BRPI0712514A2 - processo para identificar loci de caracterìsticas quantitativas de resistência a doenças na soja e composições dos mesmos - Google Patents

Abstract

PROCESSO PARA IDENTIFICAR LOCI DE CARACTERISTICAS QUANTITATIVAS DE RESISTêNCIA A DOENçAS NA SOJA E COMPOSIçõES DOS MESMOS. A presente invenção refere-se ao campo de cruzamento e genética de plantas, partícularmente uma vez que pertence ao gênero, Glycine. Mais especificamente, a invenção refere-se ao processo para a seleção de plantas de soja contendo um ou mais loci de características quantitativas para resistência a doenças, a espécies de Gfycine que possuem tais loci e a processos para o cruzamento e para a seleção de Glycine com tais loci. A invenção refere-se ainda ao uso de germoplasma exótico em um programa de cruzamento.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROCESSO PARA IDENTIFICAR LOCI DE CARACTERÍSTICAS QUANTITATIVAS DE RESISTÊNCIA A DOENÇAS NA SOJA E COMPOSIÇÕES DOS MESMOS"

Referência Cruzada Aos Pedidos de Patentes Relacionados

Este pedido de patente reivindica o benefício de prioridade ao Pedido de Patente U.S. Provisório N- de Série 60/808.430 depositado em 25 de maio de 2006.

Incorporação da Listagem de Seqüências

Uma listagem de seqüências está contida no arquivo nomeado "pa_53517.txt" que tem 65.000 bytes (medidos no MS-Windows) e foi criado em 22 de maio de 2007 e está alocado em uma forma que pode ser lida pelo computador em um disquete depositado com a presente invenção e é incor- porado aqui como referência.

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se ao campo de cruzamento de plan- tas e resistência a doenças. Mais especificamente, a invenção refere-se a um método para a seleção de plantas do gênero Glycine contendo loci de características quantitativas que estão associadas com resistência a doen- ças e métodos para o cultivo de plantas de Glycine resistentes a doenças. A doença pode ser causada por um fungo, um vírus, uma bactéria ou um ani- mal invertebrado. A invenção refere-se ainda ao uso do número de acesso de germoplasma contendo loci de características quantitativas (QTL) que conferem resistência a doenças para introgressão no germoplasma de elite em um programa de cruzamento para resistência ao agente patogênico fún- gico, Phakopsora pachyrhizi.

Antecedentes da Invenção

A soja, Glycine max (L.) Merril, é uma das plantas de cultivo e- conômicas principais cultivadas em todo o mundo como uma fonte primária de óleo e proteína vegetal (Sinclair e Backman, Compendium of Soybean Diseases, 3â Ed. APS Press, St. Paul, MN, p. 106. (1989)). A demanda de cultivo para dietas com baixo teor de colesterol e alto teor de fibras também aumentou a importância da soja como um alimento saudável.

Os rendimentos de soja nos Estados Unidos da América são reduzidos a cada ano por doenças. Os altos rendimentos por hectare são críticos para uma margem de lucro do cultivador, especialmente durante pe- ríodos de preços baixos para a soja. A perda financeira causada por doen- ças da soja é importante para as economias rurais e para as economias de indústrias aliadas em áreas urbanas. Os efeitos destas perdas são eventu- almente sentidos em todo o mercado da soja por todo o mundo. As estimati- vas de perdas devido à doença nos Estados Unidos da América e em Ontá- rio variam de ano para ano e por doença. De 1999 até 2002 as estimativas de perda no rendimento da soja estavam na faixa de 8 milhões de toneladas métricas até 10 milhões de toneladas métricas nos Estados Unidos da Amé- rica e de 90.000 até 166.000 de toneladas métricas em Ontário (Wrather e outros, Online. PIantHeaIth Progress doi:10:1094/PHP-2003-0325-01-RV).

A Ferrugem Asiática da Soja (referida aqui como ASR) foi rela- tada nos hemisférios oriental e ocidental. No hemisfério oriental, a ASR foi relatada na Austrália, na China, na índia, no Japão, em Taiwan e na Tailân- dia. No hemisfério ocidental, a ASR foi observada no Brasil, na Colômbia, na Costa Rica e em Porto Rico. A ASR pode ser uma doença devastadora, que causa perdas no rendimento de até 70 até 80% como é relatado em alguns campos em Taiwan. As plantas que são fortemente infectadas possuem me- nos vagens e sementes menores que possuem baixa qualidade (Frederick e outros, Mycology 92: 217-227 (2002)). A ASR foi primeiramente observada nos Estados Unidos da América no Havaí em 1994. A ASR foi introduzida depois no continente dos Estados Unidos da América no outono de 2004, presumidamente como uma conseqüência da atividade de tempestades tro- picais. Previsões de modelo indicaram que a ASR foi amplamente dispersa ao longo de todo o sudeste dos Estados Unidos da América e observações subsequentes no campo e no laboratório confirmaram esta distribuição.

Duas espécies de fungos, Phakopsora pachyrhizi Sydow e Pha- kopsora meibomiae (Arthur) Arthur, causam ASR. Ao contrário de outras fer- rugens, P. pachyrhizi e P. meibomiae infectam uma faixa extraordinariamen- te ampla de espécies de plantas. P. pachyrhizi é conhecido por infectar natu- ralmente 31 espécies em 17 gêneros de legumes e 60 espécies em 26 ou- tros gêneros foram infectadas sob condições controladas. P. meibomiae in- fecta naturalmente 42 espécies em 19 gêneros de legumes e 18 espécies adicionais em 12 outros gêneros foram infectadas artificialmente. Vinte e quatro espécies de plantas em 19 gêneros são hospedeiras para ambas as espécies (Frederick e outros, Mycology 92: 217-227 (2002)).

Foram identificadas plantas de soja resistentes à ASR. Quatro QTL específicos à raça herdados independentemente dominantes para re- sistência a P. pachyrhizi, representados aqui como lócus 1 de resistência à ASR, lócus 2 de resistência à ASR, lócus 3 de resistência à ASR e lócus 4 de resistência à ASR, foram identificados em PI 200492, PI 230970, PI 462312 (Ankur) e Pl 459025B, respectivamente. Estas linhagens, assim co- mo outras sete, são suspeitas de conterem QTL para resistência à ASR. PI 239871A e PI 239871B (G. soja), PI 230971 e Pl 459024B e os cultivares Taita Kaohsiung-5, Tainung-4 e Wayne têm sido utilizados como diferenciais para a identificação de nove raças no Asian Vegetable Research and Deve- lopment Center, em Taiwan. A raça predominante era compatível com três ou mais dos diferenciais, indicando que algumas raças já possuem vários fatores de virulência para genes conhecidos e suspeitos para resistência. A resistência também ocorre entre a Glycine spp. do tipo selvagem da Austrá- lia. A resistência redutora da taxa também foi demonstrada. Entretanto, é difícil avaliar este tipo de resistência porque a taxa de desenvolvimento de ferrugem é dependente do desenvolvimento e da maturidade da soja (Sincla- ir e outros, eds., Soybean rust workshop. College of Agricultural, Consumer e Environmental Sciences. Natl. Soybean Res. Lab. Publ. 1 (1996)).

