CN112195177A

CN112195177A - 一种核酸提取方法及试剂盒

Info

Publication number: CN112195177A
Application number: CN202011175528.4A
Authority: CN
Inventors: 孙佳瑞; 王玲; 任红燕
Original assignee: Shanghai Mubo Biomedical Technology Co ltd
Current assignee: Shanghai Mubo Biomedical Technology Co ltd
Priority date: 2020-10-28
Filing date: 2020-10-28
Publication date: 2021-01-08
Anticipated expiration: 2040-10-28
Also published as: CN112195177B

Abstract

本发明涉及核酸提取领域，特别是涉及一种核酸提取方法及试剂盒，所述试剂盒中包括：所述核酸化学裂解液、抑制成分去除液，所述核酸化学裂解液包括异硫氰酸胍、N‑月桂酰肌氨酸钠盐、PBS，所述抑制成分去除液包括十二水合硫酸铝铵溶液和交联聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)的混合液以及乙酸铵。本发明的核酸提取方法包括采用所述核酸化学裂解液化学裂解样本，再经杂质去除、核酸吸附、洗涤、洗脱后，收集得到核酸。本发明的方法充分考虑到核酸提取中的全面性和无偏向性，又考虑到核酸的纯度，核酸完整性，以及减少过程中损失而确保浓度，也可针对不同类型的生物或环境样本可形成嵌套，保障了提取方法的广谱适用性。

Description

一种核酸提取方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及核酸提取领域，特别是涉及一种核酸提取方法及试剂盒。

背景技术

脱氧核糖核酸(DNA)是生物的主要遗传物质。在分子生物学、生物化学等领域中，以DNA为研究对象或目标的领域甚是广泛。然而，从环境样本(例如：土壤、水体、沙地等)和生物样本(例如：排泄物、组织、体液等)中获得DNA则是开展相关研究实验操作的第一步。目前，从获取DNA的手段大致可以分为如下几类：基于传统分子生物学手段利用醇类沉淀DNA；基于硅胶基质材料的柱吸附DNA；基于磁性材料表明的修饰基团(例如：羟基基团-OH和羧基基团-COOH)吸附DNA等。根据不同的DNA获取手段，同时也兴起了方便快捷的试剂盒，如利用硅胶基质材料进行DNA提取的离心柱DNA提取试剂盒，以及利用磁性材料及其表面修饰基团进行DNA提取的纳米磁珠DNA提取试剂盒及其与之配套的自动化设备等。目前，使用这些方法或试剂盒进行DNA提取，具有样品类型覆盖面广、广谱适用性强，可以获得完整性好，浓度、纯度高的DNA溶液。

近些年来，随着分子生物学技术的不断发展和组学技术研究的开展，高通量测序技术已经得到了广泛应用。DNA则是高通量测序技术中常用的“原料”之一。然而，高通量测序技术应用不断地深入发现，DNA的提取不能仅基于获取核酸片段的完整性、浓度、纯净度和获取效率上，更应该考虑复杂环境及复杂生物样本类型中核酸获取的全面性，无偏向性问题。近年来，DNA提取带来的结果差异已陆续报道：Theda等(Theda U P Bartolomaeus,etal.Quantifying technical confounders in microbiome studies,CardiovascularResearch,cvaa128,doi:10.1093/cvr/cvaa128(2020).)，采用不同提取方法针对心血管疾病队列进行研究发现，使用不同提取方法得出的特定种属细菌与心血管疾病的危险标志物的相关性不一致，进行宏基因组比较分析时要确保DNA提取方法一致；Costea等(Costea,P.I.,et al.Towards standards for human fecal sample processing in metagenomicstudies.Nat Biotechnol 35,1069-1076,doi:10.1038/nbt.3960(2017).)针对同一份粪便样本，采用21种有代表性的DNA提取方法，并量化观察到的微生物群落组成的差异；通过对不同DNA提取操作流程的对比，明确DNA提取方法对宏基因组分析结果具有较大影响。一些组学研究中，也明确列出DNA提取的偏向性是开展这些组学研究时的一项劣势或限制因素(Andreas Schwiertz.Microbiota of the human body-implications in health anddisease.Switzerland:Springer,doi:10.1007/978-3-319-31248-4(2016):11-12.)。

由此可见，在现有方法优势(完整性好，浓度、纯度高)的基础上，考虑样本中DNA提取的全面性，无偏向性，建立一套DNA提取方法，可以尽可能完全获取样本中各类物种的DNA，为各类研究提供稳定的实验结果。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种核酸提取方法及试剂盒，用于解决现有技术中的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种核酸化学裂解液，所述核酸化学裂解液的配制原料包括异硫氰酸胍、N-月桂酰肌氨酸钠盐和pH缓冲液。

本发明还提供一种试剂盒，所述试剂盒中包括：所述核酸化学裂解液、抑制成分去除液。

优选的，所述抑制成分去除液包括十二水合硫酸铝铵溶液和交联聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)的混合水溶液和乙酸铵溶液。

