CN104032034A - 一种同时检测甲型、乙型及丙型流感病毒的方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术应用领域，涉及一种同时检测甲型、乙型及丙型流感病毒的含内质控的多重荧光RT-PCR方法及试剂盒。本发明针对甲型、乙型及丙型流感病毒代表株的M基因、NS基因及NP基因的保守序列设计特异性引物和探针，建立了含内质控的一步法多重荧光RT-PCR快速检测方法，操作简便快捷，克服了常规单重荧光RT-PCR单孔单检的繁琐，简化了操作程序，节省了试验成本，利用其较高的特异性、灵敏度、高效性和稳定性为病毒的现场检测、水和食品的卫生评价、临床诊断等方面提供了有力的技术支撑。

Description

一种同时检测甲型、乙型及丙型流感病毒的方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术应用领域，尤其是用于甲型、乙型及丙型流感病毒的同时检测与鉴定。

背景技术

甲、乙、丙型流感病毒是引起人类流感的主要病原体成员，属于正粘病毒科，为单股负链、分节段的RNA病毒，其基因组由8个片段组成(丙型流感病毒由7个片段组成)，甲型流感病毒对多种禽类和哺乳动物也具有高度传染性，也可引起每年季节性流行和反复的大流行，对全世界经济和公共卫生都造成了严重的危害。

甲型流感病毒的8个基因组至少编码10种蛋白，包括两种表面糖蛋白(HA和NA)，六种内部蛋白(NP，PB1，PB2，PA，M1和M2)和两种非结构蛋白(NS1和NS2)。根据HA和NA抗原性不同，甲型流感病毒可分为16个HA亚型(H1～H16)和9个NA亚型(N1～N9)。目前16个HA亚型均可感染禽类，而感染人的流感目前只发现H1、H2、H3、H5、H7及H9亚型。H1和H3两种亚型在人群中一直存在，与乙型流感病毒一起构成了季节性流感的主要病原。乙型流感病毒根据其抗原性和基因特性的不同分为两大谱系，即Yamagata系和Victoria系。丙型流感病毒在遗传学上比甲型和乙型流感病毒较为稳定，但人群中血清抗体仍一直存在。所以，加强甲、乙、丙型流感病毒的检测尤为重要。

目前，国内外检测流感病毒的经典方法是病毒的分离培养，但是其操作烦琐，耗费时间长；电镜、免疫组化、ELISA、常规PCR等具有各自突出的优点，但都很难检测微量核酸和准确定量，20世纪末发展起来的实时荧光定量PCR技术(Real-time fluorescentquantitative PCR)是一种在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，该技术不仅实现了对模板的定性和定量，而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实验多重反应、自动化程度高、无污染性、具有实时性和准确性等特点。因而，在呼吸道病原体检测中具有巨大应用优势。相对普通PCR及单荧光PCR，多重荧光PCR具有以下优点：(1)检测效率高，即多重荧光PCR可以实现一管多检，通过收集的不同波长的荧光信号来区分不同的检测对象，从而简化操作流程；(2)节省试剂成本和人员操作时间，尤其在开展大量样品检测时，可以显著地降低检测成本和操作时间。(3)本方法中含内质控基因的监控，在各类标本中，存在各种影响或抑制PCR反应的因素，且在标本的采集处理、核酸提取、扩增和分析过程中，也可能因人为操作失误而导致产生假阴性检测结果。因此本申请采用内质控的方法，在标本中含有的内质控基因(LDHA)经历检测标本核酸提取、加样、PCR扩增及信号检测的全过程，从而可对每一份标本实施监控。

本发明成功建立的可同时检测甲型、乙型及丙型流感病毒一步法多重荧光RT-PCR方法，采用LDHA作为内质控，可以有效监控样本中的PCR抑制因素以及由操作误差所造成的假阴性结果。并且该方法除了具有特异性强、灵敏度高、检测效率高及稳定性的特点之外，其检测所需要RNA量较少，且操作简便快速，在病毒的现场检测、卫生评价、临床诊断等方面显示出良好的应用前景。并有利于进一步深入研究相关病原体感染的分子机理和免疫调节机理、开展有效的临床治疗等方面显示出良好的应用前景。

