CN102586302B - 转Bt基因棉花标准质粒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种转Bt基因棉花标准质粒及其应用，一种转Bt基因棉花标准质粒，由SEQ ID No.1(174bp)所示核苷酸片段与SEQ ID No.2(116bp)所示核苷酸片段经过拼接后，加入常见的酶切位点，插入常规卡隆载体制得。本发明提供的转Bt基因棉花标准质粒，生产方便、易扩增、操作简便、稳定性好、纯度较高、高效经济，解决了转Bt基因棉花和转Bt基因农作物检测中标准物质缺乏的难题，并且提供了一种准确、快速、简便、省时省力的转Bt基因农作物检测试剂盒，能够很好的达到转Bt基因作物定量分析检测，特别是定量PCR检测的目的。

Description

转Bt基因棉花标准质粒及其应用

(一)技术领域

本发明涉及一种转Bt基因棉花标准质粒，及其在定性检测转Bt基因农作物及定量检测转Bt基因棉花转基因含量上的应用，以及利用该标准质粒对转Bt基因农作物的转基因含量进行检测的荧光定量PCR检测试剂盒。

(二)背景技术

Bt基因是苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)晶体蛋白基因的简称。1981年，Schnepf等人首次成功地克隆了第一个编码Bt杀虫晶体蛋白基因，揭开了利用基因工程培育抗虫植物的序幕。Bt基因中分为Cry和Cyt二大类。迄今为止，已经报道的Bt达到476种，其中Cry分为58群、449种，Cyt分为2群、27种(http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/toxins2.html)。经过密码子优化的Bt基因已被成功地导入烟草、玉米、棉花等多种植物，获得一大批具良好抗虫性的转基因植物品种和种质资源，Bt基因已成为植物基因工程及转基因育种中应用最广泛、最具潜力和应用前景的抗虫基因。

目前全世界总共已获得了50多种转Bt杀虫晶体蛋白基因植物，其中水稻、玉米、棉花、马铃薯、油菜、杨树、烟草等已商品化，我国农业部于2009年批准转基因抗虫水稻的生物安全证书。自1996年首例转基因农作物产业化应用以来，全球转基因技术研究与应用产业快速发展。截至2010年底，已有25个国家批准了24种转基因作物的商业化应用。以转基因大豆、棉花、玉米、油菜为代表的转基因作物种植面积由1996年的170万公顷发展到2010年的14800万公顷，14年间增长了87倍。

ACP基因是棉花内源基因，用于定量检测的棉花ACP基因片段长度为116bp的DNA片段；其核苷酸序列不仅具备种内一致性，即所有棉花品种中含有ACP基因；还具备种间特异性，即在除棉花外其它物种里没有该基因DNA片段。

近年来，关于转基因植物的安全性事件报道不断，如1996年巴西豆过敏事件、1998年Pusztai事件、1999年美国大斑蝶事件和墨西哥玉米污染事件、2000年星联Bt玉米事件、2007年印度转基因抗虫棉事件、加拿大超级杂草事件和中国抗虫棉事件等，这些事件促使国际组织和国家纷纷制定相应的安全管理法规，加强遗传改良作物的规范管理，并对遗传改良植物及其产品实施标识制度。

为了应对遗传改良作物管理相关的法律法规和制度，有必要建立一套高效、快速、特异的检测技术。聚合酶链反应(PCR)无疑是最佳选择。在实际检测中，标准物质十分关键。质粒标准分子的概念由日本科学家Kuribara等于2002年提出，它是指一种含有检测目的基因特异性片段的线性化重组质粒分子。经实验验证，不管是由单一特异性外源序列还是多段目标序列构建的质粒标准分子，都能很好的达到转基因作物定量分析检测，特别是定量PCR检测的目的。

质粒标准分子由于生产方便、易扩增、操作简便、稳定性好、纯度较高、高效经济等优点愈来愈受全世界转基因检测专家和研究者们重视，在转基因生物鉴定检测中是很好的标准阳性物质替代物，应用于转基因品系以及其加工品的定量PCR检测。标准质粒分子在转基因作物和附属产品检测鉴定中的应用将会发挥越来越重要的作用。

(三)发明内容

本发明的目的在于提供一种转Bt基因棉花标准质粒，解决转基因Bt农作物尤其是转Bt基因棉花检测中标准物质缺乏的难题，提供一种准确、快速、简便的转基因Bt农作物尤其是转基因棉花检测方法。

