CN110317903B - 甲型流感病毒h8n7的检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种甲型流感病毒H8N7的检测试剂盒，所述试剂盒包括病毒核酸快速提取试剂、PCR扩增试剂、PCR酶混合液、H8N7检测试剂、阳性对照品、阴性对照品；所述H8N7检测试剂包含H8N7扩增引物和探针。本发明采用的病毒核酸快速提取试剂配方可用于病毒RNA快速提取，只需要常温静置5‑10min，大大缩短了提取时间、提高了提取效率，且对后续PCR扩增体系具有促进作用，提高PCR检测效率；且本发明针对甲型流感病毒H8N7亚型的特异性扩增引物探针，该引物探针序列为首创且设计独特，特异性好，灵敏度高，能够实现高效、精准的分型检测甲型流感病毒H8N7亚型。本发明还提供了甲型流感病毒H8N7的检测方法。

Description

甲型流感病毒H8N7的检测试剂盒及检测方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种RT-PCR扩增技术，具体涉及一种甲型流感病毒H8N7的检测方法及检测试剂盒。
背景技术
流感病毒分为甲、乙、丙三型，甲型流感病毒为最常见且最容易发生变异的流感病毒，流感大流行就是甲型流感病毒出现新亚型或旧亚型重现引起的。甲型流感病毒具有两种特异性的囊膜蛋白，即血凝素(Hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)，根据HA和NA蛋白抗原性不同，主要分为16个H亚型(H1-H16)和9个N亚型(N1-N9)。
近年来的研究发现，HA和NA基因之间存在某种平衡对病毒的致病性有很大关系。甲型流感病毒H8N7亚型是异于普通甲型流感的一种新变种甲型流感病毒，拥有飞沫传播和水源传播的特性，且容易进化为空气传播型，此种病毒的致死率预计达到100％，对人类造成极大的生命威胁。由此可见，针对甲型流感病毒H8N7的快速准确地检测对于流感病毒的及时诊断及防御至关重要。
荧光定量PCR技术是一种传统的生物分子检测方法，具有高敏感、高特异、高准确性且能实现多重实时检测的优势，目前已被广泛用于核酸(DNA/RNA)分子检测。目前，在荧光定量PCR技术平台针对甲型流感病毒H8N7的检测方法未见报道，因此，本领域技术人员极有必要利用该平台开发一种高敏感、高特异、高准确性的一步法实时荧光定量RT-PCR检测方法及试剂盒，实现对甲型流感病毒H8N7亚型的检测。
发明内容
针对上述现有技术中的不足，本发明要解决的技术问题是提供一种甲型流感病毒H8N7的检测试剂盒及检测方法。
为实现上述目的提供一种甲型流感病毒H8N7的检测试剂盒，本发明采用了以下技术方案：
一种甲型流感病毒H8N7的检测试剂盒，所述试剂盒包括病毒核酸快速提取试剂、PCR扩增试剂、PCR酶混合液、H8N7检测试剂、阳性对照品、阴性对照品。
优选的，所述病毒核酸快速提取试剂包含：pH为10.0的500mM Tris-HCl、10％v/vTritonX100、4M异硫氰酸胍、100mM KCl、pH为8.0的0.2M EDTA。
优选的，所述PCR扩增试剂包含：2×PCR buffer、50mM MgCl2、pH为10.0的100mMTris-HCl、0.5mM dNTP、5％g/ml BSA。
优选的，所述所述阳性对照品为：HA8基因和NA7基因的两个合成基因片段连接到一个pUC57质粒载体上，然后以DEPC水进行106倍稀释，作为最终的阳性对照。
优选的，所述PCR酶混合液包括0.5U/μl逆转录酶、5U/μl DNA聚合酶、5×RNA酶抑制剂。
优选的，所述H8N7检测试剂包含：H8N7基因的扩增引物和探针；探针H8N7-P1的5’端标记有报告荧光染料FAM，3’端标记有淬灭荧光染料BHQ；探针H8N7-P2的5’端标记有报告荧光染料VIC，3’端标记有淬灭荧光染料BHQ；引物探针序列为：
H8N7-F1：5’-GCTGGATGCTGACGGAACTTAG-3’
H8N7-F2：5’-GATGACTGGTTCGGATGACATCT-3’
H8N7-R1：5’-TTGACTAAATGGACGATATTATC-3’
H8N7-R2：5’-CAAATCGGAGATTATTCTAGCGA-3’
H8N7-P1：5’-FAM-CGATTGCTGCAGGACACTAATCCTGC-BHQ-3’
H8N7-P2：5’-VIC-TAGACATAGGTCATGCCTGTGTCCATC-BHQ-3’
进一步的，各引物浓度均为0.2mM，探针浓度均为0.1mM。
本发明还提供了一种甲型流感病毒H8N7的检测方法，包括如下步骤：
S1、将病毒核酸快速提取试剂和待测样品等体积混合，常温静置5-10分钟，然后直接用于PCR检测；
S2、以步骤S1中的混合物为模板，同时使用阳性对照品和阴性对照品，利用检测甲型流感病毒H8N7亚型的引物探针进行荧光定量PCR检测；
S3、数据处理：反应结束后，根据信噪情况设定和调整基线和阈值，通过收集的荧光曲线和Ct值判定结果。
