CN103451320B

CN103451320B - 人细小病毒B19三种基因型的实时荧光定量PCR检测方法及其通用检测引物、TaqMan探针与试剂盒

Info

Publication number: CN103451320B
Application number: CN201310378628.0A
Authority: CN
Inventors: 马玉媛; 章金刚; 贾俊婷; 赵雄; 郭逸; 吕茂民; 尹惠琼
Original assignee: Institute of Field Blood Transfusion Chinese Academy of Military Medical Sciences
Current assignee: Institute of Field Blood Transfusion Chinese Academy of Military Medical Sciences
Priority date: 2013-08-09
Filing date: 2013-08-27
Publication date: 2015-05-06
Anticipated expiration: 2033-08-27
Also published as: CN103451320A

Abstract

本发明公开了一种对人细小病毒B19三种基因型同时进行定性、定量检测的实时荧光定量PCR检测方法及其通用检测引物、TaqMan探针与试剂盒。本发明通用检测引物、TaqMan探针可结合实时荧光定量PCR实现准确定性、定量待测样本中三种基因型B19病毒DNA的目的，基于此形成的针对B19病毒三种基因型的NAT检测方法明显优于现有的检测技术，具有准确度高、低污染、检测速度快、对仪器设备要求低和成本低廉等优点，除临床检测和血液筛查外，还能对科研以及生产中对原料血浆和血液制品中B19病毒的污染状况进行定性和定量分析，对保障血液制品的病毒安全性具有重要意义。

Description

人细小病毒B19三种基因型的实时荧光定量PCR检测方法及其通用检测引物、TaqMan探针与试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域中核酸的分子生物学检测方法，特别是涉及人细小病毒B19三种基因型的实时荧光定量PCR检测方法及其通用检测引物、TaqMan探针与试剂盒。

背景技术

人细小病毒B19（B19病毒）与输血安全和血液制品的病毒安全性密切相关。B19病毒是目前确认的唯一可致人类疾病的细小病毒。B19病毒感染后临床表现多样。儿童B19病毒感染以传染性红斑（EI）多见，又称“第五病”。成人感染常为隐性感染，或者仅出现轻微发热、头痛等类似感冒的症状，免疫功能缺陷患者感染可以导致慢性贫血，血液病人感染可以引起短暂性再生障碍危象（TAC），孕妇感染则可以导致流产、死产和水肿性死胎等。B19病毒感染还可以引发很多并发症，包括嗜血细胞综合征、肺炎、肾小球肾炎、神经系统症状、肝炎、过敏性紫癜、血管炎、心肌炎、心包炎等。除上述症状和疾病外，B19病毒还被认为与多种自身免疫病有关，包括系统性红斑狼疮、巨细胞动脉炎、结节性多动脉炎、特发性血小板减少性紫癜等。

B19病毒急性感染期，患者血液中病毒含量可高达10¹¹～10¹⁴拷贝/mL。部分病毒感染者经过急性感染期后，病毒不被清除而形成持续感染，血液中病毒含量在10³～10⁷拷贝/mL之间，病毒在体内持续时间可长达几个月甚至几年。

B19病毒传播途径除主要经呼吸道传播外，也可通过输血、血液制品传播，且因为接受输血和应用血液制品的人群常常有血液病、免疫缺陷或其它疾患存在，病毒感染后更容易导致疾病的发生。因此，血液、血制品感染途径具有更重要的临床意义。

近年来，国际组织及发达国家对于原料血浆及血液制品中B19病毒的污染均采取了一定的监控措施。国际血浆蛋白治疗协会（PPTA）是全球血浆采集和治疗产业的代表机构。PPTA在2003年制定相关标准：混合血浆中细小病毒B19DNA含量不能超过10⁵IU/mL，并将核酸检测技术（nucleic acid amplification technology，NAT）作为检测B19病毒载量的一种在线控制措施执行。美国食品与药品监督管理局（FDA）于2009年建议混合血浆中B19病毒的含量控制在＜10⁴IU/mL的水平，将NAT方法作为在线控制措施，并且要求使用的NAT技术能检出B19病毒的全部基因型（即能同时检出B19病毒的三种基因型）。欧洲药典对于抗D免疫球蛋白及S/D灭活血浆也做出要求，B19病毒载量低于10⁴IU/mL。