本发明采用的技术方案是：

一种转Bt基因棉花标准质粒，由SEQ ID No.1(174bp)所示核苷酸片段与SEQ IDNo.2(116bp)所示核苷酸片段经过拼接后，加入常见的酶切位点，插入常规克隆载体(如pEASY-T3、PMD18-T、PMD19-T等)制得。

具体的，所述的转Bt基因棉花标准质粒，由SEQ ID No.3插入pEASY-T3载体制的，以下简称308号质粒。所述SEQ ID No.3由SEQ ID No.1(174bp)所示核苷酸片段与SEQ ID No.2(116bp)所示核苷酸片段经过拼接，加入酶切位点Pst I、Nde I及Sal I(该酶切位点位于两片段间)得到。

所述308号质粒由如下方法构建：

1.设计PCR特异性引物；

2.PCR扩增；

3.Bt目标序列获取，片段长度174bp，通过测序进行验证；并设计荧光定量PCR引物及探针；

4.ACP目标序列获取，片段长度116bp，通过测序进行验证；并设计荧光定量PCR引物及探针；

5.构建标准质粒；

6.通过PCR、酶切、测序等验证标准质粒；

7.对标准质粒进行特异性、稳定性及均匀性检测；

8.对标准质粒特异性、稳定性及均匀性结果进行分析。

本发明转Bt基因棉花标准质粒分子既含有Bt外源基因又包括ACP棉花内源基因，Bt外源基因既可用于定性待测农产制品是否含有转Bt基因，棉花ACP内源基因可定性检测农产制品中是否含有棉花；同时，Bt外源基因和棉花ACP内源基因可以定量检测棉花类农产制品中的转Bt基因棉花的含量。

本发明还涉及所述转Bt基因棉花标准质粒在检测棉花类农产制品中转Bt基因棉花含量中的应用。

所述转Bt基因棉花标准质粒可用于检测下列之一的转Bt外源基因农作物：(1)CryIA(a)，(2)CryIA(b)，(3)CryIA(c)，(4)CryIab/ac。

所述转Bt基因农作物可为下列之一：水稻、玉米、大豆、棉花、油菜，优选为棉花。

所述转Bt基因棉花标准质粒含有棉花ACP内源基因，可在转Bt基因棉花转基因含量检测中的定性定量应用。

本发明还涉及一种转Bt基因棉花的荧光定量PCR检测试剂盒，主要包括特异性引物和探针、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶和转Bt基因棉花标准质粒，所述特异性引物和探针序列如下：

用于检测Bt外源基因的引物和探针：

Bt-F-Primer：5’-GTAAGGTCGTTGTAACGGCTATTG-3’

Bt-R-Primer：5’-CGCCTTGACCACAGCTATCC-3’

Bt-Probe：5’-FAM-CCACCTTTGCCCAAACACGCTAACG-Eclipse-3’

用于检测棉花ACP内源基因的引物和探针：

ACP-F-Primer：5’-CAAACAAGAGACCGTGGATAAGGTA-3’

ACP-R-Pnmer：5’-CAAGAGAATCAGCTCCAAGATCAAG-3’

ACP-Probe：5’-FAM-TTAGCTTTAGACAATGACAAACCAATCACCGG

-TAMRA-3’，其中FAM为荧光报告基团，TAMRA为荧光淬灭基团。

所述的转Bt基因棉花标准质粒由SEQ ID No.3所述核苷酸片段插入pEASY-T3载体制的。

使用以上试剂盒对转Bt基因农作物的荧光定量PCR检测可按本领域常规方法进行，提取待测样品基因组DNA后，配制PCR缓冲液进行PCR扩增，取PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果是否出现Bt基因的特异性条带(174bp)，判断待测农作物是否含有相应外源基因，若电泳结果同时出现ACP基因特异性条带(116bp)，则待测农作物为转Bt基因棉花；同时以标准质粒梯度浓度溶液于相同条件下进行扩增，绘制标准曲线，对照标准曲线，即可获得待测样品中外源基因和内源基因的拷贝数，即可获知待测样品的外源基因含量。

本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一种转Bt基因棉花标准质粒，生产方便、易扩增、操作简便、稳定性好、高效经济，解决了转Bt基因农作物检测中标准物质缺乏的难题，并且提供了一种准确、快速、简便的转Bt基因农作物检测试剂盒，能够很好的进行转Bt基因农作物的定量分析检测。