在数据处理步骤中，根据实际情况分别调节FAM和VIC通道的Baseline的Start值、End值以及Threshold的Value值(Start值建议设在3～15、End值建议设在5～20，同时调整阴性对照的扩增曲线平直或低于阈值线)，点击Analysis获得分析结果，得到FAM和VIC通道的Ct值。
根据所得FAM和VIC通道的Ct值；进行：
S31、有效性判断：阴/阳性对照品检测结果需满足表3要求，否则，本次实验结果无效；
表3阴/阳性对照品判读标准
Figure GDA0003928921270000031
S32、结果判读：
a.H8N7管阳性判读：FAM通道CT≤39，H8亚型阳性；VIC通道CT≤39，N7亚型阳性；FAM通道CT≤39且VIC通道CT≤39，H8N7阳性。
b.阴性判读：阳性判读以外的其它结果，均判为阴性。
优选的，步骤S2中荧光定量PCR的扩增体系如下表1所示。
表1 PCR扩增体系
试剂名称 用量
PCR扩增试剂 12μl
PCR酶混合液 4μl
H8N7检测试剂 4μl
模板/阳性对照品/阴性对照品 5μl
优选的，步骤S2中PCR的扩增程序如下表2所示。
表2 PCR扩增程序
Figure GDA0003928921270000041
本发明的有益效果在于：
1)本发明采用的病毒核酸快速提取试剂配方为自主特需设计，该配方可用于病毒RNA快速提取，既能有效裂解病毒外壳、抑制RNA酶的活性从而获得病毒RNA，又能保证配方中的各试剂成分不影响后续PCR扩增。本提取试剂整个操作过程只需要常温静置5-10min，大大缩短了提取时间、提高了提取效率；而常规的病毒RNA提取试剂需要30-90min，且病毒RNA具有一定的损失而导致提取效率不高。此外，本发明提供的核酸快速提取试剂配方加入一定量的KCl，能够促进引物退火，从而对后续PCR扩增体系具有促进作用，提高PCR扩增效率。
2)本发明针对甲型流感病毒H8N7亚型的特异性扩增引物探针，该引物探针序列为首创且设计独特，特异性好，灵敏度高，能够实现高效、精准的检测出甲型流感病毒H8N7亚型。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1为依据本发明建立的荧光RT-PCR方法对甲型流感病毒H8N7型患者唾液拭子的检测结果图。
图2a、2b分别为FAM荧光通道、VIC荧光通道模式下，采用本发明扩增体系对1000、100、10、5、0TCID50/L浓度的甲型流感病毒H8N7型进行扩增检测的结果，对应从A至E的扩增曲线。
图3为从甲型流感病毒H8N7型疑似患者的10份临床样本中提取病毒RNA，用本发明荧光RT-PCR方法进行检测的结果图。
图4为本发明病毒核酸快速提取试剂对H8N7检测中PCR扩增体系的影响对比图。
图5为依据本发明建立的荧光RT-PCR方法对甲型流感病毒H13N6型患者唾液拭子的检测结果图。
图6a、6b分别为FAM荧光通道、VIC荧光通道模式下，采用本发明扩增体系对500、100、10、5、0TCID50/L浓度的甲型流感病毒H13N6型进行扩增检测的结果，对应从A至E的扩增曲线。
图7为从甲型流感病毒H13N6型疑似患者的12份临床样本中提取病毒RNA，用本发明荧光RT-PCR方法进行检测的结果图。
图8为本发明病毒核酸快速提取试剂对H13N6检测中PCR扩增体系的影响对比图。
图9为本发明H8N7荧光定量PCR检测中病毒核酸快速提取试剂与市售提取试剂的提取效率比较图。
图10为本发明H13N6荧光定量PCR检测中病毒核酸快速提取试剂与市售提取试剂的提取效率比较图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本技术领域的普通技术人员应该理解的是,在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
下列实施例中，采用的试剂和生物材料如未特别说明，均为商业化产品。
实施例1——一种甲型流感病毒H8N7的检测试剂盒
一种利用实时荧光PCR检测甲型流感病毒H8N7的试剂盒，包括：病毒核酸快速提取试剂、PCR扩增试剂、PCR酶混合液、H8N7检测试剂、阳性对照品、阴性对照品。其中：
(1)所述病毒核酸快速提取试剂包括裂解试剂，裂解试剂包含：500mM Tris-HCl(pH10.0)、10％v/v TritonX100、4M异硫氰酸胍、100mM KCl、0.2M EDTA(pH8.0)。
(2)所述PCR扩增试剂包括PCR扩增缓冲液；包含：2×PCR buffer、50mM MgCl2、100mM Tris-HCl(pH10.0)、0.5mM dNTP、5％g/ml BSA。
(3)所述PCR酶混合液包括0.5U/μl逆转录酶、5U/μl DNA聚合酶、5×RNA酶抑制剂；
(4)所述H8N7检测试剂包括H8N7特异性的引物和探针；具体的，特异性引物和探针为：
H8N7-F1：5‘-GCTGGATGCTGACGGAACTTAG-3’
H8N7-F2：5‘-GATGACTGGTTCGGATGACATCT-3’
H8N7-R1：5‘-TTGACTAAATGGACGATATTATC-3’
