CN102212615A

CN102212615A - 基于耐高温RNase HII的单核苷酸多态性检测方法

Info

Publication number: CN102212615A
Application number: CN2011100825424A
Authority: CN
Inventors: 侯敬丽; 张琳; 刘建华; 梁齐
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2011-04-01
Filing date: 2011-04-01
Publication date: 2011-10-12

Abstract

一种生物检测技术领域的基于耐高温RNase HII的单核苷酸多态性检测方法，其涉及的分子信标序列为：5’-(FAM)CCGACG X_7-13yX_7-13CGTCGG(Dabcyl)-3’，其中：y表示任意a，u，c，g四种核糖核苷酸的一种，X表示任意A，T，C，G四种脱氧核糖核苷酸的一种，X下标数字表示连续7-13个脱氧核糖核苷酸。对应的扩增目标序列的引物为：HLA-A-F：5’-GCTCCCACTCCATGAGGTATT-3’/HLA-A-R：5’-GGGACAAGGGTCTCGGAGT-3’。本检测方法操作简便，准确度高，不需要大型昂贵仪器，可用于测定各种生物的SNP。

Description

基于耐高温RNase HII的单核苷酸多态性检测方法

技术领域

本发明涉及的是一种生物检测技术领域的方法，具体是一种基于耐高温RNase HII的单核苷酸多态性检测方法。

背景技术

核酸检测和SNP分析已经是一个很大的产业。这些技术不仅在科学研究上获得广泛的应用，在临床诊断、食品检测、法医鉴定等领域的重要性也越来越明显，例如利用SNP可以更好的理解遗传疾病的复杂基础，实现药物治疗[Gene，1999 234，177-186.]。现今的核酸检测和SNP分析技术种类多样，然而目前的方法仍然存在费时费力，通量不高和步骤繁琐等问题[Nat.Rev.Genet，2001，2：930-942；Pharmacogenomics，2000，1：95-100.]，因此SNP检测的高通量与灵敏度，以及简单操作、缩短检测时间目前仍是基因和SNP检测的发展方向。

经过对现有技术的检索发现，Hou J，Liu X，Zheng Y，Liu J.A method for HLA genotyping using the specific cleavage of DNA-rN1-DNA/DNA with RNase HII from Chlamydia pneumoniae Oligonucleotides(利用Chlamydia pneumoniae核糖核酸酶HII酶切DNA-rN1-DNA/DNA底物的特异性检测SNP的方法研究，2007-12-27；Vol 17(4)：433-443)中记载了RNase H是一种特异的内切核糖核酸酶，它能够降解RNA/DNA链中的RNA。目前研究证明RNaseHII能够酶切正确配对的嵌合一个核糖核苷酸的DNA-rN₁-DNA/DNA杂合双链，并且衣原体RNaseHII不能酶切这种错配底物或者酶切效率非常低，因此利用衣原体RNaseHII能够实现对SNP的检测。

最近研究表明耐高温菌的RNase HII具有与衣原体RNaseHII相似的酶切性质，能够酶切正确配对的DNA-rN₁-DNA/DNA底物，不能酶切这种错配底物。另外耐高温菌的RNase HII能够耐受高温，因此在SNP检测方面具备比常温RNaseHII更广泛的应用潜力。

发明内容

本发明针对现有技术存在的上述不足，提供一种基于耐高温RNase HII的单核苷酸多态性检测方法，检测方法操作简便，准确度高，不需要大型昂贵仪器，可用于测定各种生物的SNP。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明涉及一种分子信标，其序列为：5’-(FAM)CCGACG X_7-13yX_7-13CGTCGG(Dabcyl)-3’，其中：y表示任意a，u，c，g四种核糖核苷酸的一种，X表示任意A，T，C，G四种脱氧核糖核苷酸的一种，X下标数字表示连续7-13个脱氧核糖核苷酸。

所述的分子信标的全长27-39个核苷酸，嵌合一个核糖核苷酸，分子信标5’端有荧光基团FAM，3’端具有荧光淬灭基团Dabcyl。分子信标5’端6-8个核苷酸与3’端6-8个核苷酸互补配对，使分子信标常温下形成茎环结构，荧光基因不能发出荧光。分子信标中间部位嵌合的一个核糖核酸核苷酸与待检SNP位点配对。除了5’端和3’端6-8个核苷酸序列，分子信标其余核苷酸与待测目标序列DNA的SNP位点两侧核苷酸完全配对；

本发明上述分子信标的扩增目标序列的引物，由特异性正向引物和反向引物组成，其序列分别为：

HLA-A-F：5’-GCTCCCACTCCATGAGGTATT-3’

