CN103981289A - 同时检测人类疱疹病毒及肠道病毒的基因芯片 - Google Patents

同时检测人类疱疹病毒及肠道病毒的基因芯片 Download PDF

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Abstract

本发明涉及同时检测人类疱疹病毒及肠道病毒的基因芯片，包括核苷酸提取试剂盒、DNA与RNA同时逆转录试剂盒、DNA与RNA同时PCR扩增试剂盒、连接有特异探针的基因芯片。本发明仅用100μl脑脊液即可实现多种疱疹病毒、肠道病毒核酸同时提取、扩增和检测，所需样本量少，提取快捷，扩增效率高，结果可靠，特异性强，可以实现对上述病毒引起的临床病毒性脑炎、脑膜炎的早期诊断和治疗，解决了目前临床脑脊液中病毒检测的瓶颈问题。

Description

同时检测人类疱疹病毒及肠道病毒的基因芯片
技术领域
本发明涉及同时检测人类疱疹病毒及肠道病毒的基因芯片，属于分子生物学技术领域。
背景技术
病毒性脑炎、脑膜炎是由病毒感染引起的以中枢神经系统(CNS)损害为主的传染病，常见的病毒主要包括疱疹病毒科的单纯疱疹病毒1型和2型(HSV1和HSV2)、水痘-带状疱疹病毒(VZV)、EB病毒(EBV)、人巨细胞病毒(HCMV)、人类疱疹病毒6型(HHV6)和7型(HHV7)以及引起手足口病的肠道病毒(EVs)如肠道病毒71型(EV71)、柯萨奇病毒A16型(CoxA16)和柯萨奇B组5型(CoxB5)等。由单纯疱疹病毒引起的单纯疱疹病毒脑炎是散发性脑炎及脑膜炎最常见的病原体，若不及时用无环鸟苷进行抗病毒治疗，则死亡率可高达70％。而近年亚洲地区流行的手足口病，规模呈上升趋势，并发重症CNS感染而导致死亡的病例也逐渐增多，可引起无菌性脑膜炎、脑干脑炎、急性脊髓灰质炎样麻痹、脑脊髓炎、神经源性肺水肿，甚至导致死亡，重症存活患者常伴有神经系统后遗症。
由于不同的病毒感染，病变范围、程度相差悬殊，临床表现十分复杂，缺乏特异性，给诊断带来困难，确诊的主要依据是脑脊液的病原学诊断，但脑脊液中病毒含量甚低，其病毒培养检测不但费时、费力，而且敏感性和特异性很差，远远不能满足临床要求，严重滞后于临床治疗；而组织学和免疫学检测方法需要在疾病中后期取材才可能得到阳性结果，由此延误治疗造成该类疾病的死亡率居高不下或病后严重的后遗症，对人民身体健康和生命质量造成严重危害。
分子生物学技术的发展为解决这一难题提供了条件，PCR是一种简便和快速的体外DNA扩增技术，是以样本中的DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下，特异性地在体外扩增所需要的目的基因，以检测DNA病毒；RT-PCR技术是在PCR技术基础上建立起来的，以样本中的RNA为模板，在逆转录酶的作用下，反转录成cDNA后，再以cDNA为模板进行PCR扩增，以检测RNA病毒的感染。两者因其简便、快速、灵敏、特异等优点已成为生物医学领域最有价值的研究手段和病毒学诊断的金标准。疱疹病毒为一组有包膜的DNA病毒，而包括手足口病毒在内的肠道病毒是一组正义单链RNA病毒，由于DNA病毒和RNA病毒基因组核酸提取方法及扩增程序都不同，目前所建立的检测脑脊液疱疹病毒和肠道病毒的方法仍需将DNA病毒与RNA病毒分别进行核酸提取，DNA病毒的核酸提取多采用蛋白酶K/酚-氯仿-异戊醇提取法，再将提取的DNA进行PCR扩增；RNA病毒的核酸提取多采用Trizol/氯仿-异丙醇提取法，再将提取的RNA进行RT-PCR检测。
中国专利文献CN103614371A(申请号201310594174.0)公开了一种同时提取血清、双拭子中动物DNA病毒和RNA病毒核酸的方法，该发明公开了一种同时提取血清、双拭子中动物DNA病毒和RNA病毒核酸的方法，包括步骤：对待提取物使用异硫氰酸胍裂解液裂解；硅胶膜吸附RNA；洗液Ⅰ除去杂蛋白；洗液Ⅱ洗去杂质；DEPC水洗脱核酸；上述异硫氰酸胍裂解液包括3-7M异硫氰酸胍、0.6％-1.0％TriTon-100、30-50mM Tris-Cl、5-15mM DTT、60-90μg/mL蛋白酶K、10-30mM EDTA，PH在4.3-4.6；上述洗液Ⅰ包括5-6M盐酸胍，53-59％无水乙醇，K70-90μg/mL蛋白酶，PH在6.4-6.6；上述洗液Ⅱ包括70-80％乙醇。该发明的优点在于提取过程简单、周期短、成本低、能同时提取动物血清样本、双拭子样本中的RNA病毒和DNA病毒核酸。
