CN104878126A - 一种柯萨奇病毒a6型核酸的检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

一种柯萨奇病毒a6型核酸的检测试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明属生物技术领域，具体涉及一种快速柯萨奇病毒A6型的实时荧光定量逆转录PCR检测试剂盒及检测方法。本发明所述柯萨奇病毒A6核酸的检测试剂盒，包括：核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的柯萨奇病毒A6正向引物、核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的反向引物以及核苷酸序列如SEQ ID No.3所示的特异性荧光探针。本发明所述柯萨奇病毒A6核酸的检测试剂盒敏感度高、特异性强、操作快捷简便、结果精确稳定、适用范围广，适用于柯萨奇病毒A6型的人群筛查。

Description

一种柯萨奇病毒A6型核酸的检测试剂盒及检测方法
技术领域
本发明属生物技术领域，涉及一种核酸检测试剂盒，具体涉及一种快速柯萨奇病毒A6型的实时荧光定量逆转录PCR检测试剂盒，可应用于公共卫生单位和临床医疗单位，以对柯萨奇病毒A6型引起的手足口病暴发疫情、聚集性病例和临床病例进行快速、定性或定量检验。
背景技术
手足口病是由多种肠道病毒(human enterovirus，HEV)引起的出疹发热性急性传染病，主要感染婴幼儿。该病报道最早见于20世纪50年代末，并分别于1958年、1969年从临床样品中成功分离得到柯萨奇病毒A16型和肠道病毒71型两种病原体。之后数十年中，柯萨奇病毒A16型和肠道病毒71型在世界不同国家和地区交替流行，被认为是手足口病最重要的病原体。但是自2008年起，另一种可以引起手足口病的肠道病毒——柯萨奇病毒A6型，其感染性和致病力突然增强。短短数年间在欧洲(芬兰、法国、西班牙、英国)、东亚(日本、中国台湾)、东南亚(新加坡、泰国)、美洲(美国、古巴)和大洋洲(新西兰)的许多国家和地区引起不同规模的流行，甚至造成较为严重的公共卫生事件。作为手足口病流行较广的中国，近几年来也呈现出病原谱组成发生改变的新情况。如2011年深圳市数据显示，柯萨奇病毒A6型已取代柯萨奇病毒A16型，成为该市手足口病排名第二位的病原体。2012年，湖北十堰、福建福州等多地的柯萨奇病毒A6型感染均上升明显，也成为当地手足口病最主要的病原体之一。2013年初，北京、西安、河南、江苏、广东以及全国多地柯萨奇病毒A6型感染在短时间内急剧上升，首次出现全国范围内的柯萨奇病毒A6型手足口疫情。综合国内外情况，柯萨奇病毒A6型极有可能稳定地成为手足口病主要病原体，在未来与肠道病毒71型、柯萨奇病毒A16型长期并存，交替流行，改变手足口病流行的既有规律。因此，开展对柯萨奇病毒A6型肠道病毒的日常监测和临床检验已十分必要。
长久以来实验室对柯萨奇病毒A6型的鉴定多采用对病毒基因扩增后测序的方式实现，显然不适合应用在大量样品的日常筛检以及突发公共卫生事件的快速检验之中。近期有个别品牌的同时检测柯萨奇病毒A6型和其它某型肠道病毒的双通道检测试剂产品面世。虽然提供了一种检测方法，但是因其是双通道产品，成本较高，应用在柯萨奇病毒A6型的专项检测工作时，存在严重浪费的情况。因此建立一套成熟、稳定、经济的，专门针对柯萨奇病毒A6型肠道病毒检测的方法，以满足疾控机构和医疗单位开展柯萨奇病毒A6型的日常监测和应急检验需求，为新形势下手足口病防控提供技术支持。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是提供一种柯萨奇病毒A6型的核酸检测试剂盒及检测方法。
为实现以上目的，本发明采用以下技术方案：
一种柯萨奇病毒A6核酸的检测试剂盒，包括：柯萨奇病毒A6正向引物、反向引物以及特异性荧光探针，其中所述柯萨奇病毒A6正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示、所述柯萨奇病毒A6反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3，其5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。
