CN107058621B - 一组丙型流感病毒lamp检测用引物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本申请属于丙型流感病毒检测技术领域，具体涉及利用环介导逆转录等温扩增技术(RT‑LAMP)检测丙型流感病毒时所用引物序列的专利申请。一组丙型流感病毒LAMP检测用引物，包括外引物对INF‑CF3/INF‑CB3、内引物对IFN‑C FIP/IFN‑C BIP两对引物，利用该引物组可制备RT‑LAMP检测用试剂盒。总体而言，基于现有环介导逆转录等温扩增技术原理，本发明首次将其应用于丙型流感病毒检测应用中，应用范围广泛，既可人用，也可兽用，具有操作流程一致度高，检测结果稳定可靠等优点，对于丙型流感病毒检测及预防体系的建立具有十分重要的应用价值。

Description

一组丙型流感病毒LAMP检测用引物及其应用
技术领域
本申请属于丙型流感病毒检测技术领域，具体涉及利用环介导逆转录等温扩增技术(RT-LAMP)检测丙型流感病毒时所用引物序列的专利申请。
背景技术
RT-LAMP技术的原理是：设计两对引物（一对内引物、一对外引物），特异性识别靶序列中的六个结合区域，在具有置换活性的Bst DNA 聚合酶及逆转录酶AMV的催化下，使RNA模板在特定恒温环境中通过循环置换反应实现快速、特异、灵敏地扩增，从而达到检测病毒的目的。
RT-LAMP扩增主要分为两个阶段，第一阶段为哑铃状扩增始发物的形成：内引物FIP和BIP除了在3’端与模板互补外，其5’端还可与下游扩增产物中的部分序列互补，使得新合成的单链产物两端可形成一个类似哑铃状的环形结构。第二价段为循环扩增阶段：以第一阶段形成的哑铃状的环形DNA为模板，进行周而复始的扩增和延伸，扩增的终产物是具有不同长度、不同个数茎环结构的DNA混合物，其在电泳后的琼脂糖凝胶上可形成连续的梯状条带。
从RT-LAMP的原理和特点可以看出，与常规基因检测方法相比，该方法在RNA病毒的检测方面应该有着很大的优势。第一，操作简单：与传统PCR方法相比，该反应是在恒温条件下进行的，除了使用一些常用聚合酶外，不需要特殊的仪器设备和娴熟的实验技能，只需要简单的恒温装置（如恒温水浴锅，恒温培养箱等）即可完成检测工作。第二，快速高效：RT-LAMP反应不需要经历普通PCR的变性、退火、复性等复杂过程，核酸扩增在30~60min内即可完成，且产物可达到109~1010水平。另外该反应省略了单独的逆转录反应，在实验实施过程中，只需在同一反应管中添加逆转录酶，一步反应即可完成实验操作，减小了污染的机率。第三，特异性强：只有在四条引物完全与靶序列中的六个结合区完全匹配的情况下，扩增反应才能顺利进行，任何一条不匹配反应都无法进行，故具有极强的特异性。第四，灵敏度高：对于病毒核酸的扩增模板量可低至几个拷贝，且产物扩增迅速。第五，结果判定简便：利用普通的DNA电泳和紫外灯等简单设备即可判断是否有阳性反应。或者利用染色剂HNB的蓝或紫色的变换，通过肉眼即可直接观察到阴阳性反应。
丙型流感病毒（Influenza C virus）自1947年首次在美国分离得到以来，在日本、英国、希腊等多国相继发现，特别是日本某些地区一直在持续监测该病毒的流行情况。丙型流感病毒为正粘病毒科、丙型流感病毒属的唯一种，是一种单股负链RNA病毒，由7个RNA片段组成，分别为：PB2、PB1、P3、HE、NP、MP和NS，可编码9种蛋白质。与甲型和乙型流感病毒一样，丙型流感病毒也能够普遍感染人群，引起发热、流涕、咳嗽等感冒症状。
国外流行病学及血清学研究表明，丙型流感病毒对人的感染通常发生在儿童期，从1岁起血清阳性百分率会随着年龄逐渐增加，在20~30岁左右达到最高水平。我国郭元吉教授曾于 1981 年和 1982 年在猪群中分离到 2 株丙型流感病毒，破除了最初人们认为人是丙型流感病毒的唯一自然宿主的说法。但到目前为止没有关于丙型流感病毒在中国人群中流行情况和感染状况的监测数据。