A avaliação de plantas que poderiam potencialmente conter QTL conferindo resistência à ASR pode ser demorada e requerer grandes quanti- dades de espaço de contenção biológica. O cultivo de P. pachyrhizi requer o uso de uma câmara de contenção biológica aprovada. Em adição, estufas e câmaras de crescimento utilizadas para crescer plantas para o teste de re- sistência à ASR deverão ser construídas de uma maneira que previna a Iibe- ração acidental do organismo, especialmente em localizações em que o or- ganismo ainda não foi observado. Culturas diferentes de P. pachyrhizi po- dem possuir fatores de virulência diferentes. Ao longo do tempo, novas ce- pas de P. pachyrhizi podem ser introduzidas nos Estados Unidos da Améri- ca. Portanto, qualquer programa de cruzamento planejado para criar resis- tência na soja contra a ASR precisará ser capaz de responder rapidamente às alterações na população de P. pachyrhizi. Ainda, o cruzamento de plantas de cultivo de soja utilizadas em outras localizações geográficas precisará selecionar a resistência às cepas específicas que afetam tais regiões, em adição ao fornecimento das características agronômicas que são preferidas por estes cultivadores em tal região. Há, portanto, uma grande necessidade de um método de alto rendimento rápido, eficiente em relação ao tempo e em relação ao custo para a seleção de germoplasma resistente à ASR. Este método não pode fornecer apenas rapidez e eficiência, mas também tem que ser capaz de ser realizado com uma quantidade mínima de espaço, permitindo a seleção de muitas amostras de uma vez.

A presente invenção fornece um método para a seleção de uma planta de soja que compreende QTL para resistência a doenças.

Sumário da Invenção

A presente invenção fornece um método para analisar plantas de soja em relação à resistência, à imunidade ou a susceptibilidade a doen- ças que compreende: (a) a separação de um tecido vegetal da planta de so- ja; (b) o cultivo do dito tecido em um meio; (c) a exposição do dito tecido a um agente patogênico de planta; e (d) a avaliação do dito tecido em relação à resistência, à imunidade ou à susceptibilidade à doença causada pelo a- gente patogênico. Adicionalmente, a resposta da planta ao agente patogêni- co pode ser avaliada através das etapas a seguir (e) isolamento dos ácidos nucléicos (DNA e/ou RNA) da dita planta; (f) análise dos ditos ácidos nucléi- cos (DNA, RNA e/ou cDNA) em relação à presença de um ou mais marcado- res moleculares para um lócus de característica quantitativa associado com a dita resistência, imunidade ou susceptibilidade; e (g) seleção da dita planta para uso em um programa de cruzamento. A determinação da resistência, da imunidade ou da susceptibilidade de uma planta a um agente patogênico particular é óbvia para qualquer versado na técnica. O tecido vegetal pode ser folha, tecido vascular, flor, vagem, raiz, caule, semente ou uma parte da mesma ou uma célula isolada do tecido. A exposição do dito tecido a um agente patogênico de planta é realizada através de um meio selecionado do grupo que consiste em (a) aplicação direta do agente patogênico ao tecido; (b) inclusão do agente patogênico no meio de cultura; e (c) inclusão de um agente que é eficientemente contaminado com o agente patogênico e serve para inocular o tecido. O agente patogênico de planta pode ser um fungo, um vírus, uma bactéria ou um animal invertebrado. A exposição ao agente patogênico de planta pode ser na forma de macromoléculas, células, tecidos do agente patogênico, do organismo inteiro ou de combinações dos mes- mos, em que o agente patogênico ou partes do mesmo, está vivo ou morto contanto que o material medeie uma resposta imunológica no tecido hospe- deiro. As macromoléculas de agente patogênico relevantes para a presente invenção incluem, mas não estão limitadas a toxinas, paredes celulares ou membranas, antígenos e polissacarídeos.

A presente invenção compreende ainda um QTL que confere resistência a doenças causadas por um agente patogênico fúngico selecio- nado do grupo que consiste em Phakopsora pachyrhizi, Phakopsora meibo- miae (Ferrugem Asiática da Soja), Colletotrichum truncatum, Colletotrichum dematium var. truncatum, Glomerella glycines (Antracnose da Soja), Phyto- phthora sojae (podridão da raiz ou do caule causada por Phytophthora), S- clerotinia sclerotiorum (podridão do caule causada por Sclerotinia), Fusarium solani f. sp. glycines (síndrome de morte súbita), Fusarium spp. (podridão da raiz causada por Fusarium), Macrophomina phaseolina (podridão cinzenta), Septoria glycines, (Mancha Parda), Pythium aphanidermatum, Pythium de- baryanum, Pythium irregulare, Pythium ultimum, Pythium myriotylum, Pythi- um torulosum (decomposição de sementes causada por Pythium), Diaporthe phaseolorum var. sojae (Podridão da vagem), Phomopsis longicola (Podri- dão de caule), Phomopsis spp. (decomposição de sementes causada por Phomopsis), Peronospora manshurica (Míldio Felpudo), Rhizoctonia solani (podridão da raiz e caule causada por Rhizoctonia, podridão aérea causada por Rhizoctonia), Phialophora gregata (Podridão Parda do Caule), Diaporthe phaseoiorum var. caulivora (Cancro do Caule), Cercospora kikuchii (Mancha Púrpura da Semente), Alternaria sp. (Mancha Alvo), Cercospora sojina (Mancha foliar "olho de rã"), Sclerotium rolfsii (Podridão das estacas), Arkoo- la nigra (Deterioração foliar negra), Thielaviopsis basicola, (Podridão negra da raiz), Choanephora infundibulifera, Choanephora trispora (deterioração foliar causada por Choanephora), Leptosphaerulina trifolii (mancha foliar causada por Leptosphaerulina), Mycoleptodiscus terrestris (podridão da raiz causada por Myeoleptodiseus), Neocosmospora vasinfeeta (podridão do cau- le causada por Neoeosmospora), Phyllostieta sojieola (mancha foliar causa- da por Phyllostieta), Pyrenoehaeta glyeines (mancha foliar causada por P- yrenoehaeta), Cylindroeladium erotalariae (Mancha foliar), Dactulioehaeta glyeines (Mancha foliar vermelha), Spaeeloma glyeines (Sarna), Stemphyli- um botryosum (deterioração foliar causada por Stemphylium), Corynespora eassiieola (Mancha Alvo), Nematospora eoryli (Mancha causada por levedu- ra) e Phymatotriehum omnivorum (Podridão da raiz de algodão).