虽然上述文献公开了同时提取DNA和RNA的方法，但所含试剂多、成分复杂、操作较为繁琐，更重要的是该方法仅针对动物血清及双拭子样本中的RNA病毒和DNA病毒核酸，因这些样本通常含有的RNA病毒和DNA病毒核酸浓度较高，易于提取分离，但如应用于病毒含量较低的脑脊液样本，可造成脑脊液本身低浓度的病毒丢失使结果呈现假阴性，因而不适宜脑脊液中病毒的提取。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种同时检测人类疱疹病毒及肠道病毒的基因芯片，仅通过一次提取、扩增和杂交即可同时检测出脑脊液中上述病毒的靶基因，时间仅需5.5小时。
本发明技术方案如下：
一种同时检测脑脊液中人类疱疹病毒及肠道病毒的基因芯片，包括核苷酸提取试剂盒、DNA与RNA同时逆转录试剂盒、DNA与RNA同时PCR扩增试剂盒、连接有特异探针的基因芯片；其特征在于：
所述的DNA与RNA同时PCR扩增试剂盒中的引物由Biotin-HHV1,2,4,5-f、HHV1,2,5-r、HHV4-r、Biotin-EV-f和EV-r五种引物混合，核苷酸序列分别如下：
HHV1,2,4,5-f:5′-TCATCTACGGGGACACGGAC-3′；
HHV1,2,5-r:  5′-CGCACCAGATCCACGCCCTT-3′；
HHV4-r:      5′-GAGCTCCACCCCCTTCATC-3′；
EV-f:        5′-TTAAAACAGCCTGTGGGTTG-3′；
EV-r:        5′-TGACTCATCGACCTGATCTACA-3；
其中HHV1,2,4,5-f为扩增HSV1、HSV2、EBV、CMV的上游引物；
HHV1,2,5-r为扩增HSV1、HSV2、CMV的下游引物；
HHV4-r为扩增EBV的下游引物；
Biotin-HHV1,2,4,5-f和Biotin-EV-f为在两条上游引物HHV1,2,4,5-f和EV-f的5’端添加生物素Biotin作为标记物；
所述的特异性探针分为肠道病毒特异性探针和人类疱疹病毒特异性探针，肠道病毒特异性探针序列如下：
EV71-P:GATCGTGGTTCGCTGCTTCTA；
CA16-P:CACTATTGGTCGTGATTGTACAAAG；
CB5-P:TGCCTACTATTGATCGAGGTGTATTG；
人类疱疹病毒特异性探针序列如下：
HSV1-P:GGCACAGCACAAAGATGGA；
HSV2-P:GGCACAAAACGAAAATGGA；
HHV3-P:GTTTGTTATGACGGCCGAG；
HHV5-P:ACGAAAGCGGACAAACACG。
根据本发明优选的，所述核苷酸提取试剂盒中的提取裂解液，每百毫升组分如下：
硫氰酸胍47.264g，N-月桂酰肌氨酸0.5g，二硫苏糖醇15.425mg，柠檬酸钠736.25mg，糖原10mg，DEPC-ddH2O加至100ml；
根据本发明优选的，所述的DNA与RNA同时逆转录试剂盒中的特异性逆转录引物序列如下：
EV-r:5′-TGACTCATCGACCTGATCTACA-3′；
根据本发明优选的，所述的DNA与RNA同时逆转录试剂盒，反应体系如下：
5×RT Buffer2μl，RT Enzyme Mix0.5μl，2μM特异性逆转录引物0.5μl，核酸模板2μl，DEPC-ddH2O加至10μl。
逆转录试剂盒除引物外的其它试剂也可采用本领域市售产品。
根据本发明优选的，所述的DNA与RNA同时PCR扩增试剂盒中，PCR扩增反应体系如下：
10×PCR Buffer1.5μl，dNTP(10mM each)0.4μl，MgCl2(10mM)0.6μl，混合引物10.4μl，PCR模板1.0μl，Taq聚合酶0.5μl，加ddH2O至15μl。