NAT是一种新兴的血液传染病检测方法，其敏感性和特异性均很高，可用于B19病毒感染的早期诊断及B19病毒分子流行病学调查。除此之外，还被血液制品生产企业用来进行原料血浆和血液制品生产的质量控制。目前，国内外常用来检测B19病毒的NAT技术主要为聚合酶链反应技术（polymerase chain reaction，简称PCR）和实时荧光定量PCR技术。

PCR是一种利用DNA变性和复性原理在体外进行特定的DNA片段高效扩增的技术，可检出微量靶序列。在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。仅需用极少量模板，在一对引物介导下，可扩增至100万-200万份拷贝。PCR反应分三步：变性、退火及延伸。以上三步为一循环，每一循环的产物作为下一个的模板，这样经过多个循环，可得到大量复制的特异性DNA片段。

实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、自动化程度更高、可有效解决PCR污染问题等特点，目前已得到广泛应用。所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’－3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

为制备高特异性、高敏感性、重复性好的B19病毒荧光定量PCR检测试剂盒，其关键在于获得针对B19病毒各种基因型及分离株的特异、敏感的通用引物及通用探针。目前，常用的检测技术只针对B19病毒的1型，无法实现对B19病毒全部基因型的检测。

发明内容

本发明的目的是提供一种特异性和灵敏度较高、省时省力的人细小病毒B19三种基因型同时进行定性、定量检测的实时荧光定量PCR检测方法及其通用检测引物、TaqMan探针与试剂盒。

本发明所提供的一对用于对人细小病毒B19（B19病毒）三种基因型进行实时荧光定量PCR检测的通用型引物，其上游引物的核苷酸序列如序列表中SED ID NO：1所示，下游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。

将上游引物命名为P(NS1-1)，序列表中的SEQ ID NO：1由20个碱基组成，该序列位于B19病毒NS1基因自5’端第1638-1657位碱基；将下游引物命名为P(NS1-2)，SEQ ID NO：2由23个碱基组成，该序列为B19病毒NS1基因自5’端第1736-1758位碱基的反向互补序列。

由上述引物衍生的引物序列也属于本发明的保护范围。所述衍生序列是指在SEQID NO：1和/或SEQ ID NO：2的基础上经过一至十个碱基的取代、缺失或添加得到的引物序列。

上述引物既适用于B19病毒三种基因型的实时荧光定量PCR检测中，也可用于该病毒的常规PCR检测技术中，其检测对象是B19病毒的NS1基因。若以待测样品中提取的DNA为模板，在上述引物的引导下进行PCR扩增，扩增产物中若有121bp大小的条带，则样品中含有B19病毒。

本发明还提供了用于对B19病毒三种基因型同时进行实时荧光定量PCR检测的通用型TaqMan探针。

本发明所提供的TaqMan探针，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：3所示；所述探针为经过荧光标记的，其5’端标记有报告荧光基团，3’端标记有淬灭荧光基团。

所述报告荧光基团可为HEX、FAM等，优选为HEX；所述荧光淬灭基团可为ECLIPSE、TAMRA等，优选为ECLIPSE。

为防止PCR扩增时被延伸，所述探针的3’端还需经磷酸化处理。

将序列表中SEQ ID NO：3所示的TaqMan探针命名为TaqManProbe(NS1)，序列表中的SEQ ID NO：3由26个碱基组成，该序列为B19病毒NS1基因自5’端第1655-1680位碱基。

由上述TaqMan探针序列的衍生序列也属于本发明的保护范围。所述衍生序列是指在SEQ ID NO：3的基础上，在序列的5’端和/或3’端再添加、减少一个或多个碱基得到的序列。

