BE1014838A3 - Procede de replication in vitro de virus. - Google Patents
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Abstract
La présente invention se rapporte à un procédé pour cultiver, propager et répliquer in vitro à haut redement, à l'intérieur de cellules hôtes, des virus comprenant les étapes suivantes: on isole des cellules hôtes permissives; on isole un virus; on cultive ces cellules dans un milieu de culture et dans des conditions de culture appropriées; on infecte lesdites cellules à l'aide du virus, en mettant en contact la culture de cellules hôtes avec la fraction contenant ledit virus; on incube les cellules hôtes en présence du virus pendant un temps d'incubation adéquat; ledit procédé étant caractérisé en ce que lesdites cellules sont cultivées en condition d'hypoxie.
Description
<Desc/Clms Page number 1> PROCEDE DE REPLICATION IN VITRO DE VIRUS Objet de l'invention [0001] La présente invention concerne les domaines de l'immunologie et de la virologie. [0002] La présente invention se rapporte en particulier à un procédé pour obtenir l'expression et la réplication in vitro et à haut rendement de virus, en particulier de l'érythrovirus B19, ainsi que les applications de ce procédé, en particulier pour caractériser l'infectivité présente dans un échantillon biologique ainsi que pour la détection et la quantification d'anticorps dirigés contre ledit virus dans un plasma sanguin de patients. Etat de la technique [0003] Pour différents virus, en particulier l'érythrovirus B19, mais également d'autres virus, tels que les virus HBV, HCV, GBV, TTV, SEN-V, SEN-F..., les expérimentateurs sont confrontés au problème d'obtenir des modèles expérimentaux d'infection c'est-à-dire des modèles de culture in vitro permettant d'obtenir une infection des cellules hôtes par ces virus. Il est notamment particulièrement difficile d'obtenir des modèles de réplication et d'expression in vitro à haut rendement de ces virus pathogènes pour des mammifères, en particulier pour l'homme. <Desc/Clms Page number 2> [0004] Les érythrovirus B19 et V9 sont des petits virus non enveloppés de la famille des Parvovirus qui constituent les seuls parvovirus pathogènes pour l'homme (R. Laub et P. Strengers, 2002). [0005] On observe que de plus en plus de pathologies chez l'homme sont liées au virus B19. Selon l'hôte infecté, les manifestations cliniques qui lui sont associées varient d'asymptomatiques chez l'enfant (Sème maladie) à sévères chez la femme enceinte (27% des hydrops fetalis non immuns) ou chez les individus immunodéprimés. [0006] Contrairement au V9, le virus B19 est largement répandu dans la population. Sa présence est le plus souvent asymptomatique. On estime que la séroprévalence pour la population adulte s'élève entre 60 et 80%. La présence du DNA viral détecté par PCR peut varier entre 1/250 et 1/6000 chez les donneurs sains ; a été estimée à 1/625 dans une étude récente réalisée en Belgique. [0007] Jusqu'à présent il n'a pas été possible de trouver des lignées cellulaires continues permanentes. De plus, les modèles cellulaires qui ont été proposés sont peu efficaces et fastidieux à obtenir. [0008] En effet, les cellules permissives constituent a priori un modèle cellulaire intéressant pour la quantification de l'expression et de l'amplification de B19 ainsi que comme source de production d'antigènes viraux. Dans ce type de cellules, B19 effectue un cycle viral complet, c'est-à-dire que les protéines virales sont synthétisées et que les virions néo-synthétisés sont libérés avec lyse des cellules. [0009] Le problème est que l'érythrovirus B19 présente un tropisme cellulaire marqué pour les progéniteurs érythroïdes (dont les CFUe) humains présents dans la moëlle, dans le foie fétal et en nombre très faible <Desc/Clms Page number 3> dans le sang périphérique. De plus, le nombre de