H8N7-R2：5‘-CAAATCGGAGATTATTCTAGCGA-3’
H8N7-P1：5‘-FAM-CGATTGCTGCAGGACACTAATCCTGC-BHQ-3’
H8N7-P2：5‘-VIC-TAGACATAGGTCATGCCTGTGTCCATC-BHQ-3’
(5)阳性对照品：以HA8基因和NA7基因的两个合成基因片段连接到一个pUC57质粒载体上，该质粒用DEPC水进行106倍稀释，作为H8N7的阳性对照；
(6)阴性对照品：DEPC H2O；
其中，各引物浓度均为0.2mM，探针浓度均为0.1mM。
实施例2——一种甲型流感病毒H8N7的检测方法
一种甲型流感病毒H8N7和H13N6的实时荧光PCR检测方法，包括以下实验步骤：
(1)主要试剂、仪器：采用实施例1中的试剂盒试剂；荧光定量PCR仪为ABI7500。
(2)标本准备：阳性标本为人感染甲型流感病毒H8N7滴定后灭活病毒，然后用DEPC水进行不同倍数的稀释，阴性对照标本为健康人的唾液拭子。
(3)RNA提取：将病毒核酸快速提取试剂和待测样品等体积混合，常温静置5-10分钟，然后将裂解混合液直接用于PCR检测。
(4)靶基因的扩增：
a.引物和探针的设计：根据甲型流感病毒H8N7序列分别设计特异性引物和探针，特异性引物和探针分别是针对H8N7的HA基因和NA基因两个靶标的特异性引物扩增区内设计、能够区别其他病毒株，分别为两组特异性引物探针对。其特异性引物和探针为：
H8N7-F1：5‘-GCTGGATGCTGACGGAACTTAG-3’
H8N7-F2：5‘-GATGACTGGTTCGGATGACATCT-3’
H8N7-R1：5‘-TTGACTAAATGGACGATATTATC-3’
H8N7-R2：5‘-CAAATCGGAGATTATTCTAGCGA-3’
H8N7-P1：5‘-FAM-CGATTGCTGCAGGACACTAATCCTGC-BHQ-3’
H8N7-P2：5‘-VIC-TAGACATAGGTCATGCCTGTGTCCATC-BHQ-3’
b.阳性对照：本方法中的阳性对照为HA8基因和NA7基因的两个合成基因片段连接到一个pUC57质粒载体上，该质粒用DEPC水进行106倍稀释，最终作为本方法中的阳性对照。
c.RT-PCR反应平台：总体积25μl的H8N7扩增体系中分别加入PCR扩增试剂12μl，PCR酶混合液4μl，H8N7检测试剂4μl，核酸标本5μl。PCR扩增的反应条件为50℃逆转录15min；95℃预变性5min；95℃变性10s，55℃退火和延伸40s，40个循环。
d.数据处理：
反应结束后，根据实际情况分别调节FAM和VIC通道的Baseline的Start值、End值以及Threshold的Value值(Start值建议设在3～15、End值建议设在5～20，同时调整阴性对照的扩增曲线平直或低于阈值线)，点击Analysis获得分析结果，得到FAM和VIC通道的Ct值；
e.有效性判断：
阴/阳性对照品检测结果需满足表3要求，否则，本次实验结果无效。
表3阴/阳性对照品判读标准
Figure GDA0003928921270000071
f.结果判读：
f1.H8N7管阳性判读：FAM通道CT≤39，H8亚型阳性；VIC通道CT≤39，N7亚型阳性；FAM通道CT≤39且VIC通道CT≤39，H8N7阳性。
f2.阴性判读：阳性判读以外的其它结果，均判为阴性。
(5)实验结果：
a.特异性检测结果：如图1所示，依据本发明建立的荧光RT-PCR方法对甲型流感病毒H8N7具有较好的特异性，甲型流感病毒H8N7型患者的唾液拭子检测结果FAM通道CT值为23、VIC通道CT值为25，显示阳性，对其它流感病毒和空白对照等均无交叉反应，Ct无数值，如表4所示。
表4 H8N7试剂对不同流感病毒类型的检测结果
病毒名称 H8N7试剂检测结果
甲型流感病毒H8N7 阳性
甲型流感病毒H13N6 阴性
甲型流感病毒H1N1 阴性
甲型流感病毒H10N8 阴性
甲型流感病毒H3N2 阴性
甲型流感病毒H5N1 阴性
甲型流感病毒H5N8 阴性
甲型流感病毒H7N9 阴性
乙型流感病毒BV 阴性
乙型流感病毒BY 阴性
丙型流感病毒 阴性
b.灵敏性试验结果：对甲型流感病毒H8N7型病毒毒株采用MDCK细胞进行病毒效价测定，然后将其分别稀释至1000、100、10、5、0TCID50/L，用本试剂盒提供的病毒核酸快速提取试剂进行RNA提取，然后用本发明建立的荧光RT-PCR方法进行检测，如图2a(FAM荧光通道)和图2b(VIC荧光通道)所示，图中从A至E的扩增曲线依次表示采用本扩增体系对1000、100、10、5、0TCID50/L浓度的甲型流感病毒H8N7型进行扩增检测的结果，FAM荧光通道Ct值依次为22、28、32、34、无数值；VIC荧光通道Ct值依次为22、28、33、35、无数值，结果表明荧光RT-PCR方法检测甲型流感病毒H8N7型的敏感性达到5TCID50/L(FAM和VIC通道CT值分别为34、35)。
