CN103789455B - 一组检测牛、羊赤羽病病毒的一步法实时荧光qrt-pcr引物、探针及其使用方法 - Google Patents

一组检测牛、羊赤羽病病毒的一步法实时荧光qrt-pcr引物、探针及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一组检测牛、羊赤羽病病毒的一步法实时荧光QRT-PCR引物、探针及其使用方法。所述引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～3所示。本发明检测牛、羊赤羽病病毒的方法是以样品RNA为模板，利用上述引物和探针，进行一步法实时荧光QRT-PCR扩增检测，反应结束后，如果出现特异性荧光扩增曲线则判定样品RNA中含有牛、羊赤羽病病毒核酸，即该样品为牛、羊赤羽病病毒阳性。根据模拟标准品制备的标准曲线，可以进行定量一步法实时荧光QRT-PCR扩增检测。本发明所述检测牛、羊赤羽病病毒的方法安全、快速、特异性好、敏感性强，为畜牧业牛、羊赤羽病的检测以及进境牛羊的检疫工作提供了技术支持。

Description

一组检测牛、羊赤羽病病毒的一步法实时荧光QRT-PCR引物、探针及其使用方法
技术领域
本发明属于病毒分子生物学检测技术领域。更具体地，涉及一组检测牛、羊赤羽病病毒的一步法实时荧光QRT-PCR引物、探针及其使用方法。
背景技术
赤羽病（Akabane disease，AKAD）又名阿卡斑病，是由赤羽病病毒（Akabane virus，AKAV）引起的牛、绵羊和山羊的一种多型性病毒传染病。该病的病症主要有流产、早产、死胎、胎儿畸形、木乃伊等，能引起先天性关节弯曲和积水性无脑综合症。该病为虫媒性传染病，传播媒介为吸血的蚊、库蠓等。赤羽病是世界动物卫生组织（OIE）法定通报性疾病，也是我国从国外进口牛、羊必须检测的7种疫病之一。研究表明，该病在我国进口牛、羊的主要国家存在，因此有随着牛、羊进口引进该病的风险。如果该病随着大量牛、羊的进口传入我国，将给我国畜牧业造成严重的经济损失。
由于感染动物早期一般不出现临床症状，该病在8～9月份发生流产及早产，且数量激增，至10月份为最高峰，往往被误认为是由热应激引起，不易在感染早期发现。因此，及早发现牛、羊群是否感染赤羽病病毒，是减少生产损失的有效途径。由于感染早期动物体内的病毒复制有限，不易检测，因此感染早期的动物往往检测不出来。
为防治和消灭牛、羊赤羽病，首先必须迅速、准确地检测出赤羽病病毒。经过几十年的努力，赤羽病检测技术从最早的病毒分离鉴定到血清学试验，目前已发展为更敏感、更特异、更方便、更经济的分子生物学检测技术。张吉红等根据GenBank中赤羽病病毒的基因序列，设计了特异性引物和探针，建立了检测赤羽病病毒的Real-time RT-PCR方法，但是其敏感性并不是特别好，检测下限为1.18ng/μL，仍然满足不了对感染早期牛、羊群准确检测的要求。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有检测牛、羊赤羽病病毒方法的敏感性不足等问题，提供一组准确、快速、特异性好、敏感性更强的检测牛、羊赤羽病病毒的引物、探针及其使用方法。
本发明的目的是提供一组检测牛、羊赤羽病病毒的一步法实时荧光QRT-PCR引物和探针。
本发明另一目的是提供一种利用所述引物和探针检测牛、羊赤羽病病毒的方法。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明提供了一组检测牛、羊赤羽病病毒核酸的引物，所述引物为Pf99/AKAV和Pr184/AKAV，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示。
本发明还提供了一种检测牛、羊赤羽病病毒核酸的探针，所述探针为Pb132/AKAV，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；该探针的5’端标记有报告荧光染料，3’端标记有淬灭荧光染料。
优选地，所述的报告荧光染料为FAM、HEX、TET、JOE、VIC、FITC、CY3或CY5中的一种，所述的淬灭荧光染料为BHQ1、BHQ2、TAMRA、ROX或DABCY1中的一种。
更优选地，所述的报告荧光染料为FAM，所述的淬灭荧光染料为BHQ1。
本发明所述引物和探针是根据Genebank上公布的赤羽病S基因保守片段序列，利用Primer Express 3.0基因分析软件设计。所有引物和探针的合成均由上海英骏生物技术有限公司完成。
本发明还提供了一种利用上述引物和探针检测牛、羊赤羽病病毒核酸的方法，该方法是以样品的核酸为模板，利用引物Pf99/AKAV和Pr184/AKAV，以及探针Pb132/AKAV进行一步法实时荧光QRT-PCR扩增；
所述扩增的结果判定方法为：反应结束后，如果出现特异性荧光扩增曲线则判定样品的核酸中含有牛、羊赤羽病病毒核酸，即该样品为牛、羊赤羽病病毒阳性。