CFUe varie d'un individu à l'autre, ce qui limite pour des raisons expérimentales et éthiques évidentes, le nombre de systèmes cellulaires susceptibles d'être utilisés pour la quantification de l'expression et de l'amplification virale (Brown et al. 2001). [0010] En outre, les cellules CFU-e peuvent être purifiées à partir du sang périphérique mais étant donné la fenêtre spécifique de l'état de différenciation requis pour la permissivité à B19 obtenue en cultivant les cellules CFU-e en présence de haute concentration d'érythropoiétine, la sensibilité des tests demeure faible. En effet, il a été démontré (Sugawara et al., 2001) que suivant les méthodes employées, ces tests nécessitent entre 104 (tests immunologiques) et 1010 (tests de toxicité) copies du génome de B19, pour mesurer une réponse biologique. [0011] De nombreux auteurs ont tenté de trouver une solution à ce problème en mettant au point des lignées cellulaires établies dans lesquelles le virus B19 pourrait être propagé in vitro. Il a ainsi été proposé d'utiliser des lignées de cellules blastiques pluripotentes avec des caractéristiques phénotypiques de cellules érythroïdes ou megacaryoblastoïdes provenant d' érythroleucémie. On citera ainsi à titre d'exemples l'utilisation des lignées UT7/Epo mégacaryoblastoïdes (Shimomura et al, 1992), JK1 érythroïdes (Takabashi et al, 1993), KU812 Ep6 érythroïdes (Miyagawa et al, 1999), TF-1 érythroblastoïdes, M-07 mégacaryoblastoïdes (Gallinella et al, 2000), ou encore des lignées MB02 mégacaryoblastoïdes (Munshi et al, 1993). [0012] Malheureusement, toutes ces lignées de cellules se sont révélées n'être que peu, voire non réellement permissives, (seule une très faible proportion des cellules est réellement permissive), les mesures de <Desc/Clms Page number 4> l'infectivité du B19 présentant en outre un taux de reproductibilité relativement bas. [0013] Par ailleurs, ces lignées de cellules présentent l'inconvénient d'être très difficiles à cultiver et leur culture nécessite le plus souvent l'ajout dans le milieu de culture de composés très onéreux à haute concentration, tels que l'érythropoïétine. [0014] A titre d'exemple, on a observé que pour la lignée UT7, qui constitue la lignée la plus employée, moins de 5% des cellules étaient réellement permissives, lorsqu'elles sont cultivées en présence d'érythropoïétine (tests réalisés avec des anticorps anti-protéine de capsides). Pour comparaison, les cellules de moelle sont légèrement plus permissives (15%), les cellules les plus permissives vis-à-vis de B19 étant les CFU-e (cellules cibles naturelles) isolées à partir de sang de cordon (30 à 40%) . [0015] Par conséquent, il n'existe pas à l'heure actuelle de méthode de réplication in vitro de nombreux virus, en particulier l'érythrovirus B19, qui soit satisfaisante aussi bien en terme de sensibilité, en terme de rendement, qu'en terme de coût. [0016] Une telle méthode serait susceptible d'être utilisée dans les laboratoires à des fins de diagnostic ou à des fins thérapeutiques, notamment en vue de la mise au point de médicaments pour lutter contre la prolifération de ces virus, en particulier l'érythrovirus B19. [0017] L'identification de virus produits dans les cellules se fait soit à l'aide de tests biologiques (Sugawara et al., 2001), soit par amplification génomique, soit par détection des protéines de capsides. D'autre part, la détection des protéines non-structurales de B19 (NS1, protéine llkDa et 7kDa) au niveau de cellules même <Desc/Clms Page number 5> n'exprimant pas les protéines de capsides, permettra également leur utilisation comme modèles cellulaires. Buts de l'invention [0018] La présente invention vise à fournir un procédé pour quantifier la production de virus fastidieux à multiplier dans des cultures cellulaires, en particulier l'érythrovirus B19 à l'intérieur de