在一些实施方案中，所述特异性荧光探针的荧光报告基团选自FAM、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas Red或LC RED640中的任一种，荧光淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1或Tamra中的任一种。
在一些实施方案中，所述的核酸检测试剂盒，还包括实时荧光PCR反应液、逆转录体系、柯萨奇病毒A6型标准品和DEPC处理水中至少一种。
在一些实施方案中，所述实时荧光PCR反应液由PCR缓冲液、耐热TaqDNA聚合酶、硫酸镁、三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物组成。
在一些实施方案中，所述逆转录体系由MMLV逆转录酶、RNA酶抑制剂和随机引物组成。
在一些实施方案中，柯萨奇病毒A6型标准品为含有柯萨奇病毒A6型VP1基因部分序列的阳性质粒。
在一些优选实施方案中，所述含有柯萨奇病毒A6型VP1基因部分序列的阳性质粒的序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明还提供了一种柯萨奇病毒A6核酸的检测方法，提取待测样品RNA，以待测样品RNA为模板，在柯萨奇病毒A6正向引物、反向引物、特异性荧光探针及实时荧光PCR反应液、逆转录体系和DEPC处理水存在下进行实时荧光定量PCR反应，根据实时荧光PCR的扩增曲线分析待测样品；其中所述柯萨奇病毒A6正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示、所述柯萨奇病毒A6反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3，其5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。
在一些实施方案中，所述正向引物、反向引物和特异性荧光探针的摩尔比为7:7:2。
在一些实施方案中，所述实时荧光定量PCR反应程序为：45℃，15min；95℃，2min；然后40个循环，每个循环95℃，15s；60℃，60s。
本发明提供的柯萨奇病毒A6型核酸的检测试剂盒至少具有如下技术效果之一：
1、本发明所述试剂盒中各组分配制体系时操作简单便捷，PCR扩增时间较短，约为60-70min，PCR体系各组分加量完毕后反应管始终封闭，降低了发生实验室污染的几率，且具有高度的特异性和敏感性。
2、本发明所述试剂盒可以对柯萨奇病毒A6型进行定量检测和定性检测，适合对手足口病病人的病情进展情况和临床治疗效果进行评估。
3、本发明所述试剂盒采用单通道检测技术，对PCR扩增仪要求低，适合针对柯萨奇病毒A6型的大样本量的专门筛检，结果稳定可靠。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示实施例1五组引物探针对阳性临床样品A的PCR扩增结果对比图，其中，图中曲线1-5分别代表第1组-第5组引物探针对；
图2示实施例1五组引物探针对阳性临床样品B的PCR扩增结果对比图，其中，图中曲线1-5分别代表第1组-第5组引物探针对；
图3示实施例2不同引物探针摩尔配比对同一阳性临床样品样本的PCR扩增结果对比图；
图4示实施例5采用本发明实施例3所述试剂盒检测对柯萨奇病毒A6型阳性临床标本的检测结果图；
图5示试验例1采用本发明实施例3所述试剂盒对不同稀释度标准品的扩增曲线，A、B、C、D、E、F代表分别代表1.0×107copies/mL、1.0×106copies/mL、1.0×105copies/mL、1.0×104copies/mL、1.0×103copies/mL和1.0×102copies/mL浓度的标准品；
图6示试验例1采用本发明实施例3所述试剂盒对不同稀释度标准品绘制的标准曲线，横坐标为PCR反应起始拷贝数的对数，纵坐标为CT值，A、B、C、D、E、F代表分别代表1.0×107copies/mL、1.0×106copies/mL、1.0×105copies/mL、1.0×104copies/mL、1.0×103copies/mL和1.0×102copies/mL浓度的标准品；