根据本发明优选的，所述的PCR扩增的引物由Biotin-HHV1,2,4,5-f、HHV1,2,5-r、HHV4-r、Biotin-EV-f和EV-r五种引物按摩尔比4.5：0.6：0.2：4.5：0.6的比例混合。
本发明所应用的杂交缓冲液、洗涤液和Cy3-Streptavidin溶液为普通市售试剂。
利用上述基因芯片同时检测脑脊液中人类疱疹病毒及肠道病毒的方法，步骤如下：
(1)取脑脊液100μl，加入200μl硫氰酸胍核酸提取裂解液，涡旋振荡器混匀30sec，室温静置10min；
(2)加入250μl预冷的异丙醇，冰上放置5min；12000rpm，4℃离心10min；弃上清，DEPC配制的体积百分比为75％乙醇750μl洗涤沉淀，12000rpm，4℃离心10min；风干，10μl DEPC-ddH2O溶解后做为核酸模板；
(3)取步骤(2)制得的核酸模板，利用DNA与RNA同时逆转录试剂盒进行RT-PCR，制得逆转录反应产物；
RT-PCR反应体系：
5×RT Buffer2μl，加入RT Enzyme Mix0.5μl，2μM特异性逆转录引物0.5μl，核酸模板2μl，DEPC-ddH2O加至10μl，混匀；
RT-PCR反应条件：42℃15min，85℃5sec；
所述的PCR扩增为非对称的生物素标记引物扩增，两条上游引物5’端的标记物为生物素，所用荧光素为Cy3标记的链霉亲和素；
(4)取步骤(3)制得的逆转录反应产物为模板，利用DNA与RNA同时PCR扩增试剂盒进行PCR扩增，制得PCR扩增产物；
PCR反应体系：
10×PCR Buffer1.5μl，dNTP(10mM each)0.4μl，MgCl2(10mM)0.6μl，混合引物10.4μl，PCR模板1.0μl，Taq聚合酶0.5μl，加ddH2O至15μl；
PCR反应条件：
95℃预变性5min；95℃变性30sec、58℃退火30sec、72℃延伸30sec，35个循环；最后72℃延伸5min。
(5)取步骤(4)制得的PCR扩增产物于95℃变性3min，冰中冷却，与等量杂交缓冲液混匀，与连接有特异分子探针的基因芯片杂交，48℃避光2h，洗涤之后与Cy3-Streptavidin溶液在室温反应30min，洗涤，离心干燥，进行扫描分析。
有益效果
1、本发明克服了临床脑脊液样本中不同DNA、RNA病毒核酸提取和扩增的限制，实现了对脑脊液DNA病毒和RNA病毒基因进行同时提取和扩增，与DNA、RNA分别提取再进行PCR和RT-PCR扩增的结果一致；
2、本发明仅用100μl脑脊液即可实现多种疱疹病毒、肠道病毒核酸同时提取、扩增和检测，所需样本量少，提取快捷，扩增效率高，结果可靠，特异性强，可以实现对上述病毒引起的临床病毒性脑炎、脑膜炎的早期诊断和治疗，解决了目前临床脑脊液中病毒检测的瓶颈问题；
3、本发明所述的基因芯片可以一次性快速检测四种疱疹病毒：单纯疱疹病毒1型和2型(HSV1和HSV2)、EB病毒(EBV)、人巨细胞病毒(HCMV)，和三种肠道病毒：肠道病毒71型(EV71)、柯萨奇病毒A组16型(CoxA16)和柯萨奇B组5型(CoxB5)，具有平行、准确、省时、省力、样本用量少的特点。
4、本发明以脑脊液为主要样本的RNA病毒和DNA病毒核酸提取方法，结合快速扩增及病毒芯片技术，可以实现仅通过一次提取、扩增和杂交即可同时检测脑脊液中常见的人类疱疹病毒和肠道病毒的靶基因。
附图说明
图1、人类疱疹病毒DNA和肠道病毒RNA同时提取扩增与分别提取扩增结果；
图中：左侧为本发明的DNA/RNA同时提取扩增的结果；右侧为DNA、RNA分别提取后再行PCR、RT-PCR的结果；
其中M为DL-2000DNA Marker；HSV1为单纯疱疹病毒1型；HSV2为单纯疱疹病毒2型；EBV为EB病毒；CMV为人巨细胞病毒；EV71为肠道病毒71型；CA16为柯萨奇病毒A组16型；CB5为柯萨奇病毒B组5型。
图2、典型样本的病毒芯片杂交结果；
