CN111676323B - 一种检测鸡星状病毒的lamp引物组、试剂盒及检测方法和应用 - Google Patents
一种检测鸡星状病毒的lamp引物组、试剂盒及检测方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本申请公开了一种检测鸡星状病毒的LAMP引物组、试剂盒及检测方法和应用，引物组包括浓度比为16：1：8的外引物、内引物和环引物，其核苷酸序列依次为序列表中SEQ ID No.1‑6所示。试剂盒添加WarmStart LAMP变色预混液,65℃反应20分钟即可终止反应。本申请能够同时检测鸡Ⅰ型和鸡Ⅱ型星状病毒，可在20min钟内检测到10个拷贝的核酸，敏感性更高，特异性强，检测速度快，反应结果肉眼可识别。
Description
技术领域
本申请涉及分子生物学技术领域，具体而言，涉及一种检测鸡星状病毒的LAMP引物组、试剂盒及检测方法和应用。
背景技术
鸡星状病毒(Chicken astrovirus,CAstV)属于星状病毒科禽星状病毒属，鸡感染CAstV可引起肉鸡发育障碍综合征、雏鸡腹泻性肠炎、肾炎和蛋鸡产蛋率下降，并且该病毒可通过垂直传播的方式传染给鸡胚，给养鸡业造成一定的经济损失。我国各地鸡群中普遍感染CAstV，感染率达45％以上。CAstV的基因组全长约7kb左右，包含三个开放阅读框(ORF1a、ORF1b和ORF2)，5′端和3′端的两个非编码区(UTR)、33′端有一个Poly(A)尾。ORF1a和ORF1b分别编码的蛋白是丝氨酸蛋白酶和RNA依赖的RNA聚合酶，这两者均为非结构蛋白，而ORF2编码的是结构蛋白即病毒衣壳结构蛋白。目前针对CAstV的诊断检测方法常常采用3种方法：一种是基于酶联免疫吸附法(ELISA)；第二种是基于聚合酶链式反应的靶基因扩增方法，包括RT-PCR方法和荧光定量PCR方法；第三种是通过细胞或者鸡胚分离获得CAstV分离株。上述前两种方法均需要依赖专门的仪器，成本较高；第三种方法耗时较长，不能快速的及时的对CAstV的检测结果作出判断。
环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术是反应混合物在等温(60-65℃)条件下进行扩增，具有快速、简便和敏感的特性，该方法已在多种疾病的检测上得到应用。该方法与传统的检测方法(ELISA和PCR方法)相比，不需要昂贵的仪器，只需要一台能调节温度的水浴锅，并且具有操作简便和快速的特点。CN109055613A和CN108929919A分别公开一种鸡Ⅰ型与鸡Ⅱ型星状病毒环介导等温扩增检测引物组、试剂盒以及其检测方法，以上两种方法只能对鸡Ⅰ型和鸡Ⅱ型星状病毒分别进行检测，其检测方法所需的反应时间较长，为40min，且其检测灵敏度较低，最低检测限为135copy/μL；另外CN109055613A和CN108929919A的方法的结果判断需要在紫外线(350-370nm)照射装置下进行判定，无法实现肉眼检测。
发明内容
本发明提供了一种检测鸡星状病毒的LAMP引物组，包括外引物CAstV-F3和CAstV-B3、内引物CAstV-FIP和CAstV-BIP以及环引物CAstV-LF和CAstV-LB，外引物、内引物、环引物依次为序列表中SEQID No.1至SEQ ID No.6所示核苷酸序列，或为将序列表中SEQ IDNo.1至SEQ IDNo.6所示的核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中所示的核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列。本发明还提供一种检测鸡星状病毒的LAMP试剂盒,该试剂盒包括前述的引物组。
进一步的，试剂盒还包括WarmStart LAMP变色预混液，试剂盒中内引物、外引物和环引物的浓度比为16：1：8。
进一步的，试剂盒的每20ul反应体系中包括2μL cDNA模板，2×WarmStart LAMP变色预混液10μL，内引物CAstV-FIP和CAstV-BIP混合液32pmol，外引物CAstV-F3和CastV-B3混合液2pmol，环引物CAstV-LF和CAstV-LB混合液16pmol，余量为ddH2O。