HLA-A-R：5’-GGGACAAGGGTCTCGGAGT-3’。

本发明涉及一种基于耐高温RNase HII的单核苷酸多态性检测方法，通过将含有目标序列、扩增目标序列的特异性正向引物和反向引物、检测目标序列SNP的分子信标、vent(-exo)DNA聚合酶、耐高温RNase HII和不影响耐高温RNase HII活性的聚合酶链式反应缓冲液的单核苷酸多态性测定反应混合物用PCR仪进行扩增，定量PCR仪实时检测反应混合物发出的荧光强度，并根据荧光强度检测得到目标DNA的SNP类型。

所述的扩增是指：采用热稳定性DNA聚合酶催化的聚合酶链式反应(PCR)扩增双链DNA，将聚合酶链式反应后的混合物置于质量浓度为1.5％的琼脂糖凝胶中，利用胶回收试剂盒回收扩增的目标片断；其中的聚合酶链式反应体系由热稳定性DNA聚合酶反应缓冲液、待测目标DNA模板分子、待测目标DNA特异性引物、dNTPs和热稳定性DNA聚合酶组成。

所述的荧光强度检测是指：SNP检测反应混合物在下列条件下进行实时荧光PCR。反应所用的仪器为定量PCR仪，仪器运行前设定检测方法，包括荧光检测基团FAM的设定；荧光检测区域的设定；反应运行程序的设定：95℃×5分钟；(95℃×30秒，49℃×2分，49℃×10秒荧光检测，72℃×30秒)×30循环，其中49℃×10秒荧光检测表示仪器在此阶段自动检测SNP混合反应物的荧光强度并且自动保存。反应结束后分析检测的荧光信号强度，获得待测目标DNA待测位点单核苷酸多态性。

本发明与现有SNP测定技术相比有显著的进步。主要优点如下：(1)操作简便、结果稳定，只需要进行简单可靠的实时荧光PCR反应；(2)操作通量大，每次可以做96/384个反应；(3)不需要大型昂贵设备，整个操作过程中仅需要定量PCR仪。本发明可用于测定各种SNP，包括微生物、植物、动物、人的SNP。

附图说明

图1基于耐热性RNase HII蛋白的单核苷酸多态性检测方法示意图。

图2耐热性RNase HII检测SNP位点的实施例1示意图。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

人类白细胞抗原A型(HLA-A)基因rs113699656SNP位点的测定

本实施例中的，待测SNP位点为人HLA-A基因rs113699656SNP位点，耐热性RNase HII蛋白为TthRNase HII，目标DNA为人类基因组DNA，具体实施步骤如下：

第一步，设计合成用于测定人HLA-A基因rs113699656SNP位点的嵌合分子信标。2条嵌合核糖核苷酸的分子信标分别为A274c、A274a，它们序列如下：

A274c：5’-(FAM)CCGACG CTTCATCGCcGTGGGCTAC CGTCGG(Dabcyl)-3’

A274a：5’-(FAM)CCGACG CTTCATCGCaGTGGGCTAC CGTCGG(Dabcyl)-3’

其中，分子信标全长31个核苷酸，小写字母表示核糖核苷酸，大写字母表示脱氧核糖核苷酸。分子信标的5’端用荧光基团FAM标记，3’端用淬灭基因Dabcyl标记。5’端第16位的核糖核苷酸对应于人HLA-A基因的待测rs113699656 SNP位点，整条分子信标下划线标识的核苷酸与人HLA-A基因除SNP位点外的18个碱基完全互补配对。分子信标可以自己利用DNA合成仪合成或由各DNA合成公司合成。

第二步，人基因组DNA的抽提。获得的人体新鲜血液加入15g/L EDTA.2Na的抗凝剂防止血液凝固。血液中加入红细胞裂解液裂解红细胞，并且按照操作说明利用人基因组抽提试剂盒抽提人基因组DNA。

第三步，设计合成用于扩增人HLA-A基因片断的特异性引物。正向、反向引物分别为HLA-A-F、HLA-A-R，引物碱基序列如下：

HLA-A-F：5’-GCTCCCACTCCATGAGGTATT-3’

HLA-A-R：5’-GGGACAAGGGTCTCGGAGT-3’

引物分别与人HLA-A基因的一段393bp的DNA序列的两端互补配对，引物可以自己利用DNA合成仪合成或由各DNA合成公司合成。

第四步，人HLA-A基因片断制备。首先采用Taq DNA聚合酶催化的PCR扩增人HLA-A基因片断。PCR反应混合物组成(50微升)：正向引物(HLA-A-F)与反向引物(HLA-A-R)，0.5μM；50纳克人基因组DNA；dNTPs，200μM；Taq DNA聚合酶，2.5单位；10×Taq DNA聚合酶反应缓冲液，5微升；补加去离子水至总体积为50微升。PCR反应条件：95℃×5分钟；(95℃×60秒，54℃×60秒，72℃×60秒)×30循环；72℃×2分钟。扩增DNA片段长度为393bp，然后用胶回收试剂盒纯化人HLA-A基因片断。