(四)附图说明

图1为pEASY-T3重组载体结构图；

图2为Bt和ACP基因验证电泳图；Marker：DL2000；1、2为Bt基因；3、4为ACP基因；

图3为EcoRI单酶切；M：DL2000；1：Sal I酶切；2：EcoR I酶切；3：Pst I酶切；4：308质粒；

图4为308号质粒测序结果与合成序列比对图；

图5为308号质粒的Bt基因荧光定量PCR结果(标准曲线)；

图6为308号质粒的ACP基因荧光定量PCR结果(标准曲线)；

图7为308号质粒4℃下Bt片段第1天荧光定量PCR结果；

图8为308号质粒4℃下Bt片段第14天荧光定量PCR结果；

图9为308号质粒4℃下Bt片段第28天荧光定量PCR结果；

图10为308号质粒4℃ACP片段第1天荧光定量PCR结果；

图11为308号质粒4℃ACP片段第14天荧光定量PCR结果；

图12为308号质粒4℃ACP片段第28天荧光定量PCR结果；

图13为308号质粒Bt基因均匀性qPCR分析；

图14为308号质粒ACP基因均匀性qPCR分析；

图15为308号质粒荧光定量检测极限分析。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：308号质粒的构建

本发明所述一种转基因棉花标准质粒包含外源Bt基因和ACP棉花内源基因，其构建方法包括如下步骤：

1.设计PCR特异性引物

Bt-F：5’-TTCCTTGGACGAAATCCCACC-3’

Bt-R：5’-GCCAGAATTGAACACATGAGCGC-3’

2.PCR扩增

利用设计的PCR引物特异性扩增转Bt基因农作物的特异性序列。

3.Bt目标序列获取，并通过测序进行验证

步骤2获得的扩增后特异性序列即为Bt目标序列，其片段为174bp，用美国ABI公司3730型测序仪对其进行测序验证；并设计荧光定量PCR引物及探针，荧光定量PCR引物及探针如下所示：

Bt-F-Primer：5’-GTAAGGTCGTTGTAACGGCTATTG-3’

Bt-R-Primer：5’-CGCCTTGACCACAGCTATCC-3’

Bt-Probe：5’-FAM-CCACCTTTGCCCAAACACGCTAACG-Eclipse-3’

4.采用与步骤4相同方法选择ACP目标序列，选取长度为116bp的序列作为质粒的内源基因特异性片段，并设计荧光定量PCR引物及探针。荧光定量PCR引物及探针如下所示：

ACP-F-Primer：5’-CAAACAAGAGACCGTGGATAAGGTA-3’

ACP-R-Primer：5’-CAAGAGAATCAGCTCCAAGATCAAG-3’

ACP-Probe：5’-FAM-TTAGCTTTAGACAATGACAAACCAATCACCGG-TAMRA-3’，

其中FAM为荧光报告基团，TAMRA为荧光淬灭基团。

5.构建标准质粒

将步骤4中所选取的174bp的Bt特异片段与步骤5中选取的116bp的ACP内源特异性片段经过拼接，两端添加Pst I、Nde I酶切位点，两片段间添加酶切位点Sal I后，所得片段插入pEASY-T3克隆载体(购自北京全式金生物技术有限公司)，完成标准质粒的组合，标准质粒分子如附图1(因其插入片段长度为308bp，本发明简称308号质粒)。

其重组流程如下：

a.基因序列的QC：对所需合成的基因全序列进行分析，检查基因内部是否含有复杂二级结构和重复序列。根据序列情况设计合成方案；

b.根据基因序列分析的结果，进行单链oligo的设计及合成；

c.利用PCR将合成的oligo拼接成完整的基因；

d.将合成好的基因装入pEASY-T3 Cloning载体并转化至感受态细胞DH5α；

e.测序验证重组克隆中基因序列是否与要求相符。

质粒重组片段序列如下：

308号质粒：插入片段长度为308bp，包括Bt(174bp)、ACP(116bp)、连接两个片段的酶切位点Sal I和插入片段两端的酶切位点Pst I、Nde I。。

6.通过PCR、酶切、测序等验证标准质粒

(1)PCR验证

对所构建的308号质粒用Bt基因及ACP基因的前述引物进行扩增电泳，在目标片段区域获得清晰的单一预期条带，如图2，说明这二个片段已经被正确地插入质粒中。

(2)酶切验证

根据插入片段和pEASY-T3载体TA克隆位点两端特异性较高的酶切位点选择Sal I、EcoR I、Pst I分别单酶切308质粒，结果见图3，分别可以看到预期大小的酶切片段，由此基本肯定质粒片段的正确性。

(3)测序验证

根据插入片段(含两端酶切位点)设计引物，进行PCR扩增，将扩增结果进行测序。并对测序结果与设计序列进行匹配对比，结果完全吻合，验证了质粒序列100％的可靠性，比较结果如图4。