cellules hôtes et leur production dans le milieu de culture, qui soit fiable et notamment dont le taux de reproductibilité soit satisfaisant. [0019] La présente invention vise également à fournir un procédé qui soit de conception simple et peu coûteuse. [0020] La présente invention vise à obtenir aussi de nouveaux outils d'identification des protéines virales, en particulier de la protéine NS1 de l'érythrovirus B19, tels que des anticorps anti-peptides épitopiques identifiés préalablement à l'aide de divers algorithmes. Résumé de l'invention [0021] La présente invention se rapporte à un procédé général pour cultiver, propager et répliquer in vitro à haut rendement des virus choisis parmi le groupe constitué par les parvovirus autonomes et recombinants, en particulier l'érythrovirus, ainsi que d'autres virus, tels que le virus HBV, HCV, TTV, SEN-V, SEN-F, ou GBV à l'intérieur de leurs cellules hôtes. [0022] Dans le procédé de l'invention, on sélectionne les cellules hôtes permissives ou semipermissives, on isole ledit virus et on cultive ces cellules dans un milieu de culture et dans des conditions de culture appropriées, c'est-à-dire susceptibles de <Desc/Clms Page number 6> favoriser la transcription et l'amplification de l'ADN du virus. On infecte lesdites cellules à l'aide du virus en mettant en contact la culture de cellules hôtes avec la fraction contenant ledit virus, on incube les cellules hôtes en présence du virus pendant un temps d'incubation adéquat, de manière à réaliser un nombre suffisant de cycles d'amplification dudit virus, les cellules hôtes permissives étant cultivées en présence du virus entre autres en condition d'hypoxie, et éventuellement en présence de cobalt ou à pH acide. [0023] Ces conditions de culture permettent la concentration suffisante de facteurs de transcription cellulaires tels que le facteur HIF-la favorisant la réplication et l'expression du virus. [0024] De préférence, le virus est l'érythrovirus B19 et les cellules de culture sont des cellules KU812F ou une souche analogue comme définie ci-dessous. [0025] De préférence, le milieu de culture adéquat choisi correspond à un milieu RPMI ou milieu analogue connu par l' homme de métier contenant de 0% à environ 20% sérum (serum foetal de veau, serum de veau nouvellement né, serum ou plasma humain, ...) et de 0 à 10 unités d'érythropoïétine. [0026] De préférence, la température d'incubation est comprise entre environ 25 et environ 39 C. Le temps d'incubation est compris entre environ 24 h et environ 400 h. [0027] Les souches de cellules analogues aux cellules Ku812F (hépatocarcinome cellule de rein, choriocarcinome, fibroblastes, synoviocytes, ...) sont caractérisées par le fait qu'elles peuvent présenter le/les récepteurs spécifiques de B19, comme par exemple le récepteur globoside, ou un mécanisme efficace d'entrée du virus, ou qu'elles synthétisent les facteurs de <Desc/Clms Page number 7> transcription nécessaires au virus, ou encore qu'elles sont sensibles aux facteurs hémapoiétiques (K562, HL60,..). [0028] En fonction du type de virus, comme HBV, HCV, d'autres cellules hôtes, en particulier des hépatocytes, en culture, des hépatoblastomes HepG2, des hépatocarcinomes, et autres, seront sélectionnées par l'homme du métier. [0029] En outre, le procédé de l'invention peut être également utilisé pour quantifier l'infectivité d'un virus ou l'utiliser à des fins de diagnostic ou à des fins thérapeutiques (séquences épitopiques), en particulier en vue de concevoir un vaccin antiviral, en particulier un vaccin anti-érythrovirus B19, ou en vue d'identifier une cartographie des épitopes anticorps anti-érythrovirus B19, de préférence, et pour sélectionner ensuite des anticorps spécifiques, en particulier des anticorps neutralisants. Exemple 1 procédé de réplication in vitro de l'érythrovirus B19 [00301 