CN111363855A

CN111363855A - 一种同时检测a、d型流感病毒的成套试剂、试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN111363855A
Application number: CN202010365828.2A
Authority: CN
Inventors: 于志君; 朱彤; 吴家强
Original assignee: Poultry Research Institute Shandong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Poultry Research Institute Shandong Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2020-04-30
Filing date: 2020-04-30
Publication date: 2020-07-03

Abstract

本发明提供一种同时检测A、D型流感病毒的成套试剂、试剂盒及其应用，属于生物工程和分子检测技术领域。基于本发明的成套试剂和试剂盒进行检测，检测方法简便快捷，重复性好，敏感度高，特异性强，可以实现大通量样品的检测，从而同时对A、D型流感病毒进行快速的、高敏感度的实时荧光定量PCR检测；便于基层操作和应用，更符合实际的需要，应用前景广阔，对于A、D型流感病毒疫病诊断和流行病学调查具有重大的应用价值。

Description

一种同时检测A、D型流感病毒的成套试剂、试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于生物工程和分子检测技术领域，具体涉及一种同时检测A、D型流感病毒的成套试剂、试剂盒及其应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

流感病毒是一种重要传染病，能够感染人类、鸟类和哺乳动物。流感病毒根据病毒抗原性不同分为A、B、C和D型四种。其中A型流感病毒和D型流感病毒的宿主范围最为广泛，均可以感染人和猪、牛等多种哺乳动物，对畜牧业和公共卫生安全均构成严重威胁。因此加强对这两种类型的流感病毒检测十分重要，可以及时发现变异的毒株，发现流感病毒的跨物种感染，为防控流感病毒奠定基础。

目前虽然分别有检测A型和D型流感病毒的检测方法，但这两种流感病毒可以同时感染一种动物，如果能一次性对一份动物样品同时检测A型和D型两种病毒，则可以大大提高流感病毒的检测效率，缩短检测时间。然而，目前尚未有同时检测A、D型流感病毒的相关检测试剂和方法。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种同时检测A、D型流感病毒的成套试剂、试剂盒及其应用。本发明针对近年来新发现的A、D型流感病毒基因组来设计荧光定量检测引物从而获得一种特异性强、灵敏度高以及重复性好的检测A、D型流感病毒的荧光定量PCR引物组、探针及相应试剂盒，从而完成本发明。

为实现上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明的第一个方面，提供一种成套试剂，所述成套试剂包括引物组和探针。

所述引物组由引物P1、P2、P3、P4和P5组成；

所述引物P1为如下(a1)或(a2)：

(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；

(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；

所述引物P2为如下(b1)或(b2)：

(b1)序列表的序列2所示的单链DNA分子；

(b2)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；

所述引物P3为如下(c1)或(c2)：

(c1)序列表的序列3所示的单链DNA分子；

(c2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；

所述引物P4为如下(d1)或(d2)：

(d1)序列表的序列4所示的单链DNA分子；

(d2)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子；

所述引物P5为如下(e1)或(e2)：

(e1)序列表的序列5所示的单链DNA分子；

(e2)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的DNA分子。

所述探针包括探针1和探针2；

其中，所述探针1为如下(f1)或(f2)：

(f1)序列表的序列6所示的单链DNA分子；

(f2)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同功能的DNA分子；

所述探针2为如下(g1)或(g2)：

(g1)序列表的序列7所示的单链DNA分子；

(g2)将序列7经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列7具有相同功能的DNA分子。

所述探针序列末端可具有荧光基团，所述荧光基团包括但不限于FAM、Cy5。

所述成套试剂的用途为如下(A1)或(A2)：

(A1)鉴定或辅助鉴定A型流感病毒和/或D型流感病毒；

(A2)鉴定或辅助鉴定待测样本中是否含有A型流感病毒和/或D型流感病毒。

本发明的第二个方面，提供所述成套试剂在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的用途为如下(A1)或(A2)：