其中：1.为HSV1阳性样本杂交结果；2.为HSV2阳性样本杂交结果；3.为EBV阳性样本杂交结果；4.为CMV阳性样本杂交结果；5.为EV71阳性样本杂交结果；6.为CA16阳性样本杂交结果；7.为CB5阳性样本杂交结果；8.为EBV和CMV双阳性样本杂交结果；
图3、病毒检测探针排布图；
其中：阳性对照探针；阴性对照探针；HSV1探针；HSV2探针；EBV探针；CMV探针；EV71探针；CA16探针；CB5探针。
图4、典型脑脊液样本分别提取扩增后的杂交结果；
其中：1.为HSV1阳性样本杂交结果；2.为HSV2阳性样本杂交结果；3.为EBV阳性样本杂交结果；4.为CMV阳性样本杂交结果；5.为EV71阳性样本杂交结果；6.为CA16阳性样本杂交结果；7.为CB5阳性样本杂交结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。
试剂来源
杂交缓冲液Ambion公司有售，名称为：Glass Array Hybridization Buffer#4；
洗涤液Ambion公司有售；
Cy3-Streptavidin溶液购自美国Zymed公司。
实施例1
一种同时检测脑脊液中人类疱疹病毒及肠道病毒的基因芯片，包括核苷酸提取试剂盒、DNA与RNA同时逆转录试剂盒、DNA与RNA同时PCR扩增试剂盒、连接有特异探针的基因芯片；
所述的DNA与RNA同时逆转录试剂盒中的特异性逆转录引物序列如下：
EV-r:5′-TGACTCATCGACCTGATCTACA-3′；
所述的DNA与RNA同时PCR扩增试剂盒中的引物由Biotin-HHV1,2,4,5-f、HHV1,2,5-r、HHV4-r、Biotin-EV-f和EV-r五种引物按摩尔比4.5：0.6：0.2：4.5：0.6的比例混合，核苷酸序列分别如下：
HHV1,2,4,5-f:5′-TCATCTACGGGGACACGGAC-3′
HHV1,2,5-r:  5′-CGCACCAGATCCACGCCCTT-3′
HHV4-r:      5′-GAGCTCCACCCCCTTCATC-3′
EV-f:        5′-TTAAAACAGCCTGTGGGTTG-3′
EV-r:        5′-TGACTCATCGACCTGATCTACA-3
其中HHV1,2,4,5-f为扩增HSV1、HSV2、EBV、CMV的上游引物；
HHV1,2,5-r为扩增HSV1、HSV2、CMV的下游引物；
HHV4-r为扩增EBV的下游引物；
Biotin-HHV1,2,4,5-f和Biotin-EV-f为在两条上游引物HHV1,2,4,5-f和EV-f的5’端添加生物素Biotin作为标记物；
所述的特异性探针分为肠道病毒特异性探针和人类疱疹病毒特异性探针，肠道病毒特异性探针序列如下：
EV71-P:GATCGTGGTTCGCTGCTTCTA
CA16-P:CACTATTGGTCGTGATTGTACAAAG
CB5-P:TGCCTACTATTGATCGAGGTGTATTG
人类疱疹病毒特异性探针序列如下：
HSV1-P:GGCACAGCACAAAGATGGA
HSV2-P:GGCACAAAACGAAAATGGA
HHV3-P:GTTTGTTATGACGGCCGAG
HHV5-P:ACGAAAGCGGACAAACACG
根据本发明优选的，所述核苷酸提取试剂盒中的提取裂解液，每百毫升组分如下：
硫氰酸胍47.264g，N-月桂酰肌氨酸0.5g，二硫苏糖醇15.425mg，柠檬酸钠736.25mg，糖原10mg，DEPC-ddH2O加至100ml；
根据本发明优选的，所述的DNA与RNA同时逆转录试剂盒，反应体系如下：
5×RT Buffer2μl,加入RT Enzyme Mix0.5μl，2μM特异性逆转录引物0.5μl，核酸模板2μl，DEPC-ddH2O加至10μl。
根据本发明优选的，所述的DNA与RNA同时PCR扩增试剂盒中，PCR扩增反应体系如下：
10×PCR Buffer1.5μl，dNTP(10mM each)0.4μl，MgCl2(10mM)0.6μl，混合引物10.4μl，PCR模板1.0μl，Taq聚合酶0.5μl，加ddH2O至15μl。
