CN101886142A - 家蚕血液型脓病病源BmNPV直接PCR检测法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种家蚕血液型脓病病源BmNPV直接PCR检测法，其检测方法首先对染病家蚕的血液通过乙醇沉淀法进行处理，去除PCR反应抑制物；根据家蚕血液型脓病病源BmNPV的基因组分析，设计多角体蛋白基因PCR引物；对多角体蛋白基因进行PCR扩增，反应体系中加入了抗PCR反应抑制物BSA，同时以家蚕线粒体COI基因的引物进行PCR反应做阳性对照；分别取正常家蚕血液和感染了白僵病、绿僵病、细菌病、微孢子病的家蚕的染病中肠，进行PCR反应的特异性分析；琼脂糖胶电泳检测上述PCR反应结果。整个检测过程操作简单，仅4个小时就可完成。应用本发明定期抽样检测，可以在BmNPV感染早期对疾病进行诊断，及时采取措施预防疾病的发生。
Description
技术领域
本发明涉及由家蚕核型多角体病毒BmNPV引起的家蚕血液型脓病的早期分子生物学诊断技术，属家蚕蚕病防治生物技术领域。
背景技术
家蚕是有重要经济价值的鳞翅目昆虫，在国际市场上，我国生丝出口占世界生丝出口总量的90%以上，绸缎出口占50%以上，丝绸服装出口也占相当大的比重。
家蚕核型多角体病毒（BmNPV）是一种环状双链DNA，由其引起的家蚕核型多角体病是茧丝生产中最重要的病害，该病传染性极强，难以控制。每年全国蚕桑生产因蚕病的损失占到总产量的30%，其中70%由核型多角体病毒（BmNPV）引起。该病在各龄幼虫、蛹、成虫期均可发生，每年都有5-20%的发病率，严重时可达到50%。目前我国还没有对BmNPV引起的疾病进行早期规范化的诊断技术，生产上主要依靠病症来进行诊断，即在发病中后期才可以诊断，而此时病蚕已不可用药物治疗，严重影响了蚕农的生产积极性和蚕桑产业的发展。
基于PCR的诊断技术已经在疾病的诊断中发挥了重要的作用，它具有快速、灵敏、准确的特点，并已在人类的一些由病原微生物引起的疾病如HIV、SARS等中得到广泛应用。染病家蚕血细胞中BmNPV多角体（occlusionbodies,OBs）最早是在1856年由Maestri和Cornalia分别利用光学显微镜观察观察到的，这也是目前大多数检测NPV的方法，其最低检测水平为106个多角体。杂交能检测到20～5000PIBs（0.1ngDNA），但该方法技术操作十分复杂，严重限制了其在疾病诊断中的应用。本发明方法提取病蚕血液的基因组DNA，利用PCR的方法则可检测到1～5fg的病毒DNA，（1fg=10-6ng=10-15g），灵敏度远高于前两种方法，在幼虫感染两天就可检测到。
发明内容
本发明目的在于提供一种快速、灵敏和特异性强的早期防治家蚕重大病害BmNPV病原检测方法。
本发明的实现过程如下：
一种家蚕血液型脓病病源BmNPV直接PCR检测法，检测步骤如下：
（1）对染病家蚕的血液通过乙醇沉淀法进行处理，去除PCR反应抑制物，
酒精擦拭染病家蚕体表，以防污染影响实验结果，取10ul家蚕血液到1.5mL离心管中，加入0.5mL75%乙醇，涡旋1min后，10000rpm离心1分钟，倒去上清，空气中干燥5min，以去除乙醇残留，加入50ulTE，充分溶解；
（2）根据家蚕血液型脓病病源BmNPV的基因组分析，设计多角体蛋白基因(polyhedron,polh)PCR引物，
引物序列为：polhf：ATGCCGAATTATTCATACACCCC
Polhr：TAATACGCCGGACCAGTGAACAG
（3）对多角体蛋白基因进行PCR扩增，反应体系中加入了抗PCR反应抑制物BSA，同时以家蚕线粒体COI基因的引物进行PCR反应做阳性对照；
（4）分别取正常家蚕血液和感染了白僵病、绿僵病、细菌病、微孢子病的家蚕的染病中肠，进行PCR反应的特异性分析；
（5）琼脂糖胶电泳检测上述PCR反应结果。
本发明的优点与积极效果：本发明检测方法简易的、易于规模化、低成本，直接利用家蚕组织进行PCR检查BmNPV技术，与现有技术相比具有如下优点：
（1）由于血液中含有大量的PCR反应抑制物，不能直接进行检测，因此传统的基于PCR的检测需要从血液中纯化病菌的DNA。该方法操作繁琐，不利于规模化应用，现有的技术也未曾提供不通过纯化家蚕的血液DNA进行BmNPV检测的方法。本发明省却了染病家蚕组织的DNA提取过程，能够缩短诊断过程，降低诊断成本，加快PCR技术在蚕病诊断上的应用。
（2）以往基于PCR检测BmNPV的方法，设计的PCR扩增引物多为BmNPV功能基因上的一段核酸序列，未考虑其与家蚕基因组序列的相似性。而本发明的引物序列充分考虑了BmNPV基因组序列和家蚕基因组序列的相似性，选取BmNPV基因组的特异序列，即杆状病毒的多角体蛋白基因的编码序列作为扩增的目的条带，减少了疾病检测中的假阳性，同时本发明运用鳞翅目昆虫线粒体COI基因通用的扩增引物作为对照，能够避免疾病检测中的假阴性。
