CN115029421B - 一种转基因植物核酸标准物质及形貌模拟方法 - Google Patents

一种转基因植物核酸标准物质及形貌模拟方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种转基因植物核酸标准物质及形貌模拟方法，涉及生物参数测量及分子诊断技术领域。通过对外源插入的目的基因片段和受体植物的基因组核酸的混合物进行PCR，分别检测外源目的基因和内标基因的含量，并进一步通过调整外源目的基因片段与受体植物基因组核酸的混合质量比值，直至接近或达到目标转基因植物含外源插入的目的基因片段的比例，从而根本上模拟原始转基因植物的形貌特征。该方法通过高低温切换，使得带有接头的外源目的基因片段整合到受体植物的基因组核酸中，模拟出原始转基因植物材料形貌，以此制备出相对稳定的转基因植物核酸标准物质候选材料，以期进一步通过筛选及定值获得转基因植物核酸标准物质。

Description

一种转基因植物核酸标准物质及形貌模拟方法
技术领域
本发明涉及生物参数测量及分子诊断技术领域，具体而言，涉及一种转基因植物核酸标准物质及形貌模拟方法。
背景技术
标准物质又称标准样品、参考物质。标准物质是转基因成分的标准化检测的物质基础。标准物质为检测结果的准确性、可比性和可溯源性提供了重要保障。
我国开展转基因标准物质研究已有十余年的历史，主要由计量机构（中国计量科学研究院等）及农业研究机构（中国农业科学院等）开展了核酸标准物质的研究。目前，发布的转基因植物标准物质种类主要是基体、基因组DNA和质粒DNA三种形式。
其中，基体和基因组DNA均来自于转基因材料本身，和待测样本具备较高的一致性，颇受欢迎。质粒DNA标准物质是将检测片段，包括外源目标基因和内源基因，通过克隆到质粒上，重组质粒作为标准品。但是与基因组DNA相比，质粒DNA的结构和分子量差异悬殊，此外质粒分子易产生气溶胶，核酸拷贝数受到管壁吸附及冻融的影响，测量偏差（不确定度）较大。
转基因标准物质的缺乏已成为制约转基因植物检测技术发展和检测机构建设的瓶颈问题之一。国内生产的转基因植物核酸标准物质种类相对更少，仅涉及了转基因水稻、玉米、大豆和棉花等作物种类。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种转基因植物核酸标准物质及形貌模拟方法以解决上述技术问题。
本发明是这样实现的：
本发明提供了一种制备转基因植物的核酸标准物质的形貌模拟方法，其包括如下步骤：将两端带有接头的转基因植物的外源目的基因片段与受体植物的基因组核酸混合，通过高低温切换反应以使得带有接头的外源目的基因片段整合到受体植物的基因组核酸中从而获得核酸混合物，然后进行PCR验证；
PCR验证是以所述核酸混合物为模板，以外源目的基因的检测引物和探针对模板进行PCR获得第一产物，以内标基因的检测引物和探针对模板进行PCR获得第二产物，分别检测第一产物和第二产物的拷贝数，调整外源目的基因片段与受体植物的基因组核酸的混合质量比，至第一产物与第二产物的拷贝数比例接近或等于目标转基因植物含外源插入的目的基因片段的比例。外源目的基因片段两端的接头与受体植物的基因组核酸的部分序列通过碱基互补匹配。
发明人提供了一种转基因植物的核酸标准物质的新思路，通过对外源插入的目的基因片段和受体植物的基因组核酸的混合物进行PCR，分别检测外源目的基因和内标基因的含量，通过调整外源目的基因片段与受体植物的基因组核酸的混合质量比，直至接近或达到目标转基因植物含外源插入的目的基因片段的比例，从而根本上模拟原始转基因植物的形貌特征。例如，当目标转基因植物含外源插入的目的基因片段的比例为100%，则通过调整外源目的基因片段与受体植物的基因组核酸的混合质量比，使得第一产物与第二产物的拷贝数比例接近或达到100%，从而获得转基因植物的核酸标准物质。在其他实施方式中，上述比例也可以是5%-100%或1%-60%。
该方法通过高低温切换，使得带有接头的外源目的基因片段整合到受体植物的基因组核酸中，模拟出原始转基因植物材料形貌，以此制备出相对稳定的转基因植物的核酸标准物质的候选材料，以期进一步通过筛选获得转基因植物的核酸标准物质。
本发明提供的方法可以广泛应用于多种转基因植物的核酸标准物质制备，解决了原始材料获取难的“卡脖子”问题。
在本发明应用较佳的实施方式中，形貌模拟方法还包括获得两端带有接头的转基因植物的外源目的基因片段，其包括：根据转基因植物的外源目的基因片段的全长序列，设计并筛选出扩增全长序列的上游扩增引物和下游扩增引物，然后在上游扩增引物和下游扩增引物的两端添加接头以与受体植物的基因组核酸的部分序列通过碱基互补匹配，通过分子克隆的方法或基因合成的方法获得两端带有接头的转基因植物的外源目的基因片段，通过分子克隆的方法或基因合成的方法获得两端带有接头的转基因植物的外源目的基因片段。