c.临床样本的检测结果：从甲型流感病毒H8N7型疑似患者的10份临床样本中提取病毒RNA，用本发明荧光RT-PCR方法进行检测，结果如图3所示，本发明方法检测出H8N7阳性5份。经测序确认，采用本发明多重荧光PCR方法检测该10份样本的阳性符合率为100％，由此可见，本发明方法具有高度准确性。
d.重复性检测结果：采用2例甲型流感病毒H8N7阳性的临床样本，用本发明多重荧光PCR方法各重复检测6次检测，结果如表5所示，各样本重复6次检测结果CT值的CV＜2％(CV＝CT标准偏差÷CT平均值)，其中CV值为变异系数，是衡量指标中各观测值变异程度的一个统计量，荧光PCR平台通常使用CT值的CV值来衡量检测重复性，表明本实施例依据本发明建立的多重荧光PCR方法的检测重复性较好。
表5甲型流感病毒H8N7核酸检测试剂的重复性检测结果
Figure GDA0003928921270000091
Figure GDA0003928921270000101
综上所述，本实施例中检测结果显示表明本发明方法的敏感性好、特异性高、重复性好且准确可靠。
实施例3——验证病毒核酸快速提取试剂中的KCl对荧光PCR检测效果的影响
(1)按照本发明提供的配方配制含有KCl的病毒核酸快速提取试剂A：pH为10.0的500mM Tris-HCl、10％v/v TritonX100、4M异硫氰酸胍、100mM KCl、pH为8.0的0.2M EDTA。
(2)配制不含KCl的病毒核酸快速提取试剂B：pH为10.0的500mM Tris-HCl、10％TritonX100、4M异硫氰酸胍、pH为8.0的0.2M EDTA。
(3)采用H8N7阳性临床样本，分别用病毒核酸快速提取试剂A、病毒核酸快速提取试剂B与样本等体积混合，常温静置5-10分钟，然后将裂解混合液A、B分别用于PCR检测。
(4)采用本发明提供的H8N7荧光PCR检测试剂进行PCR检测，PCR检测步骤同实施例2。
从图4所示的荧光定量PCR检测结果显示，不含KCl的病毒核酸快速提取试剂B的扩增结果FAM和VIC通道Ct值均落后于含有KCl的病毒核酸快速提取试剂A。由此可见，本发明提供的病毒核酸快速提取试剂引入KCl，对PCR扩增体系具有促进作用，能够有效提高PCR扩增效率。
此外，本发明的技术方案除了上述实施例的应用以外，还可用于甲型流感病毒H8N7与其它病毒的联合检测，如甲型流感病毒H13N6。详见以下实施例。
实施例4——甲型流感病毒H13N6的检测试剂盒
本实施例利用实时荧光PCR检测甲型流感病毒H13N6的试剂盒包括：病毒核酸快速提取试剂、PCR扩增试剂、PCR酶混合液、H13N6检测试剂、阳性对照品、阴性对照品。其中：
(1)所述病毒核酸快速提取试剂包括裂解试剂，具体包含：500mM Tris-HCl(pH10.0)、10％v/v TritonX100、4M异硫氰酸胍、100mM KCl、0.2M EDTA(pH8.0)。
(2)所述PCR扩增试剂包括PCR扩增缓冲液；包含：2×PCR buffer、50mM MgCl2、100mM Tris-HCl(pH10.0)、0.5mM dNTP、5％g/ml BSA。
(3)所述PCR酶混合液包括0.5U/μl逆转录酶、5U/μl DNA聚合酶、5×RNA酶抑制剂；
(4)所述H13N6检测试剂包括H13N6特异性的引物和探针；如序列表所示的H13N6-F1、H13N6-F2、H13N6-R1、H13N6-R2、H13N6-P1、H13N6-P2；各引物浓度均为0.2mM，探针浓度均为0.1mM。
(5)阳性对照品：以HA13基因和NA6基因的两个合成基因片段连接到一个pUC57质粒载体上，然后以DEPC水进行106倍稀释，作为最终的H13N6阳性对照；
(6)阴性对照品：DEPC H2O。
实施例5——甲型流感病毒H13N6的检测方法
本实施例甲型流感病毒H13N6的实时荧光PCR检测方法，包括以下实验步骤：
(1)主要试剂、仪器：采用实施例4中的试剂盒试剂；荧光定量PCR仪为ABI7500。
(2)标本准备：阳性标本为人感染甲型流感病毒H13N6滴定后灭活病毒，然后用DEPC水进行不同倍数的稀释，阴性对照标本为健康人的唾液拭子。
(3)RNA提取：将病毒核酸快速提取试剂和待测样品等体积混合，常温静置5-10分钟，然后将裂解混合液直接用于PCR检测。
(4)靶基因的扩增：
a.引物和探针的设计：根据甲型流感病毒H13N6序列分别设计特异性引物和探针，特异性引物和探针分别是针对H13N6的HA基因和NA基因两个靶标的特异性引物扩增区内设计、能够区别其他病毒株，分别为两组特异性引物探针对。其特异性引物和探针为：
H13N6-F1：5’-TCATATTGATTGAGATCTTACG-3’
H13N6-F2：5’-TGATGACACCTAAGTAATGACT-3’
H13N6-R1：5’-AGTGCACTGCATTGAACCACA-3’
H13N6-R2：5’-CCACTGCTCCATGCCCACATTAT-3’
H13N6-P1：5’-FAM-TGCTCACATGRACTGTAGCCCAGC-BHQ-3’
H13N6-P2：5’-VIC-ACAGCCTTAATGCTCCACAGCACTGC-BHQ-3’