A presente invenção compreende ainda um QTL que confere resistência a doenças causadas por um agente patogênico viral selecionado do grupo que consiste em Alfamovirus (Vírus mosaico da alfafa, AMV), Co- movirus (vírus do mosqueado do feijoeiro, BPMV), Potyvirus (vírus mosaico amarelo do feijoeiro, BYMV), Bromovirus (vírus do mosqueado clorótico do feijão-fradinho, CCMV), Begomovirus (vírus mosaico amarelo do feijão-da- China, MYMV), Potyvirus (vírus do mosqueado do amendoim, PeMoV), Potyvirus (vírus de estrias do amendoim, PStV), Cucumovirus (vírus do atro- fiamento do amendoim, PSV), Caulimovirus (vírus do mosqueado clorótico da soja, SbCMV), Begomovirus (vírus de enrugamento foliar da soja, SCLV), Luteovirus (vírus de nanismo da soja, SbDV), Potyvirus (vírus mosaico da soja, SMV), Nepovirus (vírus do atrofiamento grave da soja, SSSV) e Nepo- virus (vírus das manchas circulares do tabaco, TRSV).

A presente invenção compreende ainda um QTL que confere resistência a doenças causadas por um agente patogênico bacteriano sele- cionado do grupo que consiste em Bacillus subtilis (decomposição de se- mentes causada por Bacillus), Pseudomonas savastorioi pv. glycinea (Dete- rioração bacteriana), Pseudomonas syringae subsp. syringae (Folha enruga- da causada por bactérias), Xanthomonas axonovagemis pv. glycines, (Pús- tula bacteriana), Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens, (Mancha castanha bacteriana), Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens, Ralstonia solanacearum, (Murchamento causado por bactérias) e Pseudo- monas syringae pv. tabaci (Mancha aureolada "wildfire").

A presente invenção compreende ainda um QTL que confere resistência a doenças causadas por um agente patogênico invertebrado se- lecionado do grupo que consiste em Aphis glycines (Afídeo da soja), Hetero- dera glycines (Nematóide do cisto da soja), Meloidogyne arenaria, Meloi- dogyne hapla, Meloidogyne incógnita, Meloidogyne javanica (Nematóide das galhas radiculares), Hoplolaimus Columbus, Hoplolaimus galeatus, Hoplola- imus magnistylus (Nematóide em "arpão"), Pratylenchus spp. (Nematóide das lesões), Paratylenchus projectus, Paratylenchus tenuicaudatus (Nema- tóide em forma de pino), Rotylenchulus reniformis (Nematóide reniforme), Criconemella ornata (Nematóide em anel), Hemicycliophora spp. (Nematóide em bainha), Heliocotylenchus spp. (Nematóide espiralado), Belonolainus graeilis, Belonolainus Iongicaudatus (Nematóide de ferrão), Quinisulcius acu- tus, Tylenchorhynchus spp. (Nematóide atrofiador) e Paratrichodorus minor (Nematóide das raízes em coto).

A presente invenção fornece ainda tecido e plantas de soja sele- cionados que são resistentes a Phakopsora pachyrhizi, Phakopsora meibo- miae (Ferrugem Asiática da Soja), Colletotrichum truncatum, Colletotrichum dematium var. truncatum, Glomerella glycines (Antracnose da Soja), Phyto- phthora sojae (Podridão da raiz ou do caule causada por Phytophthora), S- clerotinia selerotiorum (Podridão do caule causada por Sclerotinia), Fusarium solani f. sp. glycines (síndrome de morte súbita), Fusarium spp. (podridão da raiz causada por Fusarium), Macrophomina phaseolina (podridão cinzenta), Septoria glycines, (Mancha Parda), Pythium aphanidermatum, Pythium de- baryanum, Pythium irregulare, Pythium ultimum, Pythium myriotylum, Pythi- um torulosum (decomposição de sementes causada por Pythium), Diaporthe phaseolorum var. sojae (Podridão da vagem), Phomopsis Iongicola (Podri- dão de caule), Phomopsis spp. (decomposição de sementes causada por Phomopsis), Peronospora manshurica (Míldio Felpudo), Rhizoctonia solani (podridão da raiz e caule causada por Rhizoctonia, podridão aérea causada por Rhizoctonia), Phialophora gregata (Podridão Parda do Caule), Diaporthe phaseolorum var. caulivora (Cancro do Caule), Cercospora kikuchii (Mancha Púrpura da Semente), Alternaria sp. (Mancha Alvo), Cercospora sojina (Mancha foliar "olho de rã"), Selerotium rolfsii (Podridão das estacas), Arkoo- la nigra (Deterioração foliar negra), Thielaviopsis basieola, (Podridão negra da raiz), Choanephora infundibulifera, Choanephora trispora (deterioração foliar causada por Choanephora), Leptosphaerulina trifolii (mancha foliar causada por Leptosphaerulina), Myeoleptodiseus terrestris (podridão da raiz causada por Myeoleptodiseus), Neocosmospora vasinfeeta (podridão do cau- le causada por Neoeosmospora), Phyllostieta sojieola (mancha foliar causa- da por Phyllostieta), Pyrenoehaeta glyeines (Mancha foliar causada por P- yrenoehaeta), Cylindroeladium erotalariae (Mancha foliar ("Red crown rot")), Dactulioehaeta glyeines (Mancha foliar vermelha ("Red leaf blotch")), Spaee- loma glyeines (Sarna), Stemphylium botryosum (deterioração foliar causada por Stemphylium), Corynespora eassiieola (Mancha Alvo), Nematospora eor- yli (Mancha causada por levedura), Phymatotriehum omnivorum (Podridão da raiz de algodão), Alfamovirus (Vírus mosaico da alfafa, AMV), Comovirus (vírus do mosqueado do feijoeiro, BPMV), Potyvirus (vírus mosaico amarelo do feijoeiro, BYMV), Bromovirus (vírus do mosqueado clorótico do feijão- fradinho, CCMV), Begomovirus (vírus mosaico amarelo do feijão-da-China, MYMV), Potyvirus (vírus do mosqueado do amendoim, PeMoV), Potyvirus (vírus de estrias do amendoim, PStV), Cucumovirus (vírus do atrofiamento do amendoim, PSV), Caulimovirus (vírus do mosqueado clorótico da soja, SbCMV), Begomovirus (vírus de enrugamento foliar da soja, SCLV), Luteovi- rus (vírus de nanismo da soja, SbDV), Potyvirus (vírus mosaico da soja, SMV), Nepovirus (vírus do atrofiamento grave da soja, SSSV), Nepovirus (vírus das manchas circulares do tabaco, TRSV), Bacillus subtilis (decompo- sição de sementes causada por Bacillus), Pseudomonas savastonoi pv. gly- cinea (Deterioração bacteriana), Pseudomonas syringae subsp. syringae (Folha enrugada causada por bactérias), Xanthomonas axonovagemis pv. glycines, (Pústula bacteriana), Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfa- ciens, (Mancha castanha bacteriana), Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens, Ralstonia solanacearum, (Murchamento causado por bacté- rias), Pseudomonas syringae pv. tabaci (Mancha aureolada), Aphis glycines (Afídeo da soja), Heterodera glycines (Nematóide do cisto da soja), Meloi- dogyne arenaria, Meloidogyne hapla, Meloidogyne incógnita, Meloidogyne javanica (Nematóide das galhas radiculares), Hoplolaimus Columbus, Hoplo- Iaimus galeatus, Hoplolaimus magnistylus (Nematóide em "arpão"), Prat- ylenchus spp. (Nematóide das lesões), Paratylenchus projectus, Paratylen- chus tenuicaudatus (Nematóide em forma de pino), Rotylenchulus reniformis (Nematóide reniforme), Criconemella ornata (Nematóide em anel), Hemicy- cliophora spp. (Nematóide em bainha), Heliocotylenchus spp. (Nematóide espiralado), Belonolainus graeilis, Belonolainus Iongicaudatus (Nematóide de ferrão), Quinisulcius acutus, Tylenchorhynchus spp. (Nematóide atrofiador) ou Paratrichodorus minor(Nematóide das raízes em coto).