第五步，配制SNP测定反应混合物。SNP测定反应混合物组成(10微升)：分子信标(A274c或A274a，共两个反应管，每个反应管只加入一种分子信标)，0.5μM；人HLA基因片断，5纳克；耐热性RNase HII蛋白，5微克；人HLA基因片断的正向引物与反向引物HLA-A-F和HLA-A-R，0.3μM；dNTPs，200μM；vent(-exo)DNA聚合酶，0.5单位；10×DNA聚合酶反应缓冲液，1.0微升；补加去离子水至总体积为10微升。

第六步，实时荧光PCR检测人HLA-A基因片断SNP。人HLA-A基因片断SNP测定反应混合物在下列条件下进行实时荧光PCR，反应程序：95℃×5分钟；(95℃×30秒，49℃×2分，49℃×10秒荧光检测，72℃×30秒)×30循环。观察荧光信号强度，检测待测目标DNA待测位点单核苷酸多态性。图2表示了采用上述分子信标和检测方法，一个人类基因组样品的实时荧光检测图谱。A274c或者A274a特异性的分子信标分别识别C或者A多态性位点，利用基于耐热性RNase HII的SNP检测方法鉴定这个样品得到荧光检测图谱。如图所示利用A274c分子信标检测样品时测得的荧光强度显著增加，而利用A274a分子信标检测样品时荧光强度几乎没有增加。这些结果表明，此人类基因组HLA基因rs113699656SNP位点的碱基是C而不是A。

实施例2

人类白细胞抗原A型(HLA-A)基因rs78625613SNP位点的测定

本实施例中的，待测SNP位点为人HLA-A基因rs78625613SNP位点，耐热性RNase HII蛋白为TthRNase HII，目标DNA为人类基因组DNA，具体实施步骤如下：

第一步，设计合成用于测定人HLA-A基因SNP位点的嵌合分子信标。2条嵌合核糖核苷酸的分子信标分别为A370g、A370u，它们序列如下：

A370g 5’-(FAM)CGGGCT AGCAGGAGGGgCCGGAGTATT AGCCCG(Dabcyl)-3’

A370u 5’-(FAM)CGGGCT AGCAGGAGGGuCCGGAGTATT AGCCCG(Dabcyl)-3’

其中，分子信标全长31个核苷酸，小写字母表示核糖核苷酸，大写字母表示脱氧核糖核苷酸。分子信标的5’端用荧光基团FAM标记，3’端用淬灭基因Dabcyl标记。5’端第17位的核糖核苷酸对应于人HLA-A基因的待测rs78625613SNP位点，整条分子信标下划线标识的核苷酸与人HLA-A基因除SNP位点外的20个碱基完全互补配对。分子信标可以自己利用DNA合成仪合成或由各DNA合成公司合成。

第二步-第四步同实施例1的第二步-第四步步骤。

第五步，配制SNP测定反应混合物。SNP测定反应混合物组成(10微升)：分子信标(A370g或A370u，共两个反应管，每个反应管只加入一种分子信标)，0.5μM；人HLA基因片断，5纳克；耐热性RNase HII蛋白，5微克；人HLA基因片断的正向引物与反向引物HLA-A-F和HLA-A-R，0.3μM；dNTPs，200μM；vent(-exo)DNA聚合酶，0.5单位；10×DNA聚合酶反应缓冲液，1.0微升；补加去离子水至总体积为10微升。

第六步，实时荧光PCR检测人HLA-A基因片断SNP。人HLA-A基因片断SNP测定反应混合物在下列条件下进行实时荧光PCR，反应程序：95℃×5分钟；(95℃×30秒，49℃×2分，49℃×10秒荧光检测，72℃×30秒)×30循环。观察荧光信号强度，鉴定目标DNA待测位点单核苷酸多态性为G。

实施例3

人类白细胞抗原A型(HLA-A)基因rs113607596SNP位点的测定

本实施例中的，待测SNP位点为人HLA-A基因rs113607596SNP位点，耐热性RNase HII蛋白为TthRNase HII，目标DNA为人类基因组DNA，具体实施步骤如下：

第一步，设计合成用于测定人HLA-A基因SNP位点的嵌合分子信标。2条嵌合核糖核苷酸的分子信标分别为A562a、A562g，它们序列如下：

A562a 5’-(FAM)CGCGAT TCCGAGATCCaCCCCGAAGCC ATCGCG(Dabeyl)-3’

