CN113388632B - 牛星状病毒elisa抗体检测的引物、试剂盒及应用 - Google Patents

牛星状病毒elisa抗体检测的引物、试剂盒及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供的牛星状病毒ELISA抗体检测的引物、试剂盒及其应用，试剂盒包括扩增BoAstV结构重组蛋白pET‑32a‑1‑12E1基因的引物、重组表达的BoAstV结构重组蛋白pET‑32a‑1‑12E1抗原包被的ELISA反应板、酶标试剂、封闭液、洗涤液、稀释液、阳性对照样品、阴性对照样品、显色液和终止液。以BoAstV结构重组蛋白pET‑32a‑1‑12E1作为ELISA包被抗原，成本低。本试剂盒具有使用方便快捷、敏感性高、特异性强等优点，为BoAstV抗体检测、流行病学调查为BoAstV净化带来了一种新的有效的检测手段。

Description

牛星状病毒ELISA抗体检测的引物、试剂盒及应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种牛星状病毒ELISA抗体检测的引物、试剂盒及应用。
背景技术
星状病毒(Astrovirus，AstV)是单股正链RNA病毒，可以引起各种动物的腹泻症状，属于星状病毒科小肠病毒属，其结构在电镜下显示呈五角或者六角的总状结构，其基因组拥有3个连续的开放阅读框(open reading frame，ORF)，从5’端到3’端依次是ORF1a、ORF1b和ORF2。此外，在基因组5’端和3’端各拥有1个非编码区(untranslated region，UTR)；5’UTR和3’UTR，在其3’末端有一条30bp的Poly(A)尾。星状病毒感染哺乳动物主要引起肠道病毒性腹泻和呕吐，在禽类动物体内还能引起肝炎。在国际病毒学分类大会报告中，将星状病毒分为33个哺乳基因型和7个禽类基因型。
1978年，在英国犊牛的排泄物中首次发现牛星状病毒(BoAstV)，1984年研究者发现BoAstV感染牛后可以引起牛回肠的细胞发生病变，粪便颜色由棕变黄还能加剧其他病毒感染如冠状病毒等，感染宿主时可引起剧烈腹泻症状。近年来研究发现，BoAstV感染可能引起脑炎和脑膜炎，使宿主发生严重的神经症状。
BoAstV的ORF2基因诱导编码的衣壳蛋白nsp2，是该病毒的主要抗原蛋白，ORF2是区分不同基因型的重要依据，同时也是星状病毒的抗原蛋白，nsp2的氨基酸序列的对比发现了两个明显差别的区域在1aa-380aa的氨基酸同源性比较高为编码衣壳蛋白的氨基酸序列的保守区，在380aa-400aa的氨基酸同源性比较低为编码衣壳蛋白的氨基酸序列的高变区。保守区主要构成衣壳蛋白的内在部分，用来保护RNA。所以这个区域推测为抗原区域。通过DNAstar软件对ORF2保守区氨基酸序列进行分析发现几处较高的抗原表位，对pET-32a-1-12E1进行重组表达建立间接ELISA检测方法。
当前国内对BoAstV的检测主要在逆转录聚合酶链式反应检测，实时荧光定量PCR检测，但太过繁琐效率不高对于临床上大量检测BoAstV带来了困扰，为此，本研究建立一种高效便捷灵敏性高的间接ELISA检测方法，为BoAstV的净化带来新的技术。
发明内容
根据现有技术中的不足，本发明提供一种牛星状病毒ELISA抗体检测的引物、试剂盒及应用，具体方案如下：
扩增BoAstV结构重组蛋白pET-32a-1-12E1基因的引物，包括特异性引物对，所述特异性引物对为序列表SEQ.ID.No.4和SEQ.ID.No.5的碱基序列。
所述的扩增BoAstV结构重组蛋白pET-32a-1-12E1基因的引物在RT-PCR扩增中的应用。
一种牛星状病毒ELISA抗体检测试剂盒，包括所述的扩增BoAstV结构重组蛋白pET-32a-1-12E1基因的引物。
进一步地，还包括重组表达的BoAstV结构重组蛋白pET-32a-1-12E1抗原包被的ELISA反应板、酶标试剂、封闭液、洗涤液、稀释液、阳性对照样品、阴性对照样品、显色液和终止液。
进一步地，所述BoAstV结构重组蛋白pET-32a-1-12E1重组表达基因的核苷酸序列如序列表SEQ.ID.No.1所示，编码的氨基酸序列如序列表SEQ.ID.No.2所示。
进一步地，所述BoAstV结构重组蛋白pET-32a-1-12E1重组表达的方法，包括如下步骤：
S1.利用序列表SEQ.ID.No.4和SEQ.ID.No.5碱基序列的特异性引物通过RT-PCR扩增BoAstV结构重组蛋白pET-32a-1-12E1基因；
S2.将步骤S1所得的基因融合到质粒载体中，获得重组质粒；
S3.将步骤S2所构建的重组质粒转化到宿主菌并诱导表达，获取菌液；