A presente invenção fornece ainda que a planta selecionada é do grupo que consiste nos membros do gênero Glycine, mais especificamen- te do grupo que consiste em Glycine arenaria, Glycine argyrea, Glycine ca- nescens, Glycine clandestine, Glycine curvata, Glycine cyrtoloba, Glycine falcate, Glycine latifolia, Glycine latrobeana, Glycine max, Glycine microphyl- la, Glycine pescadrensis, Glycine pindanica, Glycine rubiginosa, Glycine so- ja, Glycine sp., Glycine stenophita, Glycine tabacina e Glycine tomentella.

A presente invenção fornece ainda que o meio utilizado no mé- todo para seleção é compreendido de água que não é tratada, destilada ou deionizada. O meio pode conter quaisquer ingredientes necessários para manter o agente patogênico ou o tecido vegetal, contanto que os ingredien- tes não interfiram na expressão de resistência que é conferida pelo QTL.

A presente invenção fornece ainda uma planta de soja selecio- nada utilizando o dito método. A presente invenção fornece ainda um QTL que é selecionado do grupo que consiste no lócus de tolerância à infecção por Phytophthora (podridão da raiz, do lócus de resistência a Fusarium solani f. sp. glycines (síndrome de morte súbita), do lócus de resistência a Cercospora sojina (Mancha foliar "olho de rã"), do lócus de resistência a Phialophora gegata (Podridão Parda do Caule), do lócus de resistência a Sclerotinia (podridão do caule), do lócus 1 de resistência à ASR, do lócus 2 de resistência à ASR, do lócus 3 de resistência à ASR, do lócus 4 de resistência à ASR, do lócus 5 de resistência à ASR, do lócus 6 de resistência à ASR, do lócus 7 de resis- tência à ASR, do lócus 8 de resistência à ASR, do lócus 9 de resistência à ASR, do lócus 10 de resistência à ASR, do lócus 11 de resistência à ASR, do lócus 12 de resistência à ASR e do lócus 13 de resistência à ASR.

A presente invenção fornece ainda que a planta selecionada contém um ou mais QTLs de resistência a doenças fúngicas, incluindo o ló- cus 1 de resistência à ASR, o lócus 2 de resistência à ASR, o lócus 3 de re- sistência à ASR, o lócus 4 de resistência à ASR, o lócus 5 de resistência à ASR, o lócus 6 de resistência à ASR, o lócus 7 de resistência à ASR, o lócus 8 de resistência à ASR, o lócus 9 de resistência à ASR, o lócus 10 de resis- tência à ASR, o lócus 11 de resistência à ASR, o lócus 12 de resistência à ASR e o lócus 13 de resistência à ASR.

A presente invenção fornece ainda um ou mais loci marcadores de polimorfismo de um único nucleotídeo (SNP) para o lócus 1 de resistên- cia à ASR, em que o dito marcador de SNP é selecionado do grupo que consiste em NS0093250, NS0119710, NS0103004, NS0099454, NS0102630, NS0102915, NS0102913, NS0123728, NS0129943, NS0102168, NS0092723, NS0098177, NS0127343 e NS0101121. Um ou mais loci marcadores de SNP para o lócus 3 de resistência à ASR também são fornecidos, em que o dito marcador de SNP é selecionado do grupo que consiste em NS0099746, NS0123747, NS0126598, NS0128378, NS0096829, NS0125408, NS0098902, NS0099529, NS0097798, NS0137477, NS0095322, NS0136101 e NS0098982. Um exemplo de lócus marcador de SNP, NS0103033, é fornecido para o lócus 5 de resistência à ASR1 o lócus 6 de resistência à ASR, o lócus 7 de resistência à ASR, o lócus 8 de resistência à ASR e o lócus 9 de resistência à ASR. Um outro exemplo de lócus marcador de SNP, NS0124935, é fornecido para o lócus 10 de re- sistência à ASR, o lócus 11 de resistência à ASR, o lócus 12 de resistência à ASR e o lócus 13 de resistência à ASR. Ainda, um ou mais marcadores mapeados dentro de 10 centimorgans ou menos das ditas moléculas marca- doras podem ser utilizados para a seleção e para a introgressão dos loci de resistência à ASR.

A presente invenção fornece ainda um método para a seleção e para a introgressão de resistência à ASR na soja que compreende: (a) o iso- lamento de ácidos nucléicos de um grande número de plantas de soja; (b) a detecção nos ditos ácidos nucléicos isolados da presença de uma ou mais moléculas marcadoras associadas com os loci 1-13 de resistência à ASR, em que a dita molécula marcadora é selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 67 até 99 e qualquer molécula marcadora mapeada dentro de centimorgans ou menos das ditas moléculas marcadoras; e (c) a seleção de uma planta de soja que compreende a dita uma ou mais moléculas mar- cadoras, selecionando assim uma planta de soja resistente à ASR.

A presente invenção fornece ainda uma planta de soja selecio- nada utilizando o dito método.

Descrição Detalhada da Invenção

A presente invenção fornece um método para a seleção de plan- tas de soja em relação à resistência, à imunidade ou à susceptibilidade a uma doença fúngica. Em uma modalidade preferida a planta é selecionada do gênero Glycine. As sojas perenes selvagens pertencem ao subgênero Glycine e possuem um amplo arranjo de diversidade genética. A soja culti- vada (Glycine max (L.) Merr.) e sua progenitora anual selvagem (Glycine soja (Sieb. e Zucc.)) pertencem ao subgênero Soja, contêm 2n = 40 cromos- somos, são compatíveis para cruzamento, produzem geralmente híbridos F1 férteis vigorosos e carregam genomas similares. São possíveis os cruza- mentos entre espécies cultivadas de Glycine e espécies perenes selvagens de Glycine, cujo sucesso é variável entre os números de acesso. Investiga- ções mostraram que vários números de acesso de Glycine perenes selva- gens carregam resistência à Mancha Parda, à ferrugem da soja, à podridão da raiz, ao vírus mosaico amarelo e ao míldio pulverulento. Há mais de 100.000 números de acesso de Glycine max, provavelmente menos de 10.000 números de acesso de Glycine soja e aproximadamente, 3500 núme- ros de acesso de espécies perenes de Glycine em coleções de germoplas- ma ao longo de todo o mundo. Os números exatos não são conhecidos. As coleções principais de Glycine existem na Austrália, no Brasil, na China, na Alemanha, na índia, na Indonésia, no Japão, na Rússia, na Coréia do Sul e nos Estados Unidos da América. Muitas outras coleções menores, mas im- portantes, existem ao longo da Ásia e da Europa. Não é sabido quantos são os números de acesso duplicados entre as coleções. A USDA Soybean Germplasm Collection é uma das maiores coleções e a maior fora da Ásia (Verma e outros, eds., Soybean: Genetics, Molecular Biology and Biotechno- logy (1996)). Contém atualmente 20.765 números de acesso, compreendi- dos de 19 coleções de espécies, incluindo 18.680 números de acesso de Glyeine max e 1.166 números de acesso de Glyeine soja assim como espé- cies perenes de Glyeine.

Em uma modalidade preferida, uma planta de soja é analisada em relação à resistência, à imunidade ou à susceptibilidade a doenças com- preendendo: (a) a separação de um tecido vegetal da planta de soja; (b) o cultivo do dito tecido em um meio; (c) a exposição do dito tecido a um agente patogênico de planta; e (d) a avaliação do dito tecido em relação à resistên- cia, à imunidade ou à susceptibilidade à doença causada pelo agente pato- gênico. Adicionalmente, a resposta da planta ao agente patogênico pode ser avaliada através das etapas a seguir (e) de isolamento de ácidos nucléicos da dita planta; (f) de análise dos ditos ácidos nucléicos em relação à presen- ça de um ou mais marcadores moleculares para um lócus de característica quantitativa associado com a dita resistência, imunidade ou susceptibilidade; e (g) de seleção da dita planta para uso em um programa de cruzamento. A determinação de resistência, imunidade ou susceptibilidade de uma planta a um agente patogênico particular é óbvia a qualquer versado na técnica. O tecido vegetal pode ser folha, tecido vascular, flor, vagem, raiz, caule, se- mente ou uma parte dos mesmos ou uma célula isolada do tecido. A exposi- ção do dito tecido a um agente patogênico de planta é realizada através de um meio selecionado do grupo que consiste em (a) aplicação direta do agen- te patogênico ao tecido; (b) inclusão do agente patogênico no meio de cultu- ra; e (c) inclusão de um agente que é eficientemente contaminado com o agente patogênico e serve para inocular o tecido. O agente patogênico de planta pode ser um fungo, um vírus, uma bactéria ou um animal invertebra- do. A exposição ao agente patogênico de planta pode ocorrer na forma de macromoléculas, células, tecidos, organismo inteiro do agente patogênico ou combinações dos mesmos, em que o agente patogênico e partes do mesmo, são vivos ou mortos contanto que o material medeie uma resposta imunoló- gica no tecido hospedeiro. As macromoléculas do agente patogênico rele- vantes para a presente invenção incluem, mas não estão limitadas a toxinas, paredes ou membranas celulares, antígenos e polissacarídeos.

Em uma modalidade preferida, o tecido de folha pode compre- ender uma folha de cotilédone, uma folha unifoliada, uma folha trifoliada e prófilos. Há quatro tipos de folhas de soja: 1) o primeiro par de cotilédones simples ou folhas de semente, 2) o segundo par de folhas primárias simples, também conhecidas como folhas unifoliadas, 3) as folhas de folhagem trifoli- adas e 4) os prófilos, que são partes da planta que se assemelham a folhas. As folhas unifoliadas ocorrem no primeiro nó acima dos cotilédones. Todas as outras folhas seriam trifoliadas, em que o primeiro par a emergir após as unifoliadas é o das primeiras folhas trifoliadas, que são seguidas pela emer- gência das segundas folhas trifoliadas e então das terceiras folhas trifoliadas (H.R. Boerma e J.E. Specht (ed.) Soybean Monograph, 3â Edição, Am. Soe. Agron., Madison, WI (2004)).

