CN114369684B

CN114369684B - 用于马病毒性动脉炎病毒实时荧光rt-pcr检测的引物、探针、试剂盒、方法及其应用

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Publication number: CN114369684B
Application number: CN202111303332.3A
Authority: CN
Inventors: 朱道中; 曹志玲; 熊文杰; 佟铁铸; 李明; 鱼海琼; 罗琼
Original assignee: Guangzhou Customs Technology Center
Current assignee: Guangzhou Customs Technology Center
Priority date: 2021-11-05
Filing date: 2021-11-05
Publication date: 2024-04-02
Anticipated expiration: 2041-11-05
Also published as: CN114369684A

Abstract

本发明公开了一种用于马病毒性动脉炎病毒实时荧光RT‑PCR检测的引物、探针、试剂盒、方法及其应用，涉及病毒检测技术领域，解决了现有技术中缺乏用于检测马病毒性动脉炎病毒核酸的荧光RT‑PCR检测方法的问题。本发明的两套引物和各自对应的探针既可独立用于检测马病毒性动脉炎病毒基因组RNA，也可同时用于检测马病毒性动脉炎病毒基因组RNA。本发明通过对基于上述引物和探针构建的反应体系和反应条件进行优化后，所建立的用于检测马病毒性动脉炎病毒基因组RNA的单重和多重实时荧光RT‑PCR检测方法具有扩增效率更高、特异性强、灵敏度高、操作简便、反应时间短等优点，本方法具有很好的重复性、稳定性，比普通RT‑PCR检测方法灵敏度至少高100倍。

Description

用于马病毒性动脉炎病毒实时荧光RT-PCR检测的引物、探针、试剂盒、方法及其应用

技术领域

本发明涉及病毒检测技术领域，尤其涉及一种用于马病毒性动脉炎病毒实时荧光RT-PCR检测的引物、探针、试剂盒、方法及其应用。

背景技术

马病毒性动脉炎病毒(EVAV)是一种有囊膜的单股RNA病毒，该病毒归属冠状病毒科动脉炎病毒属。马病毒性动脉炎病毒在低温条件下极稳定，在 -20℃保存7年仍有活性。通常情况下，马病毒性动脉炎病毒在4℃条件下可保存35天，在37℃环境下仅存活2天，56℃条件下30分钟可使其灭活。

马病毒性动脉炎主要是通过呼吸系统和生殖系统在马属动物间传播。患病马在急性期通过呼吸道分泌物将病毒传给同群马或与其相接触的马，流产马的胎盘、胎液、胎儿亦可传播本病，长期带毒的种公马可通过自然交配或人工授精的方式把病毒传给母马。另外，健康的易感马通过与受污染的饲具、饲料、饲养人员等接触可感染该病。人工接种病毒于怀孕母马及幼驹，可使50％的幼驹死亡，母马则发生流产。大多数自然感染的马表现为亚临诊症状，实验接种马可表现为临诊症状。本病的典型症状是发热，一般感染后3-14天体温升高达 41℃，并可持续5-9天。病马出现以淋巴细胞减少为特征的白细胞减少症，临诊病期大约14天。表现厌食、精神沉郁、四肢严重水肿，步伐僵直，眼、鼻分泌物增加，后期为脓性粘液，发生鼻炎和结膜炎。面部、颈部、臀部形成皮肤疹块。有的表现呼吸困难、咳嗽、腹泻、共济失调，公马的阴囊和包皮水肿，马驹和虚弱的马可引起死亡。怀孕母马流产，其流产可达90％以上。动脉炎病毒可突破胎盘屏障而感染胎儿，胎儿常在流产前就死亡。更重要的是大多数公马恢复后会成为病毒的长期携带者，持续向环境中排出病毒，故给高价值的马产业带来了严重的威胁。

实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。其检测技术在于将标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合后, 当探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；而当高温变性、低温复性、适温延伸的热循环过程中，随着PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，在特定光激发下其发出荧光，从而被荧光监测系统接收到荧光信号，随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，荧光监测系统接收到的荧光信号也呈指数级增长。即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。若同时利用数个已知模板浓度的标准品作对照，则可得出对应的不同Ct值，从而通过样品浓度与Ct值建立的曲线图得出待测样品中所含目的基因的拷贝数。