制得的同时检测脑脊液中人类疱疹病毒及肠道病毒的基因芯片，病毒检测探针排布如图3所示。
利用上述基因芯片同时检测脑脊液中人类疱疹病毒及肠道病毒的方法，步骤如下：
(1)在生物安全柜内无菌条件下，取脑脊液100μl，加入200μl硫氰酸胍核酸提取裂解液，涡旋振荡器混匀30sec，室温静置10min；
硫氰酸胍核酸提取裂解液，以DEPC-ddH2O浸泡过夜后，烤箱180℃烘干2小时的玻璃瓶配制，每百毫升组分如下：
(2)加入250μl预冷的异丙醇，冰上放置5min；12000rpm，4℃离心10min；弃上清，DEPC配制的体积百分比为75％乙醇750μl洗涤沉淀，12000rpm，4℃离心10min；风干，10μl DEPC-ddH2O溶解后做为核酸模板，-80℃备用；
(3)取步骤(2)制得的核酸模板，进行RT-PCR，采用TaKaRa公司生产的逆转录试剂盒，制得逆转录反应产物；
RT-PCR反应体系：
5×RT Buffer2μl,加入RT Enzyme Mix0.5μl，2μM特异性逆转录引物0.5μl，核酸模板2μl，DEPC-ddH2O加至10μl，混匀；
RT-PCR反应条件：42℃15min，85℃5sec；
所述的PCR扩增为非对称的生物素标记引物扩增，两条上游引物5’端的标记物为生物素，所用荧光素为Cy3标记的链霉亲和素；
(4)取步骤(3)制得的逆转录反应产物为模板，进行PCR扩增，制得PCR扩增产物；
PCR反应体系：
10×PCR Buffer1.5μl，dNTP(10mM each)0.4μl，MgCl2(10mM)0.6μl，混合引物10.4μl，PCR模板1.0μl，Taq聚合酶0.5μl，加ddH2O至15μl；
PCR反应条件：
95℃预变性5min；95℃变性30sec、58℃退火30sec、72℃延伸30sec，35个循环；最后72℃延伸5min。
(5)取步骤(4)制得的PCR扩增产物，以TAE为电泳缓冲液，1.5％(w/v)琼脂糖凝胶电泳，85V20min，SYBR Green I染色，电泳确定扩增效果，结果如图1所示；
扩增后的标记产物于95℃变性3min，冰中冷却，与等量杂交缓冲液混匀，与连接有特异分子探针的基因芯片杂交，48℃避光2h，洗涤液洗涤2次，每次1min；离心后与Cy3-Streptavidin溶液在室温反应30min，洗涤，离心干燥，进行扫描分析，结果如图2所示。
实施例2
一种同时检测脑脊液中人类疱疹病毒及肠道病毒的基因芯片，包括核苷酸提取试剂盒、DNA与RNA同时逆转录试剂盒、DNA与RNA同时PCR扩增试剂盒、连接有特异探针的基因芯片；其特征在于：
所述的DNA与RNA同时逆转录试剂盒中的特异性逆转录引物序列如下：
EV-r:     5′-TGACTCATCGACCTGATCTACA-3′；
所述的DNA与RNA同时PCR扩增试剂盒中的引物由Biotin-HHV1,2,4,5-f、HHV1,2,5-r、HHV4-r、Biotin-EV-f和EV-r五种引物按摩尔比4.5：0.6：0.2：4.5：0.6的比例混合，核苷酸序列分别如下：
HHV1,2,4,5-f:5′-TCATCTACGGGGACACGGAC-3′
HHV1,2,5-r:  5′-CGCACCAGATCCACGCCCTT-3′
HHV4-r:      5′-GAGCTCCACCCCCTTCATC-3′
EV-f:        5′-TTAAAACAGCCTGTGGGTTG-3′
EV-r:        5′-TGACTCATCGACCTGATCTACA-3
其中HHV1,2,4,5-f为扩增HSV1、HSV2、EBV、CMV的上游引物；
HHV1,2,5-r为扩增HSV1、HSV2、CMV的下游引物；
HHV4-r为扩增EBV的下游引物；
Biotin-HHV1,2,4,5-f和Biotin-EV-f为在两条上游引物HHV1,2,4,5-f和EV-f的5’端添加生物素Biotin作为标记物；
