CN101294221A

CN101294221A - 一种大批量快速制备pcr模板的方法

Info

Publication number: CN101294221A
Application number: CNA2008100712674A
Authority: CN
Inventors: 陈平华; 王恒波; 陈由强; 陈如凯; 许莉萍; 郭晋隆; 徐景升; 蔡澜峰; 潘永保
Original assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Current assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Priority date: 2008-06-23
Filing date: 2008-06-23
Publication date: 2008-10-29
Anticipated expiration: 2028-06-23
Also published as: CN101294221B

Abstract

一种大批量快速制备PCR模板的方法，属植物分子检测技术领域，具体涉及植物组织在裂解液中加热裂解和裂解液中和。本发明的技术方案是：将微量植物叶片放入一定体积的裂解液中加热裂解，然后中和，反应混合液可直接作为PCR反应的模板，在添加适量聚合酶稳定剂的情况下，PCR反应稳定，重复性强。该方法特别适宜大批量PCR反应模板的快速制备，可以大幅度提高分子检测和遗传分析的效率，极显著地降低成本。

Description

一种大批量快速制备PCR模板的方法

技术领域

本发明涉及一种PCR模板的制备方法，尤其是一种大批量快速制备PCR模板的方法和试剂配方。植物组织通过裂解液裂解和中和液中和后，直接作为PCR反应模板进行PCR扩增分析，为大批量进行植物基因组遗传分析提供模板。

背景技术

随着分子生物学的迅速发展，生物技术的研究领域逐渐拓展到生物科学的各个方面，核酸水平的研究是分子生物学研究的重要内容，PCR(polymerase chain reaction)技术作为研究核酸的主要工具，在分子生物学领域扮演着越来越重要的角色。应用PCR技术研究核酸的前提是制备PCR反应的模板，也就是将生物组织内的遗传物质如DNA释放出来，供PCR分析之用。

目前较常规提取植物基因组DNA的方法主要有CTAB(王丽，乔爱民，孙一铭，等.菜心基因组DNA提取及RAPD反应体系的优化[J].西南师范大学学报，2006，31(2)：124-128)和SDS(聂珍素，赖钟雄，潘东明，等.橄榄基因组DNA提取及RAPD扩增条件优化[J].亚热带农业研究，2005，1(2)：6-8)法，这两种方法各有优缺点，但是都需要对植物组织进行低温研磨、高温裂解、残渣分离、去除蛋白、RNA、盐类等杂质、沉淀DNA并离心分离等步骤，程序复杂、操作繁琐、时间长、成本高、所需较多的植物材料，而且提取过程中要用酚、氯仿等对人体有害的有机试剂。另外，需要的药品很多，尤其是需要提取大批量材料的DNA样品时，山于研磨和提取DNA过程中许多器皿不得不重复使用，往往对于污染高度敏感的PCR反应会产生严重影响。

本发明根据碱裂解原理[J·萨姆布鲁克，E·F·费里奇等.分子克隆实验指南(第二版)]，研制不改变PCR反应缓冲液成分的裂解液配方，提出增加酶稳定剂以降低杂质干扰的理念，最终发明了一种免除DNA抽提制备PCR反应模板的新方法，和已有DNA制备方法相比，该方法具有简便、快速和高效的突出优点。以有代表性的单子叶和双子叶植物的叶片为供试材料，经过对不同种类的植物组织、多种引物的PCR反应的反复验证，证实了这种方法的可行性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高通量制备PCR模板的方法，简便快速地制备大批量适于PCR检测的模板。该方法只需要微量的植物材料，且不需要抽提植物DNA，能应用于大批量活体植物组织的快速分子检测，为植物大批量活体分子检测提供了一种新的方法。

本发明是一种大批量快速制备PCR模板的方法，其特征在于通过以下步骤实现：

1)量取等体积的Solution A和Solution B，添加灭菌双蒸水并充分混匀后得裂解液，备用；所述的Solution A为1mol/L KOH的水溶液；Solution B为20％Tween-20的水溶液；所述灭菌双蒸水的添加量为Solution A使用量的8倍；