本发明还提供一种检测鸡星状病毒的方法，采用前述的引物组或试剂盒进行环介导等温扩增反应，该方法不用于疾病的诊断和治疗。
进一步的，环介导等温扩增反应的反应过程包括65℃反应20分钟，80℃灭活5min。
本发明还提供一种前述的引物组、试剂盒、检测鸡星状病毒的方法在同时检测鸡Ⅰ型与鸡Ⅱ型星状病毒中的应用。
本发明的有益效果包括：本发明在引物设计时，在鸡Ⅰ型和鸡Ⅱ型星状病毒的ORF1a的保守区域设计出通用型的鸡星状病毒等温扩增引物套，能够同时检测鸡Ⅰ型和鸡Ⅱ型星状病毒；本发明除了设计鸡星状病毒等温扩增的内外套引物对外，另外设计了一对环引物，环引物的添加加快了等温扩增的反应速度，在最佳反应温度和引物浓度下，在20min钟内即可检测到10个拷贝的核酸，敏感性更高，特异性强，检测速度更快；本发明采用了商品化的LAMP变色预混液，其反应结束后根据反应产物的颜色变化通过肉眼即可判定结果，无需经过紫外线照射，检测方法更加便捷：该方法等温扩增反应结束后，反应产物颜色由原来的粉色变成黄色，说明结果为阳性，如反应产物未发生颜色变化，呈现原来的粉色，则判定结果为阴性。本发明的引物组、试剂盒及检测方法更方便在临床检测中运用。
附图说明
图1为不同LAMP反应温度下的实时浊度仪650nm监测副产物磷酸镁曲线图，其中，图A-D的反应温度分别为62,63,64和65℃，样品1为鸡星状病毒，2为阴性对照；
图2为LAMP特异性试验结果图，其中样品1为NDV cDNA,2为MDV DNA,3为REV cDNA,4为H7 cDNA,5为H9 cDNA,6为H5 cDNA,7为ALV-J cDNA,8为E coli DNA,9为CIAV DNA,10为FAdV-4DNA,11为AEV cDNA,12为IBV cDNA,13为IBDV cDNA,14为ARV cDNA,15为阳性CAstV对照，16为阴性对照；
图3为LAMP灵敏性试验结果图，其中图3A为实时浊度仪650nm监测副产物磷酸镁曲线图，图3B为反应结束后反应产物颜色变化结果图，样品1-6为105-100拷贝/μL模板标准品,样品7和8为阴性对照；
图4为LAMP临床检测结果图，其中样品1-14为临床样品，样品15为阳性CAstV对照，16为阴性对照。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行进一步说明和描述，但所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明和实施例中，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他发明和实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
其中，LAMP变色预混液购自New England Biolabs(NEB)公司；Loopamp LA-320C实时浊度仪购自荣研生物科技(中国)有限公司；EasyPure Viral DNA/RNA Kit为DNA/RNA共提试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司；反转录试剂盒和pMD-18T购自宝日医生物技术(北京)有限公司；NanoDrop2000核酸测定仪购自Thermo FisherScientific公司；多色荧光成像系统购自美国BIO-RAD公司。
禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)H5(Duck/HK/313/78)和H7亚型(Duck/HK/47/76)由香港大学惠赠；鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)AV6毒株购自中国兽药品检查所；禽脊髓脑炎病毒(Avian encephalomyelitis virus,AEV)AE1163由美国康乃狄格州州立大学惠赠；新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)GX6/02株、H9亚型AIV(Duck/Guangxi/1/00)、禽呼肠孤病毒(ARV)S1133株、禽网状内皮增生症病毒(Reticuloendotheliosis