为了填补目前对丙型流感病毒监测的空白，需要建立针对该病毒快速灵敏高效的实验室诊断方法。目前丙型流感病毒的检测方法有病毒分离、单克隆抗体、RT-PCR、实时荧光定量RT-PCR等。丙型流感病毒可通过鸡胚分离或通过犬肾细胞（MDCK细胞）、人恶性黑色素瘤细胞株（HMV-II细胞）分离，但是病毒分离难度较大、分离时间较长，远远不能满足实际工作中高通量高效率的要求。常用的核酸和抗体检测方法所需试剂和仪器的成本相对较高。因此，利用RT-LAMP检测方法操作简单、成本较低、快速高效、特异性强、灵敏度高、结果可视的特点，如何建立针对丙型流感病毒的RT-LAMP检测方法，对于进行大规模流行病学研究和感染状况监测具有非常重要的现实意义。
发明内容
本发明目的在于提供一组针对丙型流感病毒的、RT-LAMP检测用引物序列，并以此序列为基础，设计了检测用试剂盒及丙型流感的RT-LAMP检测方法。
本发明的技术方案详述如下。
一组丙型流感病毒LAMP检测用引物，包括外引物对INF-CF3/ INF-CB3、内引物对IFN-C FIP/ IFN-C BIP两对引物，引物序列如SEQ ID NO.1~4所示，具体如下：
INF-CF3：5’- CCAAATAATGGAAATGGTTGAAG-3’，
INF-CB3：5’- TCTTCTCCAAGGCCAGTA-3’；
IFN-C FIP：5’- TCTCAACCAAGCTGTGATTGTTC-TACGATCACCCAAACGACTA-3’，
IFN-C BIP：5’- GAGTAATGTCTCAGAAAGTGGAAGA-TCGTTCATTGCTGTGCTG-3’。
利用所述丙型流感病毒LAMP检测用引物所制备的RT-LAMP检测用试剂盒，由如下组分构成：
（1）RNA提取液：TRIZol和RNA酶抑制剂，
（2）反应混合液：
包括Bst DNA聚合酶缓冲液，Bst DNA聚合酶，AMV反转录酶，dNTP，Betaine（甜菜碱），MgCl2溶液，INF-CF3引物，INF-CB3引物，INF-C FIP引物，INF-C BIP引物，DEPC处理水，
（3）染色剂：染色剂HNB（羟基萘酚蓝），
（4）阳性对照样品：重组质粒INF-CPMD，所述重组质粒INF-CPMD，其制备方法为，利用INF-CF3、INF-CB3为引物对，对丙型流感病毒RNA样品进行RT-PCR，将扩增产物与pMD18-T载体连接构建获得；
（5）DEPC处理水。
需要解释的是，所述重组质粒INF-CPMD，其制备过程中相关具体操作按现有技术进行操作即可。
所述RT-LAMP检测用试剂盒，25次检测用量各成分比例如下：
（1）RNA提取液：TRIZol，25mL，RNA酶抑制剂25μL；
（2）反应混合液：
Bst DNA聚合酶缓冲液，（10×）、62.5μL；
Bst DNA聚合酶，8U/μL、25μL；
AMV反转录酶，10U/μL、25μL；
dNTP，10mM、62.5μL；
Betaine（甜菜碱），25mM、25μL；
MgCl2溶液，150mM、25μL；
INF-CF3引物，5μm、25μL；
INF-CB3引物，5μm、25μL；
INF-C FIP引物，10μm、25μL；
INF-C BIP引物，10μm、25μL；
DEPC处理水，500μL；
（3）染色剂：染色剂HNB（羟基萘酚蓝），5mM、25μL；
（4）阳性对照样品：重组质粒INF-CPMD，0.1ng/μL、20μL；
（5）DEPC处理水，1mL。
需要解释的是，试剂盒中相关试剂产品可由相关生物制剂公司中现有产品中选择应用，例如：NEB公司的Bst DNA聚合酶，Promega公司的RNA酶抑制剂、dNTP 、AMV反转录酶等。
利用所述RT-LAMP检测用试剂盒的丙型流感病毒的RT-LAMP检测方法，具体包括如下步骤：
（1）获取待检测样品的RNA样本，具体操作为：将待测样品（例如疑似患者的咽拭子）浸入到300μL无菌生理盐水中，震荡挤压；
在获得的液体中加1mL的TRIZol，充分混匀；
随后加200μL氯仿，混匀并静置5min，然后10000rpm离心5min；取上清置于等体积的冰的（0℃左右）异丙醇中，-20℃放置1小时，再10000rpm离心5min获取沉淀；
沉淀用无水乙醇洗一次，阴干后加入10μL的DEPC处理水溶解备用；
（2）RT-LAMP反应进行检测，
25μL反应液的体积配比参考设计如下：
反应混合液，22μL；
步骤（1）中待测样品的RNA样本，3μL；