优选的，所述试剂盒中还包括蛋白质去除剂，所述蛋白质去除剂选自蛋白酶K常温保存液。

优选的，所述试剂盒中还包括DNA与硅胶基质的结合缓冲液，所述结合缓冲液包括盐酸胍、Tris-base、乙酸钠、Triton X-100。

优选的，所述试剂盒中还包括蛋白洗涤液(Clean Buffer)，所述蛋白洗涤液包括盐酸胍、Tris-base、氯化钠、乙醇。

优选的，所述试剂盒中还包括离子洗涤液(Wash Buffer)，所述离子洗涤液包括Tris-base、乙二胺四乙酸二钠、盐酸、Tween 20、乙醇。

优选的，所述试剂盒中还包括洗脱液。

本发明还提供一种核酸提取方法，所述核酸提取方法包括采用所述核酸化学裂解液化学裂解样本，再经杂质去除、核酸吸附、洗涤、洗脱后，收集得到核酸。

优选的，所述核酸提取方法还包括以下特征中的一种或几种：

1)裂解样本时采用化学裂解、高温孵育裂解和物理击打裂解三种方式相结合；

2)杂质去除时采用所述试剂盒中的抑制成分去除液、蛋白质去除剂分别去除体系中的杂质；

3)基于硅胶基质离心柱式方法提取核酸时，采用所述试剂盒中的结合缓冲液使离心柱吸附核酸；

4)洗涤时采用试剂盒中的蛋白洗涤液和/或离子洗涤液洗涤；

5)所述核酸提取的样本选自生物或环境样本。

如上所述，本发明的核酸提取方法及试剂盒，具有以下有益效果：

在现有DNA提取方法及其优势条件下，面临的DNA提取不全面性和偏向性问题，设计的一套DNA提取方法。因DNA提取的不全面性和偏向性问题，重要环节是样本裂解环节。因而，通过化学裂解、高温孵育裂解以及物理击打破碎，三种处理方法相结合的方式，充分且无偏向性的处理裂解样本，尽可能完全释放样本中所有物种的核酸物质，用以达到DNA提取的全面性和无偏向性。

针对DNA提取的杂质去除环节，采用乙酸铵、十二水硫酸铝氨和不溶性PVPP可去除体系中的多糖和酚类物质，同时利用PVPP的颗粒性和悬浮性，对十二水硫酸铝氨作用形成的絮凝物提供协助沉淀的作用，进而更好地去除杂质，可避免仅使用乙酸铵和十二水硫酸铝氨两步方式进行溶液体系中杂质的絮凝去除时，由于十二水硫酸铝氨与杂质形成的絮凝物质地轻重不同，离心操作不能完全沉淀去除絮凝物的问题。同时，在去杂环节，考虑到具有生物活性蛋白酶K的酶类保存和运输问题，采用甘油和Tween 20等试剂对酶类起到更好地保护作用和悬浮作用对酶的常温保存和运输提供了良好保障。

DNA与离心柱中硅胶基质吸附结合环节中，此环节既需要考虑DNA与硅胶基质的结合需要的高离序盐溶液，同时也要考虑体系溶液是蛋白酶K的反应溶液，而盐酸胍可溶解蛋白酶K，但不会破坏蛋白酶K的酶活，也可提供高离序盐状态，因此，选择盐酸胍可更好地融合蛋白质的去除和DNA与硅胶基质的结合反应而不形成相互干扰。再者，为确保对残留杂质的进一步去除，Triton X-100去垢剂的加入能更充分地溶解和消除前述操作残留在体系中的杂质。

DNA与硅胶基质结合后的洗涤，一方面可去除蛋白酶K反应后残留的蛋白及蛋白酶K；另一方面，可去除被硅胶基质吸附溶液中的离子。因而选用可溶解蛋白的盐酸胍进行洗涤，同时Tris-base、氯化钠、无水乙醇需要保证DNA与硅胶基质的吸附结合、DNA结构的稳定且不被过多溶解而产生损失。再者，吸附柱中可能残留的离子利用EDTA-Na₂与离子的螯合作用而进行去除，Tris-base、盐酸、Tween 20和无水乙醇的调配也可保证DNA与硅胶基质的吸附结合、DNA结构的稳定且不被过多溶解而产生损失。

最终在低离序盐溶液10mM Tris-base或水中使得DNA形成分离和溶解，获得最终的DNA溶液。

本发明的方法从裂解环节充分考虑到样本中各类物种的核酸释放，到确保核酸稳定结果前提下，充分去除体系中潜在杂质等。既充分考虑到DNA提取中的全面性和无偏向性，又考虑到核酸的纯度，核酸完整性，以及减少过程中损失而确保浓度。

针对不同类型的生物或环境样本可形成嵌套，保障了提取方法的广谱适用性。

附图说明

图1显示为不同DNA提取方法物种丰度比较。

图2显示为志愿者2 DNA提取电泳结果图。

图3显示为志愿者3 DNA提取电泳结果图。

图4显示为志愿者4 DNA提取电泳结果图。

图5显示为志愿者5 DNA提取电泳结果图。

图6显示为志愿者6 DNA提取电泳结果图。

图7显示为志愿者7 DNA提取电泳结果图。

图8显示为志愿者8 DNA提取电泳结果图。

图9显示为志愿者9 DNA提取电泳结果图。

图10显示为志愿者10 DNA提取电泳结果图。

图11显示为志愿者11 DNA提取电泳结果图。

图12显示为志愿者11不同DNA提取方法物种丰度比较。

图13显示为基于Bray curtis距离Average方法的hcluster tree分析。

具体实施方式

本发明首先提供一种核酸化学裂解液，所述核酸化学裂解液的的配制原料包括异硫氰酸胍、N-月桂酰肌氨酸钠盐和pH缓冲液。

在一种实施方式中，以核酸化学裂解液的总体积为基准，所述异硫氰酸胍的终浓度为0.6～1.6M。

在一种实施方式中，以核酸化学裂解液的总体积为基准，所述N-月桂酰肌氨酸钠盐的终浓度为0.03～0.05％(w/v)，单位为g/mL。

在一种实施方式中，所述pH缓冲液为PBS。以核酸化学裂解液的总体积为基准，PBS的终体积浓度为60～100％。当PBS的终体积浓度小于100％时，其余部分为水，此处水指的是另加入的水，而不是PBS中所含的水。例如，配制核酸化学裂解液时，加入的PBS的终体积为90％，加入的水的终体积为10％。