S4.筛选步骤S3中携带BoAstV结构重组蛋白pET-32a-1-12E1基因的重组菌，在IPTG诱导下大量表达与HIS融合的BoAstV结构重组蛋白pET-32a-1-12E1；
S5.利用HIS标签镍柱亲和层析柱纯化，获得提纯后的BoAstV结构重组蛋白pET-32a-1-12E1。
进一步地，步骤S2中所述的质粒载体为pET-32a，步骤S3中所述的宿主菌为大肠杆菌。
进一步地，所述重组表达的BoAstV结构重组蛋白pET-32a-1-12E1抗原包被的ELISA反应板的制备方法：将制备的BoAstV结构重组蛋白pET-32a-1-12E1的重组蛋白经BCA蛋白检测试剂盒测定浓度后，用包被液将其稀释到0.2ug/ml的量，按100ul/孔加入到ELISA反应板中，于37℃孵育3h即制备好ELISA反应板。
进一步地，所述BoAstV结构重组蛋白pET-32a-1-12E1抗原包被的ELISA反应板的包被液是PH9.6ELISA Coating Buffer，10×包被液，所述酶标试剂为辣根过氧化物酶标记的山羊抗牛IgG抗体，所述封闭液为5％脱脂奶粉PBST或5％BSA，所述洗涤液为0.05％Tween-2.0的PBST，所述稀释液为5％脱脂奶粉PBST，所述阳性对照样品为BoAstV阳性血清样品，所述阴性对照样品为BoAstV阴性血清样品，所述显色液为TMB底物显色试剂盒，所述终止液为2MH2SO4。
本发明的优点
本发明提供的牛星状病毒ELISA抗体检测的试剂盒，以BoAstV结构重组蛋白pET-32a-1-12E1作为ELISA包被抗原。由于非结构蛋白不参与病毒粒子的合成，以BoAstV结构重组蛋白pET-32a-1-12E1作为检测抗原对活毒感染更敏感。本试剂盒的使用具有方便快捷、敏感性高、特异性强等优点，为BoAstV的疾病的抗体检测，流行病学调查以及将来对BoAstV的净化提供了一种新的有效检测手段。
附图说明
图1为BoAstV结构重组蛋白pET-32a-1-12E1的表达。
图2为BoAstV结构重组蛋白pET-32a-1-12E1纯化Western blot图。
图3为BoAstV免疫印迹阳性血清Western blot图。
图4为BoAstV免疫印迹阴性血清Western blot图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步的解释说明，但需要注意的是，本具体实施例不用于限定本发明的权利范围。
一、制备本发明的一种牛星状病毒BoAstV结构重组蛋白pET-32a-1-12E1ELISA抗体检测试剂盒
1、所用到的主要试剂如下：
重组表达的BoAstV结构重组蛋白pET-32a-1-12E1和ELISA反应板；用样品稀释液稀释的IgG酶标抗体溶液、封闭液、洗涤液、样品稀释液、阳性对照样品、阴性对照样品、显色液和终止液。具体地，酶标抗体为辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗牛IgG抗体赛默飞世尔科技公司；显色液为TMB底物显色试剂盒；终止液为2MH2SO4；封闭液为含5％的脱脂奶粉的PBST溶液；牛血清蛋白(BSA)；洗涤液为含0.05％Tween-2.0的PBST溶液；样品稀释液为PBST溶液均购买自索莱宝(Solarbio)生物试剂公司；BCA蛋白定量试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司；阳性对照样品为BoAstV阳性血清；阴性对照样品为BoAstV阴性血清均由本实验室提供；
2、BoAstV结构重组蛋白pET-32a-1-12E1抗原制备
(1)用于扩增BoAstV结构重组蛋白pET-32a-1-12E1基因的特异性引物对如SEQ.ID.No.4和SEQ.ID.No.5所示的碱基序列：
(2)步骤(1)的BoAstV结构重组蛋白pET-32a-1-12E1的特异性引物对以BufAstV-GX-NN-ORF2-12DNA为模板，经RT-PCR方法扩增获得BoAstV结构重组蛋白pET-32a-1-12E1的基因，将其克隆到原核表达载体pET-32a中，转化大肠杆菌，筛选携带BoAstV结构重组蛋白pET-32a-1-12E1基因的重组菌，在IPTG诱导下大量表达与HIS融合的BoAstV结构重组蛋白pET-32a-1-12E1，利用HIS标签镍柱亲和层析柱纯化，获得高纯度的BoAstV结构重组蛋白pET-32a-1-12E1，并保存于-80℃备用。
BoAstV结构重组蛋白pET-32a-1-12E1的重组蛋白基因的核苷酸序列如序列表SEQ.ID.No.1所示。BoAstV结构重组蛋白pET-32a-1-12E1基因的氨基酸序列如SEQ.ID.No.2所示。
