPC处理水至25μL，轻轻混匀后42℃水浴1h，70℃灭活10min，合成第一链cDNA，-20℃保存备用。

PCR反应体系为25μL，即在0.2mL的PCR反应管中加入2.0μLcDNA，2.5μL 10×引物混合物(9.6μM Nep-21R，2.4μM TBRV-256，2.4μM PRMV-293，1.6μM ArMV-342，1.6μM ToRSV-472和1.6μMTRSV-695)，0.4μL DreamTaq^TM DNA Polymerase，2.5μL 10×DreamTaq^TM PCR buffer，0.5μL dNTP Mixture(各10mmol/L)，17.10μL灭菌水。反应条件如下：95℃ 3min；94℃ 45s，52℃ 45s，72℃ 1min，40个循环；最后72℃延伸10min。取5μL的PCR产物采用2.0％的琼脂糖凝胶电泳电泳检测。

PCR反应结束后根据特异性扩增的DNA片段判定样品中是否含有检疫性线虫传多面体病毒。其中，ArMV扩增的DNA片段大小为342bp、PRMV为293bp、TBRV为256bp、ToRSV为472bp和TRSV为695bp。

实施例25种检疫性线虫传多面体病毒多重RT-PCR方法的特异性确定

取BLMoV、CLRV、GFLV、RpRSV等同属病毒的阳性样品以及健康寄主葡萄、黄瓜、桃子、菜豆、普通烟、苋色藜叶片，按实施例2方法分别提取总RNA，再按实施例3的方法进行RT-PCR扩增，凝胶电泳检测结果。其中，阳性对照可以特异扩增出预期大小的目的条带。分别为ArMV为342bp、PRMV为293bp、TBRV为256bp、ToRSV为472bp和TRSV为695bp，而同属病毒阳性对照以及健康寄主均未扩增出非特异性条带，检测结果如图2所示。表明建立的多重RT-PCR方法具有良好的特异性，可用于五种检疫性线虫传多面体病毒属病毒的检测。

实施例35种检疫性线虫传多面体病毒多重RT-PCR方法的灵敏度确定

按照实施例2方法分别提取总RNA，再按实施例3的方法进行反转录，将cDNA模板进行5倍系列稀释，进行多重RT-PCR灵敏性检测。检测结果如图3所示。表明建立的多重RT-PCR方法的检测灵敏性可以达到5^-3倍，符合检测的要求。

Claims

1.五种检疫性线虫传多面体病毒多重检测用引物，其核苷酸序

列为：

ArMV-342：5’-TCC TGT GAG TAA TCA GCA GC-3’

PRMV-293：5’-CGC CGC TCT ATT TGT GGT-3’

TBRV-256：5’-TTG TGG TTT GCC CTC TGG A-3’

ToRSV-472：5’-GGA CGG ACA TTT ATC AGC G-3’

TRSV-695：5’-GAT GAA TTG CTT GTG GAA CGT-3’

Nep-21R：5’-YTT RTC MBT VCC ATC MGTA AT-3’

其中，Y＝C/T，V＝G/A/C，R＝A/G，B＝G/T/C，M＝A/C。

2.一种检测五种检疫性线虫传多面体病毒的多重方法，该方法以样品总RNA为模板，利用权利要求1所述的引物进行RT-PCR扩增，反应结束后凝胶电泳检测扩增产物，根据特异性扩增DNA片段的位置判定结果。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，RT-PCR的反应过程中反转录反应的温度为42℃，PCR扩增的退火温度为52℃，延伸温度为72℃。

4.含有权利要求1所述五种检疫性线虫传多面体病毒多重检测用引物的试剂盒。

5.权利要求1所述的引物在五种检疫性线虫传多面体病毒多重检测中的应用。