virus,REV)毒株2012001-1(登录号为KC453976)、禽传染性支气管病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)毒株GXIB/02、鸡马立克病病毒(Marek’sdisease virus,MDV)毒株2012006-1(登录号为KC453972)、禽4型腺病毒(fowl adenovirusgroup 4,FAdV-4)毒株FAdV-4-GX2018001、ALV-J亚群毒株2012004-C5(登录号为KC453974)、鸡传染性贫血病毒(CIAV)GXC060821毒株由广西兽医研究所保存；本实验所用临床样品来源于广西某规模化鸡场采集的咽喉拭子和泄殖腔拭子；CAstV阳性样品已经过本实验室普通PCR并测序鉴定，用于本试验中的CAstV阳性cDNA来源于临床样品。
下述实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
实施例1、引物组的设计
根据GenBank中CAstV的ORF1a基因的保守序列，利用MEGA 4.0和Primer ExplorerV4在线引物设计软件设计LAMP引物，外引物为CAstV-F3和CAstV-B3；内引物为CAstV-FIP和CAstV-BIP，内引物FIP＝F1c+F2，BIP＝B1c+B2；环引物为CAstV-LF和CAstV-LB。引物序列如表1所示，内引物和外引物序列由引物由华大基因生物科技(深圳)有限公司合成。
表1引物序列
CAstV的三个开放阅读框中，ORF1a和ORF1b相对保守，其中ORF1b基因最保守，而ORF2基因变异最大。目前用于检测鸡星状病毒的PCR、荧光定量PCR方法以及CN109055613A和CN108929919A中均以ORF1b为靶基因进行扩增。本研究从基于ORF1a、ORF1b和ORF2基因的保守区域设计了7套LAMP引物，从中只筛选得到一套能特异性扩增阳性CAstV cDNA的LAMP引物(即表1列出的针对ORF1a基因的LAMP引物套)，其余6套引物均未出现扩增。
实施例2、鸡星状病毒的LAMP检测方法的验证
1.RNA/DNA模板的提取
按照EasyPure Viral DNA/RNA Kit中的说明书提取不同病毒和临床样品的RNA和DNA,RNA病毒反转录成cDNA，将cDNA/DNA模板于-20℃保存备用。
2.阳性质粒标准品的制备
2.1鸡Ⅱ型星状病毒标准品的制备
分别使用外引物CAstV-F3和CAstV-B3以CAstV阳性cDNA为模板扩增截短的目的基因，目的片段大小分别是226bp，扩增后的PCR阳性产物连接到pMD-18T载体，构建重组质粒，提取阳性质粒，送公司测序，经测序鉴定为鸡Ⅱ型星状病毒，记为CAstV-Ⅱ。利用NanoDropND-2000紫外分光光度计测量CAstV的阳性重组质粒浓度，再根据分子量及浓度计算拷贝数。
2.2鸡Ⅰ型星状病毒的标准品的制备
参考GenBank上公布的鸡Ⅰ型星状病毒序列CAstV/Poland/G059/2014(登录号：KT886453)的ORF1a基因序列，并在ORF1a基因上位于第242-467个碱基的这部分区域进行截短，将该段截短基因送公司进行基因合成，使用外引物CAstV-F3和CAstV-B3以该截短基因作为模板进行PCR扩增，按照2.1中标准品制备的步骤制备鸡Ⅰ型星状病毒的标准品，记为CAstV-Ⅰ。利用NanoDrop ND-2000紫外分光光度计测量CAstV的阳性重组质粒浓度，再根据分子量及浓度计算拷贝数。
3.LAMP反应体系和反应条件的优化
2μL cDNA模板，WarmStart Colorimetric LAMP 2×Master Mix 10μL，内引物CAstV-FIP和CAstV-BIP混合液(工作浓度为16μmol/L)2μL，外引物CAstV-F3和CastV-B3混合液(工作浓度为2μmol/L)2μL，环引物CAstV-LF和CAstV-LB混合液(工作浓度为8μmol/L)各2μL，加ddH2O补足20μL。同时设立阴性对照，以无RNAase水作为模板加入到反应管中。将上述反应管置Loopamp LA-320C实时浊度仪内，调整反应温度(62℃、63℃、64℃和65℃)反应60min以确定最佳的反应温度，80℃灭活5min。