将反应液1000rpm短暂（30s左右）离心以使反应液混合均匀；
然后置于65℃水浴中90min，随后80℃灭活5min；
以相同操作方式以阳性对照样品替代待测样品的RNA样本进行RT-LAMP反应；
（3）结果判定：采用如下两种方式之一进行结果判定
A、凝胶电泳方式：对步骤（2）中RT-LAMP反应产物进行1.2%的琼脂糖凝胶电泳分析，100V电泳30min，电泳结束后，紫外灯下观察电泳条带，若出现阶梯状条带，则视为丙型流感病毒检测阳性，否则，视为阴性；
B、颜色观察方式：步骤（2）中RT-LAMP反应开始前，在反应体系中加入1μL的HNB染料，反应结束后，观察试管颜色，如果呈现蓝色表示样品阳性，感染有丙型流感病毒，如果呈现紫色，表示样品阴性，不含有丙型流感病毒。
通过对现有RNA病毒检测技术的改进和完善，相较于现有丙型流感病毒检测技术，本发明具有简便、快速、高效、灵敏等技术优势，主要表现在一下几个方面：
1、具有极强的特异性：只有在四条引物完全与靶序列中的六个结合区完全匹配的情况下，扩增反应才能顺利进行；
2、便于操作：由于扩增反应是在恒温条件下进行的，无需PCR仪等昂贵仪器，只需要简单的恒温装置即可完成检测工作，降低了对硬件设备的要求，易于推广应用；
3、反应稳定可靠：由于扩增反应不需要经历核酸的变复性过程和单独的逆转录反应，只需一步就可完成实验操作，既缩短了反应所需的时间，又减少了RNA酶和扩增核酸污染的机率；
4、灵敏度较高：能够快速扩增模板量低至几个拷贝的病毒核酸，具有较好灵敏度；
5、易于观察和判定结果：根据反应结束后反应体系颜色，用肉眼即可直观判定样品是否为阳性。
总体而言，基于现有环介导逆转录等温扩增技术(RT-LAMP)原理，本发明首次将其应用于丙型流感病毒检测应用中，应用范围广泛，既可人用，也可兽用，具有操作流程一致度高，检测结果稳定可靠等优点，对于丙型流感病毒检测及预防体系的建立具有十分重要的应用价值。
附图说明
图1为特异性验证中电泳检测结果，其中：M为电泳DNA marker；“甲”为甲型流感RNA样本；“乙”为乙型流感RNA样本；“丙”为丙型流感RNA样本；
图2为特异性验证中的可视法结果；其中“甲”为甲型流感RNA样本；“乙”为乙型流感RNA样本；“丙”为丙型流感RNA样本；
图3为敏感性验证中的电泳检测结果；其中M为电泳DNA marker；1~5依次对应5pg/μL、0.5 pg/μL、0.05 pg/μL、0.005 pg/μL和0 pg/μL的样本浓度；0 pg/μL的样本浓度是用DEPC处理水代替RNA样本获得；
图4为敏感性验证中的可视法观测的结果；其中1~5依次对应5pg/μL、0.5 pg/μL、0.05 pg/μL、0.005 pg/μL和0 pg/μL的样本浓度；0 pg/μL的样本浓度是用DEPC处理水代替RNA样本获得；
图5为敏感性验证中现有技术RT-PCR敏感性检测结果；其中M为DNA marker，1~5依次对应5pg/μL、0.5 pg/μL、0.05 pg/μL、0.005 pg/μL和0 pg/μL的样本浓度；0 pg/μL的样本浓度是用DEPC处理水代替RNA样本获得。
具体实施方式
下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明，在介绍具体实施例前，就下述实施例中涉及部分生物材料、实验试剂、实验设备等情况简要介绍如下。
生物材料：
丙型流感阳性样品，甲型、乙型、丙型流感待检样品（鼻咽拭子样品），均由中国疾病预防控制中心提供，其中待检样品为从湖南、河南、山东等地收集的样本中所随机挑选出来样本；
pMD18-T载体，TAKARA公司；
引物由华大基因公司合成提供；
实验试剂：
Bst DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶缓冲液，NEB公司；
RNA酶抑制剂、dNTP 、AMV反转录酶等，Promega公司；
DEPC处理水，购自江莱生物；
Betaine（甜菜碱），购自New England Biolabs公司；
实验设备：
分光光度计Nano-200，杭州奥盛仪器有限公司；
PCR仪ABI 9700，美国Applied Biosystems公司；