发明内容

本发明是由国家“十二五”科技重大专项2012ZX10004215-003-001支持的。我们成功设计和合成了针对甲型、乙型及丙型流感病毒相应M基因、NS基因及NP基因特异性引物和探针。基于此引物和探针，我们建立了一步法含内质控的多重荧光RT-PCR检测方法。该方法通过对多种相关病毒的检测、标准曲线的构建、与商品化单重荧光RT-PCR诊断试剂盒比较、稳定性试验等，说明该方法具有较高的特异性、灵敏度、稳定性和高效性。

在本发明的第一方面，提供了一种针对甲型、乙型及丙型流感病毒M基因、NS基因及NP基因的特异性引物和探针序列，如SEQ NO：1至12所示。

在本发明的第二方面，提供一种同时检测甲型、乙型及丙型流感病毒的试剂盒，该试剂盒中含有第一方面所述引物和探针。

在一个实施方案中，所述试剂盒包括以下成份：

a)反应缓冲液，所述缓冲液为常规PCR反应缓冲液；

b)反应酶，所述反应酶为常规PCR反应酶；

c)SEQ NO：1、2、4、5、7、8、10、11所示的引物；

d)SEQ NO：3、6、9、12所示的探针

e)无RNA酶的水。

其特征在于甲型流感病毒的M基因探针5’端由FAM标记，3’端由BHQ1标记；乙型流感病毒的NS基因探针5’端由JOE标记，3’端由BHQ1标记；丙型流感病毒的NP基因探针5’端由ROX标记，3’端由BHQ2标记；质控基因LDHA基因探针5’端由CY5标记，3’端由BHQ2标记。

在一个具体实施方案中，所述方法为多重荧光RT-PCR检测试剂盒的具体应用，并使用所述引物和探针作为检测序列。

在本发明的第三方面，提供一种同时检测甲型、乙型及丙型流感病毒的PCR扩增方法，该方法使用第二方面所述的试剂盒。

在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：

a)四个荧光通道的设置；

b)反转录的温度与时间；

c)预热的温度与时间；

d)热循环(预热温度与时间、退火温度与时间、荧光收集温度、循环数)；

e)以界定的Ct值来判定检测结果。

在本发明的第四方面，提供第一方面所述引物和探针在制备甲型、乙型及丙型流感病毒的检测试剂中的应用。

附图说明

图1.甲、乙、丙型流感病毒一步法含内质控的多重荧光RT-PCR检测方法的特异性鉴定，其中：

图1A为同时加入甲、乙、丙型流感病毒阳性模板的荧光扩增图。

图1B为加入其他5种呼吸道多病原的阳性模板的荧光扩增图(以副流感病毒I型为例)。

具体实施方式

本发明所述甲型、乙型及丙型流感病毒多重荧光RT-PCR检测方法，是基于相应型别M基因、NS基因及NP基因保守区设计的特异性引物和探针。

本发明的技术途径是首先利用Applied Biosystems(ABI)公司开发的Primer Express3.0软件、针对甲型、乙型及丙型流感病毒相应M基因、NS基因及NP基因的保守区设计特异性引物和探针序列，确定了最佳配制体系及上机扩增程序，并且进行特异性、灵敏度及稳定性等验证实验，成功建立了甲型、乙型及丙型流感病毒一步法多重荧光RT-PCR快速检测方法。

下面结合优选实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体的实验方法，通常按照常规条件和方法，如分子克隆实验室手册(Sambrook，et al.New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)及实时荧光PCR技术(李金明，2007)中所述方法或试剂制造商提供的方法。