所述核酸化学裂解液的pH为7～9。

异硫氰酸胍一种强力蛋白质变性剂，能溶解蛋白质导致细胞结构破碎；同时细胞内存在的核酸酶可以被其抑制，防止核酸酶对核酸进行降解破坏；细胞内的核酸与核蛋白相互缠绕，异硫氰酸胍可以对核蛋白的二级结构形成破坏，使得核酸与核蛋白分离，充分释放核酸。N-月桂酰肌氨酸钠盐一种阴离子表明活性剂，阴离子洗涤剂，可以协助溶解细胞。磷酸缓冲液(PBS)可形成缓冲体系，确保混合液中的pH在一定范围内稳定。

在一种实施方式中，核酸化学裂解液为DNA核酸化学裂解液。

所述核酸化学裂解液和抑制成分去除液为两种分离的试剂，在核酸提取的不同阶段使用。

所述抑制成分去除液包括十二水合硫酸铝铵溶液和交联聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)的混合水溶液，乙酸铵溶液。

在一种实施方式中，乙酸铵的浓度选自50mM～5M。例如选自50～150mM、150～250mM、250～350mM、350～450mM、450～650mM、650～850mM、850mM～1M、1～2M、2～3M、3～4M、4～5M中的一个范围。更优选的为150mM。

在一种实施方式中，十二水硫酸铝铵的浓度选自50mM～0.6M。例如选自50～150mM、150～250mM、250～350mM、350～450mM、450～600mM。更优选的选自120mM。

在一种实施方式中，PVPP的粒径为100～120μm。优选为110μm。以十二水合硫酸铝铵溶液和PVPP的混合水溶液的总体积为基准，PVPP体积为0.01～50％(v/v)。在一种实施方式中，PVPP体积为0.01～1％(v/v)、1～10％(v/v)、10～20％(v/v)、20～30％(v/v)、30～40％(v/v)、40～50％(v/v)中的一个范围。更优选的选自30％。

本发明采用两步絮凝的方式去除裂解体系中抑制物成分。第一步采用乙酸铵作为第一次絮凝过程，从混合体系中去除大部分干扰成分。第二步若仅采用十二水硫酸铝铵，使得抑制剂与十二水硫酸铝铵形成絮状物，由于絮凝过程形成的絮凝物质的不同，有些不能通过高速离心而形成有效的沉淀而漂浮溶液体系中。因此，第二步采用可吸附去除多糖和酚类物质的不溶性PVPP与十二水硫酸铝氨配制成混合溶液，使得PVPP执行吸附功能的同时可分散在溶液中通过离心起到助沉剂的作用，携带质地较轻的絮凝物质形成沉淀，进而形成抑制成分的有效去除。

所述试剂盒中还包括蛋白质去除剂，所述蛋白质去除剂选自蛋白酶K常温保存液。以蛋白酶K常温保存液的总体积为基准，所述蛋白酶K常温保存液包括以下浓度的各组分：

10～30mg/mL蛋白酶K；

5-50mM Tris-base；

1～50mM氯化钙；

10～500mM氯化钠；

甘油30～60％(v/v)；

吐温20(Tween 20)，0.1～5％(v/v)；

溶剂为水。

在一种实施方式中，所述蛋白酶K的终浓度选自以下范围中的一种：10～15mg/mL、15～20mg/mL、20～25mg/mL、25～30mg/mL。在一种更佳的实施方式中，所述蛋白酶K的终浓度为20mg/mL。蛋白酶K可通过市售蛋白酶K干粉配置。

在一种实施方式中，所述Tris-base的终浓度选自以下范围中的一种：5mM-15mM、15mM-25mM、25mM-35mM、35mM-50mM。在一种更佳的实施方式中，所述Tris-HCl的终浓度为10mM。

在一种实施方式中，所述氯化钙的终浓度选自以下范围中的一种：1mM-15mM、15mM-25mM、25mM-35mM、35mM-50mM。在一种更佳的实施方式中，所述氯化钙的终浓度为10mM。

在一种实施方式中，所述氯化钠的终浓度选自以下范围中的一种：10mM-100mM、100mM-200mM、200mM-300mM、300mM-400mM、400mM-500mM。在一种更佳的实施方式中，所述氯化钠的终浓度为200mM。

在一种实施方式中，所述甘油的终浓度选自以下范围中的一种：30～40％(v/v)、40～50％(v/v)、50～60％(v/v)。在一种更佳的实施方式中，所述甘油的终浓度为50％(v/v)；

在一种实施方式中，所述吐温20的终浓度选自以下范围中的一种：0.1～1％(v/v)、1～2％(v/v)、2～3％(v/v)、3～4％(v/v)、4～5％(v/v)。在一种更佳的实施方式中，所述吐温20的终浓度为0.5％。

所述蛋白酶K的pH为7～8.5。优选为8.0。

蛋白酶K属于酶类，常温下保存不稳定，应用时不利于保存和运输。因此，为方便使用、运输和应用，需要使用溶液体系维持蛋白酶K在常温下可以稳定保存。Tris-HCl和氯化钠可以在蛋白酶K反应是维系体系内核酸的稳定，甘油是蛋白酶K的储存液可以有效保护蛋白酶K，氯化钙在溶液中提供Ca²⁺离子，可以激活或增加蛋白酶K降解蛋白质的活性，Tween20是良好的悬浮剂，可以使得蛋白酶K充分悬浮在溶液中及防止蛋白酶K溶液与容器间形成沉积或挂壁。

对下游实验产生抑制效果抑制物、未被消化完全的蛋白质、不溶性颗粒、多糖、酚类干扰性有机物等均属于杂质，杂质即为在样本DNA提取过程中，存在对下游提取操作和后续生物、化学等实验操作造成影响的非核酸物质。