(A1)鉴定或辅助鉴定A型流感病毒和/或D型流感病毒；

本发明的第三个方面，提供一种试剂盒，包括上述成套试剂；所述试剂盒的用途为如下(A1)或(A2)：

(A1)鉴定或辅助鉴定A型流感病毒和/或D型流感病毒；

所述试剂盒还包括阳性标准质粒。具体来说，所述阳性标准质粒为将A型流感病毒的M基因(GenBank登录号：AF389121.1)插入载体的多克隆位点得到的重组质粒1和/或将D型流感病毒的PB1基因(GenBank登录号：KF425653.1)插入载体的多克隆位点得到的重组质粒2。

本发明的第四个方面，提供一种鉴定或辅助鉴定A和/或D型流感病毒的方法，包括如下步骤：以待测病毒的cDNA为模板，采用上述成套试剂和/或试剂盒进行荧光定量PCR；

本发明的第五个方面，提供一种鉴定或辅助鉴定待测样本中是否含有A和/或D型流感病毒的方法，包括如下步骤：以待测样本的cDNA为模板，采用上述成套试剂和/或试剂盒进行荧光定量PCR；

以上任一所述方法中，荧光定量PCR的反应程序包括：预变性：95℃30s；PCR反应：95℃5s，60℃30s，40个循环；50℃30s，1个循环。

以上任一所述方法中，荧光定量PCR的反应体系包括：2X Premix Ex Taq 10μL、引物P1 0.4μL、引物P2 0.4μL、P3 0.4μL、P4 0.4μL、P5 0.4μL、探针1 0.8μL、探针2 0.8μL，模板1 2μL、模板2 2μL，加RNase-Free ddH₂O至20μl。

上述一个或多个技术方案的有益技术效果：

基于上述技术方案中的成套试剂和试剂盒进行检测，检测方法简便快捷，重复性好，敏感度高，特异性强，可以实现大通量样品的检测，从而同时对A、D型流感病毒进行快速的、高敏感度的实时荧光定量PCR检测；便于基层操作和应用，更符合实际的需要，应用前景广阔，对于A、D型流感病毒疫病诊断和流行病学调查具有重大的应用价值。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明实施例4中A型流感荧光定量PCR的标准曲线试验图；

图2为本发明实施例4中D型流感荧光定量PCR的标准曲线试验图；

图3为本发明实施例5中A型流感荧光定量PCR的特异性试验图；

图4为本发明实施例5中D型流感荧光定量PCR的特异性试验图；

图5为本发明实施例6中A型流感荧光定量PCR的敏感性试验图；

图6为本发明实施例6中D型流感荧光定量PCR的敏感性试验图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。

如前所述，目前虽然有分别检测A型和D型流感病毒的检测方法，但这两种流感病毒可以同时感染一种动物，如果能一次性对一份动物样品同时检测A型和D型两种病毒，则可以大大提高流感病毒的检测效率，缩短检测时间。然而，目前尚未有同时检测A、D型流感病毒相关检测试剂和方法。

本发明的一个典型实施方式中，提供一种同时检测A、D型流感病毒的荧光定量PCR引物组和探针，其中A型流感病毒检测引物组为了囊括所有亚型的A型流感病毒，特别设计两条下游引物(P2和P3)，此外还包括一条上游引物(P1)和一条探针(探针1)；D型流感病毒检测引物组包括1条上游引物(P4)、一条下游引物(P5)和一条探针(探针2)，具体各引物和探针序列如下：

P1：5'-AGATGAGTCTTCTAACCGAGGTCG-3'(SEQ ID No.1)；

P2：5'-TGCAAAAACATCTTCAAGTYTCTG-3'(SEQ ID No.2，其中Y为简并碱基)；

P3：5'-TGCAAAGACACTTTCCAGTCTCTG-3'(SEQ ID No.3)；

P4：5'-GCTGTTTGCAAGTTGATGGG-3'(SEQ ID No.4)；

P5：5'-TGAAAGCAGGTAACTCCAAGG-3'(SEQ ID No.5)；

探针1:5'-FAM-TCAGGCCCCCTCAAAGCCGA-BHQ1-3'(SEQ ID No.6)；

探针2:5'-Cy5-TTCAGGCAAGCACCCGTAGGATT-BHQ2-3'(SEQ ID No.7)。

上述引物根据GenBank上已公布的A型流感病毒的M基因序列(GenBank登录号：AF389121.1)和D型流感病毒的PB1基因序列(GenBank登录号：KF425653.1)为参考序列而设计。

