CN104017801A - 一种微量提取辣椒单粒种子dna的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种微量提取辣椒单粒种子DNA的方法，其步骤：A、一粒辣椒种子洗净浸种；B、液氮研磨；C、加DNA提取缓冲液，混匀；D、65℃水浴10min；E、加NaAc混匀冰浴，13000r/min离心。取上清液，加异丙醇混匀，13000r/min离心。弃上清，静置干燥，加75%乙醇清洗干燥。加入双蒸水及NaAc，充分混匀，加无水乙醇混匀，-70℃深冻1h。13000r/min离心，弃上清，75%乙醇清洗干燥。将核酸溶于无菌双蒸水，-20℃保存。本发明方法获得的种子DNA纯度和浓度均可满足PCR扩增对模板DNA的要求，成本低，速度快，是一种资源节约型和环境友好型的高效提取方法。

Description

一种微量提取辣椒单粒种子DNA的方法

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种适用于辣椒单粒种子基因组DNA的微量提取方法。

背景技术

辣椒种子纯度的鉴定方法有幼苗形态特征鉴定法、辣椒同工酶电泳鉴定法、田间小区种植鉴定法及DNA分子标记鉴定法。传统的纯度鉴定是通过海南田间小区反季节种植鉴定和本地田间小区正季种植鉴定。前者可在农户播种之前了解种子纯度，虽然可以避免因种子不纯给农户造成的损失，但公司的损失已无可挽回(制种款已在收种时付给制种农户)，而且海南鉴定结果准确性差，时间也偏晚，纯度结果出来时，早已进入种子销售旺季，影响公司经营策略。后者虽然结果准确，但时间过晚，公司和购种农户的损失都已发生，不可避免，只能作为种子的后控措施。SCAR分子标记鉴定技术可以在短时间内检测杂交辣椒种子纯度，速度快，准确性高，可有效防止制种农户参假制假。

应用SCAR分子标记鉴定过程，对基因组DNA高效提取是基本环节。目前已有多种叶片DNA提取方法，如SDS、CTAB等方法均可获取高质量、高产量的基因组DNA。这些方法应用于SCAR标记辅助育种或者杂交种纯度鉴定对大量样本进行分析时，要求种子发育长出叶片，整个过程步骤繁琐、耗时较长，对仪器设备有特殊要求等，这些缺点限制了其应用。

因此，为了及时准确地完成对大批量样本的SCAR分子标记鉴定工作，必须建立简单、高效、稳定的DNA提取方法。

发明内容

本发明的目的是一种微量提取辣椒单粒种子DNA的方法，方法简单、高效、稳定。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术措施：

一种微量提取辣椒单粒种子DNA的方法，其步骤是：

A、随机抽取辣椒干种子1粒洗净后，先将种子放入适当容器中，再缓缓倒入50～55℃水，边倒边搅拌，使种子受热均匀，15-20分钟后，水温降至常温(20-25℃，以下同)，继续浸种4小时；

B、在液氮中磨成粉末，转移至Eppendorf管中；

C、每管再加100μl DNA提取缓冲液(50mmol/L Tris/HCl pH8.0,10mmol/L EDTA pH8.0,100mol/LNaCl,1.0％SDS(W/V),8％PVP(W/V),10mmol/Lβ-巯基乙醇)的提取缓冲液，混匀；

D、置于65℃水浴中保温10min；

E、加入25μl3mol/L NaAc轻轻混匀，冰浴20min，13000r/min离心10min。取上清液置于新离心管中，加入预冷(-20℃)的等体积异丙醇混匀，13000r/min离心5min。弃上清，静置干燥后，用预冷的75％乙醇清洗后干燥。加入20μl无菌双蒸水及2μl3mol/L NaAc，充分混匀，加入50μl无水乙醇轻轻混匀，置于-70℃深冻1h。13000r/min离心5min，弃上清，用预冷的75％乙醇清洗后干燥。将核酸溶于5μl无菌双蒸水，-20℃保存备用。