反应产物的结果判定根据LAMP变色预混液试剂盒说明书进行判定，LAMP反应产物颜色由粉色反应液变成黄色，说明结果为阳性，如未发生颜色未发生变化，则判定结果为阴性。目前大多数学者建立LAMP检测方法的判定结果主要是根据反应产物直接凝胶电泳观察梯形条带和扩增产物加入荧光显色剂显色两种方式进行判断，这两种方式均需要将打开反应管盖子后进行后续的操作，这就导致反应产物易形成气溶胶，导致实验环境受到污染，结果易造成假阳性，这对于结果的判定是非常不利的。CN109055613A和CN108929919A虽然在反应前加入了荧光试剂避免了开盖带来的污染，但是，其反应结果尚需在紫外灯下才能观察。本研究扩增结束后不需要进行电泳和加入荧光剂，减少了反应产物对实验室的污染，实验结果可通过产物的颜色反应作出判定，大大缩短的检测的时间。
如图1所示。当温度在65℃时，浊度仪曲线图的阴性对照无起峰并且最早进入指数增长期，因此，反应的最佳温度是65℃。
确定最佳反应温度后，按照内引物(CAstV-FIP/CAstV-BIP):外引物(CAstV-F3/CAstV-B3):环引物(CAstV-LF/CAstV-LB)不同比例的终浓度进行引物浓度优化，不同比例的引物终浓度(Xμmol/L)分别为1.6:0.1:0.8，1.6:0.15:0.8，1.6:0.2:0.8，2:0.1:0.8，2:0.15:0.8，2.4:0.2:0.8和2.4:0.25:0.8；按照最佳的反应温度进行反应后，确定引物的最佳浓度和比例。
内引物、外引物和环引物的最佳终浓度分别为1.6μmol/L、0.1μmol/L和0.8μmol/L。
根据CastV-LAMP的反应体系，将步骤2中制备好的CAstV-Ⅱ和CAstV-Ⅰ重组质粒按照计算出的拷贝数分别梯度稀释为104、103、102和101拷贝/μL，每个稀释度的质粒取2μL作为模板分别加入到反应管中，同时设立阴性对照，以无RNAase水作为模板加入到反应管中。将反应管分别按照20min、30min、40min和60min的反应时间进行反应后，80℃灭活5min。
CastV-LAMP反应体系中CAstV-Ⅱ和CAstV-Ⅰ不同稀释度的质粒模板均在反应时间20min内均获得阳性反应，即含有质粒浓度为104、103、102和101拷贝/μL的CastV-LAMP的反应体系的反应液均呈粉色，说明CastV-LAMP反应体系可最快在20min钟内完成LAMP的扩增。
4.特异性验证试验
使用步骤3中确定的最佳反应条件和最佳反应体系，以CAstV、AIV、IBDV、AEV、NDV、ARV、REV、IBV、MDV、FAdV-4、ALV-J、E coli和CIAV的cDNA或DNA为模板加入反应体系中，同时设立无RNAase水作为阴性对照，验证引物的特异性。
如图2所示，结果表明只有加入阳性CAstV cDNA的反应产物有颜色变化(由粉色变成黄色)。
5.灵敏度验证试验
将步骤2中制备好的CAstV-Ⅱ和CAstV-Ⅰ重组质粒按照计算出的拷贝数分别梯度稀释为105、104、103、102、101和100拷贝/μL。根据步骤3中确定的最佳反应条件和最佳反应体系，取梯度稀释的重组质粒2μL依次加入到反应管中，同时设立阴性对照，以无RNAase水作为模板加入到反应管中，混匀后放置到Loopamp LA-320C实时浊度仪反应，试验结束后肉眼观察反应产物颜色。
如图3A所示，实时浊度仪监测浊度结果显示CAstV-Ⅱ和CAstV-Ⅰ最低检出限度为101拷贝/μL。同时肉眼观察在实时浊度仪反应结束后的反应产物的颜色变化结果如图3B所示，图3B中样品1-5颜色呈黄色，样品6-8呈粉色，由此可以看出，CAstV最低检出限度也为101拷贝/μL，该结果与实时浊度仪的结果相符。
6.临床样品的检测试验
使用步骤3中确定的最佳反应条件和最佳反应体系，对14份临床样品进行检测。同时采用PCR方法进行检测结果验证，检测CAstV的单重PCR引物CAstV-F和CAstV-R的具体序列见SEQ ID NO.7-8。扩增片段大小为361bp；引物由华大基因生物科技(深圳)有限公司合成，该引物对用于检测CAstV，所得结果与本研究建立的LAMP检测CAstV的结果进行比较，验证本方法的可靠性。