所述试剂盒中还包括DNA与硅胶基质的结合缓冲液(即高离序盐溶液，称为DNABinding Buffer)，所述结合缓冲液包括盐酸胍、Tris-base、乙酸钠、Triton X-100，溶剂为水。

DNA与硅胶基质结合主要是在高离序盐溶液中，低pH环境下，DNA中的磷酸基团(即示意为DNA-P-O^-)，在盐离子的作用下可以与硅基质(即示意为Si-OH⁺)表面形成高效、专一性吸附，即示意形成为Si-O-Na-O-P-DNA。该结构在低盐，高pH环境下，可释放DNA，进行形成DNA的纯化与分离。

在一种实施方式中，以结合缓冲液的总体积为基准，所述盐酸胍的终浓度为2-6M。例如选自以下范围中的一种：2-3M、3-4M、4-5M、5-6M。更优选为5M。

在一种实施方式中，以结合缓冲液的总体积为基准，所述Tris-base的终浓度为10～100mM。例如选自以下范围中的一种：10～30mM、30～50mM、50～70mM、70～100mM。更优选为30mM。

在一种实施方式中，以结合缓冲液的总体积为基准，所述乙酸钠的终浓度为50mM～3M。例如选自以下范围中的一种：50mM～350mM、350mM～650mM、650mM～1M、1M～2M、2M～3M。更优选为300mM。

在一种实施方式中，以结合缓冲液的总体积为基准，所述Triton X-100的终浓度为0.1～5％(v/v)。例如选自以下范围中的一种：0.1～1％(v/v)、1～2％(v/v)、2～3％(v/v)、3～4％(v/v)、4～5％(v/v)。更优选为2％。

使用时，按照样本溶液:DNA Binding Buffer:无水乙醇或异丙醇(v/v/v)为0.75～1.5:1:1。优选为1:1:1。

盐酸胍是高离序盐溶液，且不影响蛋白酶K在溶液中发生反应，提供了良好前期蛋白质去除的环境和后续核酸分离环境。Tris-base可以保证核酸稳定性。无水乙醇或异丙醇、乙酸钠可以争夺核酸表面负电荷，使得核酸与水分子形成分离，同时乙酸钠可以增加离子强度，且在低温条件下，有利于将核酸在乙醇中的沉析，而沉析出的DNA不能与硅基质形成结合，但可以附着硅基质表面，经过后续洗涤操作并不会发生溶解，而随着洗脱操作附着在表面可溶解在洗脱液中并与硅基质结合DNA一同溶解，即可全面获取DNA。Triton X-100是一种表面活性剂、去垢剂，溶解去除体系内残留的杂质，但高浓度TritonX-100不能维持酶活性，会破坏蛋白结构，因使用DNA Binding Buffer作为蛋白酶K的反应体系时，TritonX-100浓度不能过高。

DNA与离心柱结合后仍可由杂质残留在离心柱中，因而对杂质进行清除(例如残留的蛋白酶K，溶液中的离子等)，且不能破坏因沉析停留在离心柱表面的DNA和与离心柱结合的DNA。因此，需要洗涤液对离心柱进行洗涤。

所述试剂盒中还包括蛋白洗涤液(Clean Buffer)，所述蛋白洗涤液包括盐酸胍、Tris-base、氯化钠、乙醇，溶剂为水。

在一种实施方式中，以不含乙醇的蛋白洗涤液的总体积为基准，所述盐酸胍的终浓度为0.5-6M。例如选自以下范围中的一种：0.5-1M、1-2M、2-3M、3-4M、4-5M、5-6M。更优选为2M。

在一种实施方式中，以不含乙醇的蛋白洗涤液的总体积为基准，所述Tris-base的终浓度为10～100mM。例如选自以下范围中的一种：10～20mM、20～40mM、40～60mM、60～80mM、80～100mM。更优选为10mM。

在一种实施方式中，以不含乙醇的蛋白洗涤液的总体积为基准，所述氯化钠的终浓度为1～500mM。例如选自以下范围中的一种：1～100mM、100～150mM、150～200mM、200～300mM、300～400mM、400～500mM。更优选为100mM。

使用时，将不含乙醇的蛋白洗涤液与无水乙醇按照体积比为1:9～19:1混合后使用。混合比例优选为1:1。所述乙醇也可以替换为异丙醇。

盐酸胍提供高离序盐溶液状态，保持DNA与离心柱结合状态外，可溶解残留在离心柱中的蛋白质以及酶类(蛋白酶K等)，Tris-base和氯化钠维持离心柱上DNA的稳定，无水乙醇保持DNA沉析或不利于溶解的状态。

所述试剂盒中还包括离子洗涤液(Wash Buffer)，所述离子洗涤液包括Tris-base、乙二胺四乙酸二钠、盐酸、Tween 20、乙醇，溶剂为水。

在一种实施方式中，以不含乙醇的离子洗涤液的总体积为基准，所述Tris-base的终浓度为10mM～5M。更优选为1M。

在一种实施方式中，以不含乙醇的离子洗涤液的总体积为基准，所述乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na₂)的终浓度为5mM～2M。更优选为0.1M。

在一种实施方式中，以不含乙醇的离子洗涤液的总体积为基准，所述盐酸(HCl)的终浓度为1N～6N。更优选为1N。

在一种实施方式中，以不含乙醇的离子洗涤液的总体积为基准，所述Tween 20的终浓度为0.5％～50％(v/v)。更优选为10％(v/v)。

使用时，将不含乙醇的离子洗涤液与无水乙醇按照体积比为1:9～19:1混合。混合比例优选为1:4。所述乙醇也可以替换为异丙醇。

以50mL溶液为例：1M Tris-base 0.500mL；0.1M EDTA-Na₂ 0.500mL；10％Tween20(v/v)0.250mL；1N HCl 0.186mL；无菌水48.564mL。使用时，采用20％(v/v)溶液加入80％(v/v)无水乙醇后进行使用。