2)取50uL裂解液于离心管中，然后置测试材料于离心管的裂解液中，短暂离心后，在PCR仪上93～98℃保持10～15min；所述测试材料为供试作物的叶片，其使用量以能够完全浸入离心管的裂解液中为宜；

3)取出离心管并迅速放冰上；向离心管中加入50uL的Solution C，混匀，即可直接用作PCR反应模板；所述Solution C为TE缓冲液，TE缓冲液成分：0.1M Tris-HCl和2mM EDTA的水溶液。

4)模板的PCR检测，在PCR反应体系配制的过程中，先添加Solution D 2.5uL/每管；然后进行PCR反应和电泳成像；所述PCR反应和电泳成像为常规技术；Solution D为1％BSA水溶液。

本发明的一种大批量快速制备PCR模板的方法，完全区别于传统的CTAB法和SDS法，可直接跳过抽提基因组DNA这种繁琐的步骤，通过KOH碱裂解析出的微量基因组DNA为模板进行PCR分析，且没有引进新的可能影响PCR反应的离子，是一重大的进步。特别适用于受试材料量极少或活体的大批量快速检测，更能充分显示其优点。该方法经过对不同种类的作物组织、多对引物的PCR反应的反复验证，证明是一种具有广泛应用价值的PCR检测模板的制备方法。

Solution A主要是为了溶解细胞，释放基因组DNA；

Solution B是一种非离子型去污剂，在乳化蛋白时不破坏蛋白的结构，可减少对蛋白质之间原有的相互作用的破坏；

Solution C是进行中和Solution A溶液的缓冲液；

Solution D在PCR体系中有助于Taq酶的稳定性及活性，降低杂质干扰，从而提高PCR的扩增效率。

本发明具有的特点为：利用一种新鲜配制的对PCR反应影响很小的碱混合液，在加热条件下对作物组织进行消化裂解，释放出基因组DNA，然后中和。中和反应液可直接作为PCR反应模板进行PCR扩增分析。这种方法在单子叶和双子叶作物中经过验证，具有广泛的适用性。该方法具有简单、快速、成本低等特点。该方法对于大批量PCR分析具有特殊的意义。

本发明具有的优点为：

1)快速高效，特别适用于大批量PCR检测分析：样品从植物组织到PCR反应的模板，耗时不足半小时，并且随样品数的增加，制备单个样品的时间就越短。裂解液可直接作为PCR反应模板使用，不用沉淀分离DNA，进一步提高了效率。

2)取样量少：一次取样量在毫克(mg)级水平，但可供近百次的PCR分析。对受试材料几乎没有伤害，不会对其生长造成影响，完全可以满足受试材料活体分析的需要。

3)通用性强：本发明方法可应用于多种作物组织制备PCR反应的模板，无论单子叶还是双子叶植物，方法具有通用性。

4)操作简便易行：不需要昂贵的仪器，特别是不用高速离心设备，样品制备简单，不需要复杂DNA抽提和预扩增；操作过程简便易行，没有复杂和要求苛刻的分子生物学实验操作步骤。

5)稳定性强：该方法对于多种作物和多次重复试验，结果重复性好，显示该方法具有很强的稳定性。

附图说明

图1为玉米IVR内源基因PCR反应产物电泳分析图；图中M：DNA标准分子量(TIANGEN BIOTECH)；1，2，3，4，5，6：玉米郑单958叶片裂解液；7：阴性对照(以水替代裂解液)；8：阳性对照(郑单958DNA)；9：提取空白对照；10：试剂空白对照。

图2为水稻SPS内源基因PCR反应产物电泳分析图；图中M：DNA标准分子量(TIANGEN BIOTECH)；1，2，3，4，5，6：水稻籼优63叶片裂解液；7：阴性对照(以水替代裂解液)；8：阳性对照(籼优63DNA)；9：提取空白对照；10：试剂空白对照。