Em uma modalidade preferida, a presente invenção possibilita que uma planta de soja seja analisada relação à resistência, à imunidade ou à susceptibilidade a uma doença fúngica. As doenças da soja causadas pe- los fungos incluem, mas não estão limitadas a Phakopsora pachyrhizi, Pha- kopsora meibomiae (Ferrugem Asiática da Soja), Colletotrichum truncatum, Colletotrichum dematium var. truncatum, Glomerella glycines (Antracnose da Soja), Phytophthora sojae (Podridão da raiz ou do caule causada por Phyto- phthora), Sclerotinia sclerotiorum (Podridão do caule causada por Sclerotini- a), Fusarium solani f. sp. glycines (síndrome de morte súbita), Fusarium spp. (podridão da raiz causada por Fusarium), Macrophomina phaseolina (podri- dão cinzenta), Septoria glycines, (Mancha Parda), Pythium aphanidermatum, Pythium debaryanum, Pythium irregulare, Pythium ultimum, Pythium myriot- ylum, Pythium torulosum (decomposição de sementes causada por Pythi- um), Diaporthe phaseolorum var. sojae (Podridão da vagem), Phomopsis longicola (Podridão de caule), Phomopsis spp. (decomposição de sementes causada por Phomopsis), Peronospora manshurica (Míldio Felpudo), Rhizoc- tonia solani (podridão da raiz e caule causada por Rhizoctonia, podridão aé- rea causada por Rhizoctonia), Phialophora gregata (Podridão Parda do Cau- le), Diaporthe phaseolorum var. caulivora (Cancro do Caule), Cercospora kikuchii (Mancha Púrpura da Semente), Alternaria sp. (Mancha Alvo), Cer- cospora sojina (Mancha foliar "olho de rã"), Sclerotium rolfsii (Podridão das estacas), Arkoola nigra (Deterioração foliar negra), Thielaviopsis basicola, (Podridão negra da raiz), Choanephora infundibulifera, Choanephora trispora (deterioração foliar causada por Choanephora), Leptosphaerulina trifolii (mancha foliar causada por Leptosphaerulina), Mycoleptodiscus terrestris (podridão da raiz causada por Mycoleptodiscus), Neocosmospora vasinfecta (podridão do caule causada por Neocosmospora), Phyllostieta sojieola (man- cha foliar causada por Phyllostieta), Pyrenoehaeta glycines (Mancha foliar causada por Pyrenochaeta), Cylindrocladium erotalariae (Mancha foliar), Dactulioehaeta glycines (Mancha foliar vermelha), Spaceloma glycines (Sar- na), Stemphylium botryosum (deterioração foliar causada por Stemphylium), Corynespora cassiicola (Mancha Alvo), Nematospora coryli (Mancha causa- da por levedura) e Phymatotrichum omnivorum (Podridão da raiz de algodão).

Em uma modalidade preferida, a presente invenção possibilita que uma planta de soja seja analisada em relação à resistência, à imunidade ou à susceptibilidade a uma doença viral. As doenças da soja causadas por vírus incluem, mas não estão limitadas a Alfamovirus (Vírus mosaico da alfa- fa, AMV), Comovirus (vírus do mosqueado do feijoeiro, BPMV), Potyvirus (vírus mosaico amarelo do feijoeiro, BYMV), Bromovirus (vírus do mosquea- do clorótico do feijão-fradinho, CCMV), Begomovirus (vírus mosaico amarelo do feijão-da-China, MYMV), Potyvirus (vírus do mosqueado do amendoim, PeMoV), Potyvirus (vírus de estrias do amendoim, PStV), Cucumovirus (ví- rus do atrofiamento do amendoim, PSV), Caulimovirus (vírus do mosqueado clorótico da soja, SbCMV), Begomovirus (vírus de enrugamento foliar da so- ja, SCLV), Luteovirus (vírus de nanismo da soja, SbDV), Potyvirus (vírus mosaico da soja, SMV), Nepovirus (vírus do atrofiamento grave da soja, SSSV) e Nepovirus (vírus das manchas circulares do tabaco, TRSV).

Em uma modalidade preferida, a presente invenção possibilita que uma planta de soja seja analisada em relação à resistência, à imunidade ou à susceptibilidade a uma doença bacteriana. As doenças da soja causa- das por bactérias incluem, mas não estão limitadas a Bacillus subtilis (de- composição de sementes causada por Bacillus), Pseudomonas savastonoi pv. glycinea (Deterioração bacteriana), Pseudomonas syringae subsp. syrin- gae (Folha enrugada causada por bactérias), Xanthomonas axonovagemis pv. glycines, (Pústula bacteriana), Curtobacterium flaccumfaciens pv. flac- cumfaciens, (Mancha castanha bacteriana), Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens, Ralstonia solanacearum, (Murchamento causado por bactérias) e Pseudomonas syringae pv. tabaci (Mancha aureolada).

Em uma modalidade preferida, a presente invenção possibilita que uma planta de soja seja analisada em relação à resistência, à imunidade ou à susceptibilidade a uma doença causada por pragas de animais. As do- enças da soja causadas por pragas de animais incluem, mas não estão limi- tadas a Aphis glycines (Afídeo da soja), Heterodera glycines (Nematóide do cisto da soja), Meloidogyne arenaria, Meloidogyne hapla, Meloidogyne in- cógnita, Meloidogyne javanica (Nematóide das galhas radiculares), Hoplola- imus Columbus, Hoplolaimus galeatus, Hoplolaimus magnistylus (Nematóide em "arpão"), Pratylenchus spp. (Nematóide das lesões), Paratylenchus pro- jectus, Paratylenchus tenuicaudatus (Nematóide em forma de pino), Rot- ylenchulus reniformis (Nematóide reniforme), Criconemella ornata (Nematói- de em anel), Hemicycliophora spp. (Nematóide em bainha), Heliocotylenchus spp. (Nematóide espiralado), Belonolainus graeilis, Belonolainus longieauda- tus (Nematóide de ferrão), Quinisulcius aeutus, Tylenehorhynehus spp. (Ne- matóide atrofiador) e Paratriehodorus minor (Nematóide das raízes em coto).

A invenção fornece ainda um método para a seleção e para a introgressão de QTL para resistência a doenças na soja que compreende: (a) o isolamento de ácidos nucléicos de um grande número de plantas de soja; (b) a detecção nos ditos ácidos nucléicos isolados da presença de uma ou mais moléculas marcadoras associadas com o QTL de resistência a do- enças; e (c) a seleção de uma planta de soja que compreende a dita uma ou mais moléculas marcadoras, selecionando assim uma planta de soja resis- tente a doenças.

O QTL de resistência a doenças da presente invenção pode ser introduzido em uma linhagem de Glyeine max de elite. Uma "linhagem de elite" é qualquer linhagem que resultou do cruzamento e da seleção para desempenho agronômico superior. Os exemplos de linhagens de elite são linhagens que estão disponíveis comercialmente para plantadores ou para cultivadores de soja tais como HARTZ® variedade H4994, HARTZ® varieda- de H5218, HARTZ® variedade H5350, HARTZ® variedade H5545, HARTZ® variedade H5050, HARTZ® variedade H5454, HARTZ® variedade H5233, HARTZ® variedade H5488, HARTZ® variedade HLA572, HARTZ® variedade H6200, HARTZ® variedade H6104, HARTZ® variedade H6255, HARTZ® va- riedade H6586, HARTZ® variedade H6191, HARTZ® variedade H7440, HARTZ® variedade H4452 Roundup Ready®, HARTZ® variedade H4994 Roundup Ready®, HARTZ® variedade H4988 Roundup Ready®, HARTZ® variedade H5000 Roundup Ready®, HARTZ® variedade H5147 Roundup Ready®, HARTZ® variedade H5247 Roundup Ready®, HARTZ® variedade H5350 Roundup Ready®, HARTZ® variedade H5545 Roundup Ready®, HARTZ® variedade H5855 Roundup Ready®, HARTZ® variedade H5088 Roundup Ready®, HARTZ® variedade H5164 Roundup Ready®, HARTZ® variedade H5361 Roundup Ready®, HARTZ® variedade H5566 Roundup Ready®, HARTZ® variedade H5181 Roundup Ready®, HARTZ® variedade H5889 Roundup Ready®, HARTZ® variedade H5999 Roundup Ready®, HARTZ® variedade H6013 Roundup Ready®, HARTZ® variedade H6255 Roundup Ready®, HARTZ® variedade H6454 Roundup Ready®, HARTZ® variedade H6686 Roundup Ready®, HARTZ® variedade H7152 Roundup Ready®, HARTZ® variedade H7550 Roundup Ready®, HARTZ® variedade H8001 Roundup Ready® (HARTZ SEED, Stuttgart1 Arkansas, USA); A0868, AG0202, AG0401, AG0803, AG0901, A1553, A1900, AG1502, AG1702, AG1901, A1923, A2069, AG2101, AG2201, AG2205, A2247, AG2301, A2304, A2396, AG2401, AG2501, A2506, A2553, AG2701, AG2702, AG2703, A2704, A2833, A2869, AG2901, AG2902, AG2905, AG3001, AG3002, AG3101, A3204, A3237, A3244, AG3301, AG3302, AG3006, AG3203, A3404, A3469, AG3502, AG3503, AG3505, AG3305, AG3602, AG3802, AG3905, AG3906, AG4102, AG4201, AG4403, AG4502, AG4603, AG4801, AG4902, AG4903, AG5301, AG5501, AG5605, AG5903, AG5905, A3559, AG3601, AG3701, AG3704, AG3750, A3834, AG3901, A3904, A4045 AG4301, A4341, AG4401, AG4404, AG4501, AG4503, AG4601, AG4602, A4604, AG4702, AG4703, AG4901, A4922, AG5401, A5547, AG5602, AG5702, A5704, AG5801, AG5901, A5944, A5959, AG6101, AJW2600C0R, FPG26932, QR4459 e QP4544 (Asgrow Seeds, Des Moines, Iowa, USA); DKB26-52, DKB28-51, DKB32-52, DKB08-51, DKB09-53, DKB10-52, DKB18-51, DKB26-53, DKB29-51, DKB42-51, DKB35-51 DKB34- 51, DKB36-52, DKB37-51, DKB38-52, DKB46-51, DKB54-52 e DeKaIb vari- edade CX445 (DeKalb, Illinois, USA); 91B91, 92B24, 92B37, 92B63, 92B71, 92B74, 92B75, 92B91, 93B01, 93B11, 93B26, 93B34, 93B35, 93B41, 93B45, 93B51, 93B53, 93B66, 93B81, 93B82, 93B84, 94B01, 94B32, 94B53, 94M80 RR, 94M50 RR, 95B71, 95B95, 95M81 RR, 95M50 RR, 95M30 RR, 9306, 9294, 93M50, 93M93, 94B73, 94B74, 94M41, 94M70, 94M90, 95B32, 95B42, 95B43 e 9344 (Pioneer Hi-bred International, Johnston, lowa, USA); SSC-251RR, SSC-273CNRR, AGRA 5429RR, SSC-314RR, SSC-315RR, SSC-311STS, SSC-320RR, AGRA5432RR, SSC-345RR, SSC-356RR, SSC- 366, SSC-373RR e AGRA5537CNRR (Schlessman Seed Company, Milan, Ohio, USA); 39-E9, 44-R4, 44-R5, 47-G7, 49-P9, 52-Q2, 53-K3, 56-J6, 58- V8, ARX A48104, ARX B48104, ARX B55104 e GP530 (Armor Beans, Fi- sher, Arkansas, USA); HT322STS, HT3596STS, L0332, L0717, L1309CN, L1817, L1913CN, L1984, L2303CN, L2495, L2509CN, L2719CN, L3997CN, L4317CN, RC1303, RC1620, RC1799, RC1802, RC1900, RC1919, RC2020, RC2300, RC2389, RC2424, RC2462, RC2500, RC2504, RC2525, RC2702, RC2964, RC3212, RC3335, RC3354, RC3422, RC3624, RC3636, RC3732, RC3838, RC3864, RC3939, RC3942, RC3964, RC4013, RC4104, RC4233, RC4432, RC4444, RC4464, RC4842, RC4848, RC4992, RC5003, RC5222, RC5332, RC5454, RC5555, RC5892, RC5972, RC6767, RC7402, RT0032, RT0041, RT0065, RT0073, RT0079, RT0255, RT0269, RT0273, RT0312, RT0374, RT0396, RT0476, RT0574, RT0583, RT0662, RT0669, RT0676, RT0684, RT0755, RT0874, RT0907, RT0929, RT0994, RT0995, RT1004, RT1183, RT1199, RT1234, RT1399, RT1413, RT1535, RT1606, RT1741, RT1789, RT1992, RT2000, RT2041, RT2089, RT2092, RT2112, RT2127, RT2200, RT2292, RT2341, RT2430, RT2440, RT2512, RT2544, RT2629, RT2678, RT2732, RT2800, RT2802, RT2822, RT2898, RT2963, RT3176, RT3200, RT3253, RT3432, RT3595, RT3836, RT4098, RX2540, RX2944, RX3444 