马病毒性动脉炎最早于1953年在美国的OHIO的BUCYRUS暴发，此后在美国的肯塔基地区发病马中也分离出病毒，经鉴定与BUCYRUS株一致。后来瑞士、波兰、奥地利、加拿大也都分离到本病病毒。此外在英国、日本、法国、西班牙、爱尔兰、葡萄牙、南斯拉夫、埃及、埃塞俄比亚、摩洛哥、德国、瑞典、伊朗、印度、丹麦、荷兰、澳大利亚、新西兰和意大利等国家通过血清学调查证实有本病存在。由于我国至今仍为马病毒性动脉炎非疫区，故对该病的研究很少；同时，世界动物卫生组织至今还未明确指定该病可采用的具体荧光RT-PCR检测用引物、探针及相应的反应体系与反应条件等。为防止该外来病传入我国以及维护我国生物安全，有必要未雨绸缪，及时建立用于检测马病毒性动脉炎病毒核酸的荧光RT-PCR检测方法，以利于口岸机构针对该外来病进行有效监控。

发明内容

本发明的目的是提出一种用于马病毒性动脉炎病毒实时荧光RT-PCR检测的引物、探针、试剂盒、方法及其应用，解决了现有技术中缺乏用于检测马病毒性动脉炎病毒核酸的荧光RT-PCR检测方法的技术问题。本发明优选技术方案所能产生的诸多技术效果详见下文阐述。

为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明用于马病毒性动脉炎病毒实时荧光RT-PCR检测的引物，包括如下序列：

EVAF1：5’-GCCATTGAAGAGGCAAGTGTATTTA-3’；

EVAF2：5’-GGTCGCTGATTGACGCATACTGGG-3’；

EVAR3：5’-GTGCAAATCTAGCCCCGGGAAA-3’；

EVAR4：5’-GTCACCTGGGCTCACATCAAAA-3’。

优选的，所述引物的配对方式为：上游引物EVAF1与下游引物EVAR3配对使用；或者上游引物EVAF2与下游引物EVAR4配对使用；或者上游引物 EVAF1、上游引物EVAF2、下游引物EVAR3和下游引物EVAR4同时使用。

本发明用于马病毒性动脉炎病毒实时荧光RT-PCR检测的探针，包括如下序列：

EVAP1：5’-TTCCACCGACCACGCGTCTGCTAAGC-3’；

EVAP2：5’-CACCGTTTACGCGCTTCCCACCATATCTG-3’；

所述探针分别采用荧光素标记探针序列的5’端，采用荧光淬灭基团标记探针序列的3’端；所述探针还包括本发明中任一项所述的用于马病毒性动脉炎病毒实时荧光RT-PCR检测的引物，并且两条探针分别与引物对EVAF1、EVAR3 配对使用或者与引物对EVAF2、EVAR4配对使用；或者两条探针分别与引物对 EVAF1、EVAR3以及引物对EVAF2、EVAR4共同使用；或者两条探针与引物对EVAF1、EVAR3以及引物对EVAF2、EVAR4共同使用。

优选的，所述荧光素为Fam、Joe、Hex、Vic中的一种或多种；所述荧光淬灭基团为BHQ1、BHQ2、TAMRA中的一种或多种。

本发明用于马病毒性动脉炎病毒实时荧光RT-PCR检测的试剂盒，包括本发明中任一项所述的用于马病毒性动脉炎病毒实时荧光RT-PCR检测的探针。

利用本发明中任一项的探针或试剂盒进行马病毒性动脉炎病毒实时荧光 RT-PCR检测的方法，包括如下步骤：

S1：选取探针以及与所述探针配套使用的引物对。优选的，选用本发明中任意一套配对引物对和与之对应的荧光探针，或者同时选用本发明中的两套引物对和两条荧光探针。

S2：提取各类来源样品中的马病毒性动脉炎病毒基因组RNA。优选的，用于提取马病毒性动脉炎病毒基因组RNA的方法为：利用TIANamp Virus DNA/RNA Kit(病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒)，或利用Trizol核酸抽提取法，或利用核酸自动提取设备及其配套的全病毒基因组提取试剂盒(Promega Maxwell 16Viral Total Nucleic AcidPurification kit)。