本发明所提供的同时检测B19病毒三种基因型的实时荧光定量PCR检测试剂盒，包含上述用于对人细小病毒B19（B19病毒）三种基因型进行实时荧光定量PCR检测的通用型引物和TaqMan探针。

具体的，该试剂盒可为将用于对人细小病毒B19（B19病毒）三种基因型进行实时荧光定量PCR检测的引物、TaqMan探针混合液120μL（含P(NS1-1)48μL，P(NS1-2)48μL，TaqManProbe(NS1)24μL）、定量PCR反应Mix液（Platinum Quantitative PCRSuperMix-UDG）480μL、B19-pUC19标准品（1×10⁴、1×10³、1×10²、1×10¹拷贝/μL4个梯度，每个梯度各30μL）、和阴性对照（B19病毒核酸阴性的血浆）150μL共同包装，得到可同时对人细小病毒B19（B19病毒）三种基因型进行定性、定量检测的实时荧光定量PCR检测试剂盒。

本发明还提供了一种针对原料血浆或血液制品用上述实时荧光定量PCR检测试剂盒同时对B19病毒三种基因型进行检测的方法，可包括以下步骤：

1）标准曲线的建立：用携带121bp B19病毒NS1基因保守区的质粒作为标准品，梯度稀释成1×10¹⁰、1×10⁹、1×10⁸、1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²拷贝/μL，将质粒作为模板，在试剂盒中通用型引物和TaqMan探针的引导下进行B19病毒NS1基因的实时荧光定量PCR检测，检测结束后，以各标准品的浓度Log值对其相应Ct值作图，绘制标准曲线；

2）以原料血浆或血液制品为待测样本，提取待测样本的DNA，以提取的DNA为模板，在试剂盒中通用型引物和TaqMan探针的引导下进行B19病毒NS1基因的实时荧光定量PCR检测；

3）根据待测样本的荧光信号的变化及强度，对待测样本中的B19病毒NS1基因进行定性、定量检测，出现荧光扩增曲线表明样本中含有B19病毒NS1基因，未出现荧光扩增曲线表明样本中不含有B19病毒NS1基因，再根据样本的荧光信号强度和步骤1）中的标准曲线，得到样本中B19病毒NS1基因的含量。

在上述检测方法中，所述步骤1）和步骤2）中的20μL实时荧光定量PCR反应体系可包括：1×Platinum Quantitative PCR SuperMix-UDG，500nM P(NS1-1)，500nMP(NS1-2)，250nM TaqManProbe(NS1)，模板3μL，加ddH₂O至20μL。

所述步骤1）和步骤2）中的实时荧光定量PCR反应条件可为：先50℃2min，95℃2min；然后95℃9s、60℃30s，共40个循环。在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。

从技术上，上述使用实时荧光定量PCR检测试剂盒同时对B19病毒三种基因型进行检测的方法同样适用于临床样本或面向献血人群的血液筛查样本。但本发明声明放弃与此应用相关的权利，因此，所述检测方法偏向应用于对于原料血浆及血液制品中B19病毒污染的监控，以对从原料到成品的生产环节进行B19病毒检测。

本发明提供了人细小病毒B19三种基因型同时进行定性、定量检测的实时荧光定量PCR检测方法及其通用检测引物、TaqMan探针与试剂盒。该方法是通过提取待测样品的DNA，再结合通用检测引物、TaqMan探针和实时荧光定量PCR检测技术，可达到准确定性、定量待测样本中三种基因型B19病毒DNA的目的。该方法是以待检样品中的核酸为检测对象，准确度、灵敏度及稳定性均较好。本发明具有以下优点：

1、首次建立了人细小病毒B19三种基因型的实时荧光定量PCR检测方法，利用此检测方法可以对原料血浆及相关生物制品进行批量检测。

2、本检测方法与人细小病毒B19三种基因型的其它常规检测方法如病毒的分离培养鉴定、B19病毒抗体ELISA法和Nest-PCR相比，灵敏度较高，取样便捷，检测效率得到了大幅提高，并且有效地防止了操作过程中的实验污染。

