CN102220313B - 适用于作物ssr分子标记分析的基因组dna提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种适用于作物SSR分子标记分析的基因组DNA提取方法，包括步骤：1)向叶片中加入DNA提取缓冲液，蛋白酶K和核糖核酸酶，振荡混匀；2)将上述混合体系置于37℃，30min；68℃，20min；37℃，30min；然后于4℃保存；3)将步骤2)中得到的混合体系冰浴5-10min；4)将步骤3)中得到的混合体系于4℃离心，得到的上清液即可用于SSR分子标记分析。本发明提供的多种作物基因组DNA提取方法，可在短时间内完成大量样品的基因组DNA提取，提取的基因组DNA能满足SSR分子标记技术的要求，具有操作简便、快速、高通量、成本低和无污染等优点。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体地说，涉及一种适用于作物SSR分子标记分析的基因组DNA提取方法。
背景技术
传统的常规育种方法工作量大、育种周期长、效率低，消耗大量人力物力，难以满足对选育优良品种的要求。目前，利用分子标记技术进行辅助育种已成为一种趋势。许多分子标记表现为共显性，可以鉴别出纯合基因型和杂合基因型，可提供较为完整的遗传信息。分子标记技术直接以遗传物质DNA形式表现，不受物种的组织类别、发育阶段等影响，不受季节、环境等限制。分子标记辅助育种促使育种工作更便利，效率更高，结果更准确可靠。
植物基因组DNA提取是分子标记技术操作的关键步骤之一。目前，常用的植物基因组DNA提取方法主要有CTAB法、SDS法和高盐法及其改良方法；这些方法一般步骤为：使用液氮或机械研磨材料，加入DNA提取缓冲液于65℃裂解细胞、释放DNA，后经酚、氯仿和异戊醇等抽提多糖类、蛋白质等杂质来纯化DNA，之后使用无水乙醇或异丙醇沉淀DNA，最后晾干DNA和溶解DNA。操作过程较为繁琐，耗时多，生产效率低，成本高。
因此，寻找一种简便、快速、能够满足SSR分子标记技术要求的作物基因组DNA提取方法成为亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种简便、快速、高通量、成本低的适用于作物SSR分子标记分析的基因组DNA提取方法。
为了实现本发明目的，本发明的一种适用于作物SSR分子标记分 析的基因组DNA提取方法，包括步骤：
1)向叶片中加入DNA提取缓冲液，蛋白酶K和核糖核酸酶，振荡混匀；
2)将上述混合体系置于37℃，30min；68℃，20min；37℃，30min；然后于4℃保存；
3)将步骤2)中得到的混合体系快速转置于冰上冰浴5-10min；
4)将步骤3)中得到的混合体系离心，得上清。
前述的基因组DNA提取方法，步骤1)具体为：向0.02～0.04cm2的叶片中加入50～100μLDNA提取缓冲液，0.2～0.4μL的100mg/mL蛋白酶K和1～2μL的10mg/mL核糖核酸酶，振荡混匀10～20sec；
其中，DNA提取缓冲液的成份为10mmol/L Tris-HCl，1mmol/LEDTA，0.1％SDS，pH值8.0。
优选地，步骤1)为：向0.02～0.04cm2的叶片中加入50μL DNA提取缓冲液，0.2μL的100mg/mL蛋白酶K和1μL的10mg/mL核糖核酸酶，振荡混匀10sec。
前述的基因组DNA提取方法，步骤2)为混合体系置于PCR扩增仪中进行反应。
前述的基因组DNA提取方法，步骤4)为4℃下3000～5000rpm离心10～15min，优选地，4℃下3000rpm离心10min。
前述的基因组DNA提取方法，所述作物为甘蔗、水稻、玉米、大豆或花生等。
本发明至少具有下列优点及有益效果：
(一)本发明所述的基因组DNA提取方法不需要研磨样品，无需抽提蛋白质、沉淀DNA、洗涤DNA和溶解DNA，所用的试剂少，提取成本低。
(二)本发明所述的DNA提取方法可使用96孔PCR板装载反应物，具备高通量特性，可在短时间内完成大批量样品DNA的提取。
(三)本发明所述的DNA提取方法仅有4个操作步骤，简单易行。
(四)本发明所述的DNA提取方法为“单管制备DNA模板”，提取过程中不需要转换存放基因组DNA的器皿，避免交叉污染，做到DNA模板质量无污染。
(五)本发明所述的DNA提取方法适用范围较广，提取甘蔗、水稻、玉米、大豆和花生等作物的基因组DNA的质量较好，可以满足SSR分子标记分析。
附图说明
图1为采用本发明方法提取甘蔗、水稻、玉米、大豆和花生基因组DNA的0.8％琼脂糖凝胶电泳检测结果，1～2为甘蔗品种湛江25号、ROC20，3～4为水稻品种博优168、金优桂99，5～6为玉米品种正大619、桂糯518，7～8为大豆品种桂春豆1号、桂早2号，9～10为花生品种桂花26、桂花30。
图2A-图2E为对10份样品材料的基因组DNA进行SSR-PCR扩增后经7.5％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析图谱，图2A的1为DNAMarker DL2000，2～5依次为用引物SMC119CG和mSSCIR47分别对甘蔗ROC20、湛江25号基因组DNA的扩增结果；图2B的1～4依次为用引物RM585和RM171分别对水稻金优桂99、博优168基因组DNA的扩增结果，5为DNA Marker DL2000；图2C的1为DNA Marker DL2000，2～5依次为用引物bnlg125和bnlg1792分别对玉米桂糯518、正大619基因组DNA的扩增结果；图2D的1～4依次为用引物satt491、satt178对大豆桂早2号和桂春豆1号基因组DNA的扩增结果，5为DNA Marker DL2000；图2E的1为DNA Marker DL2000，2E依次为用引物PM35、PM3对花生桂花30和桂花26基因组DNA的扩增结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
以下实施例中使用的甘蔗品系湛江25和ROC20，两个水稻品系博 优168和金优桂99，两个玉米品系正大619和桂糯518，两个大豆品系桂春豆1号和桂早2号，两个花生品系桂花26和桂花30均为市售商品。实施例用于SSR分子标记分析的甘蔗、水稻、玉米和花生基因组DNA的提取
1材料与方法
1.1材料
选用两个甘蔗品系：湛江25、ROC20；两个水稻品系：博优168、金优桂99；两个玉米品系：正大619、桂糯518；两个大豆品系：桂春豆1号、桂早2号；两个花生品系：桂花26、桂花30。采集植株上部较嫩的叶片，分装入保鲜袋洒入少许水密封后置于4℃条件下保藏备用。
每种作物各筛选2个SSR标记，引物序列(表1)由上海捷瑞生物工程有限公司合成。
表1SSR标记的引物序列
1.2DNA提取方法：
1)把材料叶片洗净，室温晾干。
2)用75％的酒精擦洗过的剪刀剪取0.2～0.3cm2(每个小片约为0.02cm2)的叶片装入96孔PCR板的孔中，加入100μL DNA提取缓冲液，加入0.2μL的100mg/mL蛋白酶K和的1μL的10mg/mL核糖核酸酶，用PCR板硅胶盖封盖好后于漩涡振荡仪上混匀10sec。
3)在Biometra PCR仪中设置以下反应程序并保存：37℃，30min；68℃，20min；37℃，30min；4℃，∞。
4)将96孔PCR板放入PCR仪中进行反应。
5)将装有反应物的PCR板置于冰上冰浴10min。
6)将PCR板放入Thermo冷冻离心机中，于4℃，进行3×103rpm离心10min，得到的上清液经Eppenndorf浓度电度测定仪在260nm处测定DNA浓度后，将DNA溶液稀释到25ng/μl便可直接用于SSR-PCR分析。
1.3基因组DNA电泳分析
取10μL总DNA原液+2μL 6×loading buffer混匀，用0.8％琼脂糖凝胶电泳。经1μg/ml溴化乙锭(EB)染色15min，后用清水冲洗，于Pharmacia凝胶成像系统仪上检测、拍照并保存。
1.4SSR-PCR扩增分析
SSR-PCR扩增的具体方法：
在冰浴中建立20μL PCR反应体系(表2)，然后置于PCR仪上进行反应。
表2SSR-PCR体系(20μL)
在Biometra PCR仪上先94℃预变性5min，然后94℃变性40sec，Tm退火1min，72℃延伸50sec，32个循环，72℃终延伸3min。
PCR扩增产物使用7.5％的非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，经银染和显影后使用Bio RAD GS-800激光扫描仪摄相、编辑并保存图像。
2结果
2.1基因组DNA的提取
如图1所示，提取的DNA样品电泳主谱带为一条较为明亮、清晰、 完整的带，没有明显拖尾，说明DNA降解不明显，纯度较高；点样孔下端干净不发亮，说明蛋白质等杂质的去除比较彻底。从而可推测，提取到的DNA质量较高。
图1中，泳道1～2为甘蔗品种湛江25号、ROC20，3～4为水稻品种博优168、金优桂99，5～6为玉米品种正大619、桂糯518，7～8为大豆品种桂春豆1号、桂早2号，9～10为花生品种桂花26、桂花30。
2.2SSR-PCR扩增结果
利用本发明方法提取的5种作物基因组DNA应用于SSR标记分析，PCR扩增结果见图2A-图2E，所得条带较为清晰。其中，图2A的1为DNA Marker DL2000，2～5依次为用引物SMC119CG和mSSCIR47分别对甘蔗ROC20、湛江25号基因组DNA的扩增结果；图2B的1～4依次为用引物RM585和RM171分别对水稻金优桂99、博优168基因组DNA的扩增结果，5为DNA Marker DL2000；图2C的1为DNA MarkerDL2000，2～5依次为用引物bnlg125和bnlg1792分别对玉米桂糯518、正大619基因组DNA的扩增结果；图2D的1～4依次为用引物satt491、satt178对大豆桂早2号和桂春豆1号基因组DNA的扩增结果，5为DNAMarker DL2000；图2E的1为DNA Marker DL2000，2E依次为用引物PM35、PM3对花生桂花30和桂花26基因组DNA的扩增结果。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (3)
1.一种适用于作物SSR分子标记分析的基因组DNA提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）向0.02~0.04cm2的叶片中加入50μL DNA提取缓冲液，0.2μL的100mg/mL蛋白酶K和1μL的10mg/mL核糖核酸酶，振荡混匀10sec；
2）将上述混合体系置于37℃，30min；68℃，20min；37℃，30min；然后于4℃保存；
3）将步骤2）中得到的混合体系冰浴10min；
4）将步骤3）中得到的混合体系在4℃下，3000rpm离心10min，得上清；
其中，步骤1）中所述DNA提取缓冲液的成份为10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，0.1% SDS，pH值8.0。
2.根据权利要求1所述的基因组DNA提取方法，其特征在于，步骤2）为混合体系置于PCR扩增仪中进行反应。
3.根据权利要求1或2所述的基因组DNA提取方法，其特征在于，所述作物为甘蔗、水稻、玉米、大豆或花生。
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