S3：确定引物浓度、探针浓度、反转录酶用量、Taq DNA聚合酶用量、dNTPs 浓度，确定反应体系或使用试剂盒指定的反应体系。优选的，反应体系为50μ L，分别为2×FastKingOne Step Probe MasterMix 25μL，25×FastKing Enzyme Mix 2μL，探针浓度10μmol/L，探针0.5μL-1.2μL，上游引物浓度10μmol/L，上游引物1.0μL-1.5μL，下游引物浓度10μmol/L，下游引物1.0μL-1.5μL，模板RNA为1μL-3μL，补充RNaes-Free ddH₂O至50μL。

S4：选择检测仪器和检测通道。

S5：基于选用的反转录酶、引物和探针特性，确定反转录、变性、退火和延伸阶段的温度和时间，并确定反应条件；或根据使用试剂盒指定的反应条件进行验证后确定相应的反应条件。优选的，反应条件为42℃-50℃30min；95℃ 3min；95℃15sec，55℃-60℃30sec，扩增35-40个循环，在55℃-60℃结束时开始收集荧光信号。

S6：建立检测结果判定原则。优选的，对已知含有马病毒性动脉炎病毒基因组RNA的标准样品进行10倍梯度稀释，确定检测方法的灵敏度，并通过多次重复验证，明确检测结果判定原则。

S7：配制反应体系后上机检测，检测待检样品是否具有符合判定原则的马病毒性动脉炎病毒基因组特异的荧光曲线。具体的，若得到马病毒性动脉炎病毒实时荧光RT-PCR检测的特异性荧光曲线，则证明待检样品中含有马病毒性动脉炎病毒。

优选的，所述的用于马病毒性动脉炎病毒实时荧光RT-PCR检测的方法还包括如下步骤：采用不同的检测仪器时，对反应体系和反应条件进行修正。

本发明中任一项所述的用于马病毒性动脉炎病毒实时荧光RT-PCR检测的方法的单重或多重检测引物组、探针、试剂盒、反应体系和/或反应条件在检测马病毒性动脉炎病毒中的应用。

本发明提供的用于马病毒性动脉炎病毒实时荧光RT-PCR检测的引物、探针、试剂盒、方法及其应用至少具有如下有益技术效果：

(1)本发明用于马病毒性动脉炎病毒实时荧光RT-PCR检测的引物和探针，包括位于该病毒基因组序列不同区域的两套不同的引物对和探针，两者均可独立使用，也可同时使用，并相互印证。

(2)本发明充分利用荧光PCR检测技术的高效扩增、核酸杂交的良好特异性和荧光检测技术的倍增效应，针对马病毒性动脉炎病毒设计了两套用于检测该病毒RNA基因组的引物和探针，可以高效地独立或同时用于马病毒性动脉炎病毒基因组的检测，本发明具有扩增效率高、特异性强、灵敏度高、操作简便、反应时间短等优点，还具有很好的重复性和稳定性。

(3)本发明中的两套引物和探针所处区域的序列片段总长度均不足 100bp，故可以高效地检测马病毒性动脉炎病毒基因，相对普通RT-PCR方法而言，本发明具有操作简单、省时省力、结果准确、灵敏度高等特点，可明显提高检测效率。

(4)本发明的两套引物和探针可以在同一个反应体系和同样的反应条件下实施，不需要单独建立反应体系和反应条件，大大提高了检测的便利性；同时两套引物和探针所针对的检测区域不同，故在一定程度上可以避免因为病毒变异而导致漏检现象的发生。另一方面，本发明还可以对检测结果进行相互印证，确保检测结果的准确可靠。

(5)经验证，基于本发明中的引物和探针而建立的实时荧光RT-PCR检测方法，其检测灵敏度比OIE推荐的普通RT-PCR方法灵敏度至少高100倍。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明的检测原理示意图；