同时，需要指出的是，本发明所述的检测方法和试剂盒不仅应用于对患者(人、动物)的样品进行检测，也包括对环境中的水样品、食物样品、空气样品、微生物样品、动物细胞样品等多种样品的非诊断目的的检测。其应用也都是本领域技术的常用技术手段，并不需要进行特别的、富有创造性的改变。

实施例

实施例1.甲型、乙型及丙型流感病毒各型别M基因、NS基因及NP基因特异性引物和探针设计与合成

1.1甲型、乙型及丙型流感病毒代表株的相应靶基因M、NS及NP的选择及保守区的确定

本研究所用的序列选自NCBI GenBank(http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov)和美国洛斯阿莫斯国家实验室的流感病毒数据库(http：／／www.flu.lanl.gov)中，主要选择依据为：(a)年代较近毒株；(b)具有全长序列及主体序列毒株；(c)WHO推荐的疫苗株；(d)同亚型序列比对后选取具有代表性的毒株。选取的甲型、乙型及丙型流感病毒代表株的相应M基因、NS基因及NP基因的信息见表1-1、1-2及1-3。

本研究分别将所选择的甲型、乙型及丙型流感病毒代表株的相应M基因、NS基因及NP基因输入到DNAssist软件中进行同源比对，确定了相应亚型M基因、NS基因及NP基因的序列保守区，为引物和探针设计提供了靶区。

表1-1.选取甲型流感病毒(FluA)代表毒株的M基因信息

表1-2.选取乙型流感病毒(FluB)代表毒株的NS基因信息

表1-3.选取丙型流感病毒(FluC)代表毒株的NP基因信息

1.2引物和探针的设计与合成

利用Applied Biosystems(ABI)公司研发的Primer Express3.0软件、针对甲型、乙型及丙型流感病毒各亚型M基因、NS基因及NP基因的保守区设计特异性引物和TaqMan探针序列，并对引物和探针质量进行评估，将选定检测甲型、乙型及丙型流感病毒的特异性引物和探针序列以及内质控基因LDHA的引物和探针序列由TakaRa宝生物(大连)公司合成。其中如SEQ NO：3所示的甲型流感病毒的M基因探针5’端由FAM标记，3’端由BHQ1标记；如SEQ NO：6所示的乙型流感病毒的NS基因探针5’端由JOE标记，3’端由BHQ1标记；如SEQ NO：9所示的丙型流感病毒的NP基因探针5’端由ROX标记，3’端由BHQ2标记；如SEQ NO：12所示的内质控基因LDHA基因探针5’端由CY5标记，3’端由BHQ2标记。为了降低反应体系的干扰，合成的引物和探针采用HPLC进行纯化(见表2)。

表2.选定检测甲型流感病毒(FluA)、乙型流感病毒(FluB)及丙型流感病毒(FluC)及内质控基因LDHA的引物和探针序列及标记基团

实施例2.甲型、乙型及丙型流感病毒一步法多重荧光RT-PCR检测体系的建立

2.1按照英杰公司的核酸提取试剂盒(viral RNA Mini Kit)来提取样本核酸。

2.2甲型、乙型及丙型流感病毒一步法多重荧光RT-PCR检测体系的配制配制试剂采用Ambion公司的AgPath-IDTM One-step RT-PCR Kit，体系为50μl：

2×RT-PCR buffer 25μl

25×RT-PCR Enzyme 2μl

Detection Enhancer 3μl

引物、探针 同时加入如SEQ NO：1、2、4、5、7、8、10、11所示的引物各0.5μl，引物终浓度为200nM；加入如SEQ NO：3、6、9、12所示的探针引物各0.5μl，终浓度为100nM

模板 6μl(三种阳性模板各加2μl，并且每种模板以10-1倍数稀释后加入，终浓度1pg-100ng。以呼吸道合胞病毒阳性核酸作为阴性对照模板)