图3为甘蔗5SrDNA-ITS内源基因PCR反应产物电泳分析图；图中M：DNA标准分子量(TIANGEN BIOTECH)；1，2，3，4，5，6：甘蔗福农95-1702叶片裂解液；7：阴性对照(以水替代裂解液)；8：阳性对照(福农95-1702DNA)；9：提取空白对照；10：试剂空白对照。

图4为大豆lectin内源基因PCR反应产物电泳分析图；图中M：DNA标准分子量(TIANGEN BIOTECH)；1，2，3，4，5，6：大豆叶片裂解液；7：阴性对照(以水替代裂解液)；8：阳性对照(鲁豆4号DNA)；9：提取空白对照；10：试剂空白对照。

图5为棉花18S内源基因PCR反应产物电泳分析图；图中M：DNA标准分子量(TIANGEN BIOTECH)；1，2，3，4，5，6：棉花品种中棉41叶片裂解液；7：阴性对照(以水替代裂解液)；8：阳性对照(棉花叶片中棉41DNA)；9：提取空白对照；10：试剂空白对照。

图6为烟草18S内源基因PCR反应产物电泳分析图；图中M：DNA标准分子量(TIANGEN BIOTECH)；1，2，3，4，5，6：烟草品种K326叶片裂解液；7：阴性对照(以水替代裂解液)；8：阳性对照(烟草品种叶片DNA)；9：提取空白对照；10：试剂空白对照.

具体实施方式

为了充分公开本发明一种高通量制备PCR模板的方法，以下结合实施例加以说明。

实施例：一种大批量快速制备PCR模板的方法，依序包括如下步骤：

1、试剂配制：分别配制试剂Solution A；Solution B；Solution C；Solution D；Solution D宜先用20-25μm孔径的微孔滤膜过滤后使用。

2、PCR模板的制备：

(1)取Solution A 100uL，放入1.5mL离心管A中，然后加入Solution B 100uL，再加灭菌双蒸水800uL，充分混匀；取50uL混合液放入0.5mL离心管B中；

(2)用一次性刀片切取供试作物的鲜嫩叶片10mm²，放入0.5mL离心管B的混合液中，短暂离心后，在PCR仪上95℃保持10～15min；所述的短暂离心：以8000转/分离心，时间一般不超过10秒；所述切取供试作物的刀片，为一次性使用；由于PCR反应对污染的敏感性，所以要求每只刀片仅使用一次，不重复使用。所述供试作物，如玉米、水稻、甘蔗、大豆、棉花、烟草……。

(3)取出离心管B并迅速放冰上；向离心管B中加入Solution C 50uL，混匀，即可直接用作PCR反应模板。

3、模板的PCR检测：

(1)在PCR反应体系配制的过程中，先添加Solution D 2.5uL/每管；

(2)PCR反应：采用TaKaRa Ex Taq code NO：DRR001A的PCR反应体系。

首先进行PCR反应体系配制，加样成分如下：所加入的PCR反应成分混合液一般由1×PCR反应缓冲液，各2.5mMdATP、dTTP、dGTP和dCTP，MgCl₂，引物，模板DNA，Taq DNA聚合酶和H₂O组成。所述引物：以选用国家标准引物为主，无国家标准引物时可参考部颁标准引物。

PCR反应体系配置

(3)电泳成像，将获得的PCR产物用含0.5μg/ml溴化乙啶的1.5％琼脂糖进行电泳分离并在成像系统上进行扫描拍照，结果见图1、图2、图3、图4、图5、图6。

步骤2中(1)所述的裂解液的制备方法为：吸取终体积80％(V∶V)的灭菌双蒸水于离心管中，各加入终体积10％(V∶V)的Solution A和Solution B，涡旋片刻即制成裂解液，Solution A和Solution B要在使用前混合配制裂解液；所述的裂解液体积可依反应个数多少增减，但裂解液中KOH的终浓度为0.1M，Tween-20终浓度为2％。所述涡旋片刻即置试验材料于涡旋混合仪上震荡混匀10秒。