本发明的又一具体实施方式中，本发明的引物对可用于制备A、D型流感病毒荧光定量PCR检测试剂盒，从而对A、D型流感病毒进行病毒含量的检测。该试剂盒包括所述试剂盒由上述引物组和探针、阳性标准质粒、2X Premix Ex Taq实时荧光定量试剂和RNase-Free ddH₂O组成。

所述阳性标准质粒为：

由A型流感病毒的M基因(GenBank登录号：AF389121.1)与载体相连后得到的重组质粒和由D型流感病毒的PB1基因(GenBank登录号：KF425653.1)与载体相连后得到的重组质粒。

经试验证明，采用本发明的引物对制备的A、D型流感病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒，检测方法简便快捷，重复性好，敏感度高，特异性强，可以实现大通量样品的检测，可同时对A、D型流感病毒进行快速的、高敏感度的实时荧光定量PCR检测。

以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1阳性质粒的制备

根据QIAprep Spin Miniprep kit对阳性菌液进行少量提取和纯化后，于-20℃保存备用。

实施例2荧光定量PCR反应体系与反应条件的优化

以阳性重组质粒为模板，进行PCR扩增，对PCR反应体系(模板、2X Premix Ex Taq、7条引物、RNase-Free ddH₂O)、反应条件(变性、退火、延伸的温度及循环次数)进行优化，选取Ct最小值、荧光最高值最佳的PCR反应条件。

反应体系：2X Premix Ex Taq 10μL、引物P1 0.4μL、引物P2 0.4μL、P3 0.4μL、P40.4μL、P5 0.4μL、探针1 0.8μL、探针2 0.8μL，模板1 2μL、模板2 2μL，加RNase-Free ddH₂O至20μl。预变性：95℃30s；PCR反应：95℃5s，60℃30s，40个循环；降温50℃，1个循环，退火延伸时检测荧光信号。

实施例3重组质粒拷贝数计算以及标准品的制备

将上述质粒用核酸蛋白分析仪测定260nm与280nm波长下的OD值，判断其纯度(OD_260nm/OD_280nm>1.8者为纯品)，然后按照下面的公式转换成质粒的拷贝数：拷贝数＝质粒浓度×10^-9×6.02×10²³/(660×质粒总长度)；其中重组质粒1浓度为50ng/μl，总长度为4610bp，经计算拷贝数为9.89×10⁸拷贝/μL；重组质粒2浓度为50ng/ul，总长度为5913bp，经计算拷贝数为7.71×10⁸拷贝/μL。分别将标准品作10倍梯度稀释，-20℃保存备用。

实施例4实时荧光荧光定量PCR反应及标准曲线和回归方程的建立

分别10倍梯度稀释阳性重组质粒，获得浓度为9.89×10⁷拷贝/μL～9.89×10⁰拷贝/μL的标准模板1和7.71×10⁷拷贝/μL～7.71×10⁰拷贝/μL的标准模板2，采用优化好的条件进行PCR扩增，扩增结果使用

480II中Gene Scanning Software Version1.5软件的Abs Quant/2nd Derivative Max分析模式分析，结果各点在一直线上，采用最大二阶导数法(以Ct值作为纵坐标，以起始模板浓度的对数作为横坐标)制作两条标准曲线。得出拷贝数的对数值与Ct值之间的线性关系表达式Y1＝-3.362X1+42.473，R²＝0.9997；Y2＝-3.3411X2+41.236，R²＝0.9997。不同浓度的标准品之间具有良好的线性关系。其中X轴为质粒标准品拷贝数的对数值，Y轴为循环阂值，结果如图1和图2所示。