所述的特异性探针分为肠道病毒特异性探针和人类疱疹病毒特异性探针，肠道病毒特异性探针序列如下：
EV71-P:GATCGTGGTTCGCTGCTTCTA
CA16-P:CACTATTGGTCGTGATTGTACAAAG
CB5-P:TGCCTACTATTGATCGAGGTGTATTG
人类疱疹病毒特异性探针序列如下：
HSV1-P:GGCACAGCACAAAGATGGA
HSV2-P:GGCACAAAACGAAAATGGA
HHV3-P:GTTTGTTATGACGGCCGAG
HHV5-P:ACGAAAGCGGACAAACACG
根据本发明优选的，所述核苷酸提取试剂盒中的提取裂解液，每百毫升组分如下：
硫氰酸胍47.264g，N-月桂酰肌氨酸0.5g，二硫苏糖醇15.425mg，柠檬酸钠736.25mg，糖原10mg，DEPC-ddH2O加至100ml；
根据本发明优选的，所述的DNA与RNA同时逆转录试剂盒，反应体系如下：
5×RT Buffer2μl,加入RT Enzyme Mix0.5μl，2μM特异性逆转录引物0.5μl，核酸模板2μl，DEPC-ddH2O加至10μl。
根据本发明优选的，所述的DNA与RNA同时PCR扩增试剂盒中，PCR扩增反应体系如下：
10×PCR Buffer1.5μl，dNTP(10mM each)0.4μl，MgCl2(10mM)0.6μl，混合引物10.4μl，PCR模板1.0μl，Taq聚合酶0.5μl，加ddH2O至15μl。
制得的同时检测脑脊液中人类疱疹病毒及肠道病毒的基因芯片，病毒检测探针排布如图3所示。
利用上述基因芯片同时检测脑脊液中人类疱疹病毒及肠道病毒的方法，步骤如实施例1所示，不同之处在于核苷酸提取试剂盒及扩增试剂盒，其中核苷酸提取试剂盒中的提取裂解液包括用于人类疱疹病毒基因组DNA提取的市售普通试剂如蛋白酶K、Tris饱和酚购自大连宝生物有限公司；用于肠道病毒基因组RNA提取的市售普通试剂如DEPC购自sigma公司、Trizol购自Invitrogen公司；所有试剂按常规方法配制。扩增试剂盒包括扩增疱疹病毒靶基因的PCR扩增试剂盒，购自大连宝生物有限公司；扩增肠道病毒靶基因的逆转录试剂盒及PCR扩增试剂盒，购自大连宝生物公司，逆转录引物采用试剂盒中的随机引物。
对比例
将脑脊液分为两份，每份至少100μl，分别用于提取病毒基因组DNA和RNA，提取后的DNA作为扩增4种人类疱疹病毒的模板，采用PCR试剂盒，分别用引物Biotin-HHV1,2,4,5-f和HHV1,2,5-r扩增HSV1、HSV2和CMV，用Biotin-HHV1,2,4,5-f和HHV4-r扩增EBV；对于提取的RNA，先用逆转录试剂和随机引物逆转录为cDNA，再以cDNA为模板，采用PCR扩增试剂盒，用引物Biotin-EV-f和EV-r分别扩增EV71、CA16和CB5。其对含上述五种病毒的脑脊液样本的扩增与本发明的方法结果一致(见图1)，但其步骤繁琐，且需要的样本量多。具体步骤如下：
脑脊液中人类疱疹病毒DNA的提取与扩增：
(1)收集临床病毒性脑炎、脑膜炎患者的脑脊液，-20℃备用。
(2)脑脊液病毒DNA的提取：
所有试剂均根据《分子克隆第三版》配制。
取脑脊液100μl，加入DNA抽提液，加入蛋白酶K至终浓度20μg/ml，50℃水浴3小时；加入等体积酚，混匀，12000rpm，离心10min，吸取上层水相；加入等体积氯仿-异戊醇，混匀，12000rpm，离心10min，吸取上层水相；加入等体积异戊醇，混匀12000rpm,离心10min，吸取上层水相；加入3M1/10乙酸钠(PH5.2)；加入两倍半体积无水乙醇，12000rpm，离心10min；收集沉淀，75％乙醇洗涤一遍，重溶于20μl TE缓冲液中，作为扩增的模板。
(3)脑脊液病毒DNA的扩增：
10×PCR Buffer(含Mg++)2.5μl，加入dNTP(2.5mM)2μl，每种病毒的特异性引物2μl，PCR模板2μl，Taq聚合酶0.5μl，加高压灭菌水至25μl，混匀；置于PCR仪中，设置反应循环参数为：94℃3min；94℃30sec、58℃30sec、72℃40sec，40个循环；最后72℃延伸5min；以TAE缓冲液配制1.5％(w/v)琼脂糖凝胶溶液，制胶，SYBR Green I染色，电泳确定扩增效果，结果如图1所示。