本实施例引用具有国家标准的引物，部分引物具有物种特异性，且为单拷贝基因，这些引物分别都得到了各自大小的目的条带，从而证明按照本发明的方法制备的PCR模板完全满足PCR反应的需要，适用于对该生物DNA的PCR分析，且有足够量的DNA进行进一步的遗传分析。实施例选用在生产实践中具有代表性的单子叶和双子叶植物进行分析，结果表明该法对上述的6种主要农作物都有通用性，从而说明本法的应用具有普遍性。

如图1所示：玉米IVR内源基因的引物选用国标GB/T19495.4-2004中规定的引物序列，扩增出大小为226bp目的片段。该基因编码玉米的转化酶I基因，且为玉米内源单拷贝基因。

如图2所示：水稻SPS内源基因的引物选用行标：农业部953号公告-6-2007中规定的引物序列，扩增出大小277bp目的片段，该基因编码蔗糖磷酸合酶基因，且为水稻内源单拷贝基因。

如图3所示：甘蔗5SrDNA-ITS内源基因的引物选用CoxAV，Bennett MD，DyerTA(1992)设计的引物。详见Use of the polymerase chain reaction to detect spacer size heterogeneity in plant5S-rRNA gene clusters and to locate such clusters in wheat(Triticum aestivum L.).Theor ApplGenet 83，684-690。扩增出大小为230bp目的片段。

如图4所示：大豆lectin内源基因的引物选用国标GB/T19495.4-2004中规定的引物序列，扩增出大小为118bp目的片段。该基因编码大豆的植物凝集素基因，且为大豆内源单拷贝基因。

如图5所示：棉花18S内源基因的引物选用国标GB/T19495.4-2004中规定的引物序列，扩增出大小为137bp目的片段。该基因编码18S核糖体DNA基因，本方法适用于评估真核生物DNA的质量，并确定是否存在足够的DNA进行遗传分析。

如图6所示：烟草18S内源基因的引物选用国标GB/T19495.4-2004中规定的引物序列，扩增出大小为137bp目的片段。该基因编码18S核糖体DNA基因，本方法适用于评估真核生物DNA的质量，并确定是否存在足够的DNA进行遗传分析。

Claims

1、一种大批量快速制备PCR模板的方法，其特征在于通过以下步骤实现：

(1)量取等体积的Solution A和Solution B，添加灭菌双蒸水并充分混匀后得裂解液，备用；所述的Solution A为1mol/L KOH的水溶液；Solution B为20％Tween-20的水溶液；所述灭菌双蒸水的添加量为Solution A使用量的8倍；

(2)取50uL裂解液于离心管中，然后置测试材料于离心管的裂解液中，短暂离心后，在PCR仪上93～98℃保持10～15min；

(3)取出离心管并迅速放冰上；向离心管中加入50uL的Solution C，混匀，即可直接用作PCR反应模板；所述Solution C为TE缓冲液，组成成分为0.1M Tris-HCl和2mM EDTA的水溶液；

(4)模板的PCR检测，在PCR反应体系配制的过程中，先添加Solution D2.5uL/每管；然后进行PCR反应和电泳成像；所述Solution D为1％BSA水溶液。

2、根据权利要求1所述的一种大批量快速制备PCR模板的方法，其特征在于测试材料为供试作物的叶片，其使用量以能够完全浸入离心管的裂解液中为宜。

3、根据权利要求1或2所述的一种大批量快速制备PCR模板的方法，其特征在于供试作物的叶片为10mm²。

4、根据权利要求1所述的一种大批量快速制备PCR模板的方法，其特征在于所述的短暂离心为8000转/分离心，时间不超过10秒。

5、根据权利要求1所述的一种大批量快速制备PCR模板的方法，其特征在于Solution D先用20-25μm孔径的微孔滤膜过滤后使用。

6、根据权利要求2或3所述的一种大批量快速制备PCR模板的方法，其特征在于切取供试作物叶片的刀片，为一次性使用。