实施例1
借助AlignX和软件PrimerExplorer 4.0（http://primerexplorer.jp/e/），发明人选择丙型流感病毒的MP基因的相对保守区（GenBank: D26546.1），分别设计了四条引物，其中包括两条外引物（INF-C F3、INF-C B3），两条内引物（INF-C FIP、INF-C BIP），以此作为丙型流感病毒LAMP检测用引物，引物序列如SEQ ID NO.1~4所示，具体如下：
INF-CF3：5’- CCAAATAATGGAAATGGTTGAAG-3’，
INF-CB3：5’- TCTTCTCCAAGGCCAGTA-3’；
IFN-C FIP：5’- TCTCAACCAAGCTGTGATTGTTC-TACGATCACCCAAACGACTA-3’，
IFN-C BIP：5’- GAGTAATGTCTCAGAAAGTGGAAGA-TCGTTCATTGCTGTGCTG-3’。
实施例2
利用实施例1所设计的丙型流感病毒LAMP检测用引物制备了RT-LAMP检测用试剂盒，25次剂量各组份配比设计如下：
（1）RNA提取液：TRIZol，25mL，RNA酶抑制剂25μL；
（2）反应混合液：
Bst DNA聚合酶缓冲液，（10×）、62.5μL；
Bst DNA聚合酶，8U/μL、25μL；
AMV反转录酶，10U/μL、25μL；
dNTP，10mM、62.5μL；
Betaine（甜菜碱），25mM、25μL；
MgCl2溶液，150mM、25μL；
INF-CF3引物，5μm、25μL；
INF-CB3引物，5μm、25μL；
INF-C FIP引物，10μm、25μL；
INF-C BIP引物，10μm、25μL；
DEPC处理水，500μL；
（3）染色剂：染色剂HNB（羟基萘酚蓝），5mM、25μL；
（4）阳性对照样品：重组质粒INF-CPMD，0.1ng/μL、20μL；
（5）DEPC处理水，1mL。
需要解释的是，试剂盒中相关试剂产品可由相关生物制剂公司中现有产品中选择应用，例如：NEB公司的Bst DNA聚合酶，Promega公司的RNA酶抑制剂、dNTP 、AMV反转录酶等，亦可选用其他公司产品，根据产品规格对溶剂体系进行适当调整即可；
需要解释的是，本实施例中所用引物INF-C F3、INF-C B3、INF-C FIP、INF-C BIP由华大基因公司合成提供。
还需解释的是，所述重组质粒INF-CPMD，其制备过程中相关具体操作按现有技术进行操作即可。具体可参考如下制作过程。
首先，参照TRIZol试剂的说明，从确定的丙型流感患者的鼻咽拭子中获得病毒RNA样本，利用INF-C F3、INF-C B3引物对进行RT-PCR，获取目的片段；
RT-PCR反应分为两步，具体过程为：
RT反应过程中，20μL反应体系设计如下：
RT缓冲液（5×），4.0μL；
dNTP，10mmol/L、1.0μL；
随机引物，10μm、2.0μL；
RNA酶抑制剂， 1.0μL；
逆转录酶，5U/μL、1.0μL；
RNA模板，3.0μL；
DEPC处理水，8.0μL；
反应条件为，70℃、5min，42℃、30min，95℃、2min；反应产物立即进行后续PCR反应或者-80℃保存备用；
PCR反应时，100μL反应体系设计如下：
PCR缓冲液（10×），10μL；
dNTP，10mM、5μL；
INF-CF3/INF-CB3混合引物，5μm、2μL；
Taq DNA聚合酶，5U/μL、1μL；
cDNA模板，2μL；
DEPC处理水，80μL；
反应条件为：95℃、2min预变性；94℃、30秒，56℃、30秒，72℃、30秒，循环35次；最后72℃延伸10min；扩增样本直接使用或者置于4℃保存备用。
其次，将上述RT-PCR反应产物进行回收，将回收产物与pMD18-T载体进行连接。
最后，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选、鉴定正确重组质粒，并进行测序验证，将正确重组质粒保存备用即可。
相关过程采用商品化试剂盒进行实验，具体操作参考对应试剂盒说明书进行操作即可，不再赘述。
实施例3