图7示试验例2采用本发明实施例3所述试剂盒检测柯萨奇病毒A6型的特异性实验结果图，仅有柯萨奇病毒A6型出现特异性扩增曲线，肠道病毒71型、柯萨奇病毒A16型、A4型、A10型、B2型、B3型、埃可病毒1型、A组轮状病毒、甲型流感病毒H3型、新H1N1型、乙型流感病毒Victoria型、Yamagata型、麻疹病毒和风疹病毒，均无特异性扩增曲线产生。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供了一种柯萨奇病毒A6核酸的检测试剂盒，包括：柯萨奇病毒A6正向引物、反向引物以及特异性荧光探针。
引物是在聚合作用的起始时，与反应物以共价键形式连接的一段短的单链核苷酸序列，作为核苷酸聚合作用的起始点，核酸聚合酶可由其3′端开始合成新的核酸链。本发明所述柯萨奇病毒A6核酸的检测试剂盒中所述柯萨奇病毒A6正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示、所述柯萨奇病毒A6反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本领域技术人员可以理解，本发明所述柯萨奇病毒A6正向引物和所述柯萨奇病毒A6反向引物可以分别各自独立的存在于本发明所述柯萨奇病毒A6核酸的检测试剂盒中。
本领域技术人员也可以理解，本发明所述柯萨奇病毒A6正向引物和所述柯萨奇病毒A6反向引物可以以引物混合液形式存在于本发明所述柯萨奇病毒A6核酸的检测试剂盒中。所述引物混合液中所述柯萨奇病毒A6正向引物与所述柯萨奇病毒A6反向引物的摩尔比为1:1。
实时荧光PCR扩增时，在加入一对引物的同时需加入一个特异性的荧光探针，该探针为一段5'端和3'端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团，可以特异性与PCR产物以共价键形式结合的寡核苷酸序列。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，探针与PCR产物结合，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，报告荧光基团发射荧光，荧光监测系统可接收到荧光信号。每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。本发明所述柯萨奇病毒A6核酸的检测试剂盒中所述柯萨奇病毒A6特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3，其5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。
探针标记的报告荧光基团包括但不限于以下荧光物质：FAM、TET、JOE、VIC、HEX、ROX、TAMRA、CY3、CY3.5、CY5、CY5.5、Oregon Green、CAL Red、Red640和Texas Red。探针标记的淬灭荧光基团包括但不限于BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1和Tamra。
在一个具体实施方案中，所述特异性荧光探针的报告荧光基团为FAM，所述特异性荧光探针的淬灭荧光基团为BHQ1。
在一些实施方案中，本发明所述的核酸检测试剂盒还包括实时荧光PCR反应液、逆转录体系、柯萨奇病毒A6型标准品和DEPC处理水中至少一种。
其中，本发明所述试剂盒中所述实时荧光PCR反应液由PCR缓冲液、耐热Taq DNA聚合酶、硫酸镁、三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物组成。
本领域技术人员可以理解，本发明所述试剂盒中所述PCR缓冲液、耐热Taq DNA聚合酶、硫酸镁、三磷酸脱氧核糖核苷酸可以分别各自独立的存在于本发明所述柯萨奇病毒A6核酸的检测试剂盒中。
本领域技术人员也可以理解，本发明所述PCR缓冲液、耐热Taq DNA聚合酶、硫酸镁、三磷酸脱氧核糖核苷酸可以以实时荧光PCR反应液形式存在于本发明所述柯萨奇病毒A6核酸的检测试剂盒中。所述实时荧光PCR反应液可以通过商业渠道购买获得，也可以自行配制。
在一些具体实施方案中，所述实时荧光PCR反应液中所述PCR缓冲液、硫酸镁、耐热Taq DNA聚合酶、三磷酸脱氧核糖核苷酸的体积比为10:2:1:1。