Tris-base和盐酸维持核酸稳定；EDTA-Na₂是一种良好的配合剂可以与离子形成螯合物进而与水溶液配合清除溶液中的离子；无水乙醇维持核酸不被水溶解；Tween 20是悬浮剂将嵌入离子柱中的非核酸物质尽可能悬浮脱离离心柱而达到洗涤目的。

所述试剂盒中还包括洗脱液，所述洗脱液。所述洗脱液选自常用的DNA洗脱液即可。例如10mM Tris-base(pH8.0-8.5)或纯水溶液。优选10mM Tris-base(三羟甲基氨基甲烷)。

在低盐溶液，高pH条件下，DNA和硅胶基质解离，从离心柱中被洗脱下来，恢复成可溶解的DNA，同时沉析出的DNA可以在水溶液中获得溶解。

所述试剂盒中的各组分可单独行使相关功能，也可组合成一套试剂盒使用。

在一种实施方式中，所述核酸提取方法还包括以下特征中的一种或几种：

4)洗涤时采用试剂盒中的蛋白洗涤液和/或离子洗涤液洗涤。

步骤1)中，因裂解的主要作用是充分释放细胞内的核酸物质，若要更完全地获得样本中全面、完整的核酸物质，裂解环节则最为关键。因此，裂解环节不能仅仅只采用一种裂解方法，而需要多种裂解方式相结合，尽可能全面获取样本中的核酸物质。

在一种实施方式中，所述高温孵育裂解即采用60-95℃对化学裂解体系进行加热处理。随着温度的升高，处理的时间相对减少以免破坏细胞内遗传物质。例如60-95℃孵育10分钟～2小时。优选70℃孵育1小时。高温孵育可以使细胞蛋白质变性，进而破坏细胞结构，释放胞内物质。

在一种实施方式中，所述物理击打裂解即采用0.1～3mm的具有化学惰性的球状体，设置25～50赫兹频率，击打5～15min。

例如：所述球状体选自：玻璃珠、氧化锆、硅石子或三者的混合物。优选为0.1mm玻璃珠。因研磨仪器的多样化，击打频率和击打时间可调，直至等效。例如选用组织研磨仪设置纵向击打50赫兹、10min。物理击打不仅可以协助样本在溶液中形成匀质化，同时利用珠子撞击的剪切力破坏细胞结构释放胞内物质。

步骤2)中，去除抑制成分时分两步操作：第一步采用乙酸铵作为第一次絮凝过程，从混合体系中去除大部分干扰成分，第二步采用PVPP与十二水硫酸铝氨的混合溶液再次去除。

步骤2)中，去除蛋白质时的方法为向体系中加入蛋白质去除剂，50～75℃孵育5～15min。优选为70℃孵育10min。上述方法可以有效消化去除体系中残留的蛋白质干扰。

在一较佳实施例，步骤4)中采用两次洗涤方式：一次利用蛋白洗涤液洗涤；另一次采用离子洗涤液洗涤。

所述核酸提取方法为DNA提取方法。所述核酸提取方法中用到的其他试剂、耗材、或操作流程本发明不做具体限制，可以根据实际情况进行选择。

所述核酸提取的样本选自生物或环境样本。例如组织、体液、痰液、水体、粪便、底泥、土壤等。

不同类型的生物或环境样本可以经过前处理后再适用所述核酸提取方法。例如，组织样本可以通过胰蛋白酶消化细胞形成分散细胞或机械研磨等方式将组织匀浆化，将匀浆化的样本转入该提取方法；体液样本可以采用高速离心方式获得细胞沉淀物，将沉淀物转入该提取方法或者将少量体液样本直接转入该提取方法；痰液样本可通过液化手段后，转入该提取方法；水体样本可通过滤膜富集后，将滤膜转入该提取方法；粪便、底泥、土壤等环境样本可直接使用该提取方法。

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

实施例1

为观测不同DNA提取方法在高通量测序领域中的结果是否造成影响，选取了两种DNA提取方法，一种为Gordon等发表的一种基于环境样本的DNA提取方法，作为传统提取手段的代表性方法(简称：传统方法)；另一种为Omega Bio-tek公司生产的粪便DNA提取试剂盒(货号：D4015)，作为硅基质离心柱DNA提取的代表方法(简称：Omega试剂盒)。选择原因：1)传统的提取方法经过多年使用，仍被认可则说明在结果上更能接近数据实时，而被广泛接受。2)Omega试剂盒具备传统离心柱DNA提取方法主要流程，可以为后续验证本发明成分效能提供良好参照。因而，采用两种提取方法，观测两种DNA提取方法对DNA提取是否存在差异化。

严格按照两种DNA提取方法操作说明进行操作，针对同一志愿者(志愿者1)采集的充分混匀的粪便样本进行DNA提取(每种方法重复三次)，并按照illumina公司官方提供的16s rRNA基因建库方法(https://support.illumina.com.cn/content/dam/illumina-marketing/documents/products/other/16s-metagenomics-faq-1270-2014-003.pdf)完成Miseq测序平台文库构建，并完成测序。

按照如下方式进行生物信息学分析。

将测序获得的原始数据(Rawdata)经过质控、拼接后获得优化序列(Cleandata)，质控标准如下：1)标签序列必须完全匹配；2)双端序列重叠区(Overlap)小于50bp的序列舍弃；3)重叠区错误率大于0.1的序列舍弃；4)拼接后短于400bp的序列舍弃。

经过如上质控后获得的优化序列进行OTU聚类，分类注释后，观测志愿者1在不同DNA提取方法下，在属水平微生物物种(高通量测序常用于讨论问题的分类学水平)是否存在差异。

