CN103789450B - 一种检测柯萨奇病毒a2、a5型的荧光定量试剂盒 - Google Patents
一种检测柯萨奇病毒a2、a5型的荧光定量试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103789450B CN103789450B CN201410012003.7A CN201410012003A CN103789450B CN 103789450 B CN103789450 B CN 103789450B CN 201410012003 A CN201410012003 A CN 201410012003A CN 103789450 B CN103789450 B CN 103789450B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cva5
- cva2
- type
- quantitative
- fluorescence quantitative
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 73
- 241001466951 Coxsackievirus A2 Species 0.000 claims abstract description 39
- 241000146327 Coxsackievirus A5 Species 0.000 claims abstract description 39
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 claims abstract description 35
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 32
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 22
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 21
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims abstract description 15
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 13
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims abstract description 12
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims abstract description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 10
- 239000013558 reference substance Substances 0.000 claims abstract description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 27
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 12
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 9
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- FFYPMLJYZAEMQB-UHFFFAOYSA-N diethyl pyrocarbonate Chemical compound CCOC(=O)OC(=O)OCC FFYPMLJYZAEMQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 3
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 3
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 claims description 3
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 claims description 3
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 claims description 3
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 claims description 3
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 claims description 3
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 claims description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 claims description 3
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 claims description 3
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 claims description 3
- -1 triphosphate deoxyribose nucleotide Chemical class 0.000 claims description 3
- 208000030194 mouth disease Diseases 0.000 abstract description 12
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 6
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 abstract description 5