3、本检测方法与人细小病毒B19三种基因型的其它常规检测方法，如病毒的分离培养鉴定、B19病毒抗体ELISA法和Nest-PCR相比，具有操作程序简单易用的特点，并可进一步制成检测试剂盒，操作程序化，适合推广和应用。

4、本检测方法不仅能够评价人细小病毒B19三种基因型的感染状况，同时也为人细小病毒B19三种基因型的流行病学、致病机理等相关领域的研究提供了依据。

综上所述，本发明可实现对人细小病毒B19三种基因型同时进行定性、定量检测，是因为本发明对比了GenBank中B19病毒三种基因型代表株（GenBank NO.:prototype:M13178；Lali：AY044266；V9：NC-004295）的基因序列，设计了针对NS1基因保守区的可同时检测B19病毒三种基因型的引物与探针。通过提取待测样品的DNA，再结合PCR技术或实时荧光定量PCR检测技术，可达到准确定性或定量检测样本中B19病毒DNA的目的。本发明B19病毒三种基因型的NAT检测方法明显优于现有的检测技术，具有准确度高、低污染、检测速度快、对仪器设备要求低和成本低廉等优点，适合推广和应用。本发明设计了能同时检测B19病毒全部三种基因型的通用引物和探针，除了可用于临床检测及献血/浆人群进行血液筛查外，还可用于科研以及生产中对原料血浆和血液制品中B19病毒的污染状况进行定性和定量分析，对保障我国血液制品的病毒安全性具有重要意义。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1为PCR扩增三种基因型的人细小病毒B19NS1基因保守区的2％琼脂糖凝胶电泳检测结果

图2为以标准品质粒为模板进行实时荧光定量PCR的扩增曲线

图3为以标准品质粒为模板进行实时荧光定量PCR的标准曲线

图4为以样品为模板进行实时荧光定量PCR的扩增曲线

图5为B19病毒实时荧光定量PCR检测方法特异性检测的扩增结果

图6为B19病毒实时荧光定量PCR检测方法准确性和稳定性检测的扩增结果

图7为B19病毒实时荧光定量PCR检测方法灵敏度检测的扩增结果

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》（Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor）。

所述百分比浓度如无特别说明均为质量/体积(W/V)百分比浓度或体积/体积(V/V)百分比浓度。

实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。

所用引物和TaqMan探针均由大连宝生物公司合成，标准品质粒由中美泰和生物技术（北京）有限公司合成。

实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1、用于可同时对人细小病毒B19（B19病毒）三种基因型进行定性、定量检测的实时荧光定量PCR检测引物及TaqMan探针的设计

根据GenBank中B19病毒三种基因型代表株（GenBank NO.:prototype:M13178；Lali：AY044266；V9：NC-004295）的基因序列，利用DNA Man软件进行比对后，根据引物、TaqMan探针设计原则，选取121bp的NS1基因保守区域序列（如序列表中SEQ ID NO：4所示）作为检测序列，设计同时检测B19病毒三种基因型的实时荧光定量PCR检测引物及TaqMan探针，得到序列如下：

上游引物P(NS1-1)：5’-CGGGACCAGTTCAGGAGAAT-3’（序列表中SEQ ID NO：1），Tm值为57.4℃；

下游引物P(NS1-2)：5’-CCCAACTAACAGTTCACGAAACT-3’（序列表中SEQ ID NO：2），Tm值为56.6℃；

TaqManProbe(NS1)：5’HEX-AATCATTTGTCGGAAGCCCAGTTTCC-ECLIPSE3’（序列表中SEQID NO：3），Tm值为60.9℃。

将TaqMan探针命名为TaqManProbe(NS1)，序列表中的SEQ ID NO：3由26个碱基组成，该序列为B19病毒NS1基因自5’端第1655-1680位碱基。