图2是分别采用本发明的两套引物和对应的探针所建立的实时荧光 RT-PCR检测方法的特异性试验结果图；

图3是采用本发明的两套引物和对应的探针分别所建立的实时荧光 RT-PCR方法的灵敏度试验结果图；

图4是采用OIE推荐的普通RT-PCR检测方法的灵敏度试验结果图；

图5是采用本发明的两套引物和两条探针所建立的多重实时荧光RT-PCR 方法的灵敏度试验结果图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。

下面结合实施例1～4以及附图1～5对本实发明用于马病毒性动脉炎病毒实时荧光RT-PCR检测的引物、探针、试剂盒、方法及其应用进行详细说明。

本发明所采取的技术方案是：通过对已报道的所有马病毒性动脉炎病毒基因组序列进行同源性分析，选取其保守序列，分别设计和合成相应的引物和探针。在采用常规RT-PCR检测技术的基础上，通过添加一条两端分别标记荧光基团的核苷酸探针，荧光报告基团标记在探针的5’端，荧光淬灭基团标记在探针的3’端，两类荧光基团具有能量转移特性，即荧光报告基团所发出的荧光可以被荧光淬灭基团吸收，当二者因基团序列被酶切后相距较远时，这种能量转移特性变弱，从而导致报告基团发出的荧光信号增强。在实际检测过程中，随着扩增反应的发生，此时Taq酶不仅发挥其DNA聚合酶的作用，同时它还具有5’端到3’端的外切酶活性，因此，在扩增延伸阶段它将与模板配对的探针切断，从而导致荧光淬灭基团的抑制作用减弱或消失，报告基团的荧光信号增强，从而有利于针对马病毒性动脉炎病毒的检测。其原理详见图1。

EVAF1：5’-GCCATTGAAGAGGCAAGTGTATTTA-3’；

EVAF2：5’-GGTCGCTGATTGACGCATACTGGG-3’；

EVAR3：5’-GTGCAAATCTAGCCCCGGGAAA-3’；

EVAR4：5’-GTCACCTGGGCTCACATCAAAA-3’。

OIE推荐用于检测马病毒性动脉炎病毒普通RT-PCR检测的引物序列为：

上游引物EVA ORF 7forward：5’-ATGGCGTCAAGACGATCACG-3’；

下游引物EVA ORF 7reverse：5’-AGAATATCCACGTCTTACGGC-3’。

上述引物用于普通RT-PCR检测马病毒性动脉炎病毒时，引物的配对方案为：上游引物EVA for与下游引物EVA rev配对使用。该引物对可用于与本发明所建立的方法做检测灵敏度比较。经验证，基于本发明中所述的引物、探针和试剂盒而建立的实时荧光RT-PCR检测方法，其检测灵敏度比OIE推荐的普通RT-PCR方法灵敏度至少高100倍。

实施例1

本实施例对本发明用于马病毒性动脉炎病毒实时荧光RT-PCR检测的引物和探针进行说明。

(1)引物和探针的设计

根据实验目的，选择所有已知的马病毒性动脉炎病毒基因组序列，进行序列同源性比较分析，选取其保守序列，设计高效特异性引物和可标记不同荧光基团的特异性探针，引物序列和探针序列下所述：

上游引物：5’-GCCATTGAAGAGGCAAGTGTATTTA-3’；

下游引物：5’-GTGCAAATCTAGCCCCGGGAAA-3’；

探针序列：5’-TTCCACCGACCACGCGTCTGCTAAGC-3’；

或者是

上游引物：5’-GGTCGCTGATTGACGCATACTGGG-3’；

下游引物：5’-GTCACCTGGGCTCACATCAAAA-3’；

探针序列：5’-CACCGTTTACGCGCTTCCCACCATATCTG-3’。

(2)引物与探针用量的优化

在反应体系中，将配制好的浓度均为10μmol/L的引物溶液和探针溶液以 0.5μL为基点，依次增加0.1μL，交叉组合配对后作为不同的反应体系以检测已知的马病毒性动脉炎病毒基因组样品。通过试验结果分析比较，确定了引物和浓度的最终使用浓度见表1所示。