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 abstract description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 abstract description 3
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 abstract description 2
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 abstract description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 abstract description 2
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 abstract description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 27
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 19
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 19
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 19
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 13
- 239000000047 product Substances 0.000 description 12
- 238000013461 design Methods 0.000 description 10
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 9
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 9
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 9
- 101150024766 VP1 gene Proteins 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 8
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 7
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 6
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 6
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- 241000988559 Enterovirus A Species 0.000 description 5
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 5
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 5
- 241000709687 Coxsackievirus Species 0.000 description 4
- 241000709661 Enterovirus Species 0.000 description 4
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 4
- 241000124740 Bocaparvovirus Species 0.000 description 3
- 241001207270 Human enterovirus Species 0.000 description 3
- 241000712431 Influenza A virus Species 0.000 description 3
- 241000701076 Macacine alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 3
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 3
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 3
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 3
- 230000002550 fecal effect Effects 0.000 description 3
- 230000001524 infective effect Effects 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 3
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 3
- 241001429382 Coxsackievirus A16 Species 0.000 description 2
- 208000020061 Hand, Foot and Mouth Disease Diseases 0.000 description 2
- 230000009514 concussion Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 239000012452 mother liquor Substances 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 241000146367 Coxsackievirus A10 Species 0.000 description 1
- 241001669084 Coxsackievirus A6 Species 0.000 description 1