优选地，所述样品的核酸为RNA。
优选地，所述实时荧光QRT-PCR扩增的反应体系如下：
2×quant one step probe QRT-pcr master mix             25μL；
hotmaster taq polymerase（2.5U/μL）                       2.0μL；
quant rtase（for one step）                                            0.7μL；
引物Pf99/AKAV                                                          0.2μL；
引物Pr184/AKAV                                                          0.2μL；
探针Pb132/AKAV                                                          0.1μL；
模板                                                                              20.0μL；
ddH2O                                                                             1.8μL。
优选地，所述实时荧光QRT-PCR扩增的反应条件如下：50℃逆转录30min；92℃变性3min；以92℃、10s，55℃、30s，68℃、60s预扩增4个循环；92℃、10s，60℃、40s（收集荧光信号）主扩增40个循环。
本发明所述引物具有特别好的灵敏度，对牛、羊赤羽病病毒的检测下限为1.58×10-4 ng/μL，很好地解决了敏感性问题，同时具有非常好的特异性。
同时，本发明提供的引物、探针用于检测牛、羊赤羽病病毒的检测，其扩增模板不仅仅可以是牛、羊赤羽病病毒的RNA，还可以是牛、羊赤羽病病毒的cDNA或病毒质粒，检测范围更广，应用性更强。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一组检测牛、羊赤羽病病毒的实时荧光QRT-PCR引物和探针，以及利用所述引物和探针检测牛、羊赤羽病病毒的方法。所述引物具有特别好的灵敏性，对牛、羊赤羽病病毒的检测下限为1.58×10-4ng/μL，远远低于现有检测技术的检测限，并且特异性和重复性也非常好。
本发明所述检测牛、羊赤羽病病毒的方法，可直接检测病毒RNA，无需分步骤反转录，加样方便快速，减少污染的机会；无需电泳检测，判定结果依据仪器软件曲线和数值，比观察电泳条带更客观，误差更小；不使用溴化乙锭，保障了工作人员的安全；并且检测时间比普通的RT-PCR提前了2～3h，为畜牧业牛、羊赤羽病的检测，尤其是进境牛、羊的赤羽病检疫工作提供了技术支持，具有非常好的推广应用价值。
同时，本发明提供的引物、探针用于检测牛、羊赤羽病病毒的检测，其扩增模板不仅仅可以是牛、羊赤羽病病毒的RNA，还可以是牛、羊赤羽病病毒的cDNA或病毒质粒，检测范围更广，应用性更强。
附图说明
图1 为RNA模拟标准模板的实时荧光QRT-PCR检测标准曲线。
图2为cDNA模拟标准模板的实时荧光QRT-PCR检测标准曲线。
图3为质粒模拟标准模板的实时荧光QRT-PCR检测标准曲线。
图4为实时荧光QRT-PCR检测牛、羊赤羽病病毒RNA的曲线图； 1，2为牛、羊赤羽病病毒RNA，3为牛传染性鼻气管炎病毒核酸，4为牛病毒性腹泻病毒核酸， 5为蓝舌病病毒核酸，6为阴性对照。
图5为实时荧光QRT-PCR检测牛、羊赤羽病病毒cDNA的曲线图；1，2为牛、羊赤羽病病毒cDNA，3为牛传染性鼻气管炎病毒核酸，4为牛病毒性腹泻病毒核酸， 5为蓝舌病病毒核酸，6为阴性对照。
图6为实时荧光QRT-PCR检测牛、羊赤羽病病毒质粒的曲线图；1，2为牛、羊赤羽病病毒质粒，3为牛传染性鼻气管炎病毒核酸，4为牛病毒性腹泻病毒核酸， 5为蓝舌病病毒核酸，6为阴性对照。
图7为普通PCR扩增的敏感性结果；M为Marker，1～6分别为158ng/μL的RNA稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6倍，N为阴性对照。
图8为实时荧光QRT-PCR检测牛、羊赤羽病病毒的敏感性结果；1～8分别为158ng/μL的RNA原液及10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7倍稀释液，9为阴性对照。