将上述TaqMan探针的5’端标记报告荧光基团HEX，3’端标记淬灭荧光基团ECLIPSE，并将探针的3’端进行磷酸化处理。

实施例2、用本发明的引物对人细小病毒B19三种基因型进行常规PCR检测

1、提取B19病毒的DNA

将分别包含三种基因型的B19病毒国际标准品血浆（NIBSC code：09/110）作为待测样品（三个样品），用High Pure Viral Nucleic Acid Kit（Roche）并参照试剂盒说明书提取B19病毒DNA。

2、常规PCR检测

分别以步骤1提取的不同基因型的B19病毒核酸为模板，在本发明引物P(NS1-1)和P(NS1-2)的引导下PCR扩增121bp的NS1基因保守区，25μL PCR反应体系为：10×PCR缓冲液（配方：Tris·HCl（pH8.3）100mM，KCl500mM，MgCl₂15mM）2.5μL，dNTPs（2.5mM each）2μL，400nM P(NS1-1)，400nM P(NS1-2)，DNA模板5μL，5U Taq酶（TaKaRa），加ddH₂O至25μL。PCR反应条件为：先94℃5min；然后94℃30s，60℃30s，72℃1min，共35个循环；最后72℃10min，4℃终止反应。反应结束后，将PCR扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳检测（100V电泳40min），检测结果如图1所示（泳道M：Marker DL500，泳道A：B19病毒1型，泳道B：B19病毒2型，泳道C：B19病毒3型，泳道D：阴性对照），结果分别加有B19病毒三种基因型的样品经PCR扩增均得到了121bp的目的条带，与预期结果相符，表明本发明的引物可用于人细小病毒B19三种基因型的常规PCR（定性）检测。

实施例3、用本发明的引物及TaqMan探针进行B19病毒的实时荧光定量PCR检测

1、B19病毒DNA的提取

取两份原料血浆和一份血液制品作为待测样品，使用High Pure Viral NucleicAcid Kit（Roche）并参照试剂盒说明书提取样品DNA。

2、实时荧光定量PCR标准品的制备

本发明构建阳性标准品质粒的目的基因片段为121bp的B19病毒NS1基因保守区，克隆载体为pUC19载体，载体大小为2686bp，Amp⁺抗性，将B19病毒NS1基因保守区连接入pUC19载体多克隆位点的SalⅠ和BamHⅠ酶切位点之间，将携带有B19病毒NS1基因保守区的重组质粒命名为B19-pUC19。利用Primer Premier5.0软件对此序列进行评价，在符合实时荧光定量PCR实验对TaqMan探针及引物的要求的情况下，送与中美泰和生物技术（北京）有限公司合成B19-pUC19全基因，全基因序列如序列表中SEQ ID NO：5所示。

对全基因合成的阳性质粒进行扩大培养，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经Amp+抗性筛选，挑取单菌落小量制备质粒DNA，即得到阳性标准品。用紫外分光光度计准确定量后，根据以下公式计算出其拷贝数，进行10倍梯度稀释，浓度依次为1×10¹⁰、1×10⁹、1×10⁸、1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²拷贝/μL，作为标准品保存于-20℃备用。

分子量=片段大小×660g/(mol bp)

3、实时荧光定量PCR标准曲线的建立

以步骤2获得的拷贝数分别为1×10¹⁰、1×10⁹、1×10⁸、1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²拷贝/μL的B19-pUC19标准品质粒为模板，在引物P(NS1-1)、P(NS1-2)及探针TaqManProbe(NS1)的引导下进行实时荧光定量PCR扩增，20μL实时荧光定量PCR反应体系包括：1×Platinum Quantitative PCR SuperMix-UDG（购自Invitrogen公司），500nM P(NS1-1)，500nM P(NS1-2)，250nM TaqManProbe(NS1)，模板3μL，加ddH₂O至20μL。PCR反应条件为：先50℃2min，95℃2min；然后95℃9s、60℃30s，共40个循环。在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。