- 208000007212 Foot-and-Mouth Disease Diseases 0.000 description 1
- 241000710198 Foot-and-mouth disease virus Species 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 238000011530 RNeasy Mini Kit Methods 0.000 description 1
- 208000035199 Tetraploidy Diseases 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 210000001217 buttock Anatomy 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 239000002574 poison Substances 0.000 description 1
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 1
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 1
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 238000003375 selectivity assay Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Virology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供一种检测柯萨奇病毒A2、A5型的荧光定量试剂盒，由定量RT-PCR反应液、酶混合液、引物探针混合液、CVA2和CVA5标准品、CVA2和CVA5强阳性对照品、CVA2和CVA5弱阳性对照品、阴性对照品组成。本发明运用一步法实时荧光定量RT-PCR技术，采用CVA2、CVA5高度特异的引物和荧光标记探针，从粪便标本中同时检测出是否有CVA2、CVA5的存在，比单重荧光定量PCR方法更便捷迅速、节约成本。检测实时、准确定量，为临床提供早期诊断，为临床治疗方案的制定提供参考依据；可应用于柯萨奇病毒A2、A5型引起暴发疫情的实验室应急诊断、快速筛查、临床诊断及手足口病的流行病学的研究。
Description
技术领域
本发明属生物技术领域，涉及荧光定量RT-PCR检测试剂盒，具体涉及一种一步法双重实时荧光定量RT-PCR在同一个反应管内检测患者粪便标本中柯萨奇病毒A2、A5型的核酸检测方法，可应用于柯萨奇病毒A2、A5型引起暴发疫情的实验室应急诊断、快速筛查、临床诊断及手足口病的流行病学的研究。
背景技术
手足口病(hand，foot and mouth disease，HFMD)是由人类肠道病毒(human enterovirus，
HEV)引起的，以手、足、口、臀部出现皮疹症状为主要临床症状的常见传染病，主要以轻症为主，但重症及死亡病例也时有报道。人类肠道病毒分为A、B、C、D 4个组，目前共有90 多种基因型，其中最主要的病原体是HEV-A组中的肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A16型(Coxsackie virus A16，CVAl6)。但越来越多的研究表明，HEV中的一些其他血清型，如CVA6、CVA10、CVA2、CVA5型等也可引起HFMD。
导致手足口疾病的致病病原的变异变迁必须引起足够的重视。比如，近年来在欧洲及我国周边部分国家爆发的手足口病疫情中，柯萨奇病毒A6型等已经替代EV71和CVA16被作为主要致病病原体检出。2010年，台湾地区的手足口致病病原调查中，柯萨奇病毒A2型和柯萨奇病毒A5型有一定比例的检出。2012年，香港地区报道2例柯萨奇病毒A2型引起的儿童死亡。而近年来，在我国的广东深圳和山东临沂等地区的手足口病原中也有柯萨奇病毒A2型和柯萨奇病毒A5型检出的报道。在我们实验室开展的2013年部分月份手足口病原调查中，柯萨奇病毒A2型和A5型也占到了一定的比例。目前我国的手足口病病原诊断市场，仍然以检测肠道病毒通用型或肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型为主，导致手足口病病原体检测不明确或漏检等，造成患者治疗的延误及诊断试剂的浪费等。因而开发一种针对柯萨奇病毒A2型和柯萨奇病毒A5型病原检测的诊断试剂对明确致病病原有极大的帮助。
实时荧光定量PCR技术以其全封闭单管扩增、简便快捷、重复性好、实时定量、污染少等优势，克服了以往临床诊断的缺陷，具有高度的特异性和敏感性，为临床诊断提供了准确可靠的实验室依据，可作为一种临床病原诊断的有效、快速的检测手段。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测柯萨奇病毒A2、A5型的荧光定量试剂盒，是一种用柯萨奇病毒A2型和柯萨奇病毒A5型检测的一步法双重荧光定量RT-PCR检测试剂盒。本试剂盒包含定量RT-PCR反应液、酶混合液、引物探针混合液、标准品（CVA2、CVA5）、强阳性对照品（CVA2、CVA5）、弱阳性对照品（CVA2、CVA5）、阴性对照品。
其中定量RT-PCR反应液包含有PCR反应缓冲液（含氯化镁和三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物等），酶混合液含耐热Taq DNA聚合酶、RNA酶抑制剂和MMLV逆转录酶，引物探针混合液包含CVA2、CVA5两组引物和相应的CVA2、CVA5两种不同荧光标记的探针，阴性对照为高温高压灭菌的DEPC(焦碳酸二乙酯)处理水，CVA2、CVA5强阳性对照品和CVA2、CVA5弱阳性对照品为包含CVA2、CVA5的保守区基因序列的阳性质粒样品。
引物探针混合液需保存于棕色管。
双重荧光定量RT-PCR检测用上游引物和下游引物以及相应的特异性探针序列如下：
上游引物CVA2-F: 5’- AGTCGRCCAGTGTCTCAYTCA-3’，
下游引物CVA2-R：5’-TACACGCCCRGTCTCAATGG-3’，
特异性探针CVA2-P: 5’-FAM- AACAGCTGCWAACACCCAGGTRAGCC-BHQ1-3’，
