CN101676406B

CN101676406B - 柯萨奇病毒a16核酸检测用引物、探针及试剂盒

Info

Publication number: CN101676406B
Application number: CN2008102161661A
Authority: CN
Inventors: 何雅青; 肖性龙
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2008-09-18
Filing date: 2008-09-18
Publication date: 2012-02-01
Anticipated expiration: 2028-09-18
Also published as: CN101676406A

Abstract

本发明涉及柯萨奇病毒A16核酸检测用引物、探针及试剂盒，其引物的核苷酸序列为：正向引物5’-GAACCATCACTCCACACAGGAG-3’；反向引物5’-GTACCCGTGGTGGGCATTG-3’。其探针的核苷酸为5’-CAGCCATTGGGAATTTCTTTAGCCGTG-3’。还提供了检测柯萨奇病毒A16核酸的方法，该方法以样品RNA为摸板，利用上述引物和探针进行实时荧光RT-PCR扩增，每个循环结束后根据扩增曲线判定结果。本发明引物特异性好，检测方法快速简单，准确性高，灵敏度高，为手足口病及相关疾病的病原学诊断及鉴别诊断提供了科学依据。

Description

柯萨奇病毒A16核酸检测用引物、探针及试剂盒

技术领域

本发明涉及生物检测技术，特别涉及柯萨奇病毒A16核酸检测用引物、探针及试剂盒。

背景技术

柯萨奇病毒A16(CoxsackievirusA16，简称CA16)为单股正链RNA病毒，属于小RNA病毒科(Picoranviridae)。CA16是导致儿童手足口病的一种重要病原，所引起的临床症状与肠道病毒71型感染引起的手足口病难于区别，但通常情况下，CA16感染一般不引起严重的神经系统相关的疾病，由于其亚临床感染常常被忽略。世界上许多国家和地区曾报道CA16所致手足口病的流行，且每隔3-5年有一次大流行。近年来由于CA16与心肌炎、心包炎及其它严重疾病的相关而逐渐受到重视，日本、马来西亚和台湾都有CA16引起手足口病暴发流行的报道。1983-2003年，日本手足口病的流行是由CA16、CA16地方变异株和肠道病毒71型交替出现引起。因此，疾病预防控制机构以及医院急需特异性强，敏感性高，操作简便，可用于手足口病等暴发疫情和临床病例的早期快速诊断的方法。

手足口病于2008年5月2日已被纳入传染病防治法规定的丙类传染病进行管理。因此，快速、简单、高灵敏度的检测方法对该病的防控极其重要。经典的检测肠病毒的方法多采用细胞培养、特异性抗体检测，该方法步骤烦琐，检测周期长，而且一些肠道病毒难以在细胞中进行增殖，容易出现漏检；传统的RT-PCR也被用于检测EV71和CA16，但检测时间需要6小时。实时荧光RT-PCR(real-timefluorescent RT-PCR)技术具有灵敏度高、特异性强、速度快、抗污染、高通量等优点逐渐取代了传统RT-PCR技术。

本发明选择柯萨奇病毒A16VP1基因设计了用于荧光RT-PCR检测的引物及探针序列，建立了柯萨奇病毒A16荧光RT-PCR检测技术，反应结束即可根据扩增曲线判定是否有柯萨奇病毒A16。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种用于柯萨奇病毒A16实时荧光RT-PCR检测的引物、探针序列及试剂盒，使得能够快速简单地判断样品是否有柯萨奇病毒A16，为手足口病的病原学诊断提供科学依据。

为了解决上述技术问题，本发明在分析已报道柯萨奇病毒A16VP1基因序列的基础上，分别设计引物及荧光探针，所述的引物由正向引物和反向引物组成，其核苷酸序列如下：

正向引物：5’-GAACCATCACTCCACACAGGAG-3’；

反向引物：5’-GTACCCGTGGTGGGCATTG-3’。

本发明设计的探针的核苷酸序列如下：

5’-CAGCCATTGGGAATTTCTTTAGCCGTG-3’，该探针一端标记有报告荧光染料，另一端标记有淬灭荧光染料。其中，报告荧光染料可采用下列荧光基团中的任意一种：Fam、Hex、Tet、Joe、Vic、FITC、Cy3和Cy5。淬灭荧光染料可采用下列荧光基团中的任意一种：Tamra、Rox、Dabcyl、BHQ1和BHQ2。

根据TaqMan技术，在常规PCR的基础上添加了一条标记有两个荧光染料基团的核苷酸探针，例如将报告荧光染料标记在探针的5’端，淬灭荧光染料标记在探针的3’端，两者构成能量转移结构，即报告荧光染料所发射的荧光可被淬灭荧光染料吸收，当二者距离变远时，抑制作用减弱，报告荧光染料信号增强。在扩增反应过程中，探针同模板上的目的扩增片段杂交，由于Taq酶具有5’端到3’端的外切酶活性，在扩增延伸阶段将探针切断，淬灭荧光染料的抑制作用消失，报告荧光染料信号增强，从而实现对柯萨奇病毒A16的检测。

本发明进一步给出了应用上述引物和探针检测柯萨奇病毒A16核酸的方法，该方法是：以样品RNA为模板，利用上述的正向引物、反向引物以及探针进行实时荧光RT-PCR扩增，每个循环结束采集数据，反应结束后根据扩增曲线判定结果。

具体地说本发明以RNA为摸板，进行实时荧光RT-PCR反应，即在25μl反应体系加入2.5μl10×One Step RNA PCR Buffer，2μl dNTP(各2.5mM)，上述正向引物和反向引物(10μM)各1.5μl，0.5μl上述探针(10μM)，0.5μl Taq酶，0.5μlRNase Inhibitor(40U/μl)，0.5μl AMV RTase XL(5U/μl)，5μl RNA，10.5μl RNaseFree dH₂O。