经过统计分析比较发现不同DNA提取方法，具备一定差异性，详见图1，横坐标表示不同提取方法及其每种方法重复实验，纵坐标表示样本中每个物种的相对丰度。从图中不难看出优势物种中的Bacteroides(拟杆菌属)、Bifidobacterium(双歧杆菌属)、Fusicatenibacter(镰刀菌属)等在两种方法获取的相对丰度具备一定差异性，但同一种DNA提取方法具备一定的稳定性。因此，可以明确不同的提取方法对某些物种丰度的确存在影响。因而，需要一种适当的方法能够更加稳定且全面的获取物种信息及其丰度信息且具备相当的稳定性。

实施例2

为确定本方法各个化学组分或其混合物在DNA提取流程中是否起到应发挥的作用。将采用提取流程相近的Omega试剂盒与本方法各个提取流程的试剂或组分形成替换比较提取效果，用于确定本方法中的试剂是否挥发了所处环节应有的作用。

本方法试剂的准备：

1)核酸化学裂解液：4M异硫氰酸胍溶液；10％w/v N-月桂酰肌氨酸钠盐溶液；采用0.1M磷酸缓冲液[pH 8.0]配制5％(w/v)N-月桂酰基氨酸钠盐溶液。

2)杂质去除相关溶液：150mM乙酸铵溶液；120mM十二水合硫酸铝铵溶液(含30％v/v PVPP)；20mg/mL蛋白酶K常温保存液：25mM Tris-base，10mM氯化钙；200mM氯化钠，50％v/v甘油，HCl调pH8.0。

3)DNA Binding Buffer：5M盐酸胍；30mM Tris-base；300mM乙酸钠；2％v/vTriton X-100。

4)洗涤相关溶液：

a)Clean Buffer：2M盐酸胍，10mM Tris-base，100mM氯化钠，50％v/v无水乙醇；

b)Wash Buffer：0.01％v/v 1M Tris-base，0.01％v/v 0.1M EDTA，0.372％v/v1N HCl，0.5％v/v的10％v/v Tween 20，97.128％v/v无菌水，加入如上溶液总体积4倍体积的无水乙醇。

5)DNA洗脱溶液：10mM Tris-base。

为确保每个组分发挥的作用，将Omega试剂盒中在不同环节组分形成单一替换，并与Omega试剂盒自身的方法同时进行实验操作和比较，观测提取后核酸的浓度及纯度，用于判断本方法各组分是否在各自的环节发挥了对应的作用。

本方法的核酸化学裂解液替换Omega试剂盒中的SLX-Mlus Buffer和DS Buffer，采用充分混匀的志愿者粪便(志愿者2)进行DNA提取测试；

本方法150mM乙酸铵溶液替换Omega试剂盒中的SP2 Buffer，采用充分混匀的志愿者粪便(志愿者3)进行DNA提取测试；

本方法120mM十二水合硫酸铝铵溶液(含30％v/v PVPP)替换Omega试剂盒中的cHTR Reagent，采用充分混匀的志愿者粪便(志愿者4)进行DNA提取测试；

本方法20mg/mL蛋白酶K替换Omega试剂盒中的Proteinase K Solution，采用充分混匀的志愿者粪便(志愿者5)进行DNA提取测试；

本方法DNA Binding Buffer替换Omega试剂盒中的BL Buffer，采用充分混匀的志愿者粪便(志愿者6)进行DNA提取测试；

本方法Clean Buffer替换Omega试剂盒中VHB Buffer，采用充分混匀的志愿者粪便(志愿者7)进行DNA提取测试；

本方法Wash Buffer替换Omega试剂盒中的DNA Wash Buffer，采用充分混匀的志愿者粪便(志愿者8)进行DNA提取测试；

本方法DNA洗脱溶液替换Omega试剂盒中的Elution Buffer，采用充分混匀的志愿者粪便(志愿者9)进行DNA提取测试；

本方法中的硅基质离心柱替换Omega试剂盒中的HiBind DNA Mini Columns，采用充分混匀的志愿者粪便(志愿者10)进行DNA提取测试。

为确保两种方法在操作和参数上的一致性，将高温裂解和物理击打步骤同时添加Omega试剂盒裂解环节。每种方法仅形成单一变量的替换更利于同质化或者差异化，同质化则说明效用相同，差异化则说明效用不同。每种测试选择不同的志愿者进行可以让测试覆盖更多的人群粪便类型，可以更好地测试方法的有效性。每种方法测试时均设置三次重复提取。浓度，纯度(OD_260/280，OD_260/230)采用NanoDrop 2000进行测定。

裂解液替换后效果详见表1和图2，从表1中可以观测出裂解液替换后，DNA提取浓度上两种方式相当(T-test，P＝0.8947)；纯净程度相当(OD_260/280，T-test，P＝0.0514；OD_260/230，T-test，P＝0.1596)。从图2中可以看出核酸完整性良好，条带亮度均一性良好，与测定浓度情况匹配。综上，可以说明本方法的裂解液可以起到良好的裂解作用。

表1志愿者2粪便样本提取结果表

备注：尾号-1～-3，为采用Omega试剂盒自身方法提取的结果；尾号-4～-6为替换单一组分后的提取结果；NC-1表示Omega试剂盒提取时设置的阴性对照；NC-2为替换单一组分后提取时设置的阴性对照；若无特殊说明下同。

乙酸铵替换SP2 Buffer效果详见表2和图3，从表2中可以观测出乙酸铵替换SP2Buffer，DNA提取浓度上两种方式相当(T-test，P＝0.2813)；纯净程度相当(OD_260/280，T-test，P＝0.8964；OD_260/230，T-test，P＝0.8730)。从图3中可以看出核酸完整性良好，条带亮度均一性良好，与测定浓度情况匹配。综上，可以说明乙酸铵可以起到杂质去除的作用。