b.阳性对照：本方法中的阳性对照为HA13基因和NA6基因的两个合成基因片段连接到一个pUC57质粒载体上，该质粒用DEPC水进行106倍稀释，最终作为本方法中的阳性对照。
c.RT-PCR反应平台：总体积25μl的H13N6扩增体系中分别加入PCR扩增试剂12μl，PCR酶混合液4μl，H13N6检测试剂4μl，核酸标本5μl。PCR扩增的反应条件为50℃逆转录15min；95℃预变性5min；95℃变性10s，55℃退火和延伸40s，40个循环。
d.数据处理：
反应结束后，根据实际情况分别调节FAM和VIC通道的Baseline的Start值、End值以及Threshold的Value值(Start值建议设在3～15、End值建议设在5～20，同时调整阴性对照的扩增曲线平直或低于阈值线)，点击Analysis获得分析结果，得到FAM和VIC通道的Ct值；
e.有效性判断：
阴/阳性对照品检测结果需满足表6要求，否则，本次实验结果无效。
表6阴/阳性对照品判读标准
Figure GDA0003928921270000131
f.结果判读：
f1.H13N6管阳性判读：FAM通道CT≤39，H13亚型阳性；FAM通道CT≤39且VIC通道CT≤39，H13N6阳性。
F2.阴性判读：阳性判读以外的其它结果，均判为阴性。
(5)实验结果：
a.特异性检测结果：如图5所示，依据本发明建立的荧光RT-PCR方法对甲型流感病毒H13N6具有较好的特异性，甲型流感病毒H13N6型患者的唾液拭子检测结果显示阳性(CT值为22)，对其它流感病毒和空白对照等均无交叉反应(CT无数值)，见表7。
表7 H13N6试剂对不同流感病毒类型的检测结果
Figure GDA0003928921270000132
Figure GDA0003928921270000141
b.灵敏性试验结果：对甲型流感病毒H13N6型病毒毒株采用MDCK细胞进行病毒效价测定，然后将其分别稀释至500、100、10、5、0TCID50/L，用本试剂盒提供的病毒核酸快速提取试剂进行RNA提取，然后用本发明建立的荧光RT-PCR方法进行检测，同图6a(FAM荧光通道)和图6b(VIC荧光通道)所示，图中从A至E的扩增曲线依次表示采用本扩增体系对500、100、10、5、0TCID50/L浓度的甲型流感病毒H13N6型进行扩增检测的结果(FAM荧光通道CT值依次为22、25、28、33、无数值；VIC荧光通道CT值依次为22、26、30、33、无数值)，结果表明荧光RT-PCR方法检测甲型流感病毒H13N6型的敏感性达到5TCID50/L(CT值为33)。
c.临床样本的检测结果：从甲型流感病毒H13N6型疑似患者的12份临床样本中提取病毒RNA，用本发明荧光RT-PCR方法进行检测，结果同图7(H13N6)所示，本发明方法检测H13N6阳性2份(CT值分别为28、32)。测序确认，采用本发明多重荧光PCR方法检测该12份样本的阳性符合率为100％，由此可见，本发明方法具有高度准确性。
d.重复性检测结果：采用2例甲型流感病毒H13N6阳性的临床样本，用本发明多重荧光PCR方法各重复检测6次检测，结果如表8所示，各样本重复6次检测结果CT值的CV＜2％(CV＝CT标准偏差÷CT平均值)，其中CV值为变异系数，是衡量指标中各观测值变异程度的一个统计量，荧光PCR平台通常使用CT值的CV值来衡量检测重复性，表明本实施例依据本发明建立的多重荧光PCR方法的检测重复性较好。
表8甲型流感病毒H13N6核酸检测试剂的重复性检测结果
Figure GDA0003928921270000151
Figure GDA0003928921270000161
综上所述，本实施例中检测结果显示表明本发明方法的敏感性好、特异性高、且准确可靠。
实施例6——验证病毒核酸快速提取试剂中的KCl对荧光PCR检测效果的影响
(1)按照本发明提供的配方配制含有KCl的病毒核酸快速提取试剂A：pH为10.0的500mM Tris-HCl、10％v/v TritonX100、4M异硫氰酸胍、100mM KCl、pH为8.0的0.2M EDTA。
(2)配制不含KCl的病毒核酸快速提取试剂B：pH为10.0的500mM Tris-HCl、10％TritonX100、4M异硫氰酸胍、pH为8.0的0.2M EDTA。
(3)采用H13N6阳性临床样本，分别用病毒核酸快速提取试剂A、病毒核酸快速提取试剂B与样本等体积混合，常温静置5-10分钟，然后将裂解混合液A、B分别用于PCR检测。
(4)采用本发明提供的H13N6荧光PCR检测试剂进行PCR检测，PCR检测步骤同实施例5。
从图8所示的荧光定量PCR检测结果显示，不含KCl的病毒核酸快速提取试剂B的扩增结果(FAM-B、VIC-B)CT值落后于含有KCl的病毒核酸快速提取试剂A(FAM-A、VIC-A)。由此可见，本发明提供的病毒核酸快速提取试剂引入KCl，对PCR扩增体系具有促进作用，能够有效提高PCR扩增效率。
实施例7——甲型流感病毒H8N7和H13N6的联合检测试剂盒