7.对308号质粒进行特异性、稳定性及均匀性检测

(1)308号质粒的浓度测定和检测重复性

质粒荧光定量PCR引物与步骤4、5中相同，探针采用Primer Express2.0和Beacondesigner设计，然后由TaKaRa公司负责合成。根据PicoGreen dsDNA Reagent and Kits所测定母液浓度计算质粒拷贝数，再用灭菌去离子水分别稀释成初始模板拷贝数为10⁷，10⁶，10⁵，10⁴，10³，100，10拷贝的标准质粒进行荧光定量PCR绘制标准曲线，从而建立标准质粒的qPCR定量分析体系并用于实际标准分子的定量分析，重复定量分析3次，分析检测灵敏性。表1为荧光定量PCR 25μL扩增体系，表2为qPCR扩增程序，荧光定量PCR探针序列如下：

Bt：5’-FAM-CCACCTTTGCCCAAACACGCTAACG-Eclipse-3’

ACP：5’-FAM-TTAGCTTTAGACAATGACAAACCAATCACCGG-TAMRA-3’

表1：荧光定量PCR 25uL扩增体系

表2：qPCR扩增程序

(2)308号质粒稳定性分析

配制浓度为10⁷拷贝的质粒DNA，每管50μL，分别保存在-80，-20，4，20，40℃的环境中，比较分析标准质粒DNA在存储1天，3天，一周，两周，三周，四周时质粒DNA的短期稳定性，和在-80，-20，4℃温度处理下1，2，3个月的长期稳定性。

(3)308号质粒均匀性分析

两个质粒分别配制30管浓度分别为10⁷拷贝和10⁸拷贝的质粒标准品，每管100μL。随机选取15管，利用Picogreen试剂盒和荧光定量PCR方法分别测定标准质粒的浓度。荧光定量PCR分析所用引物与探针、体系和程序与上同。

8.对308号质粒特异性、稳定性及均匀性结果的分析

(1)308号质粒的浓度

用QIAGEN质粒提取试剂盒抽提308号质粒，纯化后用母液分装，并用PicoGreen试剂盒测定母液浓度，并按照其浓度计算拷贝数浓度，所得结果如下：

表3：308号质粒的纯度、浓度、拷贝数的检测结果

根据计算所得拷贝数，将母液以10倍梯度稀释成10⁷，10⁶，10⁵，10⁴，10³，100，10拷贝数，每个浓度取3个重复，制作标准曲线。结果如图5、图6。

对308质粒每个浓度梯度3个重复样品Ct值进行标准差分析，发现其标准差都较小，可见每个样品间重复性良好，而且在较低拷贝数(10拷贝)浓度范围依然有较好的重复性，其结果见表4。

表4：308号质粒检测的重复性

(2)308号质粒的短期稳定性分析

采用荧光定量PCR方法对308号质粒Bt基因进行短期稳定性检测。以已经建立的308号标准质粒10⁷～10拷贝的标准曲线为参考，随机选取5个温度条件下的4管样品作相对定量实验，每管做3次重复，以确定不同温度下的质粒溶液拷贝数变化，考察了第一天，第三天，第一周，第二周，第三周和第四周时拷贝数的变化，并进一步对各温度条件下，不同存储时间的荧光定量PCR结果进行平均数分析和方差分析，结果见表5～表7。从表中可知，各温度条件、存储时间下的荧光定量PCR结果的相对标准偏差均小于10％，说明实验体系稳定性好，结果可靠。进一步的方差分析结果表明：-80，-20，4，20℃条件下，28天内均表现为稳定，说明308号质粒在上述温度条件下进行短期存储是稳定的。而40℃时，P值小于0.05，说明40℃时不同时期间的质粒量值有了显著的差异。因此，为保证308号质粒量值的稳定性，建议不要在高于40℃条件下运输和储存。

表5：308号质粒Bt基因不同温度下短期稳定性分析(平均Ct值±相对标准偏差)

表6：308号质粒ACP基因不同温度下短期稳定性分析(平均Ct值±相对标准偏差)

表7：不同温度条件下308号质粒短期稳定性的方差分析

不管针对Bt片段还是ACP片段随着时间的增长，Ct值变化都呈明显降低趋势，其中在-80℃～20℃的温度区间变化不显著，40℃以上的温度段变化比较明显。可能在储存过程中溶液的蒸发，使相对浓度偏高，同时质粒模板可能发生了一定降解，间接造成了浓度的增高。