本发明所述的核酸检测试剂盒中所述逆转录体系由MMLV逆转录酶、RNA酶抑制剂和随机引物组成。本领域技术人员可以理解，本发明所述试剂盒中所述MMLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、随机引物可以分别各自独立的存在于本发明所述柯萨奇病毒A6核酸的检测试剂盒中。本领域技术人员也可以理解，本发明所述MMLV逆转录酶、RNA酶抑制剂和随机引物可以以逆转录体系形式存在于本发明所述柯萨奇病毒A6核酸的检测试剂盒中。所述逆转录体系可以通过商业渠道购买获得，也可以自行配制。
在一些具体实施方案中，所述逆转录体系中所述MMLV逆转录酶、RNA酶抑制剂和随机引物的体积比为2:2:1。
本发明所述柯萨奇病毒A6核酸的检测试剂盒还包括柯萨奇病毒A6型标准品，以验证所述引物和荧光探针是否可用，所述检测是否有效。
在一些实施方案中，本发明所述的核酸检测试剂盒中所述柯萨奇病毒A6型标准品为含有柯萨奇病毒A6型VP1基因部分序列的阳性质粒。
在一些优选实施方案中，本发明所述的核酸检测试剂盒中所述含有柯萨奇病毒A6型VP1基因部分序列的阳性质粒的序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明提供的柯萨奇病毒A6型标准品，质粒浓度为1.0×1010copies/mL，经过稀释后作为模板，进而绘制标准曲线，实现柯萨奇病毒A6型定量检测。此外，本发明提供的柯萨奇病毒A6型标准品，经过稀释后还可作为柯萨奇病毒A6型阳性对照使用。
在一些实施方案中，本发明所述试剂盒还包括DEPC处理水，可作为柯萨奇病毒A6型阴性对照使用。
本发明所述柯萨奇病毒A6核酸的检测试剂盒敏感度高、特异性强、操作快捷简便、结果精确稳定、适用范围广，适用于柯萨奇病毒A6型的人群筛查。
本发明还提供了一种柯萨奇病毒A6核酸的检测方法，提取待测样品RNA，以待测样品RNA为模板，在柯萨奇病毒A6正向引物、反向引物、特异性荧光探针及实时荧光PCR反应液、逆转录体系和DEPC处理水存在下进行实时荧光定量PCR反应，根据实时荧光PCR的扩增曲线分析待测样品；其中所述柯萨奇病毒A6正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示、所述柯萨奇病毒A6反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3，其5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。
在一些实施方案中，本发明所述检测方法中，所述正向引物、反向引物和特异性荧光探针的摩尔比为7:7:2。
在一些实施方案中，本发明所述检测方法所述实时荧光定量PCR反应程序为：45℃，15min；95℃，2min；然后40个循环，每个循环95℃，15s；60℃，60s。
本发明所述检测方法需要在实时荧光PCR反应结束后，利用实时荧光PCR仪分析软件，根据实时荧光PCR的扩增曲线分析待测样品。优选的，所述分析待测样品为当待测样本FAM通道荧光曲线呈“S”型且CT值≤35，判为柯萨奇病毒A6型阳性结果；当待测样本②曲线不呈“S”型或CT值＞35，判为柯萨奇病毒A6型阴性结果。
本发明所述检测方法采用实时荧光PCR方法，根据荧光信号强度在扩增的同时进行检测，节省了时间，提高了灵敏度，是一种简单、快捷，灵敏度高，易于推广的检测方法，适用于柯萨奇病毒A6型的人群筛查。
下面结合具体实施例来进一步描述本发明。
实施例1：
本发明针对柯萨奇病毒A6型在Genebank数据库中搜索柯萨奇病毒A6型毒株VP1基因序列，使用DNAMAN 7.0软件对多序列进行比对，找出保守的区段。利用GenScript和Oligo 7.0软件在此区段内设计特异性引物和Taqman探针，并在NCBI数据库中上进行BLAST比对，分别设计了五组引物和探针，引物和探针序列如表1所示。分别对两份CVA6临床阳性样品进行PCR扩增，扩增曲线如图1和图2。
表1引物和探针序列
由图1和图2结果可见，第五组引物和探针的扩增曲线最为典型，有明显的指数期和平台期，有较高荧光强度(纵坐标值)，且CT值较小(曲线与阈值线的交叉点所对应的横坐标)。其它引物探针曲线上升高度较低，CT值较大，平台期不明显；或者没有出现扩增，出现漏检。说明第五组引物和探针目的产物的复制速度更快、数量更多，扩增反应效率更高。