如图4所示，结果显示两份CAstV阳性，分别是10号(弱阳性)和13号样品，其余样品均为阴性，将检测结果与本实验室检测CAstV的常用PCR方法进行比较，结果发现采用本发明的CAstV LAMP检测结果与CAstV的常用PCR检测结果相符。
序列表
<110> 广西壮族自治区兽医研究所
<120> 一种检测鸡星状病毒的LAMP引物组、试剂盒及检测方法和应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggtttcttct ttgctgagac 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
caatccgttg ttgragttct 20
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctgtgctgca agacaagttt ttcaacacca acttggtctc 40
<210> 4
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcgcctgaaa gcttcactaa ttttctcctt ggcctctc 38
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gtatagcaat cccagcatcc g 21
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gcacaaacag ctctttygtc ca 22
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gaycarcgaa tgcgragrtt g 21
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tcagtggaag tgggkartct ac 22
Claims (8)
1.一种检测鸡星状病毒的LAMP引物组，其特征在于，所述引物组包括外引物CAstV-F3和CAstV-B3、内引物CAstV-FIP和CAstV-BIP以及环引物CAstV-LF和CAstV-LB，所述外引物、内引物、环引物依次为SEQ ID No.1至SEQ ID No.6所示核苷酸序列。
2.一种检测鸡星状病毒的LAMP试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括权利要求1所述的引物组。
3.根据权利要求2所述的检测鸡星状病毒的LAMP试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括WarmStartLAMP变色预混液，和/或所述试剂盒中所述内引物、外引物和环引物的浓度比为16：1：8。
4.根据权利要求2或3所述的检测鸡星状病毒的LAMP试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的每20ul反应体系中包括2μLcDNA模板，2×WarmStartLAMP变色预混液10μL，内引物CAstV-FIP和CAstV-BIP混合液32pmol，外引物CAstV-F3和CastV-B3混合液2pmol，环引物CAstV-LF和CAstV-LB混合液16pmol，余量为ddH2O。
5.一种检测鸡星状病毒的方法，其特征在于，采用权利要求1所述的LAMP引物组、或权利要求2-4任一项所述的LAMP试剂盒进行环介导等温扩增反应，所述方法不用于疾病的诊断和治疗。
6.根据权利要求5所述的检测鸡星状病毒的方法，其特征在于，所述环介导等温扩增反应的反应过程包括65℃反应20分钟。
7.根据权利要求6所述的检测鸡星状病毒的方法，其特征在于，所述环介导等温扩增反应的反应过程还包括80℃灭活5min。
8.权利要求1所述的LAMP引物组、权利要求2-4任一项所述的LAMP试剂盒、或权利要求5-7任一项所述的检测鸡星状病毒的方法在同时检测鸡Ⅰ型与鸡Ⅱ型星状病毒中的应用，所述应用不包括疾病的诊断和治疗。
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