上游引物CVA5-F: 5’- AAGCGGCGGAGACAGGAG-3’，
下游引物CVA5-R: 5’- CCATGCCTGTTGACCACACA-3’，
特异性探针CVA5-P: 5’-HEX- CAAAYGCCACCGAYGARAGCATGA-BHQ1-3’，
其中CVA2、CVA5的特异性探针分别采用FAM、HEX两种不同荧光标记。
上述CVA2、CVA5标准品的保守区基因序列如下：
CVA2标准品序列为：
AATGCTACGATAGACAGGGTGTTGAGTCGGCCAGTGTCTCATTCACCAACAGCTGCTAACACCCAGGTGAGCCAGCACTCCATTGAGACTGGGCGTGTACCTGCACTACAAGCTGCTGAAACG；
CVA5标准品序列为：
ACAGGGCAGGTACCAGCTCTGCAAGCGGCGGAGACAGGAGCGACCTCAAACGCCACCGATGAAAGCATGATTGAAACCAGGTGTGTGGTCAACAGGCATGGGGTTATGGAAACAAGTGTTGAG。
本发明提供的荧光定量试剂盒需于-20℃储存，尽量减少反复冻融；引物探针混合液需避光条件保存。
本发明的另一个目的是提供上述的一步法双重荧光定量RT-PCR检测试剂盒，应用于柯萨奇病毒A2型和柯萨奇病毒A5型的核酸检测。
本发明试剂盒的使用方法：在每次标本检测中均应设立阳性对照和阴性对照。标准品用TaKaRa公司的Easy Dilution（货号：9160）稀释为1×102-1×107copies/ml。
粪便样本核酸的提取：取约0.2g粪便样本加到EP管中，加入1.5ml的生理盐水，震荡混匀3次，每次10s，然后室温静置10min，以8000r/min离心5min。吸取200 ml上清加入到EP管中，进行核酸提取。核酸提取采用Geneaid公司的Viral Nucleic Acid extraction KitII或QIAGEN公司的QIAamp Viral RNA Mini Kit，按照试剂盒说明书进行提取, 取5ul已抽提的待测样品核酸作为模板。
核酸的检测：取5ul已抽提的待测样品核酸作为模板。反应总体积为25 ，其中定量RT-PCR反应液12.5，酶混合液1，引物探针混合液(20μmol/l，包含两组特异性引物和相应的两种荧光探针)共3，模板5，加水补足至25。在ABI7500荧光定量PCR仪（或者其他双色荧光及以上的PCR仪）上进行检测，反应参数为：反转录50℃,30min；95℃ 5min热启动，然后95℃ 15s，55℃ 45s，在55℃进行双重荧光检测，共进行40个循环。
荧光定量结果报告：① 柯萨奇病毒A2型、柯萨奇病毒A5型检测的各自CT值对应相应的荧光标记的病毒，检测样本CT值为40、0和无数值时，报告为阴性。② 检测样本CT值≤35时，报告为相应病毒阳性。③ 检测样本CT值≥35且小于40的样本，建议复检，复检结果CT值＜38者，依据②的判断标准报告为相应病毒阳性。根据所获得的标准曲线，计算待测标本柯萨奇病毒A2型或者柯萨奇病毒A5型的病毒量(copies/ml)。
本研究针对柯萨奇病毒高度保守且型间存在较大差异的VP1蛋白分别设计柯萨奇病毒A2型和柯萨奇病毒A5型高特异性的引物探针。采用单管一步法双重实时荧光定量RT-PCR，能够单管内一次反应同时检测出柯萨奇病毒A2型或/和柯萨奇病毒A5型，不仅极大的节省了试剂耗材，缩短了检测时间，并且依然具有极高的特异性和灵敏性。
本发明运用一步法实时荧光定量RT-PCR技术，采用柯萨奇病毒A2型和柯萨奇病毒A5型高度特异的引物和荧光标记探针，研制用于柯萨奇病毒A2型和柯萨奇病毒A5型检测的双重荧光定量RT-PCR检测试剂盒。该发明是通过一个PCR反应，可以从粪便标本中同时检测出是否有柯萨奇病毒A2型和柯萨奇病毒A5型的存在，比单重荧光定量PCR方法更便捷迅速、节约成本。同时，对检测的病毒进行实时准确定量，根据病毒感染的滴度，为临床上患者提供早期诊断，为临床治疗方案的制定提供参考依据；可应用于柯萨奇病毒A2、A5型引起暴发疫情的实验室应急诊断、快速筛查、临床诊断及手足口病的流行病学的研究。
附图说明
图1为本试剂盒检测柯萨奇病毒A2型的灵敏度，从左到右（1-6）依次为107、106、105、104、103、102copies/ml。
图2为本试剂盒柯萨奇病毒A2型标准品实时荧光定量RT-PCR产物凝胶电泳示意图，电泳条带大小约77bp，其中Lane M为DL2000 Marker ，Lane 1-6分别为柯萨奇病毒A2型标准品（107copies/ml）十倍梯度稀释后实时荧光定量RT-PCR产物，Lane 7为阴性对照。
图3为本试剂盒柯萨奇病毒A2型标准品实时荧光定量RT-PCR标准曲线。
图4为本试剂盒检测柯萨奇病毒A5型的灵敏度，从左到右（1-6）依次为107、106、105、104、103、102 copies/ml。
图5为本试剂盒柯萨奇病毒A5型标准品实时荧光定量RT-PCR产物凝胶电泳示意图，电泳条带大小约81bp，其中Lane M为DL2000 Marker，Lane 1-6分别为柯萨奇病毒A5型标准品（107copies/ml）十倍梯度稀释后实时荧光定量RT-PCR产物，Lane 7为阴性对照。
图6为本试剂盒柯萨奇病毒A5型标准品实时荧光定量RT-PCR标准曲线。
具体实施方式
下面具体实施例结合附图对本发明进行进一步阐述本发明，但这些实施例仅限于说明本发明而不限制本发明的范围。
实施例1
一种检测柯萨奇病毒A2、A5型的双重实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒，包含：定量RT-PCR反应液、酶混合液、引物探针混合液、标准品（CVA2、CVA5）、强阳性对照品（CVA2、CVA5）、弱阳性对照品（CVA2、CVA5）、阴性对照品。其中定量RT-PCR反应液包含有PCR反应缓冲液（含氯化镁和三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物等），酶混合液含耐热Taq DNA聚合酶、RNA酶抑制剂和MMLV逆转录酶，引物探针混合液包含CVA2、CVA5两组引物和相应的CVA2、CVA5两种不同荧光标记的探针，阴性对照为高温高压灭菌的DEPC(焦碳酸二乙酯)处理水，阳性对照为CVA2、CVA5的阳性质粒样品。其中强阳性对照品质粒浓度为106copies/ml，弱阳性对照品质粒浓度为103copies/ml。引物探针混合液管需存放于棕色管。