脑脊液肠道病毒RNA的提取与扩增：
(1)收集临床病毒性脑炎、脑膜炎患者的脑脊液，-20℃备用。
(2)脑脊液病毒RNA的提取：
所有试剂均用DEPC-ddH2O配制，所有实验用具以DEPC-ddH2O浸泡过夜后高压，烤干备用。
脑脊液100μl，加入750μl Trizol，涡旋振荡器混匀30sec，室温静置10min；加入氯仿200μl，涡旋振荡器混匀30sec，室温静置10min，12000rpm，4℃离心10min；小心吸取上清，转移至另一EP管内，加入500μl预冷异丙醇，混匀30sec，室温静置10min，12000rpm，4℃离心10min；DEPC配制的75％乙醇750μl洗涤沉淀，12000rpm，4℃离心10min；风干，以10μl DEPC-ddH2O溶解后做为逆转录反应的核酸模板，-80℃备用。
(3)脑脊液病毒RNA的扩增：
采用TaKaRa公司的试剂，按以下步骤操作：
5×RT Buffer2μl,加入RT Enzyme Mix0.5μl，2μM随机引物0.5μl，核酸模板2μl，DEPC-ddH2O加至10μl，混匀；置于PCR仪中，37℃15min，85℃5sec后作为PCR的模板。
10×PCR Buffer(含Mg++)2.5μl，加入dNTP(2.5mM)2μl，引物2μl，PCR模板2.5μl，Taq聚合酶0.5μl，加高压灭菌水至25μl，混匀；置于PCR仪中，设置反应循环参数为：94℃3min；94℃30sec、58℃30sec、72℃40sec，40个循环；最后72℃延伸5min；以TAE缓冲液配制1.5％(w/v)琼脂糖凝胶溶液，制胶，SYBR Green I染色，电泳确定扩增效果，结果如图1所示。
扩增后的标记产物于95℃变性3min，冰中冷却，与等量杂交缓冲液混匀，与连接有特异分子探针的基因芯片杂交，48℃避光2h，洗涤液洗涤2次，每次1min；之后与Cy3-Streptavidin溶液在室温反应30min，洗涤，离心干燥，进行扫描分析，也能获得较为一致的杂交结果，但杂交信号明显弱于本发明的方法且存在非特异杂交信号(见图4)；
其中：1.为HSV1阳性样本杂交结果；2.为HSV2阳性样本杂交结果；3.为EBV阳性样本杂交结果；4.为CMV阳性样本杂交结果；5.为EV71阳性样本杂交结果；6.为CA16阳性样本杂交结果；7.为CB5阳性样本杂交结果。

Claims (7)

1.一种同时检测脑脊液中人类疱疹病毒及肠道病毒的基因芯片，包括核苷酸提取试剂盒、DNA与RNA同时逆转录试剂盒、DNA与RNA同时PCR扩增试剂盒、连接有特异探针的基因芯片；其特征在于：
所述的DNA与RNA同时PCR扩增试剂盒中的引物由Biotin-HHV1,2,4,5-f、HHV1,2,5-r、HHV4-r、Biotin-EV-f和EV-r五种引物混合，核苷酸序列分别如下：
HHV1,2,4,5-f:5′-TCATCTACGGGGACACGGAC-3′；
HHV1,2,5-r:  5′-CGCACCAGATCCACGCCCTT-3′；
HHV4-r:      5′-GAGCTCCACCCCCTTCATC-3′；
EV-f:        5′-TTAAAACAGCCTGTGGGTTG-3′；
EV-r:        5′-TGACTCATCGACCTGATCTACA-3；
其中HHV1,2,4,5-f为扩增HSV1、HSV2、EBV、CMV的上游引物；
HHV1,2,5-r为扩增HSV1、HSV2、CMV的下游引物；
HHV4-r为扩增EBV的下游引物；
Biotin-HHV1,2,4,5-f和Biotin-EV-f为在两条上游引物HHV1,2,4,5-f和EV-f的5’端添加生物素Biotin作为标记物；
所述的特异性探针分为肠道病毒特异性探针和人类疱疹病毒特异性探针，肠道病毒特异性探针序列如下：