图9为实时荧光QRT-PCR检测牛、羊赤羽病病毒的重复性结果；1、2为阳性模版重复两孔，3为阴性对照。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的除引物、探针之外的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，本发明使用的试剂和试剂盒均为市购。
以下实施例中使用的牛、羊赤羽病病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛病毒性腹泻病毒和蓝舌病病毒核酸均由澳大利亚麦克阿瑟农业研究所惠赠。
实施例1 引物和探针的设计与合成
根据赤羽病S基因保守片段序列，利用Primer Express 3.0基因分析软件，设计了一对特异引物Pf99/AKAV（序列如SEQ ID NO.1所示）和Pr184/AKAV（序列如SEQ ID NO.2所示），以及一个探针Pb132/AKAV（序列如SEQ ID NO.3所示），所述探针的5’标记有FAM，3’标记有BHQ1。
SEQ ID NO.1：
5’-GCAGCTCAACTTTACTGTTGCTAGA-3’
SEQ ID NO.2：
5’-CACTTGGTTGTGGCGTCTTATGTA-3’
SEQ ID NO.3：
5’- FAM- CCTCAACCAGAAGAAGGCCAAGATGG -BHQ1-3’
引物和探针的合成均由上海英骏生物技术有限公司完成。
实施例2 模板的制备
1、牛、羊赤羽病病毒RNA的提取
取灭活的牛、羊赤羽病病毒培养物（病毒由澳大利亚麦克阿瑟农业研究所惠赠）200μL，加入到灭菌的1.5mL离心管中，按照TIANGEN的核酸提取试剂盒的说明书进行操作，提取病毒RNA，在紫外分光光度计上测定其核酸含量为158 ng/μL。得到的RNA可直接使用或者-20℃冻存备用。
2、牛、羊赤羽病病毒cDNA的制备
按照宝生物（大连）有限公司的Reverse Transcriptase XL（AMV）反转录酶使用说明书的方法，将病毒RNA反转录成cDNA，-20℃保存。
3、制备包含牛、羊赤羽病病毒核酸的质粒
（1）设计一对特异性引物：
SEQ ID NO.4上游引物：5'-CAACCCTTCACCTCA-3'，
SEQ ID NO.5下游引物：5' -GCAGCTACATTTAATCCG -3'，
引物的合成均由上海英骏生物技术有限公司完成。
（2）利用上述引物，以牛、羊赤羽病cDNA为模板，进行PCR扩增，扩增产物电泳回收。
将回收得到的电泳产物连接到载体PMD18-T，连接条件为：16 ℃连接4 h，4 ℃过夜。
（3）转化：按常规方法将连接产物转化到感受态细胞E.coli DH5α。
（4）提取质粒：挑取转化平板上的阳性单斑，扩大培养之后按照TAKARA公司的质粒抽提试剂盒的方法提取质粒，-20℃保存。
实施例3 一步法实时荧光QRT-PCR反应体系建立
1、实时荧光QRT-PCR反应引物浓度优化
为建立最适宜的反应体系，根据需要对引物浓度进行稀释。引物浓度为100μM，分别加入0.2μL，0.5μL，1μL，1.5μL，2μL引物，进行实时荧光QRT-PCR反应，对比CT值，最终得到最适的引物量为0.2μL的100μM引物，引物终浓度为400nM。
2、实时荧光QRT-PCR反应探针浓度优化
为建立最适宜的反应体系，根据需要对探针浓度进行稀释。探针浓度为100μM，分别加入0.1μL，0.2μL，0.5μL，1μL，1.5μL探针，进行实时荧光QRT-PCR反应，对比CT值，最终得到最适的探针量为0.1μL的100μM探针，探针终浓度为200 nM。
3、参照TIANGEN的一步法QRT-PCR试剂盒的说明书进行操作，根据上述优化的引物和探针浓度，建立了一个最优的实时荧光QRT-PCR反应体系（50μL），反应体系如下：
2×quant one step probe QRT-pcr master mix          25μL；
hotmaster taq polymerase（2.5U/μL）                     2μL；
quant rtase（for one step）                                        0.7μL；
引物Pf99-AKAV                                                         0.2μL；
引物Pr184-AKAV                                                        0.2μL；
探针Pb132-AKAV                                                        0.1μL；
模板                                                                                  20μL；