双重荧光定量RT-PCR检测用上游引物和下游引物以及相应的特异性探针序列如下：
上游引物CVA2-F: 5’- AGTCGRCCAGTGTCTCAYTCA-3’，
下游引物CVA2-R：5’-TACACGCCCRGTCTCAATGG-3’，
特异性探针CVA2-P: 5’-FAM- AACAGCTGCWAACACCCAGGTRAGCC-BHQ1-3’，
上游引物CVA5-F: 5’- AAGCGGCGGAGACAGGAG-3’，
下游引物CVA5-R: 5’- CCATGCCTGTTGACCACACA-3’，
特异性探针CVA5-P: 5’-HEX- CAAAYGCCACCGAYGARAGCATGA-BHQ1-3’。
其中CVA2、CVA5的特异性探针分别采用FAM、HEX两种不同荧光标记。
上述标准品包括CVA2、CVA5标准品，其保守区基因序列如下：
CVA2标准品序列为：
AATGCTACGATAGACAGGGTGTTGAGTCGGCCAGTGTCTCATTCACCAACAGCTGCTAACACCCAGGTGAGCCAGCACTCCATTGAGACTGGGCGTGTACCTGCACTACAAGCTGCTGAAACG；
CVA5标准品序列为：
ACAGGGCAGGTACCAGCTCTGCAAGCGGCGGAGACAGGAGCGACCTCAAACGCCACCGATGAAAGCATGATTGAAACCAGGTGTGTGGTCAACAGGCATGGGGTTATGGAAACAAGTGTTGAG。
本发明提供的荧光定量试剂盒需于-20℃储存，尽量减少反复冻融；引物探针混合液需避光条件保存。
实施例2
1 材料与方法
1.1临床标本与病毒核酸：
柯萨奇病毒A2、A5型的临床样本来源于浙江大学医学院附属第一医院及浙江省内其他几家医院手足口病确诊患者及疑似患者的粪便标本，样本采集后运送至实验室。另外，其他肠道病毒如肠道病毒71型、柯萨奇病毒A16型、柯萨奇病毒A5型、柯萨奇病毒A10型、柯萨奇病毒B1型、柯萨奇病毒B3型、埃克病毒30型，及甲型流感病毒、呼吸道合胞病毒、博卡病毒的阳性核酸由传染病诊治国家重点实验室提供。
1.2引物与探针
从NCBI基因库下载了涵盖国内外柯萨奇病毒A2、A5型的多条基因序列。利用DNAman软件对其进行同源性比较，确定以上病毒基因组的保守区。使用Primer Express 3.0软件在其保守区设计高度特异性的引物与Taqman探针，引物和探针序列均通过Blast验证，具有较好特异性。引物和探针序列如下：
上游引物CVA2-F: 5’- AGTCGRCCAGTGTCTCAYTCA-3’，
下游引物CVA2-R：5’-TACACGCCCRGTCTCAATGG-3’，
特异性探针CVA2-P: 5’-FAM- AACAGCTGCWAACACCCAGGTRAGCC-BHQ1-3’，
上游引物CVA5-F: 5’- AAGCGGCGGAGACAGGAG-3’，
下游引物CVA5-R: 5’- CCATGCCTGTTGACCACACA-3’，
特异性探针CVA5-P: 5’-HEX- CAAAYGCCACCGAYGARAGCATGA-BHQ1-3’，
以上引物和探针委托生工生物工程（上海）有限公司合成。
1.3病毒核酸的提取与标准品定量标准：
取约0.2g粪便样本加到EP管中，加入1.5ml的生理盐水，震荡混匀3次，每次10s，然后室温静置10min，以8000r/min离心5min。吸取200上清加入到EP管中，采用Geneaid公司的Viral Nucleic Acid extraction KitII或QIAGEN公司的Rneasy Mini Kit，按照试剂盒说明书进行提取, 取5ul已抽提的待测样品核酸作为模板。
合成各基因标准品片段，将其连接到质粒载体pMDTM19-T Simple Vector（TaKaRa公司）。转化后培养。鉴定后提取质粒DNA，利用NanoDrop ND-2000 Spectrophotometer测量质粒DNA的浓度，确定DNA的拷贝数作为标准品定量母液。根据实验需要，将标准品定量母液稀释至所需最高浓度，并做十倍稀释至最低浓度，低温保存备用。
1.4双重实时荧光定量RT-PCR反应体系和条件的优化：
反应总体积为25，其中定量RT-PCR反应液12.5，酶混合液1，引物探针混合液(20μmol/l，包含两种病毒的特异性引物和相应的两种荧光探针)共3.0，模板5，DEPC水补足至25。在ABI7500荧光定量PCR仪上进行检测，反应参数为：反转录50℃,30min；95℃ 5min热启动，然后95℃ 15s，55℃ 45s，在55℃进行双重荧光检测，共进行40个循环。结果判断：选择荧光检测模式FAM、HEX荧光基线调整取3-15个循环的荧光信号平均值，阈值设定以阈值线刚好超过阴性对照品的最高点，样本呈典型的扩增曲线，判断为阳性。无典型的扩增曲线，判断为阴性。体系的优化试验，在以相同浓度阳性核酸为模板的反应体系中，引物浓度从1～20μM，探针浓度从1～20μM，采用矩阵法优选引物和探针的最佳浓度，根据最低Ct值和最高荧光强度增加值（ΔRn）选择最佳引物和探针浓度。
1.5双重实时荧光定量RT-PCR特异性、敏感性和重复性试验
分别选择柯萨奇病毒A2型和柯萨奇病毒A5型的阳性核酸（均通过基因测序鉴定）和其他肠道病毒如肠道病毒71型、柯萨奇病毒A16型、柯萨奇病毒A2型、柯萨奇病毒A5型、柯萨奇病毒B1型、柯萨奇病毒B3型、埃克病毒30型，及甲型流感病毒、呼吸道合胞病毒、博卡病毒的阳性核酸，用双重实时荧光定量RT-PCR验证本方法的特异性；对已标定拷贝数（copies/ml）的柯萨奇病毒A2型合成片段（107copies/ml）和柯萨奇病毒A5型合成片段（107copies/ml）分别稀释后，平行进行荧光PCR反应，比较其灵敏度。此外，对每一个指定浓度的阳性核酸稀释液作3次重复检测，得到的Ct值计算其标准差和变异系数，验证该方法的重复性。
1.6 双重实时荧光定量RT-PCR标准曲线的建立
将已标定拷贝数（copies/ml）的柯萨奇病毒A2型标准品（107copies/ml）、柯萨奇病毒A5型标准品（107copies/ml）分别十倍梯度稀释至102copies/ml。分别以此为模板用本试剂盒进行实时荧光定量PCR扩增后，以标准品浓度的对数值为X轴，循环数为Y轴，绘制标准曲线。