实施例2：
针对第五组引物和探针，按照“引物：探针”的摩尔配比为5:1、4.5:1、4:1、3.5:1、3:1、2.5:1和2:1的比例，对CVA6临床阳性样品进行测试，考察不同“引物：探针”的摩尔配比对扩增曲线的影响。结果见表2和图3。
表2“引物：探针”的摩尔配比对扩增曲线的影响
引物探针配比 5:1 4.5:1 4:1 3.5:1 3:1 2.5:1 2:1
CT值 27.49 27.23 27.10 26.97 27.18 27.22 27.31
由表2和图3结果可见上述配比实验结果均较好，均可以进行正常判读。但是在引物与探针摩尔配比为3.5:1时，曲线最好，比其它六种配比时曲线上升的更高(纵坐标)，同时CT相对更小(横坐标)，说明荧光强度大反应的指数期来临的更早，曲线上升的时间更早。
实施例3：本发明所述柯萨奇病毒A6型的核酸检测试剂盒
本发明所述试剂盒包括实时荧光PCR反应液、逆转录体系、引物混合液、特异性荧光探针、柯萨奇病毒A6型标准品和DEPC处理水。
本发明所述实时荧光PCR反应液包含有2×PCR缓冲液、耐热Taq DNA聚合酶、硫酸镁、三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物。
本发明所述逆转录体系中的逆转录酶为MMLV逆转录酶。
本发明所述引物混合液中，所述正向引物的碱基序列如SEQ ID No.1所示，所述反向引物的碱基序列如SEQ ID No.2所示，正向引物和反向引物的摩尔配比为SEQ ID No.1：SEQ ID No.2为1:1。
本发明提供的柯萨奇病毒A6型特异性探针的碱基序列如SEQ ID No.3所示，探针的5’端标记有FAM荧光报告基团，3’端标记有BHQ1荧光淬灭基团。
本发明提供的柯萨奇病毒A6型标准品为包含有柯萨奇病毒A6型保守区基因序列的阳性质粒(1.0×1010copies/mL)，该质粒的碱基序列如SEQ ID No.4所示。
本发明提供的DEPC处理水为经过高温高压处理的DEPC浓度为千分之一的无菌水。
实施例4：本发明所述试剂盒检测柯萨奇病毒A6型
1、样品核酸的提取
1.1、粪便上清液的制备：在1.5mL离管中加入0.9mL的生理盐水和0.1mL的三氯甲烷组成混合液，取0.2g粪便样本加到混合液中，震荡20min，然后在室温下以1500g的离心力离心20min。吸取全部上清液。
1.2、核酸提取：核酸提取可以采用手工提取试剂盒或者全自动核酸提取仪进行提取，操作步骤按照提取试剂盒说明书或全自动核酸提取仪操作规程进行。将提取出的RNA溶液短期内储存在-20℃备用，长期储存必须在-80℃条件。
2、PCR反应体系的配置：每个检测样品对应一个PCR反应管，每个PCR反应管中各反应组分和所加入的体积如表3所示。
表3 PCR反应管中各反应组分和所加入的体积
PCR反应体系组份 加入量(μL)
实时荧光PCR反应液 10.0μL
逆转录体系 0.4μL
引物混合液 1.4μL
特异性荧光探针 0.2μL
DEPC处理水 4.0μL
模板RNA 4.0μL
总体积 20.0μL
3、将配置好反应体系的PCR反应管放置于荧光定量PCR扩增仪中，按照下列程序进行PCR扩增：逆转录45℃15min，逆转录酶灭活和DNA聚合酶激活95℃2min；变性95℃15s，退火和延伸60℃1min，变性、退火和延伸共40个循环。每个循环的延伸阶段收集FAM通道的荧光。
4、扩增结束后根据荧光曲线判断和CT值判定柯萨奇病毒A6型阳性或阴性结果。
判定结果：①FAM通道荧光曲线呈“S”型且CT值≤35，判为柯萨奇病毒A6型阳性结果；②曲线不呈“S”型或CT值＞35，判为柯萨奇病毒A6型阴性结果。
实施例5：临床检测
采用本发明实施例3所述试剂盒对安阳市2013年采集的479份手足口病临床样品进行检测，检测方法同实施例4。共检测出柯萨奇病毒A6型阳性样品84份，阳性率达到17.54％。所有阳性样品的荧光扩增曲线均十分典型，CT值介于20-35之间，其中部分阳性样品扩增曲线见图4。随机抽取10份柯萨奇病毒A6型阳性PCR产物测序后证明均为目的片段，临床样品的扩增真实有效。
试验例1：本发明所述试剂盒的灵敏性试验