（3）本方法操作简单，可以避免在DNA提取过程中人为造成的污染。灵敏度高，可以检测BmNPV感染初期的病蚕，进行人为添食两天后的家蚕即可检测到BmNPV的感染，成本低，特异性强，运用本方法定期抽样检测大规模饲养的家常可以在BmNPV感染早期发现病情，对疾病进行早期诊断，及时采取措施以预防疾病的爆发。
附图说明
图1为家蚕血液型脓病病源BmNPV直接PCR检测法的特异性验证—与其它蚕病的对照；
图2为家蚕血液型脓病病源BmNPV直接PCR检测法的灵敏度检测；
图3为家蚕血液型脓病病源BmNPV直接PCR检测法的应用实例1；
图4家蚕血液型脓病病源BmNPV直接PCR检测法的应用实例2。
具体实施方式
家蚕组织直接PCR检测家蚕血液型脓病病源BmNPV，其特征在于检测步骤如下：
第一、对染病家蚕的血液进行处理，去除PCR反应抑制物
酒精擦拭染病家蚕体表，以防污染影响实验结果，取10ul家蚕血液到1.5mL离心管中，加入0.5mL75%乙醇，涡旋1min后，10000rpm离心1分钟，倒去上清，空气中干燥5min，以去除乙醇残留，加入50ulTE，充分溶解。
第二、对家蚕血液型脓病病源BmNPV的基因组分析发现，多角体蛋白基因(polyhedron,polh)为杆状病毒所特有，具有较高的特异性，该基因序列长为738bp，编码246个氨基酸，预测分子量为28.85kda。根据polh基因的序列和和已经完成的家蚕基因组序列分析发现，该基因与家蚕基因组同源性不高，理论上能够在存在家蚕基因组的情况下进行polh基因的特异性扩增。即能够进行家蚕组织直接PCR检测家蚕血液型脓病病源BmNPV。设计引物序列为：polhf：ATGCCGAATTATTCATACACCCC
polhr:TAATACGCCGGACCAGTGAACAG
第三、进行PCR检测
PCR反应体系均为25ul，含KCl50mM，Tris(pH8.3)10mM，MgCl21.5mM，dNTPs200uM(每种)，扩增引物0.4uM(每种)，TaqDNApolymerase1单位，BSA0.1ug/uL，DNA模版2uL，ddH2O(pH7.0)补充至总体积25uL。该反应体系与常规PCR反应体系相比，其中加入了抗PCR反应抑制物BSA。
扩增条件为95℃预变性5min；94℃变性30s；55℃退火45s；72℃延伸55s，30个循环后72℃终延伸10min。
同时以家蚕COI基因的引物进行PCR反应做阳性对照。
引物序列为：
LYQ3：CCTGGATCTTTAATTGGAGA
LYQ4：GGTAAAATTAAAATATAAACTTC
第四、分别取正常家蚕血液和感染了白僵病、绿僵病、细菌病、微孢子病家蚕的染病中肠，通过前述同样的处理，去除PCR反应抑制物，进行反应的特异性分析。
第五、电泳检测
扩增产物用2%的琼脂糖胶电泳，1%的溴化乙锭染色后，紫外灯照射观察，Marker为TAKARA的DL2000。
图1为家蚕血液型脓病病源BmNPV直接PCR检测法的特异性验证—与其它蚕病的对照。M为DL2000Marker，泳道1为正常家蚕，泳道2为感染BmNPV家蚕，泳道3-6分别为感染白僵病、绿僵病、细菌病、微孢子病家蚕，泳道7为空白对照。
图2为家蚕血液型脓病病源BmNPV直接PCR检测法的灵敏度检测。M为DL2000Marker，以中国科学院武汉病毒研究所提供的BmJS13-PH质粒为模板，拷贝数分别为106，105，104，103，102，101，100。其中1拷贝约为1.3X10-16g。从图中可见，该方法所采用的引物对目的片段的扩增灵敏度为101拷贝数。
实施例1
M为DL2000Marker，1-16为添食107浓度的病源BmNPV2天后，无症状或症状不明显样本的直接PCR检测。从图3可见，使用该方法样本3和11可以扩增明显的目的条带，而样本1，6和9也可以扩增出目的条带，虽然不明显，对这些样品进行检测不见核型多角体，说明该方法可以对疾病进行早期诊断。
实施例2
受试样品为取自安康学院蚕桑科研基地的家蚕样品，M为DL2000Marker，1和2为明显发病的家蚕样品，3-17为表现正常的家蚕样品，其中直接PCR检测阳性结果出现在样品14和15中，对这两份样品进行镜检可见少量多角体（图4）。
Claims (1)
1.家蚕血液型脓病病源BmNPV直接PCR检测法，其特征在于检测步骤如下：
（1）对染病家蚕的血液通过乙醇沉淀法进行处理，去除PCR反应抑制物；
（2）根据家蚕血液型脓病病源BmNPV的基因组分析，设计多角体蛋白基因(polyhedron,polh)PCR引物，
引物序列为：polhf：ATGCCGAATTATTCATACACCCC
polhr：TAATACGCCGGACCAGTGAACAG
（3）对多角体蛋白基因进行PCR扩增，反应体系中加入了抗PCR反应抑制物BSA，同时以家蚕线粒体COI基因的引物进行PCR反应做阳性对照；
（4）分别取正常家蚕血液和感染了白僵病、绿僵病、细菌病、微孢子病的家蚕的染病中肠，进行PCR反应的特异性分析；
（5）琼脂糖胶电泳检测上述PCR反应结果。
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