结果各稀释度的B19-pUC19均能产生荧光信号，Ct值分别为7.94、12.18、14.62、17.55、20.49、24.26、27.88、31.20和34.57，扩增曲线如图2所示（由左至右依次为以1×10¹⁰、1×10⁹、1×10⁸、1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²拷贝/μL标准品质粒为模板的扩增曲线，NTC：无模板对照。），定量数据如表1所示，由扩增曲线得到的标准曲线斜率为-3.280，标准曲线如图3所示（横坐标为标准品浓度、纵坐标为荧光信号强度），由标准曲线得到的线性方程为：Y=-3.280X+40.869。4、样品检测

实时定量PCR反应体系包括：1×Platinum Quantitative PCR SuperMix-UDG，500nMP(NS1-1)，500nM P(NS1-2)，250nM TaqManProbe(NS1)，500nM P(IC-1)，500nM P(IC-2)，250nM TaqManProbe(IC)，模板3μL，加ddH₂O至20μL。实时定量PCR反应条件同步骤3，对三份血浆样品的核酸进行检测，每个样品设3个复孔，同时设阴性对照（不加模板，NTC）。结果显示，1号原料血浆样品出现明显的B19病毒扩增曲线，其Ct值为23.33；而2号原料血浆样品、3号血液制品样品和阴性对照均为直线无扩增。扩增曲线如图4所示(其中，曲线A为1号血浆样品中B19病毒核酸的扩增曲线，曲线B组为NTC和2号、3号血浆样品中B19病毒扩增曲线，其荧光强度均未达到检测阈值)，定量数据如表1所示，根据标准曲线的线性方程得到1号样品的扩增起始浓度为2.22×10⁵拷贝/μL，2号和3号血浆样品为B19病毒核酸阴性。因此1号样品对应的原料血浆建议不使用，2号样品对应的原料血浆应可用，3号样品对应的血液制品应可用。检测结果表明，用本发明的引物及TaqMan探针可用于对原料血浆或血液制品中人细小病毒B19（B19病毒）三种基因型的定性、定量检测。

表1不同稀释度B19-pUC19标准品质粒以及三份血浆样品实时荧光定量PCR的定量数据

反应样品	Ct值	绝对浓度
			1×10¹⁰拷贝/μL标准品	7.94	1.00E+10
1×10⁹拷贝/μL标准品	12.18	1.00E+09
			1×10⁸拷贝/μL标准品	14.62	1.00E+08
1×10⁷拷贝/μL标准品	17.55	1.00E+07
			1×10⁶拷贝/μL标准品	20.49	1.00E+06
1×10⁵拷贝/μL标准品	24.26	1.00E+05
			1×10⁴拷贝/μL标准品	27.88	1.00E+04
1×10³拷贝/μL标准品	31.20	1.00E+03
			1×10²拷贝/μL标准品	34.57	1.00E+02
1号血浆样品（未知浓度）	23.33	2.22E+05
			2号血浆样品（未知浓度）	N/A	0
3号血浆样品（未知浓度）	N/A	0

实施例4、人细小病毒B19（B19病毒）三种基因型实时荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法的特异性、准确性和稳定性检测

将B19病毒国际标准品（NIBSC code：09/110）的1型、2型和3型血浆的DNA样品以及Parv4（细小病毒4）、EBV（EB病毒）、CMV（巨细胞病毒）、HIV（人类免疫缺陷病毒）、HCV（丙型肝炎病毒）和HBV（乙型肝炎病毒）的标准品核酸同时应用建立的方法进行荧光定量PCR扩增检测，每个样品设3个复孔，并设定阴性对照（不加模板，NTC），检测本发明人细小病毒B19（B19病毒）实时荧光定量PCR检测方法的特异性；用实时荧光定量PCR检测方法对B19病毒标准品质粒进行重复检测，评价本发明方法的准确性和稳定性。实时荧光定量PCR检测的反应体系及反应条件与实施例3相同。

特异性实验结果显示只有以三种基因型B19病毒为模板会出现明显的扩增曲线，以Parv4、EBV、CMV、HCV以及HIV为模板均为直线无扩增，空白对照也为直线（见图5），表明本发明的检测方法具有较好的特异性。