前述的DNA提取方法，步骤A所取的辣椒单粒种子必须为完整、饱满的种子，种皮不能粘附任何其他物质；

步骤C所用的DNA提取缓冲液成份为50mmol/L Tris/HCl pH8.0,10mmol/L EDTApH8.0,100mol/LNaCl,1.0％SDS(W/V),8％PVP(W/V),10mmol/Lβ-巯基乙醇。

步骤E所用的DNA保存溶液为5μl的无菌双蒸水。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

(一)本发明所述的DNA提取方法不需要等到种子萌发长出叶片才能通过叶片提取基因组DNA，直接通过单粒种子就可提取基因组DNA。

(二)本发明所述的DNA提取方法省去了常规方法中氯仿抽提蛋白质的步骤，方法简单，避免了常规方法中因步骤繁琐而可能造成的DNA提取失败。

(三)本发明所述的DNA提取方法提取的基因组DNA量虽少，但质量较好，完全可以满足SCAR-PCR分子标记分析的需要。

附图说明

图1为采用本发明DNA提取方法提取的辣椒单粒种子基因组DNA在1％琼脂糖凝胶电泳检测结果，1～5为楚椒808。

图2为采用本发明的DNA提取方法提取的楚椒808的基因组DNA采用SCAR引物NUTR020进行PCR扩增后经1％的琼脂糖凝胶带你用分析图谱，图中谱带1～2代表楚椒808带型，谱带3代表母本带型，M为markerⅤ。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施对本发明做进一步说明。

以下实施方案中使用的材料楚椒808均由湖北省农业科学院经济作物研究所提供，用于SCAR分子标记鉴定的辣椒单粒种子基因组DNA的提取。

实施例1：

一种微量提取辣椒单粒种子DNA的方法，其步骤是：

1材料与方法

1.1材料

选用由湖北省农业科学院经济作物研究所提供的楚椒808商品杂交种子。

1.2本发明方法中选用了1个SCAR标记，从RAPD标记转化而来，引物序列(表1)由北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司合成，其在楚椒808和父本(9908)中均能扩增出862bp的片段，母本(9962)中并无扩增产物。

表1SCAR标记的引物序列信息表

1.3DNA提取方法

A、取楚椒808干种子(市售，)1粒洗净后，先将种子放入容器中，再缓缓倒入50～55℃水，边倒边搅拌，使种子受热均匀，15分钟后，水温降至常温，继续浸种4小时；

B、在液氮中磨成粉末，转移至1.5ml Eppendorf管中；

C、每管再加100μl DNA提取缓冲液(50mmol/L Tris/HCl pH8.0,10mmol/L EDTA pH8.0,100mol/LNaCl,1.0％SDS(W/V),8％PVP(W/V),10mmol/Lβ-巯基乙醇)的提取缓冲液，混匀；

D、置于65℃水浴中保温10min；

E、加入25μl3mol/L NaAc混匀，冰浴20min，13000r/min离心10min。取上清液置于新离心管中，加入预冷(-20℃)的等体积异丙醇混匀，13000r/min离心5min。弃上清，静置干燥后，用预冷(-20℃)的75％乙醇清洗后干燥。加入20μl无菌双蒸水及2μl3mol/L NaAc，充分混匀，加入50μl无水乙醇轻轻混匀，置于-70℃深冻1h。13000r/min离心5min，弃上清，用预冷(-20℃)的75％乙醇清洗干燥。将核酸溶于5μl无菌双蒸水，-20℃保存备用。

1.4基因组DNA电泳分析

配制1.0％琼脂糖凝胶(含0.5μg/mL EB)，分别在点样孔中加入标准DNA和样品DNA各2μl，制胶和电泳用1×TAE缓冲液(0.04mo1/L Tris-乙酸，0.001mol/L EDTA),3-4V/cm稳压电泳，以已知含量的λDNA/Hind III为对照，紫外灯下检测样品DNA亮点的深浅，检查DNA的分子量大小和数量，准确调整样品DNA的量与20ng/μL标准DNA的亮度相一致。