本发明实施例3所述试剂盒提供的柯萨奇病毒A6型标准品为1.0×1010copies/mL的阳性质粒，将该标准品进行10倍梯度稀释至1.0×107copies/mL、1.0×106copies/mL、1.0×105copies/mL、1.0×104copies/mL、1.0×103copies/mL和1.0×102copies/mL六个浓度梯度进行敏感性试验。
采用本发明实施例3所述试剂盒按照实施例4的方法进行检测。
检测结果表明本发明试剂盒具有良好的灵敏性，相邻稀释度标准品间的CT值差值基本相同，扩增曲线典型，结果见图5。扩增效率高达到88.9％，相关系数为0.999，标准品浓度的对数值与CT值具有较好的线性关系，结果见图6。
试验例2：本发明所述试剂盒的特异性试验
采用本发明实施例3所述试剂盒检测柯萨奇病毒A6型、肠道病毒71型、柯萨奇病毒A16型、A4型、A10型、B2型、B3型、埃可病毒1型、A组轮状病毒、甲型流感病毒H3型、新H1N1型、乙型流感病毒Victoria型、Yamagata型、疹病毒和风疹病毒。结果见图7。
检测结果显示仅柯萨奇病毒A6型出现典型的扩增曲线和CT值，其它病毒无扩增曲线产生。试验结果表明本发明试剂盒仅与柯萨奇病毒A6型发生特异性扩增反应，而不与其它病毒反应出现假阳性结果。

Claims (10)

1.一种柯萨奇病毒A6核酸的检测试剂盒，包括：柯萨奇病毒A6正向引物、反向引物以及特异性荧光探针，其中所述柯萨奇病毒A6正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示、所述柯萨奇病毒A6反向引物核苷酸序列如SEQID NO.2所示，所述特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3，其5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。
2.根据权利要求1所述的核酸检测试剂盒，所述特异性荧光探针的荧光报告基团选自FAM、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas Red或LCRED640中的任一种，荧光淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1或Tamra中的任一种。
3.根据权利要求1或2所述的核酸检测试剂盒，还包括实时荧光PCR反应液、逆转录体系、柯萨奇病毒A6型标准品和DEPC处理水中至少一种。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的核酸检测试剂盒，所述实时荧光PCR反应液由PCR缓冲液、硫酸镁、耐热Taq DNA聚合酶和三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物组成。
5.根据权利要求1-4任意一项所述的核酸检测试剂盒，所述逆转录体系由MMLV逆转录酶、RNA酶抑制剂和随机引物组成。
6.根据权利要求1-5任意一项所述的核酸检测试剂盒，柯萨奇病毒A6型标准品为含有柯萨奇病毒A6型VP1基因部分序列的阳性质粒。
7.根据权利要求6所述的核酸检测试剂盒，所述含有柯萨奇病毒A6型VP1基因部分序列的阳性质粒的序列如SEQ ID NO.4所示。
8.一种柯萨奇病毒A6核酸的检测方法，提取待测样品RNA，以待测样品RNA为模板，在柯萨奇病毒A6正向引物、反向引物、特异性荧光探针及实时荧光PCR反应液、逆转录体系和DEPC处理水存在下进行实时荧光定量PCR反应，根据实时荧光PCR的扩增曲线分析待测样品；其中所述柯萨奇病毒A6正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示、所述柯萨奇病毒A6反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3，其5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。
9.根据权利要求8所述检测方法，所述正向引物、反向引物和特异性荧光探针的摩尔比为7:7:2。
10.根据权利要求8或9所述检测方法，所述实时荧光定量PCR反应程序为：45℃，15min；95℃，2min；然后40个循环，每个循环95℃，15s；60℃，60s。
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