A562g 5’-(FAM)CGCGAT TCCGAGATCCgCCCCGAAGCC ATCGCG(Dabeyl)-3’

其中，分子信标全长31个核苷酸，小写字母表示核糖核苷酸，大写字母表示脱氧核糖核苷酸。分子信标的5’端用荧光基团FAM标记，3’端用淬灭基因Dabcyl标记。5’端第17位的核糖核苷酸对应于人HLA-A基因的待测rs113607596SNP位点，整条分子信标下划线标识的核苷酸与人HLA-A基因除SNP位点外的20个碱基完全互补配对。分子信标可以自己利用DNA合成仪合成或由各DNA合成公司合成。

第二步到第四步同实施例1的第二步到第四步步骤。

第五步，配制SNP测定反应混合物。SNP测定反应混合物组成(10微升)：分子信标(A562a或A562g，共两个反应管，每个反应管只加入一种分子信标)，0.5μM；人HLA基因片断，5纳克；耐热性RNase HII蛋白，5微克；人HLA基因片断的正向引物与反向引物HLA-A-F和HLA-A-R，0.3μM；dNTPs，200μM；vent(-exo)DNA聚合酶，0.5单位；10×DNA聚合酶反应缓冲液，1.0微升；补加去离子水至总体积为10微升。

第六步，实时荧光PCR检测人HLA-A基因片断SNP。人HLA-A基因片断SNP测定反应混合物在下列条件下进行实时荧光PCR，反应程序：95℃×5分钟；(95℃×30秒，49℃×2分，49℃×10秒荧光检测，72℃×30秒)×30循环。观察荧光信号强度，鉴定目标DNA待测位点单核苷酸多态性为A。

Claims

1.一种基于耐高温RNase HII的单核苷酸多态性检测方法，其特征在于，通过将含有目标序列、扩增目标序列的特异性正向引物和反向引物、检测目标序列SNP的分子信标、vent(-exo)DNA聚合酶、耐高温RNase HII和不影响耐高温RNase HII活性的聚合酶链式反应缓冲液的单核苷酸多态性测定反应混合物用PCR仪进行扩增，定量PCR仪实时检测反应混合物发出的荧光强度，并根据荧光强度检测得到目标DNA的SNP类型。

2.根据权利要求1所述的基于耐高温RNase HII的单核苷酸多态性检测方法，其特征是，所述的分子信标的序列为：5’-(FAM)CCGACG X_7-13yX_7-13CGTCGG(Dabcyl)-3’，其中：y表示任意a，u，c，g四种核糖核苷酸的一种，X表示任意A，T，C，G四种脱氧核糖核苷酸的一种，X下标数字表示连续7-13个脱氧核糖核苷酸。

3.根据权利要求1或2所述的基于耐高温RNase HII的单核苷酸多态性检测方法，其特征是，所述的分子信标的全长27-39个核苷酸，嵌合一个核糖核苷酸，分子信标5’端有荧光基团FAM，3’端具有荧光淬灭基团Dabcyl，分子信标5’端6-8个核苷酸与3’端6-8个核苷酸互补配对，使分子信标常温下形成茎环结构，分子信标中间部位嵌合的一个核糖核酸核苷酸与待检SNP位点配对，除了5’端和3’端6-8个核苷酸序列，分子信标其余核苷酸与待测目标序列DNA的SNP位点两侧核苷酸完全配对。

4.根据权利要求1所述的基于耐高温RNase HII的单核苷酸多态性检测方法，其特征是，所述的扩增目标序列的特异性正向引物和反向引物，其序列分别为：

HLA-A-F：5’-GCTCCCACTCCATGAGGTATT-3’

HLA-A-R：5’-GGGACAAGGGTCTCGGAGT-3’。

5.根据权利要求1所述的基于耐高温RNase HII的单核苷酸多态性检测方法，其特征是，所述的扩增是指：采用热稳定性DNA聚合酶催化的聚合酶链式反应扩增双链DNA，将聚合酶链式反应后的混合物置于质量浓度为1.5％的琼脂糖凝胶中，利用胶回收试剂盒回收扩增的目标片断；其中的聚合酶链式反应体系由热稳定性DNA聚合酶反应缓冲液、待测目标DNA模板分子、待测目标DNA特异性引物、dNTPs和热稳定性DNA聚合酶组成。

6.根据权利要求1所述的基于耐高温RNase HII的单核苷酸多态性检测方法，其特征是，所述的荧光强度检测是指：SNP检测反应混合物在下列条件下进行实时荧光PCR。