1.5SCAR-PCR扩增分析

PCR扩增的具体方法：

取100粒籽粒饱满的楚椒808辣椒种子，逐粒提取DNA。而后用SCAR引物进行检测。在25μl的反应体系中含10mmol/L Tris-HCl,50mmo1/L KCl,2.5mmol/L，MgC12,2×dNTP各0.2mmo1/L，引物各0.5μl，2μl模板DNA,1U的Taq酶，在反应液上覆盖20μl的矿物油；热循环参数为94℃预变性5min，接着以94℃变性1min,50－60℃退火1min,72℃延伸2min的程序扩增30个循环，最后在72℃延伸10min。取12μl扩增产物与2μl6×loading buffer混匀，点入含0.5μg/mL溴化乙锭(EB)的1.0％琼脂糖凝胶点样孔中，用1×TAE缓冲液在4V/cm电场强度下电泳40min，取出凝胶在凝胶成像仪观察电泳结果，并拍照。

2、结果

2.1种子基因组DNA提取的结果

如图1所示，1～5为楚椒808。扩增产物虽然电泳显示条带较弱，但分光光度计检测其纯度和浓度均可满足PCR扩增对模板DNA(纯度40ng/L；OD260/OD280为1.8)的要求。

2.2SCAR-PCR扩增结果

利用本发明的方法提取的楚椒808辣椒种子基因组DNA采用引物NUTR020经PCR扩增，产物经1％的琼脂糖凝胶电泳后得到结果图2，所得谱带清晰，无拖尾、杂带现象，也未出现RNA干扰出现的拖尾，说明本发明方法提取的基因组DNA较纯，无RNA的干扰和蛋白质等其他杂质。谱带1～2是楚椒808，谱带3为母本带型。由此得出，本发明方法提取的单粒辣椒种子基因组DNA经SCAR-PCR分析,能够得到清晰。明亮的条带，对亲本和杂种能够很好的区分。

本发明提供的一种微量提取辣椒单粒种子DNA的方法不需要等到种子萌发长出叶片通过叶片提取基因组DNA，能直接通过单粒种子就可提取基因组DNA，省去了常规方法中氯仿抽提蛋白质的步骤，方法简单，避免了常规方法中因步骤繁琐而可能造成的DNA提取失败，本发明方法提取的基因组DNA量虽少，但质量较好，完全可以满足SCAR-PCR分子标记分析的需要。

Claims (3)

1.一种微量提取辣椒单粒种子DNA的方法，其步骤是：

A、随机抽取辣椒干种子1粒洗净后，先将种子放入适当容器中，再缓缓倒入50～55℃水，边倒边搅拌，使种子受热均匀， 15-20分钟后，水温降至常温，继续浸种4小时；

B、在液氮中磨成粉末，转移至Eppendorf管中；

C、每管再加100μl DNA提取缓冲液，混匀；

D、置于65℃水浴中保温10min；

E、加入25μl 3mol/L NaAc轻轻混匀，冰浴20min，13 000 r/min离心10min；取上清液置于新离心管中，加入预冷（-20℃）的等体积异丙醇混匀，13 000 r/min离心5min；弃上清，静置干燥后，用预冷的75%乙醇清洗后干燥；加入20μl无菌双蒸水及2μl  3mol/L NaAc，充分混匀，加入50μl无水乙醇轻轻混匀，置于-70℃深冻1h；13 000 r/min离心5 min，弃上清，用预冷的75%乙醇清洗后干燥；将核酸溶于5μl无菌双蒸水，-20℃保存备用。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤A中的辣椒干种子为完整、饱满的种子，种皮不能粘附任何其他物质。

3.根据权利要求1所述的方法，步骤C 所用的DNA提取缓冲液成份为50mmol/L Tris/HCl pH8.0, 10mmol/L EDTA pH8.0, 100mol/LNaCl,1.0% SDS, 8%PVP,  10mmol/L β-巯基乙醇。