其中，上述反应条件可以是：42℃反转录25min，95℃变性3min，以95℃10s，60℃1min(收集荧光信号)扩增40个循环。

当然，可以根据本发明给出的引物对或者其扩增产物序列设计其他类型的探针，以适用不同方法的荧光PCR检测。

进一步，还可以将本发明的引物、探针以及相关试剂组装成试剂盒，以方便使用。

本发明根据柯萨奇病毒A16VP1基因序列设计的引物特异性好，用于荧光PCR检测的灵敏度高。本发明检测方法准确性高、灵敏度高，其能够快速简单地判断样品是否有柯萨奇病毒A16，为手足口病的病原学诊断及鉴别诊断提供了科学依据。

附图说明

图1是实时荧光RT-PCR技术柯萨奇病毒A16核酸检测的特异性实验的检测结果图；

图2是本发明检测方法的灵敏度实验的检测结果图。

具体实施方式

下面实施例用于对本发明的进一步说明，但不用来限制本发明的范围。

引物及探针的设计和合成：

根据GenBank中CA16VP1基因序列，利用生物软件Primer Express V2.0分别在其保守位点设计引物和Taqman探针，并通过NCBI数据库进行了Blast同源性比对验证。引物序列为：

CA16Pf(正向)：5’-GAACCATCACTCCACACAGGAG-3’

CA16Pr(反向)：5’-GTACCCGTGGTGGGCATTG-3’

探针的序列为：5’-CAGCCATTGGGAATTTCTTTAGCCGTG-3’

该探针的5’端用报告荧光染料VIC标记，3’端用淬灭荧光染料BHQ2标记。

RNA的提取：

病毒样品RNA的抽提用Roche High Pure viral RNA kit试剂盒提取，取0.5克左右粪便标本，加TE500μl制成10-20％的悬液，8000rpm离心5分钟；取200μl标本上清加400μl结合液，混合均匀，加入纯化过滤管中，10000rpm，15s；弃去过滤液，换一新的收集管，加入500μl inhibitor removal buffer，10000rpm离心1分钟；弃去过滤液，换一新的收集管，加入450μl洗液，10000rpm离心1分钟；重洗一次；最后离心，13000rpm，10s，弃去残余的洗液；去掉收集管，换一个干净的无RNA的1.5mlEppendrof离心管，用50μl洗脱液加入过滤管中，10000rpm离心1分钟，将提取的RNA移到一个新的离心管中，于-80℃保存。

Real-time RT-PCR扩增方法的建立：

1、实时荧光RT-PCR反应体系

以RNA为模板，进行实时RT-PCR反应。

荧光定量RT-PCR反应体系如下表

2、实时荧光RT-PCR反应条件

将样品管放入ABI公司7300荧光PCR仪后，设置如下条件进行反应：42℃反转录25min，95℃变性3min，以95℃10s，60℃1min(收集荧光信号)扩增40个循环。每个循环结束采集数据。反应结束后根据扩增曲线判定结果。

柯萨奇病毒A16核酸Real-time RT-PCR方法的特异性确定：

利用建立起的荧光RT-PCR反应体系对9株不同的人类病毒进行检测，检测结果如图1所示，3株CA16病毒(编号为CA16-SZ13，CA16-GZ07，CA16-SZ08)均出现相应的特异性荧光扩增曲线(参见图中A所指)，呈阳性反应。而其他6株人类病毒(包括3株灭活的脊髓灰质炎病毒Polio I、PolioII、PolioIII，两株轮状病毒、1株诺如病毒。)则均没有荧光信号产生(参见图中B所指)，判为阴性。结果表明，所设计的引物探针只对目的病毒(即，CA16病毒)特异，与其它检测对象无交叉反应。

试验结果：

以柯萨奇病毒A16的RNA为模板，通过实时荧光RT-PCR检测可观察到明显的荧光强度变化，而其他病毒的荧光强度没有变化。

灵敏度实验：

将CA16体外转录RNA用DEPC处理的水分别稀释，进行相对灵敏度检测，在25μl反应体系中，RNA分别被稀释成5.0×10⁷、5.0×10⁶、5.0×10⁵、5.0×10⁴、5.0×10³、5.0×10²、5.0×10¹拷贝数，检测结果如图2所示，结果证实CA16病毒检测的最低检测限均达到50个模板拷贝。

核苷酸序列表

<110>何雅青

肖性龙

<120>柯萨奇病毒A16核酸检测用引物、探针及试剂盒

<160>3

<170>PatentIn version3.3

<210>1

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<223>人工序列的描述：引物

<400>1

gaaccatcac tccacacagg ag 22

<210>2

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<223>人工序列的描述二引物

<400>2

gtacccgtgg tgggcattg 19

<210>3

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<223>人工序列的描述：探针

<400>3

cagccattgg gaatttcttt agccgtg 27

Claims

1.一种柯萨奇病毒A16核酸检测用引物及探针，其特征在于，该引物的核苷酸序列为：

正向引物：5’-GAACCATCACTCCACACAGGAG-3’；

反向引物：5’-GTACCCGTGGTGGGCATTG-3’；

该探针的核苷酸序列为：5’-CAGCCATTGGGAATTTCTTTAGCCGTG-3’，该探针一端标记有报告荧光染料，另一端标记有淬灭荧光染料。

2.如权利要求1所述的柯萨奇病毒A16核酸检测用引物及探针，其特征在于：报告荧光染料采用VIC荧光基团，标记在探针的5’端，淬灭荧光染料采用BHQ2荧光基团，标记在探针的3’端。

3.一种柯萨奇病毒A16核酸检测用试剂盒，其特征在于：含有权利要求1所述的正向引物、反向引物和探针。