本实施例利用实时荧光PCR双重联合检测甲型流感病毒H8N7和H13N6的试剂盒，包括：病毒核酸快速提取试剂、PCR扩增试剂、PCR酶混合液、H8N7检测试剂、H13N6检测试剂、阳性对照品、阴性对照品。其中：
(1)所述病毒核酸快速提取试剂包括裂解试剂，裂解试剂包含：500mM Tris-HCl(pH10.0)、10％v/v TritonX100、4M异硫氰酸胍、100mM KCl、0.2M EDTA(pH8.0)。
(2)所述PCR扩增试剂包括PCR扩增缓冲液；包含：2×PCR buffer、50mM MgCl2、100mM Tris-HCl(pH10.0)、0.5mM dNTP、5％g/ml BSA。
(3)所述PCR酶混合液包括0.5U/μl逆转录酶、5U/μl DNA聚合酶、5×RNA酶抑制剂；
(4)所述H8N7检测试剂包括H8N7特异性的引物和探针；如序列表所示的H8N7-F1、H8N7-F2、H8N7-R1、H8N7-R2、H8N7-P1、H8N7-P2；
(5)所述H13N6检测试剂包括H13N6特异性的引物和探针；如序列表所示的H13N6-F1、H13N6-F2、H13N6-R1、H13N6-R2、H13N6-P1、H13N6-P2；
(6)阳性对照品：以HA8基因和NA7基因的两个合成基因片段连接到一个pUC57质粒载体上，以及HA13基因和NA6基因的两个合成基因片段连接到另一个pUC57质粒载体上，两个质粒分别用DEPC水进行106倍稀释，然后将两个稀释后的质粒等体积混合，最终作为H8N7和H13N6阳性对照；
(7)阴性对照品：DEPC H2O；
各引物浓度均为0.2mM，探针浓度均为0.1mM。
实施例8——甲型流感病毒H8N7和H13N6的联合检测方法
本实施例甲型流感病毒H8N7和H13N6的实时荧光PCR检测方法，包括以下实验步骤：
(1)主要试剂、仪器：采用实施例7的试剂盒试剂；荧光定量PCR仪为ABI7500。
(2)标本准备：阳性标本为人感染甲型流感病毒H8N7滴定后灭活病毒和人感染甲型流感病毒H13N6滴定后灭活病毒，然后用DEPC水进行不同倍数的稀释，阴性对照标本为健康人的唾液拭子。
(3)RNA提取：将病毒核酸快速提取试剂和待测样品等体积混合，常温静置5-10分钟，然后将裂解混合液直接用于PCR检测。
(4)靶基因的扩增：
a.引物和探针的设计：根据甲型流感病毒H8N7和H13N6序列分别设计特异性引物和探针，特异性引物和探针分别是针对H8N7的HA基因和NA基因两个靶标以及针对H13N6的HA基因和NA基因两个靶标的特异性引物扩增区内设计、能够区别其他病毒株，分别为两组特异性引物探针对。其特异性引物和探针为：
H8N7-F1：5’-GCTGGATGCTGACGGAACTTAG-3’
H8N7-F2：5’-GATGACTGGTTCGGATGACATCT-3’
H8N7-R1：5’-TTGACTAAATGGACGATATTATC-3’
H8N7-R2：5’-CAAATCGGAGATTATTCTAGCGA-3’
H8N7-P1：5’-FAM-CGATTGCTGCAGGACACTAATCCTGC-BHQ-3’
H8N7-P2：5’-VIC-TAGACATAGGTCATGCCTGTGTCCATC-BHQ-3’
H13N6-F1：5’-TCATATTGATTGAGATCTTACG-3’
H13N6-F2：5’-TGATGACACCTAAGTAATGACT-3’
H13N6-R1：5’-AGTGCACTGCATTGAACCACA-3’
H13N6-R2：5’-CCACTGCTCCATGCCCACATTAT-3’
H13N6-P1：5’-FAM-TGCTCACATGRACTGTAGCCCAGC-BHQ-3’
H13N6-P2：5’-VIC-ACAGCCTTAATGCTCCACAGCACTGC-BHQ-3’
b.阳性对照：本方法中的阳性对照为HA8基因和NA7基因的两个合成基因片段连接到一个pUC57质粒载体上，以及HA13基因和NA6基因的两个合成基因片段连接到另一个pUC57质粒载体上，两个质粒分别用DEPC水进行106倍稀释，然后将两个稀释后的质粒等体积混合，最终作为本方法中的阳性对照。
c.RT-PCR反应平台：总体积25μl的H8N7扩增体系中分别加入PCR扩增试剂12μl，PCR酶混合液4μl，H8N7检测试剂4μl，核酸标本5μl；总体积25μl的H13N6扩增体系中分别加入PCR扩增试剂12μl，PCR酶混合液4μl，H13N6检测试剂4μl，核酸标本5μl。PCR扩增的反应条件为50℃逆转录15min；95℃预变性5min；95℃变性10s，55℃退火和延伸40s，40个循环。
d.数据处理：
反应结束后，根据实际情况分别调节FAM和VIC通道的Baseline的Start值、End值以及Threshold的Value值(Start值建议设在3～15、End值建议设在5～20，同时调整阴性对照的扩增曲线平直或低于阈值线)，点击Analysis获得分析结果，得到FAM和VIC通道的Ct值；
e.有效性判断：
阴/阳性对照品检测结果需满足表3、6要求，否则，本次实验结果无效。