2结果
2.1双重实时荧光定量RT-PCR反应体系及条件
该方法的反应总体积为25，其中定量RT-PCR反应液12.5，酶混合液1，引物探针混合液(20μmol/l，包含两组特异性引物和相应的两种荧光探针)共3，模板5，DEPC水补足至25。在ABI7500荧光定量PCR仪上进行检测，反应参数为：反转录50℃,30min；95℃ 5min热启动，然后95℃ 15s，55℃ 45s，在55℃进行三重荧光检测，共进行40个循环。可获得最低CT值和最高荧光强度。
2.2特异性试验
本发明建立的一步法双重荧光定量RT-PCR方法对柯萨奇病毒A2型和柯萨奇病毒A5型具有极好的特异性，能完全检出近期采集的临床阳性标本。本发明中的双重引物探针与其他肠道病毒如肠道病毒71型、柯萨奇病毒A16型、柯萨奇病毒A6型、柯萨奇病毒A10型、柯萨奇病毒B1型、柯萨奇病毒B3型、埃克病毒30型，及甲型流感病毒、呼吸道合胞病毒、博卡病毒的阳性核酸均无交叉反应。
2.3敏感性试验
对柯萨奇病毒A2型和柯萨奇病毒A5型敏感性检测试验，将已标定拷贝数（copies/ml）的柯萨奇病毒A2型合成片段（107copies/ml）、柯萨奇病毒A5型合成片段（107copies/ml）分别十倍梯度稀释后，用本试剂盒进行检测，结果该方法检测敏感性分别达到102、102copies/ml。结果参见图1、图4。取实时荧光定量RT-PCR产物3，120V恒压电泳20min，凝胶成像系统拍照。结果参见图2、图5。其中Lane M为DL2000 Marker，Lane 1-6分别为片段（108copies/ml）十倍梯度稀释后实时荧光定量RT-PCR产物，Lane 7为阴性对照。，电泳条带单一，亮度梯度分明，说明本试剂盒特异性好，定量结果相对准确。
2.4重复性试验
分别取柯萨奇病毒A2型合成片段（终浓度为106copies/ml）、柯萨奇病毒A5型合成片段（106copies/ml）按10倍梯度稀释成4个不同的浓度，对每一个浓度的样本作3个重复检测，结果不同核酸浓度各自的检测Ct值标准差在0.187～0.320之间，变异系数均低于1.49%，具有较好的重复性（结果见表1）。
2.5标准曲线的建立
实时荧光定量PCR扩增后，以标准品浓度的对数值为X轴，循环数为Y轴，绘制标准曲线。柯萨奇病毒A2型标准品实时荧光定量RT-PCR标准曲线如图3所示，其中斜率为3.158，截距为40.630，相关系数为0.999。柯萨奇病毒A5型标准品实时荧光定量RT-PCR标准曲线如图6所示，其中斜率为3.368，截距为42.460，相关系数为0.999。由此可见，标准品浓度的对数值与循环数具有较好的线性关系。
实施例3
采用本试剂盒对临床样本的检测主要依托“十二五”重大专项-传染病病原检测技术平台项目(2012ZX10004-210)。采集的临床样本主要来源于2013年5月至2013年7月间浙江大学医学院附属第一医院以及浙江省内其他几家医院手足口病患者及疑似患者粪便标本总共367份。采用本方法中的双重实时荧光定量RT-PCR对收集到的标本进行验证，检测结果如下：柯萨奇病毒A2型阳性23份，阳性率6.3%；柯萨奇病毒A5型阳性11份，阳性率3.0%。检测阳性结果与其已报告结果完全相符。
<110> 浙江大学
<120>一种检测柯萨奇病毒A2、A5型的荧光定量试剂盒
<160> 8
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列
<223>根据柯萨奇病毒A2型VP1基因设计的PCR检测上游引物序列
<400> 1
AGTCGRCCAGTGTCTCAYTCA 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<223>根据据奇病毒A2型VP1基因设计的PCR检测下游引物序列
<400> 2
TACACGCCCRGTCTCAATGG 20
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213>人工序列
<223>根据柯萨奇病毒A2型VP1基因设计的TaqMan荧光定量检测探针序列
<400> 3
AACAGCTGCWAACACCCAGGTRAGCC 26
<210> 4
<211> 123
<212> DNA
<213>人工序列
<223>根据柯萨奇病毒A2型VP1基因设计的荧光定量检测标准品序列
<400> 4
AATGCTACGATAGACAGGGTGTTGAGTCGGCCAGTGTCTCATTCACCAACAGCTGCTAACACCCAGGTGAGCCAGCACTCCATTGAGACTGGGCGTGTACCTGCACTACAAGCTGCTGAAACG 123
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213>人工序列
<223>根据柯萨奇病毒A5型VP1基因设计的PCR检测上游引物序列
<400> 5
AAGCGGCGGAGACAGGAG 18
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<223>根据柯萨奇病毒A5型VP1基因设计的PCR检测下游引物序列
<400> 6
CCATGCCTGTTGACCACACA 20
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213>人工序列
<223>根据柯萨奇病毒A5型VP1基因设计的TaqMan荧光定量检测探针序列
<400> 7
CAAAYGCCACCGAYGARAGCATGA 24
<210> 8
<211> 123
<212> DNA
<213>人工序列
<223>根据柯萨奇病毒A5型VP1基因基因设计的荧光定量检测标准品序列
<400> 8
ACAGGGCAGGTACCAGCTCTGCAAGCGGCGGAGACAGGAGCGACCTCAAACGCCACCGATGAAAGCATGATTGAAACCAGGTGTGTGGTCAACAGGCATGGGGTTATGGAAACAAGTGTTGAG 123
Claims (5)