无RNA酶的水 补足体系至50μl

2.3甲型、乙型及丙型流感病毒一步法多重荧光RT-PCR检测方法的上机扩增程序采用罗氏公司的Roche480仪进行上机扩增，其程序如下：

先设置FAM、JOE、ROX、CY5四个荧光采集通道；

反转录温度与时间：50℃，20min；

预变性温度与时间：95℃，10min；

结果判定标准为：Ct值≤34，判定为阳性；Ct值≥36，判断为阴性；Ct值在34～36之间为可疑。

实施例3.甲型、乙型及丙型流感病毒一步法多重荧光RT-PCR检测方法的特异性鉴定

利用实施例2建立的一步法多重荧光RT-PCR反应体系分别对甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、肠道病毒、腺病毒、博卡病毒的阳性核酸进行检测，其结果表明，只有甲型、乙型及丙型流感病毒分别在FAM、JOE、ROX检测通道出现相应的特异性荧光扩增曲线，并且没有出现交叉反应，而其他5株病毒除了内质控CY5通道有扩增曲线，其他三个通道则无扩增曲线，说明该方法具有很强的特异性(见图1)。

实施例4.甲型、乙型及丙型流感病毒一步法多重荧光RT-PCR检测方法的灵敏度鉴定

4.1一步法多重荧光RT-PCR检测方法的检测限度

用针对甲型、乙型及丙型流感病毒的各自M基因、NS基因及NP基因特异性引物，进行普通RT-PCR方法扩增(其扩增范围包括荧光定量RT-PCR扩增区域)，将其产物利用XhoI和HindIII(New England Biolabs公司)连接到pcDNAII载体(Invitrogen公司)上，再进行克隆，提取质粒，分别命名为pcDNAII-FluA-M、pcDNAII-FluB-NS、pcDNAII-FluC-NP，并将质粒送宝生物(大连)公司测序确证，将测序正确的质粒用于建立多重荧光RT-PCR检测方法的标准曲线。pcDNAII-FluA-M、pcDNAII-FluB-NS、pcDNAII-FluC-NP阳性质粒用微量核酸定量仪NanoDrop(型号：ND-1000)进行定量，取10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸拷贝／μl的重组质粒作为标准品模板，分别加入到实施例2建立的一步法多重荧光RT-PCR反应体系中进行扩增，根据Ct值与模板浓度的Log值构建标准曲线。结果表明，由pcDNAII-M阳性质粒构建的标准曲线的Ct值与模板浓度Log值在(10¹～10⁶)具有良好的线性关系，相关系数为0.9942，根据多重荧光RT-PCR检测方法结果判定标准，检测限度为10拷贝。由pcDNAII-NS阳性质粒构建的标准曲线的Ct值与模板浓度Log值在(10¹～10⁶)具有良好的线性关系，相关系数为0.9983，根据多重荧光RT-PCR检测方法结果判定标准，检测限度为20拷贝。由pcDNAII-NP阳性质粒构建的标准曲线的循环阈值(Ct值)与模板浓度Log值在(10¹～10⁶)具有良好的线性关系，相关系数为0.9978，根据多重荧光RT-PCR检测方法结果判定标准，检测限度为20拷贝。由此说明，一步法多重荧光RT-PCR检测方法具有较高的灵敏度。

4.2一步法多重荧光RT-PCR与普通RT-PCR检测灵敏度的比较

甲型、乙型及丙型流感病毒的阳性核酸进行10倍梯度系列稀释(10^-310^-8)，用实施例2建立的一步法多重荧光RT-PCR方法和普通RT-PCR方法对其进行检测。通过对甲型、乙型及丙型流感病毒阳性核酸模板不同稀释倍数的同步检测，其结果表明，多重荧光RT-PCR方法比普通RT-PCR方法检测灵敏度提高1000倍(见表3)。

表3.一步法多重荧光RT-PCR方法与普通RT-PCR方法检测灵敏度的比较

“*”表示检测结果为阳性；“#”表示检测结果为阴性。

实施例5.甲型、乙型及丙型流感病毒一步法多重荧光RT-PCR方法检测效率的鉴定

利用实施例2建立的一步法多重荧光RT-PCR方法对大量样本进行检测，并与上海之江公司甲型流感病毒核酸测定试剂盒、乙型流感病毒核酸测定试剂盒、丙型流感病毒核酸测定试剂盒的单重荧光RT-PCR方法进行比较。结果表明，多重荧光RT-PCR与之江试剂盒比较其敏感性为97.76％、特异性100％、一致性99.52％(见表4)。本研究中，全部样本中的LDHA检测均为阳性，表明检测过程中没有因操作失误或存在RT-PCR反应抑制因子而造成假阴性结果的出现。目前，较成熟的一步法多重荧光RT-PCR方法建立的较少，而单重荧光RT-PCR检测方法应用广泛，在其灵敏度、特异性及一致性相当的情况下，多重荧光RT-PCR方法实现了一管四检，简化操作程序，耗时为单重荧光RT-PCR的1／3，达到了省时、省力、省核酸、省成本的效果，更具高效性和通量性，尤其是进行大量样本筛检时，其优势更明显。

表4.一步法多重荧光RT-PCR与单重荧光RT-PCR(商品化的试剂盒)检测结果的比较

实施例6.甲型、乙型及丙型流感病毒一步法多重荧光RT-PCR检测方法的稳定性鉴定

在同一次试验中(同一个PCR板)，对10倍梯度稀释的甲型、乙型及丙型流感病毒阳性核酸(设置10^-2、10^-4、10^-6稀释梯度)利用实施例2建立的多重荧光RT-PCR方法进行检测，每个样本做3个重复；另外在不同PCR板上重复3次，结果各个稀释度样品的批内三个重复反应获得的Ct值的变异系数在(0.23％～0.34％)之间，批间重复的变异系数在(0.27％～0.85％)之间，表明本发明所建立的多重荧光RT-PCR检测方法误差小、重复性好，可对甲、乙、丙型流感病毒进行稳定、可靠的检测。

Claims (8)

1.一种同时检测甲型、乙型及丙型流感病毒的方法，其特征在于是含内质控的一步法多重荧光RT-PCR，其特异性引物和探针序列分别为：

1)SEQ NO：1、2、4、5、7、8、10、11所示的引物；

2)SEQ NO：3、6、9、12所示的探针。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于如SEQ NO：3所示的甲型流感病毒的M基因探针5’端由FAM标记，3’端由BHQ1标记；如SEQ NO：6所示的乙型流感病毒的NS基因探针5’端由JOE标记，3’端由BHQ1标记；如SEQ NO：9所示的丙型流感病毒的NP基因探针5’端由ROX标记，3’端由BHQ2标记；如SEQ NO：12所示的内质控基因LDHA基因探针5’端由CY5标记，3’端由BHQ2标记。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述多重荧光RT-PCR的反应体系：

a)反应缓冲液；

b)反应酶；

c)SEQ NO：1、2、4、5、7、8、10、11所示的引物；

d)SEQ N()：3、6、9、12所示的探针

e)无RNA酶的水补足体系要求的体积。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述多重荧光RT-PCR的反应条件如下：

a)四个荧光通道的设置；

b)反转录的温度与时间；

c)预热的温度与时间；

d)热循环(预热温度与时间、退火温度与时间、荧光收集温度、循环数)；

e)以界定的Ct值来判定检测结果。

5.如权利要求1所述方法在检测食品及原料、环境样本中甲型、乙型及丙型流感病毒中的用途。

6.权利要求1所述的引物和探针序列在制备甲型、乙型及丙型流感病毒的检测试剂中的应用。

7.一种同时检测甲型、乙型及丙型流感病毒的试剂盒，其特征在于所述试剂盒中含有特异性引物和探针，其序列分别为：

1)SEQ NO：1、2、4、5、7、8、10、11所示的引物；

2)SEQ NO：3、6、9、12所示的探针。

8.权利要求7所述的试剂盒在制备甲型、乙型及丙型流感病毒的诊断试剂中的应用。