实施例5特异性实验

采用建立好的实时荧光定量PCR方法以IBRV、BPIV3、BVDV、BEFV、A型流感病毒、D型流感病毒、dH₂O为模板进行PCR检测，除了A型流感病毒和D型流感病毒外均为阴性，结果表明此次设计的引物只能特异性扩增A型流感病毒和D型流感病毒，说明所建立的实时荧光定量PCR方法具有很好的特异性，结果如图3和图4所示。

实施例6敏感性实验

将标准阳性质粒作10倍倍比稀释，直至无荧光信号出现，该荧光定量PCR方法所能检出的最低模板1拷贝数为9.89×10²拷贝/μL(见图5)、最低模板2拷贝数为7.71×10²拷贝/μL(见图6)。

实施例7重复性实验

选取质粒1：浓度为9.89×10²拷贝/μL～9.89×10⁴拷贝/μL的标准品分别做3个批内重复和批间重复，实时荧光定量PCR方法优化的最佳反应条件进行扩增，批内重复变异系数均小于0.02，批间重复变异系数均小于0.04(见表1)；

选取质粒2：浓度为7.71×10²拷贝/μL～7.71×10⁴拷贝/μL的标准品分别做3个内重复和批间重复，实时荧光定量PCR方法优化的最佳反应条件进行扩增，批内重复变异系数均小于0.02，批间重复变异系数均小于0.03(见表2)；

表1 A型流感实时荧光定量PCR批内与批间重复性试验

表2 D型流感实时荧光定量PCR批内与批间重复性试验

应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东省农业科学院家禽研究所（山东省无特定病原鸡研究中心）

<120> 一种同时检测A、D型流感病毒的成套试剂、试剂盒及其应用

<130>

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

agatgagtct tctaaccgag gtcg 24

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tgcaaaaaca tcttcaagty tctg 24

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tgcaaagaca ctttccagtc tctg 24

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gctgtttgca agttgatggg 20

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tgaaagcagg taactccaag g 21

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tcaggccccc tcaaagccga 20

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ttcaggcaag cacccgtagg att 23

Claims

1.一种成套试剂，其特征在于，所述成套试剂包括引物组和探针；

所述引物组由引物P1、P2、P3、P4和P5组成；

所述引物P1为如下(a1)或(a2)：

(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；

所述引物P2为如下(b1)或(b2)：

(b1)序列表的序列2所示的单链DNA分子；

所述引物P3为如下(c1)或(c2)：

(c1)序列表的序列3所示的单链DNA分子；

所述引物P4为如下(d1)或(d2)：

(d1)序列表的序列4所示的单链DNA分子；

所述引物P5为如下(e1)或(e2)：

(e1)序列表的序列5所示的单链DNA分子；

2.如权利要求1所述的成套试剂，其特征在于，所述探针包括探针1和探针2；

所述探针1为如下(f1)或(f2)：

(f1)序列表的序列6所示的单链DNA分子；

所述探针2为如下(g1)或(g2)：

(g1)序列表的序列7所示的单链DNA分子；

3.权利要求1或2所述成套试剂的用途为如下(A1)或(A2)：

(A1)鉴定或辅助鉴定A型流感病毒和/或D型流感病毒；

4.权利要求1或2所述成套试剂在制备试剂盒中的应用。

5.权利要求4所述试剂盒的用途为如下(A1)或(A2)：

(A1)鉴定或辅助鉴定A型流感病毒和/或D型流感病毒；

6.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述成套试剂；所述试剂盒的用途为如下(A1)或(A2)：

(A1)鉴定或辅助鉴定A型流感病毒和/或D型流感病毒；

7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性标准质粒。

8.一种鉴定或辅助鉴定A和/或D型流感病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：以待测病毒的cDNA为模板，采用权利要求1或2所述成套试剂和/或权利要求6或7所述试剂盒进行荧光定量PCR。

9.一种鉴定或辅助鉴定待测样本中是否含有A和/或D型流感病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：以待测样本的cDNA为模板，采用权利要求1或2所述成套试剂和/或权利要求6或7所述试剂盒进行荧光定量PCR。

10.如权利要求8或9所述方法，其特征在于，荧光定量PCR的反应程序包括：预变性：95℃30s；PCR反应：95℃5s，60℃30s，40个循环；50℃30s，1个循环。