EV71-P:GATCGTGGTTCGCTGCTTCTA；
CA16-P:CACTATTGGTCGTGATTGTACAAAG；
CB5-P:TGCCTACTATTGATCGAGGTGTATTG；
人类疱疹病毒特异性探针序列如下：
HSV1-P:GGCACAGCACAAAGATGGA；
HSV2-P:GGCACAAAACGAAAATGGA；
HHV3-P:GTTTGTTATGACGGCCGAG；
HHV5-P:ACGAAAGCGGACAAACACG。
2.如权利要求1所述的基因芯片，其特征在于，所述核苷酸提取试剂盒中的提取裂解液，每百毫升组分如下：
硫氰酸胍47.264g，N-月桂酰肌氨酸0.5g，二硫苏糖醇15.425mg，柠檬酸钠736.25mg，糖原10mg，DEPC-ddH2O加至100ml。
3.如权利要求1所述的基因芯片，其特征在于，所述的DNA与RNA同时逆转录试剂盒中的特异性逆转录引物序列如下：
EV-r:     5′-TGACTCATCGACCTGATCTACA-3′。
4.如权利要求1所述的基因芯片，其特征在于，所述的DNA与RNA同时逆转录试剂盒，反应体系如下：
5×RT Buffer2μl，RT Enzyme Mix0.5μl，2μM特异性逆转录引物0.5μl，核酸模板2μl，DEPC-ddH2O加至10μl。
5.如权利要求1所述的基因芯片，其特征在于，所述的DNA与RNA同时PCR扩增试剂盒中，PCR扩增反应体系如下：
10×PCR Buffer1.5μl，每种浓度均为10mM的dNTP0.4μl，10mM的MgCl20.6μl，混合引物10.4μl，PCR模板1.0μl，Taq聚合酶0.5μl，加ddH2O至15μl。
6.如权利要求1所述的基因芯片，其特征在于，所述的PCR扩增的引物由Biotin-HHV1,2,4,5-f、HHV1,2,5-r、HHV4-r、Biotin-EV-f和EV-r五种引物按摩尔比4.5：0.6：0.2：4.5：0.6的比例混合。
7.利用权利要求1所述基因芯片同时检测脑脊液中人类疱疹病毒及肠道病毒的方法，其特征在于，步骤如下：
(1)取脑脊液100μl，加入200μl硫氰酸胍核酸提取裂解液，涡旋振荡器混匀30sec，室温静置10min；
(2)加入250μl预冷的异丙醇，冰上放置5min；12000rpm，4℃离心10min；弃上清，DEPC配制的体积百分比为75％乙醇750μl洗涤沉淀，12000rpm，4℃离心10min；风干，10μl DEPC-ddH2O溶解后做为核酸模板；
(3)取步骤(2)制得的核酸模板，利用DNA与RNA同时逆转录试剂盒进行RT-PCR，制得逆转录反应产物；
RT-PCR反应体系：
5×RT Buffer2μl，加入RT Enzyme Mix0.5μl，2μM特异性逆转录引物0.5μl，核酸模板2μl，DEPC-ddH2O加至10μl，混匀；
RT-PCR反应条件：42℃15min，85℃5sec；
所述的PCR扩增为非对称的生物素标记引物扩增，两条上游引物5’端的标记物为生物素，所用荧光素为Cy3标记的链霉亲和素；
(4)取步骤(3)制得的逆转录反应产物为模板，利用DNA与RNA同时PCR扩增试剂盒进行PCR扩增，制得PCR扩增产物；
PCR反应体系：
10×PCR Buffer1.5μl，dNTP(10mM each)0.4μl，MgCl2(10mM)0.6μl，混合引物10.4μl，PCR模板1.0μl，Taq聚合酶0.5μl，加ddH2O至15μl；
PCR反应条件：
95℃预变性5min；95℃变性30sec、58℃退火30sec、72℃延伸30sec，35个循环；最后72℃延伸5min；
(5)取步骤(4)制得的PCR扩增产物于95℃变性3min，冰中冷却，与等量杂交缓冲液混匀，与连接有特异分子探针的基因芯片杂交，48℃避光2h，洗涤之后与Cy3-Streptavidin溶液在室温反应30min，洗涤，离心干燥，进行扫描分析。
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