(3)308号质粒长期稳定性分析

通过308标准质粒的短期稳定性分析，质粒在低温条件下保存具有较好稳定性，因此在长期稳定性分析的实验设计中摒弃了较高温度的设置，选取了-80℃、-20℃和4℃的温度范围，以前面优化好的定量标准曲线为参照，各取4个重复(浓度10⁷拷贝)，对三个月、六个月时间处理的质粒DNA样品进行荧光定量PCR，对其Ct值分析及长期稳定性方差分析结果见表8-表9。

表8：308号质粒长期稳定性分析(平均Ct值±相对标准偏差)

表9：不同温度条件下308号质粒短期稳定性的方差分析

从表中可以看出，在低温状态下，308号质粒DNA的重组片段显示了良好的稳定性和重复性，三个月时方差分析结果均不显著。因此，在实际应用中可以胜任正常储存环境下的长期使用，为其代替其他阳性标准品推广使用提供了实验依据。

(4)308号质粒均匀性分析

a.荧光定量PCR分析

308号质粒Bt、ACP片段均匀性分析结果以及Ct值可信度分析如图7～图8。

从荧光定量PCR的结果以及两个质粒Bt基因和ACP基因的Ct值分析结果来看，所有10⁷拷贝浓度下的重复样品扩增结果都集中在标准曲线相应浓度的范围内，说明每个样品的重现性高，同时根据所测得的Ct值进一步分析了两类标准质粒分别在同一批次样品的Bt基因和ACP基因的荧光定量PCR扩增的均匀性性方差分析，结果见表10。其结果显示308号质粒的管间差异的P值均大于0.05，说明不同管之间没有显著差异，质粒分子的管间均匀性较好。

表10：308号质粒均匀性方差分析

(5)308号质粒的定量检测极限分析

在实际定量分析中，检测极限(Limit of Detection，LOD)是指被检样品在认可精确度范围内能被检测的最低含量。LOD是评价定量方法有效检测范围的重要参数，可通过低浓度样品多次重复数值的再现性来确定。本实验的重复性通过对荧光定量PCR实验体系中进行的样品三次重复来计算和确定。

定量PCR实验运行所用的试剂盒为TaKaRa公司的Premix Ex Taq Kit，实验针对Bt基因的扩增检测荧光累积强度，两个特异性标准质粒以10⁷-10拷贝的浓度10倍梯度稀释，每个浓度设3个样品重复，检测最低定量检测限。

根据前面优化的反应体系和程序，对308号质粒按照10⁷，10⁶，10⁵，10⁴，10³，10²，10拷贝数浓度梯度稀释的3个重复样品进行荧光定量PCR检测以后，得到结果见图9。

通过对三次重复实验结果分析以及ΔCt值计算比较，确定定量PCR的LOD为10个拷贝。

实施例2：构建的308号标准质粒在转Bt基因农作物定性检测中的应用

本实施例选取苏棉310，保铃棉99B，保铃棉33B，保铃棉DP410B，秀水11(水稻)，浙江大学2个品系转基因棉花(08-6、07-19)及亲本非转基因棉花(222)进行对比实验，考察本发明构建的转Bt基因棉花标准质粒分子在转基因棉花及其它种类转Bt基因抗虫农作物中定性检测的结果。

本发明构建的转Bt基因标准质粒，可以定性、定量检测包括CryIA(a)，CryIA(b)，CryIA(c)，CryIab/ac在内的四种Bt外源基因和棉花ACP内源基因。若待测农作物中含上述四种Bt外源基因特异性序列，则检测结果为阳性，该农作物为转Bt基因产品；若该农作物为棉花，含有棉花ACP内源基因，则检测结果为阳性。

定性检测实验过程包括如下几个步骤：

(1)农作物基因组DNA提取

a.分别将1g左右磨碎的苏棉310，保铃棉99B，保铃棉33B，保铃棉DP410B，秀水11，08-6，07-19，222种子样品放入10mL离心管中，加入Solution I 5mL，充分混合后振荡约30分钟，得样品。

b.2000rpm室温离心2分钟，将上清液移入2mL的离心管中。此时注意不要吸入变性蛋白质(白色悬浮物)。

c.12000rpm室温离心5分钟。离心时，请注意离心管在离心机里的摆放方向要统一，离心管的小耳朵朝上。

d.小心除去上清液。此时沉淀虽然看不清，但紧贴在离心管外侧(带小耳朵一侧)的内壁上。除去上清液时，请一定注意枪头不要碰到离心管外侧的内壁，插到离心管内侧的底部，将上清液吸取干净。