f.结果判读：
f1.H8N7管阳性判读：FAM通道CT≤39，H8亚型阳性；FAM通道CT≤39且VIC通道CT≤39，H8N7阳性。
f2.H13N6管阳性判读：FAM通道CT≤39，H13亚型阳性；FAM通道CT≤39且VIC通道CT≤39，H13N6阳性。
f3.阴性判读：阳性判读以外的其它结果，均判为阴性。
(5)实验结果
a.特异性检测结果：同图1所示，依据本发明建立的荧光RT-PCR方法对甲型流感病毒H8N7具有较好的特异性，甲型流感病毒H8N7型患者的唾液拭子检测结果显示阳性，对其它流感病毒和空白对照等均无交叉反应(如表4所示)；同图5所示，依据本发明建立的荧光RT-PCR方法对甲型流感病毒H13N6具有较好的特异性，甲型流感病毒H13N6型患者的唾液拭子检测结果显示阳性，对其它流感病毒和空白对照等均无交叉反应(如表7所示)。
b.灵敏性试验结果：对甲型流感病毒H8N7型病毒毒株采用MDCK细胞进行病毒效价测定，然后将其分别稀释至1000、100、10、5、0TCID50/L，用本试剂盒提供的病毒核酸快速提取试剂进行RNA提取，然后用本发明建立的荧光RT-PCR方法进行检测，同图2a(FAM荧光通道)和图2b(VIC荧光通道)所示，图中从A至E的扩增曲线依次表示采用本扩增体系对1000、100、10、5、0TCID50/L浓度的甲型流感病毒H8N7型进行扩增检测的结果，结果表明荧光RT-PCR方法检测甲型流感病毒H8N7型的敏感性达到5TCID50/L；对甲型流感病毒H13N6型病毒毒株采用MDCK细胞进行病毒效价测定，然后将其分别稀释至500、100、10、5、0TCID50/L，用本试剂盒提供的病毒核酸快速提取试剂进行RNA提取，然后用本发明建立的荧光RT-PCR方法进行检测，如图6a(FAM荧光通道)和图6b(VIC荧光通道)所示，图中从A至E的扩增曲线依次表示采用本扩增体系对500、100、10、5、0TCID50/L浓度的甲型流感病毒H13N6型进行扩增检测的结果，结果表明荧光RT-PCR方法检测甲型流感病毒H13N6型的敏感性达到5TCID50/L。
c.临床样本的检测结果：从甲型流感病毒H8N7型疑似患者的10份临床样本和甲型流感病毒H13N6型疑似患者的12份临床样本中提取病毒RNA，用本发明荧光RT-PCR方法进行检测，结果同图3(H8N7)和图7(H13N6)所示，本发明方法检测出H8N7阳性5份、H13N6阳性2份。经测序确认，采用本发明多重荧光PCR方法检测该22份样本的阳性符合率为100％，由此可见，本发明方法具有高度准确性。
d.重复性检测结果：分别采用2例甲型流感病毒H8N7阳性的临床样本、2例甲型流感病毒H13N6阳性的临床样本，用本发明多重荧光PCR方法各重复检测6次检测，结果分别如表5、8所示，各样本重复6次检测结果CT值的CV＜2％(CV＝CT标准偏差÷CT平均值)，其中CV值为变异系数，是衡量指标中各观测值变异程度的一个统计量，荧光PCR平台通常使用CT值的CV值来衡量检测重复性，表明本实施例依据本发明建立的多重荧光PCR方法的检测重复性较好。
综上所述，本实施例中检测结果显示表明本发明方法的敏感性好、特异性高、且准确可靠。
实施例9——本发明提供的病毒核酸快速提取试剂与市售的北京庄盟国际生物基因科技有限公司的Virus RNA Kit(ZP414)的核酸提取效率比较
(1)采用人感染甲型流感病毒H8N7滴定后灭活病毒样本和人感染甲型流感病毒H13N6滴定后灭活病毒样本，用DEPC水进行稀释，分别做为阳性样品A、B。
(2)将阳性样品A、B分别用本发明提供的病毒核酸快速提取试剂进行RNA提取：将病毒核酸快速提取试剂和待测阳性样品等体积混合，常温静置5-10分钟，然后将裂解混合液样本A1、B1分别用于PCR检测。
(3)将阳性样品A、B分别用北京庄盟国际生物基因科技有限公司的Virus RNA Kit(ZP414)进行核酸提取，然后将提取的样本A2、B2分别用于PCR检测。
(4)将提取的样本A1、A2用本发明提供的H8N7检测试剂进行荧光定量PCR检测，检测方法同实施例2。
(5)将提取的样本B1、B2用本发明提供的H13N6检测试剂进行荧光定量PCR检测，检测方法同实施例5。
从图9所示的H8N7荧光定量PCR检测结果显示，采用北京庄盟国际生物基因科技有限公司的Virus RNA Kit(ZP414)的A2扩增曲线CT值(FAM和VIC通道CT值均为30)落后于本发明病毒核酸快速提取试剂的A1扩增曲线CT值(FAM和VIC通道CT值均为26)；从图10所示的H13N6荧光定量PCR检测结果显示，采用北京庄盟国际生物基因科技有限公司的Virus RNAKit(ZP414)的B2扩增曲线CT值(FAM和VIC通道CT值均为31)仍落后于本发明病毒核酸快速提取试剂的B1扩增曲线CT值(FAM和VIC通道CT值均为29)。由此可见，本发明病毒核酸快速提取试剂的提取效率高于市售的核酸提取试剂盒。
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 上海伯杰医疗科技有限公司
