CN102220313B - 适用于作物ssr分子标记分析的基因组dna提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种适用于作物SSR分子标记分析的基因组DNA提取方法,包括步骤:1)向叶片中加入DNA提取缓冲液,蛋白酶K和核糖核酸酶,振荡混匀;2)将上述混合体系置于37℃,30min;68℃,20min;37℃,30min;然后于4℃保存;3)将步骤2)中得到的混合体系冰浴5-10min;4)将步骤3)中得到的混合体系于4℃离心,得到的上清液即可用于SSR分子标记分析。本发明提供的多种作物基因组DNA提取方法,可在短时间内完成大量样品的基因组DNA提取,提取的基因组DNA能满足SSR分子标记技术的要求,具有操作简便、快速、高通量、成本低和无污染等优点。

Description

适用于作物SSR分子标记分析的基因组DNA提取方法
技术领域
本发明属于基因工程领域,具体地说,涉及一种适用于作物SSR分子标记分析的基因组DNA提取方法。 
背景技术
传统的常规育种方法工作量大、育种周期长、效率低,消耗大量人力物力,难以满足对选育优良品种的要求。目前,利用分子标记技术进行辅助育种已成为一种趋势。许多分子标记表现为共显性,可以鉴别出纯合基因型和杂合基因型,可提供较为完整的遗传信息。分子标记技术直接以遗传物质DNA形式表现,不受物种的组织类别、发育阶段等影响,不受季节、环境等限制。分子标记辅助育种促使育种工作更便利,效率更高,结果更准确可靠。 
植物基因组DNA提取是分子标记技术操作的关键步骤之一。目前,常用的植物基因组DNA提取方法主要有CTAB法、SDS法和高盐法及其改良方法;这些方法一般步骤为:使用液氮或机械研磨材料,加入DNA提取缓冲液于65℃裂解细胞、释放DNA,后经酚、氯仿和异戊醇等抽提多糖类、蛋白质等杂质来纯化DNA,之后使用无水乙醇或异丙醇沉淀DNA,最后晾干DNA和溶解DNA。操作过程较为繁琐,耗时多,生产效率低,成本高。 
因此,寻找一种简便、快速、能够满足SSR分子标记技术要求的作物基因组DNA提取方法成为亟待解决的问题。 
发明内容
本发明的目的是提供一种简便、快速、高通量、成本低的适用于作物SSR分子标记分析的基因组DNA提取方法。 
为了实现本发明目的,本发明的一种适用于作物SSR分子标记分 析的基因组DNA提取方法,包括步骤: 
1)向叶片中加入DNA提取缓冲液,蛋白酶K和核糖核酸酶,振荡混匀; 
2)将上述混合体系置于37℃,30min;68℃,20min;37℃,30min;然后于4℃保存; 
3)将步骤2)中得到的混合体系快速转置于冰上冰浴5-10min; 
4)将步骤3)中得到的混合体系离心,得上清。 
前述的基因组DNA提取方法,步骤1)具体为:向0.02~0.04cm2的叶片中加入50~100μLDNA提取缓冲液,0.2~0.4μL的100mg/mL蛋白酶K和1~2μL的10mg/mL核糖核酸酶,振荡混匀10~20sec; 
其中,DNA提取缓冲液的成份为10mmol/L Tris-HCl,1mmol/LEDTA,0.1%SDS,pH值8.0。 
优选地,步骤1)为:向0.02~0.04cm2的叶片中加入50μL DNA提取缓冲液,0.2μL的100mg/mL蛋白酶K和1μL的10mg/mL核糖核酸酶,振荡混匀10sec。 
前述的基因组DNA提取方法,步骤2)为混合体系置于PCR扩增仪中进行反应。 
前述的基因组DNA提取方法,步骤4)为4℃下3000~5000rpm离心10~15min,优选地,4℃下3000rpm离心10min。 
前述的基因组DNA提取方法,所述作物为甘蔗、水稻、玉米、大豆或花生等。 
本发明至少具有下列优点及有益效果: 
(一)本发明所述的基因组DNA提取方法不需要研磨样品,无需抽提蛋白质、沉淀DNA、洗涤DNA和溶解DNA,所用的试剂少,提取成本低。 
(二)本发明所述的DNA提取方法可使用96孔PCR板装载反应物,具备高通量特性,可在短时间内完成大批量样品DNA的提取。 
(三)本发明所述的DNA提取方法仅有4个操作步骤,简单易行。 
(四)本发明所述的DNA提取方法为“单管制备DNA模板”,提取过程中不需要转换存放基因组DNA的器皿,避免交叉污染,做到DNA模板质量无污染。 
(五)本发明所述的DNA提取方法适用范围较广,提取甘蔗、水稻、玉米、大豆和花生等作物的基因组DNA的质量较好,可以满足SSR分子标记分析。 
附图说明
图1为采用本发明方法提取甘蔗、水稻、玉米、大豆和花生基因组DNA的0.8%琼脂糖凝胶电泳检测结果,1~2为甘蔗品种湛江25号、ROC20,3~4为水稻品种博优168、金优桂99,5~6为玉米品种正大619、桂糯518,7~8为大豆品种桂春豆1号、桂早2号,9~10为花生品种桂花26、桂花30。 
图2A-图2E为对10份样品材料的基因组DNA进行SSR-PCR扩增后经7.5%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析图谱,图2A的1为DNAMarker DL2000,2~5依次为用引物SMC119CG和mSSCIR47分别对甘蔗ROC20、湛江25号基因组DNA的扩增结果;图2B的1~4依次为用引物RM585和RM171分别对水稻金优桂99、博优168基因组DNA的扩增结果,5为DNA Marker DL2000;图2C的1为DNA Marker DL2000,2~5依次为用引物bnlg125和bnlg1792分别对玉米桂糯518、正大619基因组DNA的扩增结果;图2D的1~4依次为用引物satt491、satt178对大豆桂早2号和桂春豆1号基因组DNA的扩增结果,5为DNA Marker DL2000;图2E的1为DNA Marker DL2000,2E依次为用引物PM35、PM3对花生桂花30和桂花26基因组DNA的扩增结果。 