利用实施例2所制备的RT-LAMP检测用试剂盒的丙型流感病毒的RT-LAMP检测方法，具体包括如下步骤。
（1）获取待检测样品的RNA样本，具体操作为：将待测样品浸入到300μL无菌生理盐水中，震荡挤压；在获得的液体中加1mL的TRIZol，充分混匀；
随后加200μL氯仿，混匀并静置5min，然后10000rpm离心5min；取上清置于等体积的冰的（0℃左右）异丙醇中，-20℃放置1小时，再10000rpm离心5min获取沉淀；
沉淀用无水乙醇洗一次，阴干后加入10μL的DEPC处理水溶解备用；
（2）RT-LAMP反应进行检测，
25μL反应液的体积配比参考设计如下：
反应混合液，22μL；
步骤（1）中待测样品的RNA样本，3μL；
所述22μL反应混合液配方为：
Bst DNA聚合酶缓冲液，（10×）、2.5μL；
Bst DNA聚合酶，8U/μL、1μL；
AMV反转录酶，10U/μL、1μL；
dNTP，10mM、2.5μL；
Betaine（甜菜碱），25mM、1μL；
MgCl2溶液，150mM、1μL；
INF-CF3引物，5μm、1μL；
INF-CB3引物，5μm、1μL；
INF-C FIP引物，10μm、1μL；
INF-C BIP引物，10μm、1μL；
DEPC处理水，9μL。
将反应液1000rpm短暂离心（30秒左右）以使反应液混合均匀；
然后置于65℃水浴中90min，随后80℃灭活5min。
以相同操作方式以阳性对照样品替代待测样品的RNA样本（即，以3μL阳性质粒替代待测样品的RNA样本）进行RT-LAMP反应；
（3）结果判定：采用如下两种方式之一进行结果判定
A、凝胶电泳方式：取步骤（2）中RT-LAMP反应产物5μL，进行1.2%的琼脂糖凝胶电泳分析，100V电泳30min，电泳结束后，紫外灯下观察电泳条带，若出现阶梯状条带，则视为丙型流感病毒检测阳性，否则，视为阴性；
B、颜色观察方式：步骤（2）中RT-LAMP反应开始前，在反应体系中加入1μL的HNB染料，反应结束后，观察试管颜色，如果呈现蓝色表示样品阳性，感染有丙型流感病毒，如果呈现紫色，表示样品阴性，不含有丙型流感病毒。
特异性验证：
分别取甲型流感、乙型流感和丙型流感样本各一份，按照上述步骤进行操作，对RT-LAMP反应产物进行电泳检测，电泳结果如图1所示，颜色结果如图2所示。从图中可以看出，丙型流感样本可见阶梯状的电泳条带，显示为阳性；而其他两型没有，显示为阴性。这一结果表明，该方法具有较好地特异性。
敏感性检测：
取丙型流感样本一份，利用分光光度计对所得RNA样品进行计量，随后进行系列稀释，最终形成5pg/μL、0.5pg/μL、0.05pg/μL、0.005pg/μL四个梯度浓度，按照上述步骤进行检测，以检测反应的敏感度。检测结果如图3、图4所示。从图中可以看出，检测敏感度最低为0.05pg/μL，也即总量为0.15pg的RNA样本仍然可被准确检出（需要注意的是，上述敏感度是采用实施例2的试剂盒所得结果）。
采用同样样品浓度的RNA样品，按照现有的RT-PCR两步法进行检测，引物采用INF-CF3、IFN-CB3。结果显示（如图5所示），在样本浓度为0.05pg/μL，也即总含量为0.15 pg 的病毒RNA时，RT-PCR的条带就已经看不见。此结果表明，本发明所采用的检测方法，其敏感度较现有RT-PCR法最少超过10倍。
临床样本阳性率检测对比
对流感季节收集的425份具有流感症状的临床咽拭子样本，分别按照上述方法和现有RT-PCR法进行检测。结果如下表所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
。
从上表可以看出，RT-LAMP方法患者丙型流感病毒阳性8例，而常规RT-PCR方法检测到5份阳性。说明本发明的检测灵敏度优于传统的RT-PCR法，可以用于临床检验。
SEQUENCE LISTING
<110> 河南昂睿生物科技有限公司
<120> 一组丙型流感病毒LAMP检测用引物及其应用
<130> none
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工设计
<400> 1
ccaaataatg gaaatggttg aag 23