e.向沉淀中加入Solution II 1mL。此时Solution II应沿着离心管内侧的内壁加入到离心管中。

f.将离心管上下颠倒混合后，12000rpm室温离心2分钟，按操作d的方法小心除去上清液。

g.加入Solution III 500μL，剧烈振荡10秒钟以使沉淀溶解。

h.12000rpm室温离心5分钟后，将上清液移入新的1.5mL离心管中。

i.加入等量的经TE饱和的苯酚/氯仿混合后，12000rpm室温离心5分钟，将水层(上层)移入新准备的1.5mL离心管中。

j.加入等量的氯仿/异戊醇混合后，12000rpm离心5分钟，将水层(上层)移入新准备的1.5mL离心管中。

k.加入等量(约500μL)的异丙醇，充分颠倒混合。

l.4℃、12000rpm离心5分钟，小心除去上清液。注意：此时的DNA沉淀易剥离。

m.用70％的乙醇清洗沉淀后，简单干燥。

n.将沉淀溶于50μL TE或其它缓冲液中，最终得到样品1、2、3、4、5、6、7、8。

(2)质粒基因组DNA提取

a.柱平衡步骤：向吸附柱CP5中(吸附柱放入50mL收集管中)加入2.5mL的平衡液BL，10000rpm(～11500×g)离心2分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

b.取100mL过夜培养的菌液加入离心管，室温10000rpm(～11500×g)离心3分钟收集细菌，尽量吸除上清。

c.尽量吸除上清，为确保上清液全部吸取，用干净的吸水纸吸去瓶壁上的水滴。

d.向留有菌体沉淀的离心管中加入7mL溶液P1(已加入RNaseA)，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。

e.向离心管中加入7mL溶液P2，立即温和地上下翻转6-8次，室温放置5分钟。

f.向离心管中加入7mL溶液P4，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀。然后室温放置10分钟左右。10000rpm(～11500×g)离心5～10分钟，将溶液全部倒入过滤器CS中，慢慢推动推(plunger)过滤，滤液收集在干净的50mL的管中。

g.向滤液中加入滤液体积的0.3倍的异丙醇(加入异丙醇过多容易导致RNA污染)，上下颠倒混匀后转移到吸附柱CP5中(吸附柱放入50mL收集管中)。注意：过滤后滤液会损失，根据损失的不同请加入不同体积的异丙醇。吸附柱CP5的最大容积为15mL，所以需要分2次过柱。

h.室温10000rpm(～11500×g)离心2分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

i.向吸附柱中加入10mL漂洗液PW，10000rpm(～11500×g)离心2分钟，弃掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

j.重复操作步骤i。

k.向吸附柱中加入3mL无水乙醇，室温10000rpm(～11500×g)离心2分钟，倒掉废液。

l.将吸附柱CP5重新放回收集管中，10000rpm(～11500×g)离心5分钟，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。

m.将吸附柱CP5置于一个干净的50mL收集管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加1～2mL洗脱缓冲液TB，室温放置5分钟，室温10000rpm(～11500×g)离心2分钟。将50mL离心管中的洗脱液全部移入一个干净的1.5mL离心管，-20℃保存。

(3)选取引物及探针序列包括(测Bt基因)：

Bt-F-Primer：5’-GTAAGGTCGTTGTAACGGCTATTG-3’

Bt-R-Primer：5’-CGCCTTGACCACAGCTATCC-3’

Bt-Probe：5’-(FAM)CCACCTTTGCCCAAACACGCTAACG(Eclipse)-3’

(4)农作物及质粒DNA检测

取1～10μL(共1μg左右)提取的DNA样品，用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，根据其亮度和扩散程度判断DNA的质量。利用紫外分光光度法(NanoDrop ND-100)测定所提DNA的浓度与纯度。

(5)待测农作物PCR反应

提取上述样品1、2、3、4、5、6、7、8DNA，以样品1、2、3、4、5、6、7、8DNA为模板，在包括上述步骤(3)所述引物序列的荧光定量PCR反应体系中进行PCR扩增。

所述PCR反应体系终浓度组成为：

PCR反应条件为：(1)95℃，30s；(2)95℃，5s；60℃，30s；共40cycles；

(6)结果分析

取PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果是否出现特异性条带，判断待测农作物是否含有相应Bt外源基因。样品1、2、3、4、5、8未出现特异性条带，样品1、2、3、4、5、8为非转Bt基因农作物；样品6、7出现特异性条带，为转Bt基因农作物。

(7)选取引物及探针序列包括(测ACP基因)：

ACP-F-Primer：5’-CAAACAAGAGACCGTGGATAAGGTA-3’