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。 
以下实施例中使用的甘蔗品系湛江25和ROC20,两个水稻品系博 优168和金优桂99,两个玉米品系正大619和桂糯518,两个大豆品系桂春豆1号和桂早2号,两个花生品系桂花26和桂花30均为市售商品。实施例用于SSR分子标记分析的甘蔗、水稻、玉米和花生基因组DNA的提取 
1材料与方法 
1.1材料 
选用两个甘蔗品系:湛江25、ROC20;两个水稻品系:博优168、金优桂99;两个玉米品系:正大619、桂糯518;两个大豆品系:桂春豆1号、桂早2号;两个花生品系:桂花26、桂花30。采集植株上部较嫩的叶片,分装入保鲜袋洒入少许水密封后置于4℃条件下保藏备用。 
每种作物各筛选2个SSR标记,引物序列(表1)由上海捷瑞生物工程有限公司合成。 
表1SSR标记的引物序列 
Figure BDA0000065337600000041
1.2DNA提取方法: 
1)把材料叶片洗净,室温晾干。 
2)用75%的酒精擦洗过的剪刀剪取0.2~0.3cm2(每个小片约为0.02cm2)的叶片装入96孔PCR板的孔中,加入100μL DNA提取缓冲液,加入0.2μL的100mg/mL蛋白酶K和的1μL的10mg/mL核糖核酸酶,用PCR板硅胶盖封盖好后于漩涡振荡仪上混匀10sec。 
3)在Biometra PCR仪中设置以下反应程序并保存:37℃,30min;68℃,20min;37℃,30min;4℃,∞。 
4)将96孔PCR板放入PCR仪中进行反应。 
5)将装有反应物的PCR板置于冰上冰浴10min。 
6)将PCR板放入Thermo冷冻离心机中,于4℃,进行3×103rpm离心10min,得到的上清液经Eppenndorf浓度电度测定仪在260nm处测定DNA浓度后,将DNA溶液稀释到25ng/μl便可直接用于SSR-PCR分析。 
1.3基因组DNA电泳分析 
取10μL总DNA原液+2μL 6×loading buffer混匀,用0.8%琼脂糖凝胶电泳。经1μg/ml溴化乙锭(EB)染色15min,后用清水冲洗,于Pharmacia凝胶成像系统仪上检测、拍照并保存。 
1.4SSR-PCR扩增分析 
SSR-PCR扩增的具体方法: 
在冰浴中建立20μL PCR反应体系(表2),然后置于PCR仪上进行反应。 
表2SSR-PCR体系(20μL)
Figure BDA0000065337600000051
在Biometra PCR仪上先94℃预变性5min,然后94℃变性40sec,Tm退火1min,72℃延伸50sec,32个循环,72℃终延伸3min。 
PCR扩增产物使用7.5%的非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离,经银染和显影后使用Bio RAD GS-800激光扫描仪摄相、编辑并保存图像。 
2结果 
2.1基因组DNA的提取 
如图1所示,提取的DNA样品电泳主谱带为一条较为明亮、清晰、 完整的带,没有明显拖尾,说明DNA降解不明显,纯度较高;点样孔下端干净不发亮,说明蛋白质等杂质的去除比较彻底。从而可推测,提取到的DNA质量较高。 
图1中,泳道1~2为甘蔗品种湛江25号、ROC20,3~4为水稻品种博优168、金优桂99,5~6为玉米品种正大619、桂糯518,7~8为大豆品种桂春豆1号、桂早2号,9~10为花生品种桂花26、桂花30。 
2.2SSR-PCR扩增结果 
利用本发明方法提取的5种作物基因组DNA应用于SSR标记分析,PCR扩增结果见图2A-图2E,所得条带较为清晰。其中,图2A的1为DNA Marker DL2000,2~5依次为用引物SMC119CG和mSSCIR47分别对甘蔗ROC20、湛江25号基因组DNA的扩增结果;图2B的1~4依次为用引物RM585和RM171分别对水稻金优桂99、博优168基因组DNA的扩增结果,5为DNA Marker DL2000;图2C的1为DNA MarkerDL2000,2~5依次为用引物bnlg125和bnlg1792分别对玉米桂糯518、正大619基因组DNA的扩增结果;图2D的1~4依次为用引物satt491、satt178对大豆桂早2号和桂春豆1号基因组DNA的扩增结果,5为DNAMarker DL2000;图2E的1为DNA Marker DL2000,2E依次为用引物PM35、PM3对花生桂花30和桂花26基因组DNA的扩增结果。 
虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。 
Figure IDA0000065337660000011
Figure IDA0000065337660000021
Figure IDA0000065337660000031