<120> 甲型流感病毒H8N7的检测试剂盒及检测方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> 针对H8N7的HA基因设计的PCR检测上游引物序列
<400> 1
gctggatgct gacggaactt ag 22
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(23)
<223> 针对H8N7的HA基因设计的PCR检测下游引物序列
<400> 2
gatgactggt tcggatgaca tct 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(23)
<223> 针对H8N7的NA基因设计的PCR检测上游引物序列
<400> 3
ttgactaaat ggacgatatt atc 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(23)
<223> 针对H8N7的NA基因设计的PCR检测下游引物序列
<400> 4
caaatcggag attattctag cga 23
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(26)
<223> 针对H8N7的HA基因设计的PCR检测探针序列
<400> 5
cgattgctgc aggacactaa tcctgc 26
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(27)
<223> 针对H8N7的NA基因设计的PCR检测探针序列
<400> 6
tagacatagg tcatgcctgt gtccatc 27

Claims (2)

1.一种甲型流感病毒H8N7的检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括病毒核酸快速提取试剂、PCR扩增试剂、PCR酶混合液、H8N7检测试剂、阳性对照品、阴性对照品；其中：
所述病毒核酸快速提取试剂包含：pH为10.0的500mM Tris-HCl、10%v/v TritonX100、4M异硫氰酸胍、100mM KCl、pH为8.0的0.2M EDTA；
所述PCR扩增试剂包含：2×PCR buffer、50mM MgCl2、pH为10.0的100mM Tris-HCl、0.5mM dNTP、5%g/ml BSA；
所述PCR酶混合液包括0.5 U/μl逆转录酶、5U/μl DNA聚合酶、5×RNA酶抑制剂；
所述H8N7检测试剂包含： H8N7基因的扩增引物和探针；探针H8N7-P1的5’端标记有报告荧光染料FAM，3’端标记有淬灭荧光染料BHQ；探针H8N7-P2的5’端标记有报告荧光染料VIC，3’端标记有淬灭荧光染料BHQ；引物探针序列为：
H8N7-F1：5’-GCTGGATGCTGACGGAACTTAG-3’
H8N7-F2：5’-GATGACTGGTTCGGATGACATCT-3’
H8N7-R1：5’-TTGACTAAATGGACGATATTATC-3’
H8N7-R2：5’-CAAATCGGAGATTATTCTAGCGA-3’
H8N7-P1：5’-FAM-CGATTGCTGCAGGACACTAATCCTGC-BHQ-3’
H8N7-P2：5’-VIC-TAGACATAGGTCATGCCTGTGTCCATC-BHQ-3’
所述阳性对照品为：HA8基因和NA7基因的两个合成基因片段连接到一个pUC57质粒载体上，然后以DEPC水进行106倍稀释，作为最终的阳性对照；
所述阴性对照品为：DEPC H2O。
2.根据权利要求1所述的甲型流感病毒H8N7的检测试剂盒，其特征在于：各引物浓度均为0.2mM，探针浓度均为0.1mM。
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Address after: 201415 rooms 1302, 1303, 1304, 1305, 1306, 1307 and 1309, building 3, 1588, Huhang Road, Fengxian District, Shanghai

Patentee after: Shanghai Berger Medical Technology Co.,Ltd.

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Patentee before: SHANGHAI BOJIE MEDICAL TECHNOLOGY CO.,LTD.

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Patentee after: Berger (Qingdao) Medical Technology Co.,Ltd.

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