表2志愿者3粪便样本提取结果表

含PVPP的十二水合硫酸铝铵溶液替换cHTR Reagent效果详见表3和图4，从表3中可以观测出含PVPP的十二水合硫酸铝铵溶液替换cHTR Reagent，DNA提取浓度上两种方式相当(T-test，P＝0.7772)；纯净度水平相当(OD_260/280，T-test，P＝0.6801；OD_260/230，T-test，P＝0.7979)；从图4中可以看出核酸完整性良好，条带亮度均一性良好，与测定浓度情况匹配。综上，可以说明含PVPP的十二水合硫酸铝铵溶液可以起到良好絮凝去除杂质的作用。

表3志愿者4粪便样本提取结果表

20mg/mL蛋白酶K替换Proteinase K Solution效果详见表4和图5，从表4中可以观测出20mg/mL蛋白酶K替换Proteinase K Solution，DNA提取浓度上两种方式相当(T-test，P＝0.2421)；纯净度水平相当(OD_260/280，T-test，P＝0.5022；OD_260/230，T-test，P＝0.7289)；从图5中可以看出核酸完整性良好，条带亮度均一性良好，与测定浓度情况匹配，而且胶孔内未观测到残留蛋白质。综上，可以说明20mg/mL蛋白酶K可以起到去除蛋白质的作用。

表4志愿者5粪便样本提取结果表

DNA Binding Buffer替换BL Buffer效果详见表5和图6，从表5中可以观测出DNABinding Buffer替换BL Buffer，DNA提取浓度上两种方式相当(T-Test，P＝0.298)；纯净度水平相当(OD_260/280，T-test，P＝0.5238；OD_260/230，T-test，P＝0.3697)；从图6中可以看出核酸完整性良好，条带亮度均一性良好，与测定浓度情况匹配。综上，可以说明DNA BindingBuffer可以将DNA与硅胶基质离心柱之间形成有效结合。

表5志愿者6粪便样本提取结果表

Clean Buffer替换VHB Buffer效果详见表6和图7，从表6中可以观测出CleanBuffer替换VHB Buffer，DNA提取浓度上两种方式相当(T-test，P＝0.4045)；纯净度水平相当(OD_260/280，T-test，P＝0.3509；OD_260/230，T-test，P＝0.3958)；从图7中可以看出核酸完整性良好，条带亮度均一性良好，与测定浓度情况匹配。综上，可以说明Clean Buffer可以将DNA与离心柱结合后残留的蛋白质等杂质进行有效去除。

表6志愿者7粪便样本提取结果表

Wash Buffer替换DNA Wash Buffer效果详见表7和图8，从表7中可以观测出WashBuffer替换DNAWash Buffer，DNA提取浓度上两种方式相当(T-test，P＝0.2566)；纯净度水平相当(OD_260/280，T-test，P＝0.2437；OD_260/230，T-test，P＝0.3956)；从图8中可以看出核酸完整性良好，条带亮度均一性良好，与测定浓度情况匹配。综上，可以说明Wash Buffer可以将DNA与离心柱结合后残留的离子等杂质进行有效去除。

表7志愿者8粪便样本提取结果表

DNA洗脱溶液替换Elution Buffer效果详见表8和图9，从表8中可以观测出DNA洗脱溶液替换Elution Buffer，DNA提取浓度上两种方式相当(T-test，P＝0.2400)；纯净度水平相当(OD_260/280，T-test，P＝0.5656；OD_260/230，T-test，P＝0.5376)；从图9中可以看出核酸完整性良好，条带亮度均一性良好，与测定浓度情况匹配。综上，可以说明DNA洗脱溶液可以将DNA与离心柱形成良好分离效果。

表8志愿者9粪便样本提取结果表

硅基质离心柱替换HiBind DNA Mini Columns效果详见表9和图10，从表9中可以观测出硅基质离心柱替换HiBind DNA Mini Columns，DNA提取浓度上两种方式相当(T-test，P＝0.2533)；纯净度水平相当(OD_260/280，T-test，P＝0.4345；OD_260/230，T-test，P＝0.2428)；从图10中可以看出核酸完整性良好，条带亮度均一性良好，与测定浓度情况匹配。综上，可以说明硅基质离心柱可以与实验中留出中的DNA发生有效结合和洗脱效果。

表9志愿者10粪便样本提取结果表

结合志愿者2～志愿者10核酸提取结果可以看出，每个组分可以在提取的过程中形成起到各自有效的作用，为后续DNA提取流程的组合提供可行性，为流程搭建，提供了组分应实现的作用。

实施例3

为了观测本方法是否可以较全面的获取样本各类物种的DNA信息，采用传统方法和本方法两套DNA提取流程进行比较，观测最终测序及生物信息分析结果是否存在差异。

选择志愿者11的粪便样本作为本次测试目标样本，采用传统方法和本发明方法分别进行粪便DNA提取，每种方法提取3个重复。按照illumina公司官方提供的16s rRNA基因建库方法(https://support.illumina.com.cn/content/dam/illumina-marketing/documents/products/other/16s-metagenomics-faq-1270-2014-003.pdf)完成Miseq测序平台文库构建，并完成测序。

按照如下方式进行生物信息学分析。

经过如上质控后获得的优化序列进行OTU聚类，分类注释后，观测志愿者11在不同DNA提取方法下，在属水平微生物物种(高通量测序常用于讨论问题的分类学水平)是否存在差异。

从DNA提取的结果中可以看出(详见表10和图11)，表11中可以看出，DNA提取的浓度在两种方法实施下并无显著差异(Test，P＝0.7092)，而本发明使用的方法，纯度上也并略有优势(OD_260/280，T-test，P＝0.7092；OD_260/230，T-test，*P＝0.0360)。核酸电泳检测后，条带完整性一致，且亮度与浓度关系一致(图11)。