Claims (3)

1.一种适用于作物SSR分子标记分析的基因组DNA提取方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)向0.02~0.04cm2的叶片中加入50μL DNA提取缓冲液,0.2μL的100mg/mL蛋白酶K和1μL的10mg/mL核糖核酸酶,振荡混匀10sec;
2)将上述混合体系置于37℃,30min;68℃,20min;37℃,30min;然后于4℃保存;
3)将步骤2)中得到的混合体系冰浴10min;
4)将步骤3)中得到的混合体系在4℃下,3000rpm离心10min,得上清;
其中,步骤1)中所述DNA提取缓冲液的成份为10mmol/L Tris-HCl,1mmol/L EDTA,0.1% SDS,pH值8.0。
2.根据权利要求1所述的基因组DNA提取方法,其特征在于,步骤2)为混合体系置于PCR扩增仪中进行反应。
3.根据权利要求1或2所述的基因组DNA提取方法,其特征在于,所述作物为甘蔗、水稻、玉米、大豆或花生。 
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104017859A (zh) * 2014-03-13 2014-09-03 南宁泰格瑞农业科技有限公司 一种基于ssr与毛细管电泳技术鉴定甘蔗种质资源的方法
CN103911435A (zh) * 2014-03-13 2014-07-09 南宁泰格瑞农业科技有限公司 利用ssr标记与毛细管电泳鉴定甘蔗杂交种子纯度的方法
CN105695446B (zh) * 2016-02-24 2019-01-11 镇江华大检测有限公司 一种提取大豆种子全基因组dna的方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101294221A (zh) * 2008-06-23 2008-10-29 福建农林大学 一种大批量快速制备pcr模板的方法
CN101724696A (zh) * 2009-10-28 2010-06-09 吉林大学 双温多重pcr鉴定猪早期胚胎性别的方法及试剂盒

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101413018B (zh) * 2008-12-09 2011-04-27 中南大学 一种基因组dna的提取方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101294221A (zh) * 2008-06-23 2008-10-29 福建农林大学 一种大批量快速制备pcr模板的方法
CN101724696A (zh) * 2009-10-28 2010-06-09 吉林大学 双温多重pcr鉴定猪早期胚胎性别的方法及试剂盒

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
孙林静 等.一种简单快速的DNA提取方法在水稻上的应用.《天津农学院学报》.2007,第14卷(第3期),1-4. *

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