准确性和稳定性检测结果(见图6)：起始浓度分别为1×10²、1×10³、1×10⁴拷贝/μL的标准品的最终实测值的均值分别为0.96×10²、0.91×10³、0.94×10⁴拷贝/μL，变异系数分别为0.285％、0.148％、0.321％。说明此方法具有良好的准确性和重复性。

实施例5、人细小病毒B19（B19病毒）三种基因型实时荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法的灵敏度

对制备的B19-pUC19标准品质粒以10倍梯度稀释，以浓度范围为1×10⁹-1×10⁰拷贝/μL的标准品质粒为模板，以无菌水作为阴性对照，用本发明的试剂盒和检测方法进行敏感度检测。检测体系及检测条件与实施例3相同。

结果本发明方法的最低检出浓度为10拷贝/μL，扩增曲线见图7（由左至右依次为以1×10⁹、1×10⁸、1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²、1×10¹拷贝/μL标准品质粒为模板的扩增曲线,10⁰拷贝/μL与NTC（无模板对照）为直线无扩增。）。证明了本发明的试剂盒和检测方法可用于人细小病毒B19（B19病毒）三种基因型的定性和定量检测，并具有较高的灵敏度。

实施例6、可同时对人细小病毒B19（B19病毒）三种基因型进行定性、定量检测的实时荧光定量PCR检测试剂盒

本发明试剂盒包含所述对人细小病毒B19（B19病毒）三种基因型进行实时荧光定量PCR检测的引物和TaqMan探针。

具体的，将用于对人细小病毒B19（B19病毒）三种基因型进行实时荧光定量PCR检测的引物、TaqMan探针混合液120μL（包含P(NS1-1)48μL，P(NS1-2)48μL，TaqManProbe(NS1)24μL）、定量PCR反应Mix液（Platinum Quantitative PCRSuperMix-UDG）480μL、B19-pUC19标准品（1×10⁴、1×10³、1×10²、1×10¹拷贝/μL4个梯度，每个梯度各30μL）、和阴性对照（B19病毒核酸阴性的血浆）150μL共同包装，得到可同时对人细小病毒B19（B19病毒）三种基因型进行定性、定量检测的实时荧光定量PCR检测试剂盒。

Claims

1.一种同时检测人细小病毒B19三种基因型的实时荧光定量PCR检测试剂盒，包含用于对人细小病毒B19三种基因型进行实时荧光定量PCR检测的通用型引物和用于对人细小病毒B19三种基因型同时进行实时荧光定量PCR检测的TaqMan探针，

其中，所述通用型引物的命名为P(NS1-1)的上游引物的核苷酸序列如序列表中SEDID NO：1所示，命名为P(NS1-2)的下游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示，所述TaqMan探针命名为TaqManProbe(NS1)，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：3所示。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述探针为经过荧光标记的，其5’端标记有报告荧光基团，3’端标记有淬灭荧光基团；所述报告荧光基团为HEX或FAM；所述荧光淬灭基团为ECLIPSE或TAMRA。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述报告荧光基团为HEX；所述荧光淬灭基团为ECLIPSE。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述探针的3’端还需经磷酸化处理。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的试剂盒，其特征在于：为将用于对人细小病毒B19三种基因型进行实时荧光定量PCR检测的引物、TaqMan探针混合液120μL、定量PCR反应Mix液Platinum Quantitative PCR SuperMix-UDG 480μL、1×10⁴、1×10³、1×10²、1×10¹拷贝/μL 4个梯度且每个梯度各30μL的B19-pUC19标准品、和作为阴性对照的人细小病毒B19核酸阴性的血浆150μL共同包装，得到可同时对人细小病毒B19三种基因型进行定性、定量检测的实时荧光定量PCR检测试剂盒，其中，所述混合液含P(NS1-1)48μL、P(NS1-2)48μL、TaqManProbe(NS1)24μL。