ACP-R-Primer：5’-CAAGAGAATCAGCTCCAAGATCAAG-3’

ACP-Probe：5’-FAM-TTAGCTTTAGACAATGACAAACCAATCACCGG-TAMRA-3’

(8)农作物及质粒DNA检测

取1～10μL(共1μg左右)提取的DNA样品，用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，根据其亮度和扩散程度判断DNA的质量。利用紫外分光光度法(NanoDrop ND-100)测定所提DNA的浓度与纯度。

(9)待测农作物PCR反应

提取样品1、2、3、4、5、6、7、8DNA，以样品1、2、3、4、5、6、7、8DNA为模板，在包括上述步骤(7)所述引物序列的荧光定量PCR反应体系中进行PCR扩增。所述PCR反应体系终浓度组成为：

PCR反应条件为：(1)95℃，30s；(2)95℃，5s；59℃，30s；共40cycles；

(10)结果分析

取PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果是否出现特异性条带，判断待测农作物是否含有相应ACP内源基因。样品1、2、3、4、6、7、8出现特异性条带，为棉花品种，样品5为非棉花品种。检测Bt外源基因时，样品6、7出现特异性条带，为转Bt基因品种农作物。综合上述结果，可知样品6、7为转Bt基因棉花品种。

实施例3：构建的308质粒标准在转Bt基因棉花转基因含量定量检测中的应用

本实施例选取不同重量保铃棉DP410B和浙江大学08-6品种转基因棉花棉籽(以下简称08-6)混合物进行拷贝数测定实验，保铃棉DP410B和08-6混合物总重量为1g。本实施例实验考察本发明构建的转Bt基因棉花标准质粒在转Bt基因棉花中定量检测的结果。

定量检测实验过程包括如下几个步骤：

(1)棉花基因组DNA提取

本实施例中保铃棉DP410B和08-6混合物总重量为1g。二者组成分别如表11。

表11：待检混合物组成

定量检测待测棉花基因组DNA提取方法与定性检测方法中的一致。

(2)质粒基因组DNA提取

定量检测中质粒基因组DNA提取方法与定性检测方法中的相一致。

(3)DNA检测

利用紫外分光光度法(NanoDrop ND-100)测定所提DNA的浓度与纯度。取1～10μL(共1μg左右)提取的DNA样品，用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，根据其亮度和扩散程度判断DNA的质量。

(4)荧光定量PCR检测转基因Bt含量

选取引物及探针序列如下：

Bt-F-Primer：5’-GTAAGGTCGTTGTAACGGCTATTG-3’

Bt-R-Primer：5’-CGCCTTGACCACAGCTATCC-3’

Bt-Probe：5’-(FAM)CCACCTTTGCCCAAACACGCTAACG(Eclipse)-3’

(5)待测转Bt基因PCR反应

保铃棉DP410B和08-6混合物，在包括上述(4)所述引物序列的荧光定量PCR反应体系中进行PCR扩增。

所述PCR反应体系终浓度组成为：

PCR反应条件为：(1)95℃，30s；(2)95℃，5s；60℃，30s；共40cycles；

(6)荧光定量PCR检测ACP基因含量：

ACP-F-Primer：5’-CAAACAAGAGACCGTGGATAAGGTA-3’

ACP-R-Primer：5’-CAAGAGAATCAGCTCCAAGATCAAG-3’

ACP-Probe：5’-(FAM)TTAGCTTTAGACAATGACAAACCAATCACCGG(TAMRA)-3’

(7)棉花及质粒DNA检测

取1～10μL(共1μg左右)提取的DNA样品，用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，根据其亮度和扩散程度判断DNA的质量。利用紫外分光光度法(NanoDrop ND-100)测定所提DNA的浓度与纯度。

(8)待测棉花PCR反应

提取样品DNA，以样品DNA为模板，在包括上述步骤(6)所述引物序列的荧光定量PCR反应体系中进行PCR扩增。

所述PCR反应体系终浓度组成为：

PCR反应条件为：(1)95℃，30s；(2)95℃，5s；59℃，30s；共40cycles。

(9)荧光定量PCR结果

荧光定量PCR检测结果如表12。

表12：荧光定量PCR结果

I＝(外源拷贝数/内源拷贝数)*K*100(％)