表1用于马病毒性动脉炎病毒实时荧光RT-PCR检测方法中引物和探针的浓度

(3)镁离子浓度、反转录酶、Taq DNA聚合酶和dNTPs浓度的优化

采用与上述引物和探针用量相同的优化方式，最终确定镁离子在反应体系中的最佳浓度为5mmol/L；反转录酶和Taq DNA聚合酶的最佳用量均为5U； dNTPs的最佳用量为1mmol/L-1.5mmol/L。注意：使用的检测仪器不同，反应体系中所需的上述使用物的最终浓度必要时需做微调。

(4)检测通道的选择

在使用上述引物和探针等进行马病毒性动脉炎病毒实时荧光RT-PCR检测时，在仪器中应选择与探针标记的荧光报告基团一致的荧光检测通道。

实施例2

本实施例对本发明用于马病毒性动脉炎病毒实时荧光RT-PCR检测的过程进行详细说明。

(1)待测模板的准备

方法一：采用TIANamp Virus DNA/RNA Kit(病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒)来提取各种来源样品中马病毒性动脉炎病毒的基因组RNA，具体操作步骤如下：

a.Carrier RNA溶液的配制

(a)向装有310μg Carrier RNA冻干粉的管子中加入310μL的RNase-Free ddH₂O，将Carrier RNA彻底溶解，得到终浓度为1μg/μL的溶液，并根据实验情况分装至RNase-Free的离心管中，置于-20℃储存。使用时按照提取的次数取出相应的溶液，该溶液应避免反复冻融，冻融次数不得超过3次。

(b)Carrier RNA工作液：根据样品的数量计算所需缓冲液GB和Carrier RNA溶液的体积，计算公式如下：

N×0.22mL＝YmL YmL×28μL/mL＝ZμL

其中N为同时需提取的样品个数，Y为需要加入缓冲液GB的体积，Z为需要加入Carrier RNA溶液的体积。

注意：在配制工作液时，为避免溶液出现起泡现象，请勿使用涡旋振荡，只需将缓冲液GB与Carrier RNA溶液颠倒混匀，即可得到Carrier RNA工作液。

b.具体操作步骤

步骤1：用移液器将20μL Proteinase K加入一个干净的1.5mL离心管中。

步骤2：向离心管中加入200μL的样品(血浆/血清/样品细胞培养裂解液等) 上清液，如果样本体积小于200μL，则可补充加入0.9％的NaCl溶液。

步骤3：加入200μL的Carrier RNA工作液。盖上管盖，涡旋振荡15sec 混匀。

步骤4：在56℃水浴锅内孵育15min，瞬时离心以收集附着在管壁和管盖上的液体。

步骤5：加入250μL的无水乙醇，此时可能会出现絮状沉淀。盖上管盖并涡旋振荡15sec，彻底混匀。在室温(15-25℃)放置5min。若环境温度高于25℃，则无水乙醇需在冰上进行适当预冷后再加入。

步骤6：简短离心以收集附着在管壁及管盖的液体。

步骤7：仔细将离心管中的溶液和絮状沉淀全部转移至RNase-Free吸附柱 CR2中，盖上管盖，8000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管中。

步骤8：小心打开吸附柱盖子，加入500μL缓冲液GD(注使用前需按要求加入无水乙醇)，盖上管盖，8000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管中。

步骤9：小心打开吸附柱盖子，加入600μL漂洗液PW(注使用前需按要求加入无水乙醇)，盖上盖子，静置2min，8000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管中。

步骤10：重复上述步骤9。

步骤11：小心打开吸附柱盖子，加入500μL无水乙醇，盖上管盖，8000rpm 离心1min，弃废液。

步骤12：将吸附柱放回收集管中，12000rpm离心3min，使吸附膜完全变干，弃废液。

步骤13：将吸附柱放入一个RNase-Free离心管(1.5mL)中，小心打开吸附柱的盖子，室温放置3min，以使吸附膜完全变干，同时避免膜上有乙醇的残留物对后续实验产生影响。