表10志愿者11粪便样本提取结果表

针对志愿者11两种DNA提取方法物种丰度上的比较发现(图12)，采用本发明DNA提取方法，与传统方法相比结果上物种稳定性更加趋于一致。于此同时，采用样本间的差异距离(bray-curtis)进行统计计算并采用Hcluster tree average方法进行树状图绘制，观测样本间的差异性(图13)，结果显示，两种方法三个重复样本差异甚小(距离差异小于0.1)，且采用两种方法的结果中，样本相似度并不受提取方法的不同而存在差异。

综上，本发明中使用的方法在保持了柱式提取试剂盒提取DNA的优势外，并能同传统方法保持更加一致的结果，可以为环境样本和生物样本在菌群研究中提供良好的技术保障

以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

Claims

1.一种核酸化学裂解液，其特征在于，所述核酸化学裂解液的配制原料包括异硫氰酸胍、N-月桂酰肌氨酸钠盐和pH缓冲液。

2.根据权利要求1所述的核酸化学裂解液，其特征在于，以核酸化学裂解液的总体积为基准，还包括以下特征中的一种或几种：

1)所述异硫氰酸胍的终浓度为0.6～1.6M；

2)所述N-月桂酰肌氨酸钠盐的终质量体积百分数为0.03～0.05％，单位为g/mL；

3)所述pH缓冲液为PBS；

4)所述核酸化学裂解液的pH为7～9。

3.一种核酸提取试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括：权利要求1所述的核酸化学裂解液和抑制成分去除液。

4.根据权利要求3所述的核酸提取试剂盒，其特征在于，所述抑制成分去除液包括十二水合硫酸铝铵和PVPP的混合液以及乙酸铵；优选的，还包括以下特征中的一种或几种：

1)乙酸铵的浓度为50mM～5M，溶剂为水；

2)以十二水合硫酸铝铵溶液和PVPP混合液的总体积为基准，所述十二水硫酸铝铵的终浓度为50mM～0.6M，十二水合硫酸铝铵溶液和PVPP混合液的溶剂为水；

3)所述PVPP的粒径为100～120μm。

5.根据权利要求3所述的核酸提取试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括蛋白质去除剂，所述蛋白质去除剂为蛋白酶K常温保存液，优选的，以蛋白酶K常温保存液的总体积为基准，所述蛋白酶K常温保存液包括以下组分：

蛋白酶K 10～30mg/mL；

三(羟甲基)氨基甲烷 5mM-50mM；

氯化钙 1mM～50mM；

氯化钠 10-500mM；

甘油终体积浓度为30～60％；

吐温20终体积浓度为0.1～5％；

溶剂为水。

6.根据权利要求3所述的核酸提取试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括结合缓冲液，所述结合缓冲液包括盐酸胍、三羟甲基氨基甲烷、乙酸钠和Triton X-100；优选的，以结合缓冲液的总体积为基准，还包括以下特征中的一种或几种：

1)所述盐酸胍的终浓度为2-6M；

2)所述Tris-base的终浓度为10～100mM；

3)所述乙酸钠的终浓度为50mM～3M；

4)所述Triton X-100的终体积浓度为0.1～5％；

5)所述结合缓冲液的溶剂为水。

7.根据权利要求3所述的核酸提取试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括蛋白洗涤液，所述蛋白洗涤液包括盐酸胍、Tris-base、氯化钠和乙醇，溶剂为水；优选的，以不含乙醇的蛋白洗涤液的总体积为基准，还包括以下特征中的一种或几种：

1)所述盐酸胍的终浓度为0.5-6M；

2)所述Tris-base的终浓度为10～100mM；

3)所述氯化钠的终浓度为1～500mM；

4)所述乙醇为无水乙醇，所述不含乙醇的蛋白洗涤液与无水乙醇的混合体积比为1:9～19:1。

8.根据权利要求3所述的核酸提取试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括离子洗涤液，所述离子洗涤液包括Tris-base、乙二胺四乙酸二钠、盐酸、Tween 20、乙醇，溶剂为水；优选的，以不含乙醇的离子洗涤液的总体积为基准，还包括以下特征中的一种或几种：

1)所述Tris-base的终浓度为10mM～5M；

2)所述乙二胺四乙酸二钠的终浓度为5mM～2M；

3)所述盐酸的终浓度为1N～6N；

4)所述Tween 20的终体积浓度为0.5％～50％；

5)所述乙醇选自无水乙醇，所述不含乙醇的离子洗涤液与无水乙醇的混合体积比为1:9～19:1。

9.根据权利要求3所述的核酸提取试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括洗脱液。

10.一种核酸提取方法，其特征在于，所述核酸提取方法包括采用权利要求1或2所述的核酸化学裂解液化学裂解样本，再经杂质去除、核酸吸附、洗涤、洗脱后，收集得到核酸。

11.根据权利要求10所述的核酸提取方法，其特征在于，所述核酸提取方法还包括以下特征中的一种或几种：

1)所述核酸提取的样本选自生物或环境样本；

2)裂解样本时采用化学裂解、高温孵育裂解和物理击打裂解三种方式相结合；

3)杂质去除时采用权利要求4所述试剂盒中的抑制成分去除液、权利要求5所述试剂盒中的蛋白质去除剂分别去除体系中的杂质；

4)基于硅胶基质离心柱式方法提取核酸时，采用权利要求6所述试剂盒中的结合缓冲液使离心柱吸附核酸；

5)洗涤时采用权利要求7所述试剂盒中的蛋白洗涤液和/或权利要求8所述试剂盒中的离子洗涤液洗涤。