1.一种检测柯萨奇病毒A2、A5型的荧光定量试剂盒，其特征在于，本试剂盒由定量RT-PCR反应液、酶混合液、引物探针混合液、CVA2标准品、CVA5标准品、CVA2强阳性对照品、CVA5强阳性对照品、CVA2弱阳性对照品、CVA5弱阳性对照品、阴性对照品组成，其中定量RT-PCR反应液包含PCR反应缓冲液、氯化镁和三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物，酶混合液含耐热Taq DNA聚合酶、RNA酶抑制剂和MMLV逆转录酶，引物探针混合液包含CVA2、CVA5两组特异性引物和相应的CVA2、CVA5两种荧光标记的特异性探针，阴性对照为高温高压灭菌的焦碳酸二乙酯处理水，CVA2、CVA5强阳性对照品和CVA2、CVA5弱阳性对照品为包含CVA2、CVA5的基因序列的阳性质粒样品；强阳性对照品质粒浓度为106copies/ml，弱阳性对照品质粒浓度为103copies/ml；
CVA2、CVA5两组特异性引物和CVA2、CVA5两种荧光标记的特异性探针序列如下：
上游引物CVA2-F: 5’- AGTCGRCCAGTGTCTCAYTCA-3’，
下游引物CVA2-R：5’-TACACGCCCRGTCTCAATGG-3’，
特异性探针CVA2-P: 5’-FAM- AACAGCTGCWAACACCCAGGTRAGCC-BHQ1-3’，
上游引物CVA5-F: 5’- AAGCGGCGGAGACAGGAG-3’，
下游引物CVA5-R: 5’- CCATGCCTGTTGACCACACA-3’，
特异性探针CVA5-P: 5’-HEX- CAAAYGCCACCGAYGARAGCATGA-BHQ1-3’。
2.根据权利要求1所述的一种检测柯萨奇病毒A2、A5型的荧光定量试剂盒，其特征在于，CVA2、CVA5的特异性探针分别采用FAM、HEX两种荧光标记。
3.根据权利要求1所述的一种检测柯萨奇病毒A2、A5型的荧光定量试剂盒，其特征在于，所述CVA2、CVA5标准品的基因序列如下：
CVA2标准品序列为：
AATGCTACGATAGACAGGGTGTTGAGTCGGCCAGTGTCTCATTCACCAACAGCTGCTAACACCCAGGTGAGCCAGCACTCCATTGAGACTGGGCGTGTACCTGCACTACAAGCTGCTGAAACG；
CVA5标准品序列为：
ACAGGGCAGGTACCAGCTCTGCAAGCGGCGGAGACAGGAGCGACCTCAAACGCCACCGATGAAAGCATGATTGAAACCAGGTGTGTGGTCAACAGGCATGGGGTTATGGAAACAAGTGTTGAG。
4.根据权利要求1所述的一种检测柯萨奇病毒A2、A5型的荧光定量试剂盒，其特征在于，引物探针混合液保存于棕色管。
5.根据权利要求1所述的一种检测柯萨奇病毒A2、A5型的荧光定量试剂盒，其特征在于，所述试剂盒于-20℃储存，减少反复冻融。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410012003.7A CN103789450B (zh) | 2014-01-12 | 2014-01-12 | 一种检测柯萨奇病毒a2、a5型的荧光定量试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410012003.7A CN103789450B (zh) | 2014-01-12 | 2014-01-12 | 一种检测柯萨奇病毒a2、a5型的荧光定量试剂盒 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103789450A CN103789450A (zh) | 2014-05-14 |
| CN103789450B true CN103789450B (zh) | 2015-09-09 |
Family
ID=50665501
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410012003.7A Active CN103789450B (zh) | 2014-01-12 | 2014-01-12 | 一种检测柯萨奇病毒a2、a5型的荧光定量试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103789450B (zh) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104846122A (zh) * | 2015-05-13 | 2015-08-19 | 宝瑞源生物技术(北京)有限公司 | 肠道病毒71型和柯萨奇病毒a16型核酸检测试剂盒(荧光pcr法) |
| CN107513584B (zh) * | 2017-09-25 | 2018-12-04 | 浙江大学 | 一种检测肠道病毒的五重荧光定量试剂盒 |
| CN109487006A (zh) * | 2018-12-11 | 2019-03-19 | 东莞市第八人民医院 | 一种cva2特异性引物、实时荧光检测试剂盒及其用途 |
| CN112251542A (zh) * | 2020-11-18 | 2021-01-22 | 遵义市第一人民医院 | 一种检测柯萨奇病毒a5型的荧光检测试剂盒 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101886138A (zh) * | 2009-05-11 | 2010-11-17 | 北京索奥生物技术有限公司 | 肠道病毒71型、柯萨奇病毒a16型和肠道病毒其它各亚型三色荧光rt-pcr联合检测方法及其试剂盒 |
| CN102108421A (zh) * | 2010-12-17 | 2011-06-29 | 武汉百泰基因工程有限公司 | 快速检测柯萨奇病毒a16型的荧光定量pcr试剂盒 |
| CN101676406B (zh) * | 2008-09-18 | 2012-02-01 | 何雅青 | 柯萨奇病毒a16核酸检测用引物、探针及试剂盒 |
| CN102732639A (zh) * | 2011-04-11 | 2012-10-17 | 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 | GeXP多重基因表达遗传分析系统在手足口病病原分型检测中的应用 |