转基因植物的外源目的基因片段的全长序列可以通过现有的转化体信息索引网址或书籍等媒介获得。例如通过如下网站查询该转化体的信息，经序列拼接、BLAST搜索及已报到的检测片段验证等过程，最终得知外源目的基因片段的全长信息和序列信息。
欧盟检测方法：https://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/gmomethods/；
GMDD序列和方法：https://gmdd.sjtu.edu.cn/；
全球获批转化体信息：https://isaaa.org/；
欧盟数据库：https://bch.cbd.int/en/database/14750。
扩增全长序列的上游扩增引物和下游扩增引物需要经过筛选，确保上下游扩增引物能够扩增到预期片段。例如通过琼脂糖凝胶电泳验证或测序验证。
添加接头的方式可以直接由测序公司将接头的序列和引物合成。上述上游扩增引物的接头和下游扩增引物的接头序列不同。
在本发明应用较佳的实施方式中，以两端添加接头的上游扩增引物和下游扩增引物对外源目的基因片段进行扩增。
在外源目的基因片段加上接头的目的是可以通过反复退火（PCR扩增），将加了接头的外源目的基因片段两端与受体基因组结合，提高稳定性。经发明人验证，加了接头的标准物质比不加接头的标准物质的相对标准偏差更小，即加了接头的标准物质更稳定。
在本发明应用较佳的实施方式中，将扩增获得的扩增产物连接T载体，酶切获得带有接头的转基因植物的外源目的基因片段。
在本发明应用较佳的实施方式中，接头的长度为20bp-25bp。例如21bp，22bp，23bp，24bp，24bp或25bp。
在本发明应用较佳的实施方式中，受体植物选自小麦、水稻、大麦、燕麦、玉米、高粱、谷子、荞麦、黍稷、甘薯、马铃薯、棉花、油菜、芝麻、花生、向日葵、萝卜、胡萝卜、花椰菜、番茄、茄子、辣椒、韭菜、大葱、洋葱、韭葱、菠菜、芹菜、苋菜、莴苣、茼蒿、黄花菜、葡萄、草莓、甘蔗、烟草、芸薹属蔬菜、葫芦科植物、豆科植物、牧草、茶和木薯中的任意一种非转基因植物。
在本发明应用较佳的实施方式中，牧草包括不限于禾本科牧草或豆科牧草。
在本发明应用较佳的实施方式中，芸薹属蔬菜包括不限于芜菁、白菜、芥菜、甘蓝、芥蓝、菜苔、苦芥、擎蓝、芸苔、青菜或甜菜。
在本发明应用较佳的实施方式中，葫芦科植物包括不限于黄瓜、西葫芦、南瓜、冬瓜、苦瓜、丝瓜、菜瓜、西瓜或甜瓜。
在本发明应用较佳的实施方式中，豆科植物包括不限于绿豆、蚕豆、豌豆、扁豆、大豆、菜豆、豇豆或毛豆。
在本发明应用较佳的实施方式中，高低温切换反应是指：95℃ 20-30s，4℃ 20-30s，20-25个循环。在上述反应条件下可以很好的实现将带有接头的外源目的基因片段整合到受体植物基因组核酸中。
优选地，PCR验证时对模板进行PCR的程序包括：94-98℃，10-30s；50-58℃，30-60s；共20-50个循环；
在本发明应用较佳的实施方式中，在94-95℃，20-30s；55-58℃，30-60s；共20-40个循环。
一种采用上述的形貌模拟方法制得的转基因植物的核酸标准物质。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种获取转基因植物的核酸标准物质的新思路，通过对外源插入的目的基因片段和受体植物的基因组核酸的混合物进行PCR，分别检测外源目的基因和内标基因的含量，通过调整外源目的基因片段与受体植物的基因组核酸的混合质量比，直至接近或达到目标转基因植物含外源插入的目的基因片段的比例，从而根本上模拟原始转基因植物的形貌特征。
该方法通过PCR扩增，使得带有接头的外源目的基因片段整合到受体植物的基因组核酸中，模拟出原始转基因植物材料形貌，以此制备出相对稳定的转基因植物的核酸标准物质的候选材料，以期进一步通过筛选获得转基因植物的核酸标准物质。
本发明提供的方法可以广泛应用于多种转基因植物的核酸标准物质制备，解决了原始材料获取难的“卡脖子”问题。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为制备转基因植物的核酸标准物质的形貌模拟方法技术路线图；
图2为带接头的目的片段电泳图；
图3为带有接头的外源目的基因片段整合到受体植物的基因组核酸的原理图。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
除非另外指明，否则实践本发明将采用细胞生物学、分子生物学(包含重组技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述常规技术在本领域技术人员的能力范围内。文献中充分解释了这种技术，如《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)》，第二版(Sambrook等人，1989)；《寡核苷酸合成(OligonucleotideSynthesis)》(M.J.Gait编，1984)；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.I.Freshney编，1987)；《酶学方法(Methods in Enzymology)》(学术出版社有限公司(Academic Press，Inc.)；《实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)》(D.M.Weir和C.C.Blackwell编)；《哺乳动物细胞用基因转移载体(Gene Transfer Vectors forMammalian Cells)》(J.M.Miller和M.P.Calos编，1987)；《当代分子生物学方法(CurrentProtocols in Molecular Biology)》(F.M.Ausubel等人编，1987)；《PCR:聚合酶链反应(PCR:The Polymerase Chain Reaction)》(Mullis等人编，1994)；以及《当代免疫学方法(Current Protocols in Immunology)》(J.E.Coligan等人编，1991)，所述文献中每个文献均通过引用明确并入本文中。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例以模拟转基因玉米材料的形貌为例，分别进行转基因玉米外源片段的制备、阴性受体玉米基因组DNA的提取及两种材料的整合和测试。形貌模拟技术路线参照图1所示。
采用如下所述的实验材料：
（1）转基因片段材料
涉及的玉米B73为常规育种材料，市售的转基因玉米MON810，DNA片段通过PCR技术获得。
（2）实验仪器
分光光度计： Nanodrop 核酸蛋白测定仪（美国 Thermo 公司)；
离心机：TG16W (湖南平凡科技有限公司)；
定性PCR仪：BioRad T100 ThermalCycler；
数字PCR仪：Automated Droplet Generator、BioRad QX 200；
涡旋仪：MV-100 (武汉塞维尔生物科技有限公司)；
金属浴：GT20401 (莫纳生物科技有限公司)；
洁净工作台：SCB-1360 (北京东联哈尔仪器制造有限公司)；
电子天平：XJ3200C (上海天美天平仪器有限公司)
1.先进行靶标基因（即外源目的基因）片段的制备。
生物信息学分析。
发明人以转基因玉米MON810为例，分析该品系外源插入序列全长。通过如下网站查询该转化体的信息，经序列拼接、BLAST搜索及已报到的检测片段验证等过程，最终得知外源片段应为3847 bp。
欧盟检测方法：https://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/gmomethods/；
GMDD序列和方法：https://gmdd.sjtu.edu.cn/；
全球获批转化体信息：https://isaaa.org/；
欧盟数据库：https://bch.cbd.int/en/database/14750。
2.进行靶标基因的克隆。
2.1 外源插入序列全长扩增引物的设计及克隆。
使用的引物根据上述GMDD数据库序列中信息，设计在MON810插入序列外侧，即玉米基因组DNA上，设计合成检测所需引物探针序列（参照表1所示），上下游引物序列进行搭配，然后对不同的组合进行PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳验证是否扩增到预期片段。
表1 扩增外源目的基因设计的引物
Figure P_220930142841120_120370001
PCR扩增反应体系和反应条件见表2和表3。
表2 PCR反应体系
Figure P_220930142841229_229700001
表3 PCR反应条件
Figure P_220930142841293_293653001
将符合实验要求引物组合的PCR反应产物送去公司进行测序，将测序结果与MON810序列进行比对，结果表明，引物序列组合MON 810-F3、MON810-R1的扩增片段与预期结果一致，扩增子为3847 bp。
2.2 进行玉米基因组接头的引物设计及扩增。
将MON810的MON810-F3、MON810-R1扩增子两端加上玉米基因组接头，上下游各20个碱基左右，目的是可以通过反复退火，将加了接头的片段两端与玉米基因组结合，提高稳定性。
Adapter-F/R（接头（斜体）是指正反引物上各有20多个碱基与玉米基因组DNA上的某个基因互补），原理参照图3所示。
Adapter-F: 5'- AGCCTGGTGTTTCCGGAGGAGTTCATAACCTTCGCCCGAAAAT-3'
Adapter-R: 5'- CTGCTCCCTGCTCCCTCTTATCGCAAGCAAATTCGGAAATGAAA-3'
用上述引物克隆目的片段，通过琼脂糖凝胶电泳及测序验证片段大小。参照图2所示，结果符合预期。
2.3. 连接载体
将2.2中带接头的PCR反应产物连接T载体后测序验证及双酶切验证。
验证正确后，将携有载体的宿主菌在合适的条件下培养，以获取大量质粒DNA。
酶切质粒，大量制备目的片段及带接头Adapter的片段。
实施例2
本实施例进行植物基因组DNA提取与质量检测。
B73玉米DNA提取按照天根试剂盒方法进行。
取玉米新鲜叶片组织约150～200mg，加入液氮充分碾磨。
将研磨好的粉末迅速转移到预先装有800 µL 65℃预热缓冲液GP1的离心管中（实验前在预热的GP1中加入巯基乙醇，使其终浓度为0.1%），迅速颠倒混匀后，将离心管放在65℃水浴1 h，水浴过程中每15分钟颠倒离心管以混合样品。
提取富含多酚或淀粉的植物组织用酚:氯仿/1:1（400 µL）进行等体积抽提充分混匀，12,000 rpm (~13,400×g )离心10 min。在新离心管中加入700 µL氯仿12,000 rpm (~13,400×g )离心10 min。
小心地将上一步所得上层水相转入一个新的离心管中，加入700 µL缓冲液GP2，充分混匀。
将混匀的液体转入吸附柱CB3中，12,000 rpm (~13,400×g )离心30 sec，弃掉废液。（吸附柱容积为700 µL左右，可分次加入离心。）
向吸附柱CB3中加入500 µL缓冲液GD（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm (~13,400×g )离心30 sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
向吸附柱CB3中 加入700 µL漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm (~13,400×g )离心1 min，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
重复漂洗液步骤，将吸附柱CB3放回收集管中，12,000 rpm(~13,400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于通风橱放置5-10分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
换离心管，向吸附柱中间部位悬空滴加50µL洗脱缓冲液TE ，室温放置2-5分钟，12,000 rpm(~13,400×g)离心2 min，将溶液收集到离心管中。
表4中为使用Nanodrop核酸蛋白测定仪（美国Thermo公司)进行DNA浓度和纯度的检测。
表4 B73玉米DNA提取
Figure P_220930142841325_325423001
DNA的浓度和纯度使用Nanodrop核酸蛋白测定仪进行浓度和纯度分析结果为8管DNA浓度均在200ng/µL左右，浓度较高；而A260/280值均大于1.9左右, A260/230值均大于2.0,说明此方法提取的DNA的纯度良好，符合实验要求。
实施例3
本实施例提供了质粒DNA提取与质量检测方法。
（1）柱平衡步骤：向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入500 µL的平衡液BL，12,000 rpm (~13,400×g ) 离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。（请使用当天处理过的柱子）
（2）取1-5 mL过夜培养的菌液加入离心管中，12,000 rpm (~13,400×g )离心1min，尽量吸除上清（菌液较多时可以通过几次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。
（3）向留有菌体沉淀的离心管中加入250 µL溶液P1（请先检查是否已加入RNaseA），使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。注意：如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。
（4）向离心管中加入250 μL溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。注意：温和地混合，不要剧烈震荡，以免打断基因组DNA，造成提取的质粒中混有基因组DNA片断。此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5 min，以免质粒受到破坏。如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。
（5）向离心管中加入350 μL溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀。12,000 rpm (~13,400×g ) 离心10 min，用移液器小心地将上清转移到过滤柱CS（过滤柱放入收集管中），注意尽量不要吸出沉淀。注意：P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。
（6）12,000 rpm (~13,400×g )离心2 min，小心地将离心后收集管中得到的溶液转移到吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中），（如果过滤柱中有残余的液体说明步骤5吸取的上清中杂质过多，可以延长离心的时间； 如果离心后收集管底部有少量的沉淀，尽量的吸取上清）。12,000 rpm (~13,400×g ) 离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。
（7）向吸附柱CP3中加入500 µL去蛋白液PD，12,000 rpm (~13,400×g )离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。
（8）向吸附柱CP3中加入600 µL漂洗液PW（请先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm (~13,400×g ) 离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。
（9）重复操作步骤8。
（10）将吸附柱CP3放入收集管中，12,000 rpm (~13,400×g ) 离心2 min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。为确保下游实验不受残留乙醇的影响，建议将吸附柱CP3开盖，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
（11）将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-100 µL洗脱缓冲液TB，室温放置2 min，12,000 rpm (~13,400×g ) 离心2 min，将质粒溶液收集到离心管中。注意：为了增加质粒的回收效率，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，重复步骤。
洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若用ddH2O做洗脱液，应保证其pH值在7.0-8.5范围内，pH值低于7.0会降低洗脱效率。洗脱缓冲液体积不应少于50 µL，体积过小影响回收效率。且DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。
实施例4
本实施例对实施例1带接头Adpter的外源目的基因片段进行效果验证。
1．建立目的片段和基因组内标准基因的数字PCR方法
目的片段MON810数字PCR扩增方法已充分获得优化，确定退火温度为58℃。具体引物探针序列、反应体系及反应条件见表5，表6和表7。
表5. MON810定值引物探针序列。
Figure P_220930142841372_372310001
表6. 微滴式数字PCR反应体系。
Figure P_220930142841419_419156001
表7. 微滴式数字PCR反应条件。
Figure P_220930142841483_483613001
2．接头效果比较试验
将实施例1的两种目的片段（带接头与不带接头）分别和实施例2的基因组DNA进行混合，原则上，外源片段接近或等于内标准基因较为合适，相当于外源基因单拷贝插入基因组，并且转基因材料为纯合体，以此比较接头效果。
设置高低温循环（95° 30s，4℃ 30s，20个循环），通过高低温循环，使得接头和基因组整合。采用数字PCR分别测试外源目标基因以研究接头效果，结果分别见表8。
表8. 接头MON810、无接头MON810与玉米B73混合测试数据（copies/μL）
Figure P_220930142841530_530998001
采用数字PCR方法比较实施例3中所制备的带Adapter的片段与普通片段的效果，数字PCR结果表明，带接头的标准物质RSD值为1.98%，显著低于普通片段的RSD值（6.01%），证明了带接头的标准物质更稳定。
实施例5
本实施例进行核酸标准物质的形貌模拟。
模拟转基因作物需要将目的片段/内标准基因进行混合配比，纯合体转基因作物的Copiesmon810/Copies内标比值不能超过100%，且100%常用于下游的定量检测工作。由此可知，需要单独确定外源目的基因和内标准基因的数字PCR方法。外源目的片段的数字PCR方法见实施例4。
1.基因组内标准基因的数字PCR方法如下：
玉米内标准基因数字PCR扩增方法已充分获得优化，确定退火温度为58℃。具体引物探针序列表9，反应体系及反应条件见表5和表6。
表9. 玉米内标准基因引物探针序列
Figure P_220930142841593_593491001
2.混合配比
以配比值100%为目标，将带接头的片段与B73玉米基因组DNA混合，分别按照10,100,1000,10000,100000的稀释梯度采用玉米基因组DNA对带接头的片段进行稀释，然后通过反复退火的方式进行20个循环。玉米基因组DNA浓度大致为25ng/μL，分别测量外源目的基因和内标准基因，直至比例为100%。测试数据如表10。
表10. MON810形貌模拟测试数据（copies/μL）
Figure P_220930142841624_624750001
由此可知，本发明提供的方法通过形貌模拟出了含量为100%的转基因材料，且通过接头显著提升了稳定性。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种制备转基因植物的核酸标准物质的形貌模拟方法，其特征在于，其包括如下步骤：将两端带有接头的转基因植物的外源目的基因片段与受体植物的基因组核酸混合，通过高低温切换反应将带有接头的外源目的基因片段整合到受体植物的基因组核酸中从而获得核酸混合物，然后进行PCR验证；
所述PCR验证是以所述核酸混合物为模板，以外源目的基因的检测引物和探针对所述模板进行PCR获得第一产物，以内标基因的检测引物和探针对所述模板进行PCR获得第二产物，分别检测所述第一产物和第二产物的拷贝数，调整所述外源目的基因片段与所述受体植物的基因组核酸的混合质量比，至所述第一产物与第二产物的拷贝数比例为60%-100%；
所述外源目的基因片段两端的接头与受体植物的基因组核酸的部分序列通过碱基互补匹配；所述接头的长度为20bp-25bp；所述高低温切换反应是指：95℃ 20-30s，4℃ 20-30s，20-25个循环；
所述PCR验证时对所述模板进行PCR的程序包括：94-98℃，10-30s；50-58℃，30-60s；共20-50个循环。
2.根据权利要求1所述的形貌模拟方法，其特征在于，所述形貌模拟方法还包括获得两端带有接头的转基因植物的外源目的基因片段，其包括：根据转基因植物的外源目的基因片段的全长序列，设计并筛选出扩增所述全长序列的上游扩增引物和下游扩增引物，然后在所述上游扩增引物和下游扩增引物的两端添加接头以与所述受体植物的基因组核酸的部分序列通过碱基互补匹配，通过分子克隆的方法或基因合成的方法获得两端带有接头的转基因植物的外源目的基因片段。
3.根据权利要求2所述的形貌模拟方法，其特征在于，以两端添加接头的上游扩增引物和下游扩增引物对外源目的基因片段进行扩增；
将扩增获得的扩增产物连接T载体，通过大肠杆菌复制质粒和酶切质粒获得带有接头的转基因植物的外源目的基因片段。
4.根据权利要求2所述的形貌模拟方法，其特征在于，所述受体植物选自小麦、水稻、大麦、燕麦、玉米、高粱、谷子、荞麦、黍稷、甘薯、马铃薯、棉花、油菜、芝麻、花生、向日葵、萝卜、胡萝卜、花椰菜、番茄、茄子、辣椒、韭菜、大葱、洋葱、韭葱、菠菜、芹菜、苋菜、莴苣、茼蒿、黄花菜、葡萄、草莓、甘蔗、烟草、茶和木薯中的任意一种非转基因植物。
5.根据权利要求2所述的形貌模拟方法，其特征在于，所述受体植物选自芸薹属蔬菜、葫芦科植物、豆科植物和牧草中的任意一种非转基因植物。
6.根据权利要求5所述的形貌模拟方法，其特征在于，所述牧草选自禾本科牧草或豆科牧草。
7.根据权利要求5所述的形貌模拟方法，其特征在于，所述芸薹属蔬菜选自芜菁、白菜、芥菜、甘蓝、芥蓝、菜苔、苦芥、擎蓝、芸苔、青菜或甜菜。
8.根据权利要求5所述的形貌模拟方法，其特征在于，所述葫芦科植物选自黄瓜、西葫芦、南瓜、冬瓜、苦瓜、丝瓜、菜瓜、西瓜或甜瓜；
所述豆科植物选自绿豆、蚕豆、豌豆、扁豆、大豆、菜豆、豇豆或毛豆。
9.一种如权利要求1-8任一项所述的形貌模拟方法制得的转基因植物的核酸标准物质。
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