＝(Bt平均拷贝数/ACP平均拷贝数)*100K(％)，其中K＝4.7-4.8，本实验取4.7；

从表12可以看出，Bt平均拷贝数为14440，ACP平均拷贝数68276，完全为转Bt基因棉花(即绝对转基因含量为100％)；I值为99.40％，与实际值(100.00％)的相对误差为0.60％。Bt平均拷贝数为0，ACP平均拷贝数为68573，完全为非转基因棉花(即绝对转基因含量为0)；I值为0.00％，与实际值(0.00％)的相对误差为0.00％。绝对转基因含量为5％时，Bt平均拷贝数为700，Bt平均拷贝数理论值为722，Bt相对偏差为3.05％，而ACP平均拷贝数为67314，ACP平均拷贝数理论值68276，相对偏差为1.40％；I值为4.89％，与实际值(5.00％)的相对误差为2.67％符合要求。转Bt基因棉花的含量高于10％时，Bt和ACP拷贝数相对偏差分别为1.59％和0.29％；I值为9.75％，与实际值(10.00％)的相对误差为2.50％，符合要求。

若对未知浓度样品进行定量检测，需按照实施例3中的方法，先以梯度浓度标准品进行测定以绘制标准曲线，而后通过检测其未知浓度下的Ct值，依据标准曲线获得其拷贝数，进而得出待测未知样品浓度。

                                                SEQUENCE LISTING

 

<110>  中国计量学院

 

<120>  转Bt基因棉花标准质粒及其应用

 

<130> 

 

<160>  3    

 

<170>  PatentIn version 3.4

 

<210>  1

<211>  174

<212>  DNA

<213>  Unknown

 

<220>

<223>  人工序列

 

<400>  1

cgccttgacc acagctatcc cattgttcgc agtccagaac taccaagttc ctctcttgtc     60

 

cgtgtacgtt caagcagcta atcttcacct cagcgtgctt cgagacgtta gcgtgtttgg    120

 

gcaaaggtgg ggattcgatg ctgcaaccat caatagccgt tacaacgacc ttac          174

 

 

<210>  2

<211>  116

<212>  DNA

<213>  Unknown

 

<220>

<223>  人工序列

 

<400>  2

caagagaatc agctccaaga tcaagaaatg ttgattcacc ggtgattggt ttgtcattgt     60

 

ctaaagctaa ttgtctcttt actacttcac ataccttatc cacggtctct tgtttg        116

 

 

<210>  3

<211>  308

<212>  DNA

<213>  Unknown

 

<220>

<223>  人工序列

 

<400>  3

ctgcagcgcc ttgaccacag ctatcccatt gttcgcagtc cagaactacc aagttcctct     60

 

cttgtccgtg tacgttcaag cagctaatct tcacctcagc gtgcttcgag acgttagcgt    120

 

gtttgggcaa aggtggggat tcgatgctgc aaccatcaat agccgttaca acgaccttac    180

 

gtcgaccaag agaatcagct ccaagatcaa gaaatgttga ttcaccggtg attggtttgt    240

 

cattgtctaa agctaattgt ctctttacta cttcacatac cttatccacg gtctcttgtt    300

 

tgcatatg                                                             308

Claims (4)

1.一种转Bt基因棉花标准质粒，由SEQ ID No.3所示核苷酸片段插入pEASY-T3载体制得。

2.如权利要求1所述的转Bt基因棉花标准质粒在检测转Bt基因农作物的转基因含量中的应用，其特征在于所述的农作物为棉花。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述转Bt基因棉花标准质粒用于检测下列之一的Bt外源基因：（1）CryIA(a)，（2）CryIA(b)，（3）CryIA(c)，（4）CryIab/ac。

4.一种转Bt基因棉花的荧光定量PCR检测试剂盒，主要包括特异性引物和探针、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶和转Bt基因棉花标准质粒，其特征在于：所述特异性引物和探针序列如下：

Bt-F-Primer：5’-GTAAGGTCGTTGTAACGGCTATTG-3’

Bt-R-Primer：5’-CGCCTTGACCACAGCTATCC-3’

Bt-Probe：5’-FAM-CCACCTTTGCCCAAACACGCTAACG-Eclipse-3’

其中FAM为荧光报告基团，Eclipse为荧光淬灭基团；

ACP-F-Primer：5’-CAAACAAGAGACCGTGGATAAGGTA-3’

ACP-R-Primer：5’-CAAGAGAATCAGCTCCAAGATCAAG-3’

ACP-Probe：5’-FAM-TTAGCTTTAGACAATGACAAACCAATCACCGG–TAMRA-3’

其中FAM为荧光报告基团，TAMRA为荧光淬灭基团；

所述转Bt基因棉花标准质粒由SEQ ID No.3所示核苷酸片段插入pEASY-T3载体制得。

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