二、BoAstV结构重组蛋白pET-32a-1-12E1ELISA抗体检测试剂盒的使用方法包括如下步骤：
(1)BoAstV结构重组蛋白pET-32a-1-12E1ELISA抗原包被
将制备好的BoAstV结构重组蛋白pET-32a-1-12E1经BCA蛋白检测试剂盒测定浓度后，用包被液将其稀释到0.2ul/ml的量，按100ul/孔加入到ELISA反应板中，于37℃孵育3h，即制备好ELISA反应板；ELISA抗原以BoAstV结构重组蛋白pET-32a-1-12E1包被不同的浓度分别为0.1ug/ml、0.2ug/ml、0.4ug/ml、0.8ug/ml，抗原包被为37℃孵育3h，最佳抗原包被浓度0.4ug/ml，包被液为PH 9.6ELISA Coating Buffer，10×包被液。
(2)封闭：
将步骤(1)制备好的ELISA反应板，去掉包被液后，PBST洗涤3次每次3min，加入100ul/孔的封闭液，37℃孵育2h；其中封闭液为5％脱脂奶粉或5％BSA，封闭孵育时间1～3h，最佳封闭液为5％脱脂奶粉，封闭时间2h。
(3)一抗孵育：
加入100ul/孔用稀释液稀释好的1:100的待检血清，同时设置阳性和阴性血清对照、孵育，PBST洗涤3次每次3min；其中，待检血清的稀释浓度为1：50～1:800，一抗在37℃孵育30min～2h，最佳血清稀释浓度1:100，一抗最佳孵育时间37℃孵育1h30min，其中稀释液为PBST。
(4)二抗孵育：
加入100ul/孔用稀释液以1:5000稀释的HRP标记的山羊抗牛IgG二抗孵育，PBST洗板3次。二抗稀释倍数为1:5000～1:20000，二抗在37℃孵育30min～2h，最佳酶标板中二抗稀释度为1:10000，最佳二抗孵育时间为37℃30min。
(5)显色：
以加入100ul/孔显色剂96孔酶标板反应中，避光室温显色，显色剂为TMB底物显色液，显色5～15min，最佳显色时间为5min。
(6)终止：
加入50ul/孔2MH2SO4终止液。
(7)结果判定：
采用酶标仪测OD450nm处吸光值判定标准为：对样品OD450nm值≥0.270时为BoAstV阳性，反之为BoAstV阴性。
上述的试剂盒应用于检测牛感染星状病毒后诱导产生的传染性星状病毒特异性抗体。实例1BoAstV结构重组蛋白pET-32a-1-12E1抗原的制备
将携带有BoAstV结构重组蛋白pET-32a-1-12E1载体表达宿主菌BL21(DE3)经LB液体培养基活化，按1:100转接与含氨苄青霉素抗性的LB液体培养基中大量培养扩繁，当菌液的OD600nm达0.4～0.6时加入终浓度为1mM的IPTG诱导表达6h后，4℃7500rpm离心10min收集菌液，使用镍柱亲和层析柱，按照产品手册纯化目的蛋白。洗脱后获得的蛋白取样进行SDS-PAGE分析。如图2所示，纯化的BoAstV结构重组蛋白pET-32a-1-12E1分子量大小为79Kd，具有很高的纯度。纯化的BoAstV结构重组蛋白pET-32a-1-12E1保存在-80℃备用。
实例2阴阳血清的筛选
本试剂盒使用到的阴性与阳性血清是通过实例1纯化得到的BoAstV结构重组蛋白pET-32a-1-12E1作为抗原以免疫印迹的方式筛选出来的步骤：取40ul蛋白上清10uL5×Loading buffer混匀，沸水浴锅中煮10min，取10ul进行SDS-PAGE电泳，根据蛋白条带大小剪取大小合适的PVDF膜，进行转膜，转膜完后使用现配的TBST洗涤，5％脱脂奶粉37℃下封闭2h，TBST洗涤三次，每次5min，一抗待检血清用5％脱脂奶粉1:500稀释，4℃过夜，PBST洗涤三次，每次5min，HRP-山羊抗牛lgG(H+L)用PBST1：2000稀释，37℃下孵育1h，TBST洗涤三次，每次10min。使用现配的DAB工作液显色30s，使用Western blot蛋白印迹成像仪进行拍照，如图3和4所示。
实例3BoAstV结构重组蛋白pET-32a-1-12E1 ELISA抗体检测方法优化
1.BoAstV结构重组蛋白pET-32a-1-12E1 ELISA方法的步骤
(1)包被：用ELISA包被液将抗原稀释至工作浓度，按100ul/孔包被酶标板，37℃包被3h，PBST溶液洗涤3次，每次3min；
(2)封闭：以100ul/孔的量加入封闭液，37℃封闭2h，PBST洗板3次，每次3min；
(3)一抗孵育：以100ul/孔的量加入稀释好的待检血清，37℃孵育2h，PBST洗板3次，每次3min；
(4)二抗孵育：以100ul/孔的量加入稀释好的HRP标记的山羊抗牛IgG，37℃孵育1h，PBST洗板3次，每次3min；
(5)显色：以100ul/孔的量加入TMB底物，室温中避光10min；
(6)终止：以100ul/孔的量加入50ul/孔2MH2SO4终止液终止反应；
(7)读数：使用酶标仪测定各孔在OD450nm处吸光值；
(8)判定结果。
以上述的基本程序为基础，对BoAstV结构重组蛋白pET-32a-1-12E1 ELISA的反应条件进行优化。
2.BoAstV结构重组蛋白pET-32a-1-12E1ELISA反应条件的优化
(1)抗原及血清的最佳工作浓度确定
根据BoAstV结构重组蛋白pET-32a-1-12E1抗原包被的浓度依次用ELISA包被液将蛋白稀释为0.1ug/ml、0.1ug/ml、0.2ug/ml、0.4ug/ml、0.8ug/ml，每孔100ul包被ELISA反应板，37℃包被3h。在ELISA反应板上采用方阵法优化，将阳性与阴性血清以1:50、1:100、1:200、1:400、1:800稀释。ELISA反应后测定OD450nm值，选取P/N值(P为阳性血清，N为阴性血清)最大值为最佳浓度。经分析，当ELISA抗原包被浓度0.4ug/ml，血清稀释度为1:100，P/N值最大，为最佳包被浓度与一抗稀释度。如表1所示：
表1：
Figure GDA0003620626460000061
(2)酶标抗体工作浓度的选择
在确定的最佳ELISA抗原包被浓度和血清稀释度倍数基础上，将酶标二抗分别最1:5000、1:10000、1:15000、1:20000稀释，进行ELISA检测，选择P/N值最大的酶标抗体稀释倍数为最佳工作浓度，经分析，当酶标抗体的稀释倍数为1:10000时，P/N值最大，为最佳二抗稀释浓度，如表2所示。
表2：
Figure GDA0003620626460000071
(3)封闭液与封闭时间的选择
分别用5％BSA、5％脱脂奶粉作为封闭液，以1h、1.5h、2h、2.5h、3h封闭时间，进行ELISA检测，选择P/N最大值，经分析，封闭液5％脱脂奶粉，2h为最佳封闭液与封闭时间，如表3所示。
表3：
Figure GDA0003620626460000072
(4)包被时间的选择
分别以4℃过夜、37℃1h、37℃2h、37℃3h、37℃4h进行BoAstV结构重组蛋白pET-32a-1-12E1不同蛋白抗原包被时间，经过ELISA OD450nm测定P/N最大值为37℃3h，由此得出37℃3h为最佳包被时间，如表4所示。
表4：
Figure GDA0003620626460000073
(5)一抗反应时间的选择
加入稀释后的一抗，分别0.5h、1h、1.5h、2h进行ELISA OD450nm测定，选择P/N最大值，经过分析，待检血清1h30min为最佳一抗反应时间，如表5所示。
表5：
Figure GDA0003620626460000081
(6)酶标二抗反应时间的选择
加入稀释后的酶标抗体后，分别0.5h、1h、1.5h、2h进行ELISA OD450nm测定，选择P/N最大值，经过分析，待检血清30min为最佳酶标二抗反应时间，如表6所示。
表6：
Figure GDA0003620626460000082
(7)TMB底物反应时间的选择
加入显色液后分别在室温下孵育5min、10min、15min之后加入50ul/孔的2MH2SO4终止，选定P/N最大对应的OD450nm的TMB底物反应时间，经过结果分析，最佳底物反应时间为5min，如表7所示。
表7
Figure GDA0003620626460000083
因此，最终确定的最佳反应条件为：ELISA抗原包被浓度为0.4ug/ml，待检血清稀释倍数为1:100，酶标二抗稀释倍数为1:10000,封闭液选择5％脱脂奶粉，一抗待检血清与酶标二抗稀释液为PBST，包被时间为37℃3h，封闭时间为37℃2h，一抗待检血清孵育时间37℃1h30min，酶标二抗孵育时间为30min，底物TMB反应时间室温下5min，终止液2MH2SO4终止。
实例4临界值的确定
选取8份阴性血清，用优化好的ELISA反应体系检测血清抗体OD450nm值，对结果进行统计学分析，得出OD450nm的平均值(X)和标准差(S)，以此作为ELISA方法阴阳性血清的判定标准临界值的确定，如表8所示。
表8
Figure GDA0003620626460000091
经过计算，以上8分阴性血清平均值X＝0.169，标准差S＝0.034，ELISA阴阳临界值＝X+3S＝0.270，所以OD450nm值0.270为BoAstV阳性血清与阴性血清的临界值。
实例5敏感性试验
应用建立好的ELISA体系对不同稀释倍数的BoAstV阳性血清进行检测，结果如表9所示，ELISA检测BoAstV结构重组蛋白pET-32a-1-12E11:6400倍数时阳性血清的OD450nm值为0.276，结果呈阳性，即ELISA检测阳性血清的最低检出效价为1:6400，建立ELISA检测方法具有很好的敏感性，如表9所示。
表9
Figure GDA0003620626460000092
实例6重复性试验
选取8份BoAstV阳性与阴性抗体水平不同的血清样品分别对其进行批内重复试验和批间重复试验，每个样品检测3次，结果如表10所示，8份BoAstV抗体水平不同血清样品，BoAstV结构重组蛋白pET-32a-1-12E1重组蛋白批内重复试验的变异系数在7.24％-3.02％之间，批间重复试验的变异系数在5.48％-0.89之间由此可知，批内重复试验和批间重复试验的变异系数均小于10％，ELISA检测方法具有很好的重复性，如表10所示。
表10：
Figure GDA0003620626460000101
实例7符合性试验
选取16份已知牛星状病毒阴阳性血清实验室检测，用建立的ELISA方法去检测，经测定OD450nm值发现，8份阳性全为阳性，8份阴性全为阴性，结合统计学知识，计算符合率为100％，如表11所示。
表11：
Figure GDA0003620626460000102
实例8临床应用
用建立好的ELISA检测方法BoAstV结构重组蛋白pET-32a-1-12E1抗原包被浓度为0.4ug/ml，待检血清稀释倍数为1:100，酶标二抗稀释倍数为1:10000,封闭液选择5％脱脂奶粉，一抗待检血清与酶标二抗稀释液为PBST，包被时间为37℃3h，封闭时间为37℃2h，一抗待检血清孵育时间37℃1h30min，酶标二抗孵育时间为30min，底物TMB反应时间室温下5min，终止液2MH2SO4终止。对2019-2020年广西省部分地区采集的712份黄牛与水牛血清，进行BoAstV抗体的检测，结果如表12所示，共检出151份抗体阳性血清，BoAstV抗体阳性率为21％。由此可证明，建立的ELISA检测方法在临床上有很好的实用性，如表12所示。
表12
Figure GDA0003620626460000111
序列表
<110> 广西大学
<120> 牛星状病毒ELISA抗体检测的引物、试剂盒及应用
<130> LWY2021043
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1110
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgagcggccg gtgccccagt tctccgcaac ggtggagtga tttttgatgt ctatgagtca 60
atccagaatg cacgcgctgg cgttccttgc ctcacaactg tccagggagg ccgctgggag 120
gtgggtaagc tccactacac gcagctcaca ccaggcaacg ttggcataga ggaaactcca 180
cctgtccaga gggccataca aaccttgcca tcaaccacct atgtcatctc agccaagcgc 240
tataagttca atgggaacga ccttgtccca tccttcccgg tgttttacca ccctcacact 300
ggagaacaga attttacaac tggcattggc ttcaaagctg atggagagaa ggttccgacg 360
tataacatca tcgaagttga gattgccaat aacgtcggtg acatcaatcc tgacctgtac 420
ctgaacaagc tccccatcta ccttttctat gggagtaacc aggagaaact gatggggttt 480
gctgtggcca gcgagtatga tacgcagtcc gataactcgc tccgttacac tgtgtacacc 540
ttgctcgtgt acgctactac cactgacagg tacaatttct cccagcgctg gaagggcact 600
aagattatct acccagttga cgaccagtac cgcaccaaga ttgagtctcc tgatagcggg 660
actgagggcc atattaggtt tgagatggtc gctggccgct ggtatctcat tcaatatatg 720
tacaccggta acgccgaccg ctattatgtg gtcggtgatg accgtgtggc ccagcacgcc 780
agtgatctca ttcgtcctgg ctctattact attccaacac gtatccagga tgccaacaag 840
gccctcatca atgtatatgg tgctggcttg cacctccgca ccctcacctc tggtgaggcg 900
aatgtggagc gccaggtgct tggcgcagaa ggtggcgaca tcgatgccca actggacacc 960
ctctccttgg atgatgagga ttctgatttg gagatggaac ctgaggatca ctatagtgat 1020
ccaccccttt ctcgcctgca cgttaggcca gcggtcgagg acatctacaa gatggtcctg 1080
gatcgcggtg gcactgagcg tcaggcccgg 1110
<210> 2
<211> 370
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Arg Ala Ala Gly Ala Pro Val Leu Arg Asn Gly Gly Val Ile Phe Asp
1 5 10 15
Val Tyr Glu Ser Ile Gln Asn Ala Arg Ala Gly Val Pro Cys Leu Thr
20 25 30
Thr Val Gln Gly Gly Arg Trp Glu Val Gly Lys Leu His Tyr Thr Gln
35 40 45
Leu Thr Pro Gly Asn Val Gly Ile Glu Glu Thr Pro Pro Val Gln Arg
50 55 60
Ala Ile Gln Thr Leu Pro Ser Thr Thr Tyr Val Ile Ser Ala Lys Arg
65 70 75 80
Tyr Lys Phe Asn Gly Asn Asp Leu Val Pro Ser Phe Pro Val Phe Tyr
85 90 95
His Pro His Thr Gly Glu Gln Asn Phe Thr Thr Gly Ile Gly Phe Lys
100 105 110
Ala Asp Gly Glu Lys Val Pro Thr Tyr Asn Ile Ile Glu Val Glu Ile
115 120 125
Ala Asn Asn Val Gly Asp Ile Asn Pro Asp Leu Tyr Leu Asn Lys Leu
130 135 140
Pro Ile Tyr Leu Phe Tyr Gly Ser Asn Gln Glu Lys Leu Met Gly Phe
145 150 155 160
Ala Val Ala Ser Glu Tyr Asp Thr Gln Ser Asp Asn Ser Leu Arg Tyr
165 170 175
Thr Val Tyr Thr Leu Leu Val Tyr Ala Thr Thr Thr Asp Arg Tyr Asn
180 185 190
Phe Ser Gln Arg Trp Lys Gly Thr Lys Ile Ile Tyr Pro Val Asp Asp
195 200 205
Gln Tyr Arg Thr Lys Ile Glu Ser Pro Asp Ser Gly Thr Glu Gly His
210 215 220
Ile Arg Phe Glu Met Val Ala Gly Arg Trp Tyr Leu Ile Gln Tyr Met
225 230 235 240
Tyr Thr Gly Asn Ala Asp Arg Tyr Tyr Val Val Gly Asp Asp Arg Val
245 250 255
Ala Gln His Ala Ser Asp Leu Ile Arg Pro Gly Ser Ile Thr Ile Pro
260 265 270
Thr Arg Ile Gln Asp Ala Asn Lys Ala Leu Ile Asn Val Tyr Gly Ala
275 280 285
Gly Leu His Leu Arg Thr Leu Thr Ser Gly Glu Ala Asn Val Glu Arg
290 295 300
Gln Val Leu Gly Ala Glu Gly Gly Asp Ile Asp Ala Gln Leu Asp Thr
305 310 315 320
Leu Ser Leu Asp Asp Glu Asp Ser Asp Leu Glu Met Glu Pro Glu Asp
325 330 335
His Tyr Ser Asp Pro Pro Leu Ser Arg Leu His Val Arg Pro Ala Val
340 345 350
Glu Asp Ile Tyr Lys Met Val Leu Asp Arg Gly Gly Thr Glu Arg Gln
355 360 365
Ala Arg
370
<210> 4
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gccatggctg atatcggatc ccgagcggcc ggtgcccca 39
<210> 5
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ttgtcgacgg agctcgaatt cccgggcctg acgctcagt 39

Claims (8)

1.扩增BoAstV结构重组蛋白pET-32a-1-12E1基因的引物，其特征在于，包括特异性引物对，所述特异性引物对为序列表SEQ.ID.No.4和SEQ.ID.No.5的碱基序列。
2.权利要求1所述的扩增BoAstV结构重组蛋白pET-32a-1-12E1基因的引物在RT-PCR扩增中的应用。
3.一种牛星状病毒（Astrovirus）ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的扩增BoAstV结构重组蛋白pET-32a-1-12E1基因的引物。
4.根据权利要求3所述的牛星状病毒ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，还包括重组表达的BoAstV结构重组蛋白pET-32a-1-12E1抗原包被的ELISA反应板、酶标试剂、封闭液、洗涤液、稀释液、阳性对照样品、阴性对照样品、显色液和终止液，所述BoAstV结构重组蛋白pET-32a-1-12E1的基因核苷酸序列如序列表SEQ.ID.No.1所示，氨基酸序列如序列表SEQ.ID.No.2所示。
5.根据权利要求4所述的牛星状病毒ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，所述重组表达的BoAstV结构重组蛋白pET-32a-1-12E1抗原包被的ELISA反应板的制备方法：将制备的BoAstV结构重组蛋白pET-32a-1-12E1经BCA蛋白检测试剂盒测定浓度后，用包被液将其稀释到0.2ug/ml的量，按100ul/孔加入到ELISA反应板中，于37℃孵育3h即制备好ELISA反应板。
6.根据权利要求4所述的牛星状病毒ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，所述ELISA反应板的包被液是PH9.6ELISA Coating Buffer，10×包被液，所述酶标试剂为辣根过氧化物酶标记的山羊抗牛IgG抗体，所述封闭液为5%脱脂奶粉PBST或5%BSA，所述洗涤液为0.05%Tween-2.0的PBST，所述稀释液为5%脱脂奶粉PBST，所述阳性对照样品为BoAstV 阳性血清样品，所述阴性对照样品为BoAstV 阴性血清样品，所述显色液为TMB底物显色试剂盒，所述终止液为2MH2SO4。
7.一种BoAstV结构重组蛋白pET-32a-1-12E1重组表达的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.利用序列表SEQ.ID.No.4和SEQ.ID.No.5碱基序列的特异性引物通过RT-PCR扩增BoAstV结构重组蛋白pET-32a-1-12E1基因；
S2.将步骤S1所得的基因融合到质粒载体中，获得重组质粒；
S3.将步骤S2所构建的重组质粒转化到宿主菌并诱导表达，获取菌液；
S4.筛选步骤S3中携带BoAstV结构重组蛋白pET-32a-1-12E1基因的重组菌，在IPTG诱导下大量表达与HIS融合的BoAstV结构重组蛋白pET-32a-1-12E1；
S5.利用HIS标签镍柱亲和层析柱纯化，获得提纯后的BoAstV结构重组蛋白pET-32a-1-12E1。
8.根据权利要求7所述的BoAstV结构重组蛋白pET-32a-1-12E1重组表达的方法，其特征在于，步骤S2中所述的质粒载体为pET-32a，步骤S3中所述的宿主菌为大肠杆菌（Escherichia coli ）。
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