步骤14：向吸附膜的中间部位悬空滴加50-100μL的RNase-Free ddH2O，盖上盖子，室温放置5min。12000rpm离心1min。

步骤15：弃掉吸附柱，将含有样品提取物的RNase-Free离心管(1.5mL) 盖上，立即检测。注：若不能立即实施检测，则应将提取的核酸置于-20℃以下低温保存。

方法二：采用Trizol核酸抽提取法提取马病毒性动脉炎病毒的基因组RNA，具体操作步骤如下：

步骤1：将100μL的样品(血清/血浆/样品细胞培养裂解物等)上清液加入 RNase-Free离心管(1.5mL)中，再向其中加入300μL的Trizol组织抽提液，于振荡器上充分振荡。然后在低温超速冷冻离心机(4℃)上12000rpm离心10min，将上清液移到新的RNase-Free离心管(1.5mL)中。

步骤2：向收集的上清液中加入400μL的预冷异丙醇，在振荡器上充分振荡后，在低温超速冷冻离心机上12000rpm条件下离心10min。

步骤3：小心弃掉上清液，获得RNA沉淀物，加入75％乙醇600μL，温和振荡离心管，悬浮沉淀。

步骤4：4℃条件下12000g离心10min，尽量弃上清。

步骤5：室温晾干或真空干燥5-10min。(注：RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解)

步骤6：待乙醇完全挥发后加入50-70μL的RNase-Free ddH2O充分溶解， -20℃条件下储存备用。

方法三：采用全自动核酸提取仪有其配套的提取试剂等提取马病毒性动脉炎病毒的基因组RNA，如采用Promega Maxwell品牌的核酸自动提取设备及其配套的全病毒基因组提取试剂盒(Promega Maxwell 16Viral Total Nucleic Acid Purification kit)自动提取马病毒性动脉炎病毒的基因组RNA。

(2)用于马病毒性动脉炎病毒实时荧光RT-PCR检测方法的反应体系和反应条件

选用商品化试剂盒TIANGEN FastKing One Step RT-qPCR Kit(Probe)所建立的反应体系为50μL，分别为：2×FastKing One Step Probe MasterMix 25 μL，25×FastKingEnzyme Mix 2μL，探针(10μmol/L)0.5μL-1.2μL，上下游引物(10μmol/L)各1.0μL-1.5μL，模板RNA为1μL-3μL，补充RNaes-Free ddH₂O至50μL。

将加好反应试剂和待检样品的反应管置于荧光PCR仪中，按照探针标记的荧光报告基团设置相应的荧光收集条件，按反应条件(42℃-50℃30min；95℃ 3min；95℃15sec，55℃-60℃30sec，扩增35-40个循环，在55℃-60℃结束时开始收集荧光信号)进行目的片段的扩增检测，可实时观察检测结果。

实施例3

用于马病毒性动脉炎病毒实时荧光RT-PCR检测的方法的特异性试验

在50μL的反应体系中，分别在不同的检测反应管内加入马病毒性动脉炎病毒和其它动物疫病病毒(如马流感病毒、猪瘟病毒、禽流感病毒等)的基因组RNA作为模板，但仅在各反应管内分别按实施例2所述的方法加入针对马病毒性动脉炎病毒的引物和探针，并按照实施例2所述的反应条件进行实时荧光RT-PCR检测，结果只有加入了马病毒性动脉炎病毒基因组RNA的反应管得到特异性的荧光曲线，其它反应管无相应的特异性扩增曲线。结果表明本发明所设计的引物和探针以及所建立的检测方法仅对马病毒性动脉炎病毒基因组RNA有特异性扩增，而对其它动物病毒的基因组RNA无扩增，证明本发明所设计的针对马病毒性动脉炎病毒的引物和探针具有极强的特异性，结果如图2 所示。

实施例4

用于马病毒性动脉炎病毒实时荧光RT-PCR检测方法的敏感性试验

在50μL的反应体系中，将已知浓度的马病毒性动脉炎病毒基因组RNA 作10倍的倍比稀释，按照实施例2所述的反应体系和反应条件进行实时荧光 RT-PCR检测，以确定本发明所设计的引物、探针和所建立的针对马病毒性动脉炎病毒的荧光RT-PCR检测方法的灵敏度，结果如图3所示。