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工设计
<400> 2
tcttctccaa ggccagta 18
<210> 3
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工设计
<400> 3
tctcaaccaa gctgtgattg ttctacgatc acccaaacga cta 43
<210> 4
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工设计
<400> 4
gagtaatgtc tcagaaagtg gaagatcgtt cattgctgtg ctg 43

Claims (4)

1.一组丙型流感病毒LAMP检测用引物，其特征在于，该组引物包括外引物对INF-CF3/INF-CB3、内引物对IFN-C FIP/ IFN-C BIP两对引物，引物序列如SEQ ID NO.1~4所示，具体如下：
INF-CF3：5’- CCAAATAATGGAAATGGTTGAAG-3’，
INF-CB3：5’- TCTTCTCCAAGGCCAGTA-3’；
IFN-C FIP：5’- TCTCAACCAAGCTGTGATTGTTC-TACGATCACCCAAACGACTA-3’，
IFN-C BIP：5’-GAGTAATGTCTCAGAAAGTGGAAGA-TCGTTCATTGCTGTGCTG-3’。
2.利用权利要求1所述丙型流感病毒LAMP检测用引物所制备的RT-LAMP检测用试剂盒，其特征在于，由如下组分构成：
（1）RNA提取液：TRIZol和RNA酶抑制剂，
（2）反应混合液：
由Bst DNA聚合酶缓冲液、Bst DNA聚合酶、AMV反转录酶、dNTP、Betaine、MgCl2溶液、INF-CF3引物、INF-CB3引物、NF-C FIP引物、INF-C BIP引物、DEPC处理水构成；
（3）染色剂：染色剂HNB，
（4）阳性对照样品：重组质粒INF-CPMD；
（5）DEPC处理水。
3.如权利要求2所述RT-LAMP检测用试剂盒，其特征在于，25次检测用量各成分比例如下：
（1）RNA提取液：TRIZol，25mL，RNA酶抑制剂25μL；
（2）反应混合液：
10×的Bst DNA聚合酶缓冲液，62.5μL；
Bst DNA聚合酶，8U/μL、25μL；
AMV反转录酶，10U/μL、25μL；
dNTP，10mM、62.5μL；
Betaine，25mM、25μL；
MgCl2溶液，150mM、25μL；
INF-CF3引物，5μm、25μL；
INF-CB3引物，5μm、25μL；
INF-C FIP引物，10μm、25μL；
INF-C BIP引物，10μm、25μL；
DEPC处理水，500μL；
（3）染色剂：染色剂HNB，5mM、25μL；
（4）阳性对照样品：重组质粒INF-CPMD，0.1ng/μL、20μL；
（5）DEPC处理水，1mL。
4.利用权利要求2或3所述RT-LAMP检测用试剂盒的丙型流感病毒的非疾病诊断目的的RT-LAMP检测方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
（1）获取待检测样品的RNA样本；
（2）RT-LAMP反应进行检测，
以相同操作方式以阳性对照样品替代待测样品的RNA样本进行RT-LAMP反应；
（3）结果判定：采用如下两种方式之一进行结果判定
A、凝胶电泳方式：对步骤（2）中RT-LAMP反应产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，电泳结束后，紫外灯下观察电泳条带，若出现阶梯状条带，则视为丙型流感病毒检测阳性，否则，视为阴性；
B、颜色观察方式：步骤（2）中RT-LAMP反应开始前，在反应体系中加入1μL的HNB染料，反应结束后，观察试管颜色，如果呈现蓝色表示样品阳性，感染有丙型流感病毒，如果呈现紫色，表示样品阴性，不含有丙型流感病毒。
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