ddH2O                                                                              1.8μL。
反应条件为：50℃逆转录30min；92℃变性3min；以92℃、10s，55℃、30s，68℃、60s预扩增4个循环；92℃、10s，60℃、40s（收集荧光信号）主扩增40个循环。
4、实时荧光QRT-PCR检测标准曲线的制作
以模拟标准模板来制作实时荧光QRT-PCR检测标准曲线，有以下三种途径：
（1）根据实施例2的方法，提取牛、羊赤羽病病毒标准毒株细胞培养物的RNA，测定RNA浓度为158ng/μL，进行10倍梯度稀释，即稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7倍，然后每个稀释液被认为是相应稀释度的标准模板，进行一步法实时荧光QRT-PCR扩增，制定RNA模拟模板标准曲线图，如附图1所示。
（2）根据实施例2的方法反转录得到牛、羊赤羽病病毒标准毒株细胞培养物的cDNA，进行10倍梯度稀释，即稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7倍，然后每个稀释液被认为是相应稀释度的标准模板，进行一步法实时荧光QRT-PCR扩增，制定cDNA模拟模板标准曲线图，如附图2所示。
（3）根据实施例2的方法得到牛、羊赤羽病病毒标准毒株细胞培养物的质粒，进行10倍梯度稀释，即稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7倍，然后每个稀释液被认为是相应稀释度的标准模板，进行一步法实时荧光QRT-PCR扩增，制定质粒模拟模板标准曲线图，如附图3所示。
5、一步法实时荧光QRT-PCR反应的结果如附图4所示，1、2为牛、羊赤羽病病毒核酸，3为牛传染性鼻气管炎病毒核酸，4为牛病毒性腹泻病毒核酸， 5为蓝舌病病毒核酸，6为阴性对照。
结果显示，只有1和2出现了特异性的扩增曲线，表明利用本发明提供的引物和探针进行实时荧光QRT-PCR反应的方法，能够特异地检测出牛、羊赤羽病病毒。
另外，该检测方法非常快速，检测时间仅为80 min。
实施例4 一步法实时荧光QRT-PCR反应体系的敏感性
1、准备不同浓度的RNA样品
提取牛、羊赤羽病病毒RNA，根据分光光度法进行定量测定，RNA的浓度为158ng/μL。
将上述RNA依次作10倍梯度稀释，即稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7倍，然后以各稀释度的稀释液为模板，分别进行普通PCR和实时荧光QRT-PCR扩增。
2、普通PCR反应
普通PCR引物：
SEQ ID NO.6上游引物：5’-CCAGAAGAAGGCCAAGA-3’；
SEQ ID NO.7下游引物：5’-CCAGATTTAGCCCAGGAT-3’。
普通PCR扩增体系如下：
2×EX Taq MIX        12.5μL；
反转录产物                2μL；
上游引物                    1μL；
下游引物                    1μL；
ddH2O                           8.5μL。
反应程序如下：
94℃、5min，1个循环；
94℃、30 s，55℃、30s，72℃、30s，35个循环；
72℃、10min，1个循环。
反应结束后，各取6μL的PCR产物用1.5%（w/v）琼脂糖凝胶（100mL含6μL的Goldview）进行电泳检测，结果如附图7所示，1～4号均有特异性的条带出现，5和6号未见目的条带，表明普通PCR扩增的敏感度为1.58×10-2ng/μL。
3、实时荧光QRT-PCR反应
实时荧光QRT-PCR反应的反应体系和反应条件同实施例3。
结果如附图8所示，1～7号均出现了阳性扩增曲线，表明实时荧光QRT-PCR反应的检测限为1.58×10-4ng/μL，该检测方法敏感性好，比普通PCR提高了100倍。
实施例5 一步法实时荧光QRT-PCR反应体系的特异性
分别以牛、羊赤羽病病毒核酸，牛传染性鼻气管炎病毒核酸，牛病毒性腹泻病毒核酸，蓝舌病病毒核酸，同时设立阴性对照，反应体系和反应条件同实施例3，检测所建立的实时荧光QRT-PCR反应体系的特异性。
结果如附图4所示，牛、羊赤羽病病毒阳性样品的检测结果为阳性，其它样品呈阴性，表明本发明提供的引物和探针对牛羊赤羽病病毒具有专一性，特异性很好，可以区分与牛、羊赤羽病病症相似的一些疾病。
实施例6 一步法实时荧光QRT-PCR反应体系的重复性
根据实施例3的实时荧光QRT-PCR反应体系，以牛、羊赤羽病病毒标准株RNA为模板，重复两次进行扩增。
结果如附图9所示，除阴性对照外，重复两组的检测结果均为特异的阳性，表明本发明的实时荧光QRT-PCR反应体系具有非常好的重复性。
                         SEQUENCE LISTING
 