与此同时，根据OIE推荐的引物和方法，采用商品化试剂盒(TIANGEN FastKingOne Step RT-PCR Kit)，并按内附的说明书建立普通RT-PCR反应体系(50μL)，分别为：2×FastKing One Step RT-PCR MasterMix 25μL，25×RT-PCR Enzyme Mix 2.0μL，上游引物(EVA ORF 7forward)1.5μL，下游引物(EVA ORF 7reverse)1.5μL，RNA模板2.0μL，补充RNaes-Free ddH₂O 至50μL。按照反应条件(42℃30min；94℃3min；94℃30sec，56℃30sec，72℃30sec，共运行40个循环；72℃5min；最后4℃条件下保存)对同样稀释的马病毒性动脉炎病毒基因组RNA进行普通RT-PCR检测，最后经琼脂糖电泳并在紫外光下观察是否有约346bp的核酸带，以确定OIE推荐的普通 RT-PCR检测方法的灵敏度，结果如图4所示。

试验结果表明，本发明涉及的马病毒性动脉炎病毒实时荧光RT-PCR单重和多重检测方法均具有极高的灵敏度(图3和图5)，比OIE所推荐使用的普通RT-PCR检测方法灵敏度至少高100倍。所设计的两套引物和探针，既可以独立使用，也可以同时使用，引物对与探针间无显著的相互干扰现象。相对普通RT-PCR而言，具有特异性更强、灵敏度更高、省时省力、提高检测效率、降低检测成本和减少污染等优点。

本发明涉及的两套引物和探针在对马病毒性动脉炎病毒基因组RNA检测时，独立使用时检测灵敏度分别为10^-7和10^-8，同时使用时检测灵敏度均可达到10^-7，可以满足各种来源样品的检测要求。

采用本发明所涉及的引物、探针、建立的检测反应体系和反应条件进行马病毒性动脉炎病毒基因组RNA检测，其操作简单快捷，整个实时荧光检测时间约90min，比普通RT-PCR检测反应时间减少约1小时，并能在反应进行约 40min后实时观测检测结果，不需要进行扩增产物的电泳和紫外线照射观察。此外，还可以避免开启扩增反应管，不仅减少扩增产物间的相互污染，而且还可避免对环境造成污染。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims

1.一种用于马病毒性动脉炎病毒实时荧光RT-PCR检测的引物探针组合，其特征在于，包括如下引物：

EVAF1：5’-GCCATTGAAGAGGCAAGTGTATTTA-3’；

EVAF2：5’-GGTCGCTGATTGACGCATACTGGG-3’；

EVAR3：5’-GTGCAAATCTAGCCCCGGGAAA-3’；

EVAR4：5’-GTCACCTGGGCTCACATCAAAA-3’；

所述引物的配对方式为：上游引物EVAF1、上游引物EVAF2、下游引物EVAR3和下游引物EVAR4同时使用；

还包括如下探针：

EVAP1：5’-TTCCACCGACCACGCGTCTGCTAAGC-3’；

EVAP2：5’-CACCGTTTACGCGCTTCCCACCATATCTG-3’；

所述探针分别采用荧光素标记探针序列的5’端，采用荧光淬灭基团标记探针序列的3’端。

2.根据权利要求1所述的用于马病毒性动脉炎病毒实时荧光RT-PCR检测的引物探针组合，其特征在于，所述荧光素为Fam、Joe、Hex、Vic中的一种或多种；所述荧光淬灭基团为BHQ1、BHQ2、TAMRA中的一种或多种。

3.一种用于马病毒性动脉炎病毒实时荧光RT-PCR检测的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的用于马病毒性动脉炎病毒实时荧光RT-PCR检测的引物探针组合。

4.权利要求1至3中任一项所述的用于马病毒性动脉炎病毒实时荧光RT-PCR检测的引物探针组合或试剂盒在制备用于检测马病毒性动脉炎病毒的产品中的应用。