Conditions expérimentales . Lignée cellulaire utilisée . - KU812F : Riken Cell Bank ; Les expériences ont montré que cette lignée cellulaire est hétérogène et peu sensible au virus B19 bien qu'elle soit permissive lorsqu'elle est cultivée en présence d'érythropoïétine selon les données publiées ; ¯ Milieu de culture : RPMI contenant 10% FCS et 2U/ml d'érythropoïétine ; ¯ Virus B19 : origine : 1) 1er standard international WHO (code 99/100) pour la quantification d'ADN de B19 par la technique d'amplification génomique (106 IU/ml - 0,8.106 génome équivalent/ml) <Desc/Clms Page number 8> 2) Standard ADN de B19 (97/542) pour la quantification d'ADN de B19 par la technique d'amplification génomique (National Institute for Biological Standard and Controls, UK) 3) Pool de plasma A26 (¯ 106 génome équivalent/ml)(CAF- DCF-Croix Rouge) contenant plus de 5000 donations collectés en 1998 chez des donneurs sains, bénévoles et non-rénumérés et 4) Pool de plasma A28 (¯ 2 106 (1,84 106) génome équivalent/ml) )(CAF-DCF-Croix Rouge) contenant plus de 5000 donations collectés en 1998 chez des donneurs sains, bénévoles et non-rénumérés. . Température : 37 C +/- 0.5 C ¯ Temps d'incubation : de 24 h à 192 h ; - Pourcentage d'oxygène utilisé : 6%. Résultats [0031] Les résultats obtenus ont montré, qu'en cultivant les cellules KU812F en hypoxie, on obtenait après infection un accroissement significatif de la production virale, plus précisément de 100 à plus de 10000 fois plus par rapport à des conditions normoxiques. [0032] En outre, cette méthode de réplication in vitro du virus B19 s'est révélée très sensible puisque l'infection à faible multiplicité (0,1 à 0,025) et l'incubation pendant 72 heures permettent au virus d'effectuer plusieurs cycles d'amplification. Ainsi, avec seulement de 5 à 10 équivalents génomes (déterminés par PCR), ce qui correspond au seuil de détection de B19 par PCR (Saldanha et al. 1999), il est déjà possible d'obtenir une descendance (progénie) détectable par PCR dans le surnageant de culture des cellules KU812F infectées. Ces <Desc/Clms Page number 9> virions ainsi produits sont infectieux. Dans ces conditions d'hypoxie, la concentration en HIF-la est mesurable. [0033] On peut expliquer ces résultats par le fait que l'hypoxie induit l'accumulation du facteur de transcription HIF-la (voir pour revue Semenza 2001) pour lequel on retrouve un site de fixation en amont du promoteur viral p6, ainsi que des séquences consensus réduites localisées au niveau des palindromes. L'hypoxie favoriserait ainsi la transcription et de ce fait l'amplification virale. Exemple 2 [0034] La combinaison de divers algorithmes différents (Parker et al, 1986 ; Parker and Hodges, 1991 ; Janin et al, 1979) sont utilisés pour prédire les épitopes linéaires hautement probables au sein de la séquence des acides aminés de la protéine non structurale NS1 (671 acides aminés) (Swiss-Prot databank accession number : P07298)(Shade, R. O.et al, 1986)). Les séquences d'acides aminés identifiées par cette invention dans la protéine NS1 sont : D30-R42, M124-I138, A173-181, N186-E201, N206- S213, V228-K235, K316-L324, G328-K343, G389-R400, S510- T530, N535-P544, P546-S561, T654-E671. [0035] Ces peptides ont été synthétisés et induisent, après injection dans les lapins selon un schéma d'immunisation classique pour l'homme de métier, une production d'anticorps spécifiques qui reconnaissent la NS1 recombinante produite dans les modèles Escherichia coli ou de Baculovirus. [0036] De même, ces épitopes sont reconnus par les anticorps de type IgG ou IgM de patients trouvés positifs <Desc/Clms Page number 10> par la technique d'amplification génomique "polymerase chain reaction" et en IgM anti-capside. [0037] Parmi ces séquences, 4 peptides ont été sélectionnés dont un contenant le site de liaison des nucléotides triphosphates ( NTP binding motif ) et étudiés à titre d'exemple (N186-E201, G328-K343, S510-T530, P546-S561). Injectés chez des lapins, les anticorps anti- peptides produits ont été purifiés parallèlement sur la protéine NS1 recombinante et sur les peptides épitopiques greffés sur une résine de chromatographie. Une étude a été ensuite entreprise pour étudier, en parallèle, les anticorps humains anti-NS1 de type IgG et IgM, identifiés par le pool de ces 4 peptides, et la présence de B19-DNA de 171 donations de donneurs sains. Les anticorps, IgG et IgM, anti-protéines de capside VP ont été aussi dosés. L'étude s'est étendue à 50 plasmas de patients présentant des symptômes cliniques associés à une suspicion de B19. Cette validation clinique montre un profil semblable des anticorps anti-épitopes linéaires de NS1 et de VP chez les donneurs et les patients. <Desc/Clms Page number 11> REFERENCES IBLIOGRAPHIQUES - Brown K. E. & Young N. S., Annu. Rev. 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Claims (9)
- REVENDICATIONS 1. Procédé pour cultiver, propager et répliquer in vitro à haut rendement, à l'intérieur de cellules hôtes, des virus difficiles à faire multiplier in vitro, comme ceux appartenant à la famille des hepadnaviridae, des flaviviridae, des circaviridae, des parvovirus, y compris les érythrovirus, les autonomes ou leurs variants ou leur recombinants, ledit procédé comprenant les étapes suivantes: - on isole des cellules hôtes permissives; - on isole un virus ; - on cultive ces cellules dans un milieu de culture et dans des conditions de culture appropriées, c'est-à-dire susceptibles de favoriser la transcription et l'amplification de l'ADN du virus ; - on infecte lesdites cellules à l'aide du virus, en mettant en contact la culture de cellules hôtes avec la fraction contenant ledit virus ;- on incube les cellules hôtes en présence du virus pendant un temps d'incubation adéquat, de manière à réaliser un nombre suffisant de cycles d'amplification dudit virus ; ledit procédé étant caractérisé en ce que lesdites cellules sont cultivées en condition d'hypoxie, de préférence en présence de cobalt ou à pH acide.
- 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le virus est un parvovirus et en ce que les cellules permissives ou semi-permissives présentent un récepteur cellulaire ou un mécanisme permettant l'entrée dudit parvovirus. <Desc/Clms Page number 13>
- 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le parvovirus est un érythrovirus ou un variant de celui-ci.
- 4. Procédé selon la revendication 2 ou 3, caractérisé en ce que le milieu de culture correspond à un milieu de culture de type RPMI ou autre comprenant de 0 à 20% de sérum et 0 à 10 unités d'érythropoïétine.
- 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes 2 à 4, caractérisé en ce que la température d'incubation est comprise entre 25 C et environ 39 C.
- 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes 2 à 5, caractérisé en ce que le temps d'incubation est compris entre environ 24 heures et environ 400 heures.
- 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce qu'il comprend une étape de quantification et/ou de qualification de l'infectivité du virus.
- 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une étape d'identification et de cartographie d'épitopes linéaires ou conformationnels dudit virus et éventuellement d'identification d'anticorps de préférence neutralisants, dirigés contre lesdits épitopes dudit virus.
- 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comporte une étape d'identification des portions des épitopes linéaires ou conformationnels dudit virus, ledit procédé étant destiné à des fins thérapeutiques, en particulier pour concevoir un vaccin antiviral, en particulier un vaccin anti-érythrovirus B19.
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