<110>  广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心
 
<120>  一组检测牛、羊赤羽病病毒的一步法实时荧光QRT-PCR引物、探针及其使用
       方法
 
<130> 
 
<160>  7    
 
<170>  PatentIn version 3.3
 
<210>  1
<211>  25
<212>  DNA
<213>  引物Pf99/AKAV
 
<400>  1
gcagctcaac tttactgttg ctaga                                           25
 
 
<210>  2
<211>  24
<212>  DNA
<213>  引物Pr184/AKAV
 
<400>  2
cacttggttg tggcgtctta tgta                                            24
 
 
<210>  3
<211>  26
<212>  DNA
<213>  探针Pb132/AKAV
 
<400>  3
cctcaaccag aagaaggcca agatgg                                          26
 
 
<210>  4
<211>  15
<212>  DNA
<213>  构建包含赤羽病病毒核酸的质粒用上游引物
 
<400>  4
caacccttca cctca                                                      15
 
 
<210>  5
<211>  18
<212>  DNA
<213>  构建包含赤羽病病毒核酸的质粒用下游引物
 
<400>  5
gcagctacat ttaatccg                                                   18
 
 
<210>  6
<211>  17
<212>  DNA
<213>  普通PCR检测赤羽病病毒的上游引物
 
<400>  6
ccagaagaag gccaaga                                                    17
 
 
<210>  7
<211>  18
<212>  DNA
<213>  普通PCR检测赤羽病病毒的下游引物
 
<400>  7
ccagatttag cccaggat                                                   18
 
 

Claims (4)

1.一组检测牛、羊赤羽病病毒核酸的引物，其特征在于，所述引物为Pf99/AKAV和Pr184/AKAV，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示。
2.一种检测牛、羊赤羽病病毒核酸的探针，其特征在于，所述探针为Pb132/AKAV，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；该探针的5’端标记有报告荧光染料，3’端标记有淬灭荧光染料。
3.根据权利要求2所述检测牛、羊赤羽病病毒核酸的探针，其特征在于，所述的报告荧光染料为FAM、HEX、TET、JOE、VIC、FITC、CY3或CY5中的一种，所述的淬灭荧光染料为BHQ1、BHQ2、TAMRA、ROX或DABCY1中的一种。
4.根据权利要求2所述检测牛、羊赤羽病病毒核酸的探针，其特征在于，所述的报告荧光染料为FAM，所述的淬灭荧光染料为BHQ1。
CN201410070989.3A 2014-02-28 2014-02-28 一组检测牛、羊赤羽病病毒的一步法实时荧光qrt-pcr引物、探针及其使用方法 Active CN103789455B (zh)

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