| CN101713003B (zh) * | 2010-02-02 | 2012-10-17 | 北京爱普益生物科技有限公司 | 柯萨奇病毒a16型核酸检测试剂盒 |
-
2014
- 2014-01-12 CN CN201410012003.7A patent/CN103789450B/zh active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101676406B (zh) * | 2008-09-18 | 2012-02-01 | 何雅青 | 柯萨奇病毒a16核酸检测用引物、探针及试剂盒 |
| CN101886138A (zh) * | 2009-05-11 | 2010-11-17 | 北京索奥生物技术有限公司 | 肠道病毒71型、柯萨奇病毒a16型和肠道病毒其它各亚型三色荧光rt-pcr联合检测方法及其试剂盒 |
| CN101713003B (zh) * | 2010-02-02 | 2012-10-17 | 北京爱普益生物科技有限公司 | 柯萨奇病毒a16型核酸检测试剂盒 |
| CN102108421A (zh) * | 2010-12-17 | 2011-06-29 | 武汉百泰基因工程有限公司 | 快速检测柯萨奇病毒a16型的荧光定量pcr试剂盒 |
| CN102732639A (zh) * | 2011-04-11 | 2012-10-17 | 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 | GeXP多重基因表达遗传分析系统在手足口病病原分型检测中的应用 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 2011-2012年杭州市手足口病的病原构成及肠道病毒71型的分子流行病学特征;赵仕勇等;《疾病监测》;20130731;第28卷(第7期);第541-544页 * |
| Complete Genome Analysis of Coxsackievirus A2,A4,A5,and A10 Strains Isolated from Hand,Foot,and Mouth Disease Patients in China Revealing Frequent Recombination of Human Enterovirus A;Y.F.Hu;《J Clin Microbiol.》;20110731;第49卷(第7期);第2426-2434页 * |
| 浙江省杭州地区手足口病病原谱分析和肠道病毒71型VP1基因分析;郑书发等;《现代预防医学》;20111231;第38卷(第2期);第305-309页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103789450A (zh) | 2014-05-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103789451B (zh) | 一种检测柯萨奇病毒a6、a10型的荧光定量试剂盒 | |
| CN107513584B (zh) | 一种检测肠道病毒的五重荧光定量试剂盒 | |
| CN103275862B (zh) | 一种检测甲型流感病毒h7n9亚型的荧光定量rt-pcr试剂盒 | |
| CN103031386B (zh) | 一种检测人杯状病毒的三重荧光定量rt-pcr试剂盒 | |
| CN103045755B (zh) | 一种检测埃博拉病毒的荧光定量pcr检测方法及其引物和试剂盒 | |
| CN107557493B (zh) | 一种肠道病毒分型检测试剂盒 | |
| Tao et al. | Cocirculation of two transmission lineages of echovirus 6 in Jinan, China, as revealed by environmental surveillance and sequence analysis | |
| CN104561374A (zh) | 鉴别猪伪狂犬病病毒疫苗株和野毒株的检测试剂与方法 | |
| CN101407846B (zh) | 肠道病毒核酸荧光定量rt-pcr检测试剂盒 | |
| CN104046704A (zh) | 一种快速鉴别1型和3型鸭甲肝病毒的双重荧光定量方法 | |
| CN103484565B (zh) | 一种实时荧光rt-pcr检测冠状病毒的试剂盒及其应用 | |
| CN102534051B (zh) | 一种肠道病毒检测试剂盒 | |
| CN103789450B (zh) | 一种检测柯萨奇病毒a2、a5型的荧光定量试剂盒 | |
| CN103131798A (zh) | 一种诺如病毒实时荧光rt-pcr检测试剂盒及其应用 | |
| CN107151711A (zh) | 一种检测登革病毒和寨卡病毒的双重荧光定量rt‑pcr试剂盒 | |
| CN103627816A (zh) | 一种猪繁殖与呼吸综合征病毒的多重rt-pcr检测试剂盒及其应用 | |
| CN102586473A (zh) | 一种乙型肝炎病毒基因分型pcr检测试剂盒 | |
| CN103866050A (zh) | 猪流行性腹泻病毒荧光定量pcr检测方法及其引物 | |
| CN102206713B (zh) | 三重荧光定量rt-pcr检测试剂盒及用途 | |
| CN101328507A (zh) | 肠道病毒ev71核酸荧光定量rt-pcr检测试剂盒及检测方法 | |
| CN104593357A (zh) | 用于检测肠道病毒的核酸及其应用 | |
| CN104342501B (zh) | 一种检测猪水泡病病毒的引物、检测试剂盒和制备方法 | |
| CN101407847A (zh) | 肠道病毒Cox A16核酸荧光定量RT-PCR检测试剂盒及检测方法 | |
| CN104372111B (zh) | FMDV通用型和Asia 1型二重荧光定量检测方法 | |
| CN103882149A (zh) | 猪细环病毒i型和ii型的双重实时荧光pcr检测方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |