CN101985664A

CN101985664A - 检测a型流感病毒的核苷酸序列和试剂盒

Info

Publication number: CN101985664A
Application number: CN 201010526980
Authority: CN
Inventors: 张鹤晓; 高志强; 乔彩霞; 蒲静; 谷强; 张伟; 刘环; 张利峰; 汪琳; 柏亚铎; 张向东
Original assignee: Beijing Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau of Peoples Republic of China
Current assignee: Beijing Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau of Peoples Republic of China
Priority date: 2010-11-01
Filing date: 2010-11-01
Publication date: 2011-03-16
Anticipated expiration: 2030-11-01
Also published as: CN101985664B

Abstract

本发明公开了一组检测A型流感病毒的核苷酸序列和试剂盒。该检测A型流感病毒的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：3，其中序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2分别为检测A型流感病毒M基因的正义引物和反义引物，序列SEQ IDNO：3为检测A型流感病毒M基因的LNA修饰的荧光探针。本发明进一步公开了含有上述引物和探针的检测A型流感病毒的试剂盒。本发明所述的试剂盒具有快速、灵敏、特异、通用性好、重复性好及不易污染的特点。

Description

检测A型流感病毒的核苷酸序列和试剂盒

技术领域

本发明涉及检测A型流感病毒的核苷酸序列和试剂盒，尤指快速的基于LNA修饰的短探针荧光RT-PCR检测A型流感病毒的通用核苷酸序列和试剂盒，不仅适用于不同动物组织样本中A型流感病毒的准确检测，还可适用于不同动物活体样本(主要为拭子样品)的A型流感病毒的检测，可用于动物A型流感病毒的筛查，出入境检疫等，属于检验检疫领域。

背景技术

流感病毒(Influenza Virus)属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)，国际病毒分类委员会(ICTV)1995年发布的第六次分类报告，将正粘病毒科原来的1个属(流感病毒属)分为3个属，即A、B型流感病毒属(Influenza Virus A，B)和C型流感病毒属(Influenza Virus C)。其中B型和C型流感病毒能引起人的感染，但流行规模很小。A型流感病毒感染范围很广，能引起人和动物的大流行。其中动物流感几乎均由A型流感病毒引起。

A型流感常以流行的形式出现，发病快，传播蔓延非常迅速，危害巨大。历史上多次发生A型流感病毒大流行，席卷全世界，1918年发生的A型流感大流行导致死于流感的人数甚至超过第一次世界大战死亡的人数。

动物A型流感主要包括禽流感，猪流感，马流感以及其他动物的流感。近二十年来，由于世界各地动物流感的暴发频率越来越高、流行面积越来越广，因而导致全球对它的高度关注，虽然各国对动物流感防制策略不尽相同，但都把动物流感的快速诊断和及时监测作为首要步骤。在国际贸易中，对动物流感的检疫也成为各国进出口贸易的重点检测对象。动物流感检测方法包括传统动物流感检测方法和分子生物学检测方法。传统动物流感检测方法主要有病毒分离培养和血清学诊断(如琼脂扩散实验、酶联免疫吸附实验、间接血凝抑制实验及病毒中和试验等)，传统的动物流感检测方法不足之处在于操作繁琐、诊断时间长、结果重复性不好等。特别是动物流感宿主和血清型众多，且新的变异株不断出现，而制备血清型特异性单克隆抗体相对困难，近来研究发现，用鸡胚分离和培养的流感病毒常出现宿主介导变异，所有这些都限制了传统方法在实际中的应用。

目前新型的核酸扩增检测方法发展快速，由于其简便快捷，结果准确，已经在临床检疫中广泛应用，取得了良好的效果，目前已有替代传统检测方法的趋势。

尽管A型流感病毒M基因相对保守，但不同毒株特别是来源于不同感染宿主的A型流感病毒，在M基因序列上存在明显差异。近期，锁核酸(locked nucleic acid，LNA)作为一种新颖的核苷酸衍生物在生物学研究领域引起了人们的广泛关注，它是一种特殊的双环状核苷酸衍生物，结构中含有一个或多个2′-O，4′-C-亚甲基-β-D-呋喃核糖核酸单体，核糖的2′-O位和4′-C位通过不同的缩水作用形成氧亚甲基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基桥，并连接成环形，这个环形桥锁定了呋喃糖C3′-内型的N构型，降低了核糖结构的柔韧性，增加了磷酸盐骨架局部结构的稳定性。对DNA、RNA有很好的识别能力和强大的亲和力。LNA和DNA、RNA互补的双链有很强的热稳定性(ΔTm＝3～8℃)，具有抗3′脱氧核苷酸酶降解的稳定性，合成方法相对简单，部分或完全修饰的LNA寡核酸链可用氨基磷酸法在DNA自动合成仪上合成。本研究为保证方法的通用性，保证探针的匹配性，我们在大量序列分析基础上，在国内首次设计LNA修饰的短探针用于检测A型流感病毒，缩短了探针的核苷酸数量，并提高了方法的灵敏度。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一组特异性强、灵敏度高的检测A型流感病毒核苷酸序列，包括引物序列和基于LNA修饰的短探针序列。

本发明的另一个目的是提供快速、准确、使用方便的基于LNA修饰的检测A型流感病毒的通用检测试剂盒。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

选择A型流感病毒M基因编码区特定序列作为靶区域，在多重序列比对的基础上，进行引物和探针设计。引物长度为20个碱基左右，GC含量为50％-60％，引物内无二级结构和重复性，引物间和引物内无互补序列，引物间的熔解温度(Tm值)相差小于5℃。探针的长度在12～14个碱基左右，采用LNA修饰，并标记荧光基团。

一组检测A型流感病毒的通用核苷酸序列，如下：

1)5’-CCRATC YTG TCA CCT CTGACTAA-3′(SEQ ID NO：1)

2)5’-CGT CTA CGC TGC AGT CCT C-3’(SEQ ID NO：2)

Y代表嘧啶，此处为T或C；R代表嘌呤，此处为A或G；

3)5’-[FAM]-CAC

[TAMRA或BHQ1]-3’(SEQ ID NO：3)

其中序列1)和2)分别为检测A型流感病毒M基因的正义引物和反义引物，序列3)为检测A型流感病毒M基因的LNA修饰的荧光短探针，用斜体表示的碱基用LNA进行修饰，即第4、7、10、13位的碱基用LNA进行修饰，探针的5’端标记报告荧光基团FAM(6-carboxy-荧光素)，3’端标记淬灭基团TAMRA或BHQ1。

我们采用TaqMan荧光RT-PCR检测技术建立了A型流感病毒通用检测方法，对反应的各种条件进行了优化，其中包括引物探针的筛选，Mg²⁺使用浓度的优化，引物探针浓度的优化，得到以下试剂盒。

检测A型流感病毒LNA修饰短探针检测试剂盒，由以下组分组成：

1)裂解液：购自INVITROGEN公司，按15ml/瓶进行分装，2瓶/盒。

2)RT-PCR反应液，表1为反应液配方。

表1RT-PCR反应液配方

组分	终浓度
		5×RT-缓冲液	0.5×RT-缓冲液
10×PCR缓冲液	0.5×PCR缓冲液

25mM MgCl₂	1.5mmol/L MgCl₂
		2.5mM dNTP	0.2mmol/L dNTP
正义引物	0.5μmol/L
		反义引物	0.5μmol/L
A型通用LNA短探针	0.3μmol/L

10×PCR缓冲液、25mM MgCl2购于Promega公司；5×RT-缓冲液，2.5mM dNTP购自大连宝生物生物工程有限公司，引物和探针均委托大连宝生物生物工程有限公司合成，其中10×PCR缓冲液的组成为：500mmol/L KCl、100mmol/L Tris-HCl(pH9.0，25℃)、1.0％Triton X-100。5×RT-缓冲液组成为375mmol/L KCl、15mmol/L MgCl₂、50mmol/L DTT、250mmol/L Tris-HCl(pH8.3，25℃)。

3)RT-PCR酶颗粒，购自AMERCIA公司，12粒/盒。

4)Taq DNA聚合酶5U/μL，购自Promega公司。

5)DEPC水，用自来水两次蒸馏，经过Millipore MILLI-Q PF PLUS纯水仪纯化，收取电阻率≥18.0MΩ.cm的水，Millipore-Q纯化水加入DEPC至终浓度为0.1％，37℃搅拌处理12hr，15lbf/in2(1.034×105Pa)高压蒸汽灭菌15分钟。

6)阴性对照：流感病毒阴性组织样品，用0.01mol/L pH7.2PBS缓冲盐水制成20％悬液，70℃作用1小时。

7)阳性对照：为体外转录的非感染性RNA片段。回收A型流感病毒A/Swine/2003(H1N1)M基因RT-PCR扩增产物，长度为982bp，与pGEM-T载体(购自Promega公司)进行连接，转化JM109感受态细胞，碱裂解法提取质粒DNA，经PCR和酶切鉴定后获得阳性重组质粒，命名为pGEM-A-M。以纯化的质粒为模板，将质粒线性化之后，用Promega公司的Ribo MAXTM Large Scale RNA Production System-T7试剂盒进行体外转录；将体外转录产物用DNase除去其中的DNA模板后经TRIZOL提取后进行测定后，即得到制备A型流感病毒阳性对照品所需的RNA阳性对照品母液。

A型流感病毒A/Swine/2003(H1N1)982bp M目的片段基因序列具有序列表SEQ IDNO：4所示的核苷酸序列。

对合成的引物和探针做HPLC分析，如得到单吸收峰图谱、而且用紫外分光光度计测定OD260nm/OD280nm的比值在1.6-2.0之间，即视为合格引物。从1∶104稀释的A/Swine/2003(H1N1)鸡胚培养物中提取的RNA为模板进行扩增，结果显示本发明提供的引物对与探针配合使用，扩增的Ct值相对较低，且升幅较高。

将筛选好的引物浓度从0.1μmol/L至0.8μmol/L以0.1μmol/L为间距递增，探针浓度从0.025μmol/L至0.2μmol/L以0.025μmol/L递增。对引物和探针不同浓度的配比进行了比较，从多次重复试验中发现：采用表1所列引物浓度和探针浓度时荧光增幅相对较高。

我们针对Roche Light Cycler2.0，Roche480以及ABI 7900HT荧光PCR检测仪，在42℃/30min，94℃/3min的逆转录后，对该实验中对变性温度和时间、退火和延伸温度及时间进行了优化实验。扩增时，采用循环次数分别为40、45和50，比较扩增结果的Ct值，进而确定扩增的循环次数为40。最终确定采用扩增效果较好的方案为RT-PCR反应参数：反应条件为：94℃/15s，55℃/5s，60℃/35s，40个循环；每次循环的退火延伸时收集荧光。

研究表明，Mg²⁺浓度对荧光PCR扩增结果有一定影响，故应用筛选好的引物探针，将Mg²⁺的浓度从1.5mmol/L至6.0mmol/L以0.5mmol/L为间距递增，对不同Mg²⁺浓度条件下的扩增进行了比较。优化后的Mg²⁺浓度为见表1。

我们选择Promega公司生产的Taq酶，一单位的定义：74℃作用30分钟，能将10nM的dNTPs掺入酸溶性物质中所需要的酶量。活性要求：具DNA聚合酶活性及5’→3’核酸外切酶活性，无3’→5’核酸外切酶活性及核酸内切酶活性；具热稳定性，94℃1小时后仍保持50％活性。从多次重复试验结果中选定1.25U Taq酶作为使用的Taq酶量。

本发明所述检测A型流感病毒的检测试剂盒的使用方法：

1)样品处理：对于组织样品，用无菌的剪刀和镊子剪取待检样品1.0g于研钵中充分研磨，再加5mL PBS混匀，然后将组织悬液转入无菌Eppendorf管中，编号备用。对于液体样本，用无菌注射器直接吸取至无菌Eppendorf管中，编号备用。采集或处理的样本在2℃～8℃条件下保存应不超过24h；若需长期保存，须放置-70℃冰箱，但应避免反复冻融(最多冻融2次)。采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，尽快运送到实验室。

2)RNA的提取：在样本处理区进行。

取n个1.5ml灭菌离心管(n＝样本数+1管阴性对照+1管阳性对照)，作好标记。首先加入600μL裂解液(裂解液有很强的腐蚀性，切勿沾到皮肤或衣物，否则立即用大量清水冲洗并擦干)，然后分别加入待测样本、阴性对照、阳性对照各200μL(一份样本换用一个吸头)；再加入200μL氯仿，混匀器上振荡混匀5sec(不宜过于强烈，以免产生乳化层，也可用手颠倒混匀)。

12,000g离心15min(如有条件，于4℃进行离心)。取与上步中相同数量的1.5ml灭菌离心管，加入400μL异丙醇(-20℃预冷)，作好标记。吸取离心后上清液相转移至相应的管中，颠倒混匀。

12,000g离心15min。轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，沾干液体(不同样品应在吸水纸不同地方沾干)；加入600μL 75％乙醇(-20℃预冷)，颠倒洗涤。

12,000g离心10min。轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，尽量沾干液体。4,000g离心10sec，将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器尽量将其吸干(一份样本换用一个吸头，注意吸头不要碰到有沉淀一面)，室温干燥3min(不宜过于干燥，以免RNA不溶)。

加入11μL DEPC水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA，2,000g离心5sec，冰上保存备用(注意：此时的RNA最易受RNA酶降解，请在2小时内进行PCR扩增)。

3)RT-PCR扩增：从试剂盒中取出RT-PCR反应液、Taq酶，在室温下融化后，2,000g离心5sec。设所需PCR管数为n(n＝样本数+1管阴性对照+1管阳性对照)，每个测试反应体系需要15μL RT-PCR反应液和0.25μL Taq酶。计算好各试剂的使用量，加入一适当体积试管中，向其中加入n/4颗RT-PCR酶颗粒，充分混合均匀，向每个PCR管中各分装15μL，转移至样本处理区。在各设定的PCR管中分别加入制备的RNA溶液各10μL，盖紧管盖，于800g离心5sec。将PCR管排好放入荧光PCR检测仪内，记录样本摆放顺序。

反应参数设置：94℃/15s，55℃/5s，60℃/35s，40个循环；每次循环的退火延伸时收集荧光。

4)结果的判定：结果分析条件设定，读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点。不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整。质控标准，阴性对照无Ct值并且无扩增曲线。阳性对照的Ct值应≤30.0，并出现特定的扩增曲线。如阴性对照和阳性条件不满足以上条件，此次实验视为无效。结果描述及判定，阴性，无Ct值并且无扩增曲线，表明样品中无A型流感病毒；阳性，Ct值≤30.0，且出现特定的扩增曲线，表示样本中存在A型流感病毒。

本发明的优点是：本发明选择A型流感病毒M基因编码区作为靶区域，设计兼并引物和LNA修饰短探针建立并优化了A型流感病毒荧光RT-PCR检测方法，取得了优异的技术效果：1)快速：该方法对PCR产物进行实时监控，RT-PCR结束即可获得结果。

2)更为灵敏：由于采用了特异性的LNA修饰荧光探针，比普通TaqMan探针的灵敏度更高，比常规的PCR方法灵敏度高100～1000倍；对已知拷贝数的体外转录RNA进行检测。结果显示，灵敏度均可达10拷贝/反应，重复性更好。

3)特异：由于不仅采用了特异性的引物，而且采用了特异性的探针，使该方法的特异性高于传统RT-PCR方法；建立的荧光RT-PCR检测方法在检测所收集的其他病毒以及新城疫病毒，结果为阴性，未发现交叉反应。

4)通用性好：可以检出收集到的所有不同感染宿主来源的A型流感病毒。

5)稳定：重复性试验结果显示所建立方法的稳定性良好；对不同浓度的已知拷贝数的cRNA进行重复性试验，结果见表2。

表2重复性试验结果

6)不易污染：全封闭反应，无需PCR后处理，操作安全。

下面结合说明书附图和具体实施方式对本发明作进一步说明。

附图说明

图1为A/Swine/2003(H1N1)M基因RT-PCR扩增结果，泳道1为M基因扩增产物泳道2为HA基因扩增产物泳道3为NA基因扩增产物，泳道4为阴性对照。

图2为LNA短探针流感病毒荧光RT-PCR检测方法的特异性试验结果。

具体实施方式

表3实施例及方法研究中用到的病毒核酸

实施例1、试剂盒的配制和使用

1、试剂盒的配制组成，见表4。

表4试剂盒配制组成

2、试剂盒的使用方法

2.1RNA提取：

12,000g离心15min(如有条件，于4℃进行离心)。取与上步中相同数量的1.5ml灭菌离心管，加入400μL异丙醇(-20℃预冷)，作好标记。吸取离心后的上清液相转移至相应的管中，颠倒混匀。

2.2扩增试剂准备与配制

从试剂盒中取出荧光RT-PCR反应液、Taq酶，在室温下融化后，2,000g离心5sec。设所需PCR管数为n(n＝样本数+1管阴性对照+1管阳性对照)，每个测试反应体系需要15μL RT-PCR反应液和0.25μL Taq酶。计算好各试剂的使用量，加入一适当体积试管中，向其中加入n/4颗RT-PCR酶颗粒，充分混合均匀，向每个PCR管中各分装15μL，转移至样本处理区。在各设定的PCR管中分别加入制备的RNA溶液各10μL，盖紧管盖，于400g离心5sec。将PCR管排好放入荧光PCR检测仪内，记录样本摆放顺序。

反应参数设置：反应条件为：94℃/15s，55℃/5s，60℃/35s，40个循环；每次循环的退火延伸时收集荧光。

2.3结果判定

结果分析条件设定，读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点。不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整。质控标准，阴性对照无Ct值并且无扩增曲线。阳性对照的Ct值应≤30.0，并出现特定的扩增曲线。如阴性对照和阳性条件不满足以上条件，此次实验视为无效。结果描述及判定，阴性，无Ct值并且无扩增曲线，表明样品中无A型流感病毒；阳性，Ct值≤30.0，且出现特定的扩增曲线，表示样本中存在A型流感病毒。

实施例2、试剂盒的灵敏度试验

1、材料：

方法研究过程中应用到的病毒核酸为本实验室保存的禽流感病毒A/Duck/LCR(H5N1)核酸。

2、方法

1)将禽流感病毒A/Duck/LCR(H5N1)RNA反转录合成cDNA，应用特异性引物扩增含完整M ORF约1.0kb的DNA片段，将扩增片段回收后克隆于pGEM-T载体中。将提纯的质粒用限制性内切酶PvuII消化处理，对DNA片段纯化回收，之后将其作为模板按照Promega公司的Ribo MAXTM Large Scale RNAProduction System-T7试剂盒进行体外转录。转录产物经无RNase的Dnase(1u/μg样品DNA，Promega)消化除去其中的DNA模板后，用TRIZOL重新提取RNA，以去除杂蛋白和各种离子。将RNA沉淀溶于1.0mL的无RNA酶的灭菌水中，分装，20μL/管，冻存于-80℃下，即得到制备好的cRNA片段。

2)取制备的体外转录RNA用无RNA酶的灭菌水分别作200倍稀释，测定其A260吸收值并计算拷贝数。对上述制备的cRNA标准品以10倍梯度稀释后，按最佳条件进行荧光RT-PCR测定，并用去离子水作为阴性标准。在对不同稀释度标准品的检测中，确定荧光定量RT-PCR能检出的最低cRNA浓度，并由此得出该方法的检测极限。

3、结果

1)见图1所示，经RT-PCR扩增，获得A/Duck/LCR(H5N1)M ORF约1.0kb的DNA片段。经体外转录后将获得的cRNA纯品。

2)结果显示，方法的灵敏度均可达10拷贝/反应。

实施例3、试剂盒的特异性试验

1、材料，如表3所列。

2、方法

用所建立短探针A型流感病毒荧光RT-PCR检测方法对上述病毒核酸进行检测，以验证方法的特异性。

3、结果

如图3所示，结果表明所建立的方法可检出上述所有A型流感病毒，但与其他动物病毒无交叉反应，特异性良好。

实施例4、试剂盒对临床样品检测的实验报告

1、材料

我国直属出入境检验检疫局提供的已知样品586份。

2、方法

对我国直属出入境检验检疫局提供的已知样品586份进行检测。在实际样品中验证方法的敏感性和特异性。

3、结果

检测结果见表5。

表5临床样品的检测结果

样品	数量	实时荧光RT-PCR检测结果
			H1阳性样品	16	16/16
H3阳性样品	12	12/12
			H5阳性样品	43	43/43
H4阳性样品	2	2/2
			H9阳性样品	13	13/13
流感阴性样品	500	0/500

对586份已知样品进行检测。结果显示建立的方法可检出其中所有的A型流感病毒阳性样品，而且未出现假阳性结果，结果见表5。表明建立的方法可靠实用。

Claims

1.一组检测A型流感病毒的核苷酸序列，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：3，其中序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2分别为检测A型流感病毒M基因的正义引物和反义引物，序列SEQ ID NO：3为检测A型流感病毒M基因的LNA修饰的荧光探针。

2.根据权利要求1所述的检测A型流感病毒的核苷酸序列，其特征在于：所述探针序列SEQ ID NO：3的5’端标记报告荧光基团FAM，3’端标记淬灭荧光基团TAMRA或BHQ1，第4、7、10、13位的碱基用LNA进行修饰。

3.一种检测A型流感病毒的试剂盒，由以下组分组成：

1)裂解液；

2)RT-PCR反应液，包括：PCR缓冲液、RT缓冲液、MgCL₂、dNTP、正义引物、反义引物和荧光探针；

3)RT-PCR酶颗粒；

4)Taq DNA聚合酶；

5)DEPC水；

6)阴性对照：流感病毒阴性组织样品，用0.01mol/L pH7.2PBS缓冲盐水制成20％悬液，70℃作用1小时；

7)阳性对照：为体外转录的非感染性RNA片段，其对应的DNA序列为序列表SEQ IDNo.4所示的核苷酸序列；

其中，正义引物为序列表SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，反义引物为序列表SEQ IDNo.2所示的核苷酸序列，荧光探针为序列表SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，其5’端标记报告荧光基团FAM，3’端标记淬灭荧光基团TAMRA或BHQ1，第4、7、10、13位的碱基用LNA进行修饰。

4.根据权利要求3所述的检测A型流感病毒的试剂盒，其特征在于，所述RT-PCR反应液0.5×PCR缓冲液、0.5×RT缓冲液、1.5mmol/L MgCL₂、0.2mmol/L dNTP、0.5μmol/L正义引物、0.5μmol/L反义引物和0.3μmol/L荧光探针。