e TS466RR (Croplan Genetics, Clinton, Kentucky, USA); 4340RR, 4630RR, 4840RR, 4860RR, 4960RR, 4970RR, 5260RR, 5460RR, 5555RR, 5630RR e 5702RR (Delta Grow1 Inglaterra, Arkansas, USA); DK3964RR, DK3968RR, DK4461RR, DK4763RR, DK4868RR, DK4967RR, DK5161RR, DK5366RR, DK5465RR, DK55T6, DK5668RR, DK5767RR, DK5967RR, DKXTJ446, DKXTJ448, DKXTJ541, DKXTJ542, DKXTJ543, DKXTJ546, DKXTJ548, DKXTJ549, DKXTJ54J9, DKXTJ54X9, DKXTJ554, DKXTJ555, DKXTJ55J5 e DKXTJ5K57 (Delta King Seed Company, McCrory1 Arkansas, USA); DP 3861 RR, DP 4331 RR, DP 4546RR, DP 4724 RR, DP 4933 RR1 DP 5414RR, DP 5634 RR1 DP 5915 RR, DPX 3950RR, DPX 4891 RR, DPX 5808RR (Delta & Pine Land Company, Lubbock, Texas, USA); DG31T31, DG32C38, DG3362NRR, DG3390NRR, DG33A37, DG33B52, DG3443NRR, DG3463NRR, DG3481NRR, DG3484NRR, DG3535NRR, DG3562NRR, DG3583NRR, DG35B40, DG35D33, DG36M49, DG37N43, DG38K57, DG38T47, SX04334, SX04453 (Dyna-gro line, UAP-MidSouth, Cordova, Tennessee, USA); 8374RR CYSTX, 8390 NNRR, 8416RR, 8492NRR e 8499NRR (Excel Brand, Camp Point, Illinois, USA); 4922RR, 5033RR, 5225RR e 5663RR (FFR Semente, Southhaven, Mississippi, USA); 3624RR/N, 3824RR/N, 4212RR/N, 4612RR/N, 5012RR/N, 5212RR/N e 5412RR/STS/N (Garst Seed Company, Slater, lowa, USA); 471, 4R451, 4R485, 4R495, 4RS421 e 5R531 (Gateway Seed Company, Nashville, Illi- nois, USA); H-3606RR, H-3945RR, H-4368RR, H-4749RR, H-5053RR e H- 5492RR (Golden Harvest Seeds, Inc., Pekin, Illinois, USA); HBK 5324, HBK 5524, HBK R4023, HBK R4623, HBK R4724, HBK R4820, HBK R4924, HBK R4945CX, HBK R5620 e HBK R5624 (Hornbeck Seed Co. Inc., DeWitt, Ar- kansas, USA); 341 RR/SCN, 343 RR/SCN, 346 RR/SCN, 349 RR, 355 RR/SCN, 363 RR/SCN, 373 RR, 375 RR, 379 RR/SCN, 379+ RR/SCN, 380 RR/SCN, 380+ RR/SCN, 381 RR/SCN, 389 RR/SCN, 389+ RR/SCN, 393 RR/SCN, 393+ RR/SCN, 398 RR, 402 RR/SCN, 404 RR, 424 RR, 434 RR/SCN e 442 RR/SCN (Kruger Seed Company, Dike1 lowa, USA); 3566, 3715, 3875, 3944, 4010 e 4106 (Lewis Hybrids, Inc., Ursa, Illinois, USA); C3999NRR (LG Seeds, Elmwood, Illinois, USA); Atlanta 543, Austin RR, Cleveland VIIRR, Dallas RR, Denver RRSTS, Everest RR, Grant 3RR, Olympus RR, Phoenix IIIRR, Rocky RR, Rushmore 553RR e Washington IXRR (Merschman Seed Inc., West Point, lowa, USA); RT 3304N, RT 3603N, RT 3644N, RT 3712N, RT 3804N, RT 3883N, RT 3991N, RT 4044N, RT 4114N, RT4124N, RT 4201N, RT4334N, RT4402N, RT 4480N, RT 4503N, RT 4683N, RT 4993N, RT 5043N, RT 5204, RT 5553N, RT 5773, RT4731N e RTS 4824N (MFA Inc., Columbia, Missouri, USA); 9A373NRR, 9A375XRR, 9A385NRS, 9A402NRR, 9A455NRR, 9A485XRR e 9B445NRS (Midland Ge- netics Group L.L.C., Ottawa, Kansas, USA); 3605nRR, 3805nRR, 3903nRR, 3905nRR, 4305nRR, 4404nRR, 4705nRR, 4805nRR, 4904nRR, 4905nRR, 5504nRR e 5505nRR (Midwest Premium Genetics, Concordia, Missouri, USA); S37-N4, S39-K6, S40-R9, S42-P7, S43-B1, S49-Q9, S50-N3, S52-U3 e S56-D7 (Syngenta Seeds, Henderson, Kentucky, USA); NT-3707 RR, NT- 3737 RR/SCN, NT-3737+RR/SCN, NT-3737sc RR/SCN, NT-3777+ RR, NT- 3787 RR/SCN, NT-3828 RR, NT-3839 RR1 NT-3909 RR/SCN/STS, NT- 3909+ RR/SCN/ST, NT-3909sc RR/SCN/S, NT-3919 RR, NT-3922 RR/SCN, NT-3929 RR/SCN, NT-3999 RR/SCN, NT-3999+ RR/SCN, NT-3999sc RR/SCN, NT-4040 RR/SCN, NT-4040+ RR/SCN, NT-4044 RR/SCN, NT- 4122 RR/SCN, NT-4414 RR/SCN/STS, NT-4646 RR/SCN e NT-4747 RR/SCN (NuTech Seed Co., Ames, lowa, USA); PB-3494NRR, PB-3732RR, PB-3894NRR, PB-3921NRR, PB-4023NRR, PB-4394NRR, PB-4483NRR e PB-5083NRR (Prairie Brand Seed Co., Story City, lowa, USA); 3900RR, 4401 RR, 4703RR, 4860RR, 4910, 4949RR, 5250RR, 5404RR, 5503RR, 5660RR, 5703RR, 5770, 5822RR, PGY 4304RR, PGY 4604RR, PGY 4804RR, PGY 5622RR e PGY 5714RR (Progeny Ag Products, Wynne1 Ar- kansas, USA); R3595RCX, R3684Rcn, R3814RR, R4095Rcn, R4385Rcn e R4695Rcn (Renze Hybrids Inc., Carroll, lowa, USA); S3532-4, S3600-4, S3832-4, S3932-4, S3942-4, S4102-4, S4542-4 e S4842-4 (Stine Seed Co., Adel, lowa, USA); 374RR, 398RRS (Taylor Seed Farms Inc., White Cloud, Kansas, USA); USG 5002T, USG 510nRR, USG 5601T, USG 7440nRR, USG 7443nRR, USG 7473nRR, USG 7482nRR, USG 7484nRR, USG 7499nRR, USG 7504nRR, USG 7514nRR, USG 7523nRR, USG 7553nRS e USG 7563nRR (UniSouth Genetics Inc., Nashville, Tennessee, USA); V38N5RS, V39N4RR, V42N3RR, V48N5RR, V284RR, V28N5RR, V315RR, V35N4RR, V36N5RR, V37N3RR, V40N3RR, V47N3RR e V562NRR (Roys- ter-Clark Inc., Washington C.H., Ohio, USA); RR2383N, 2525NA, RR2335N, RR2354N, RR2355N, RR2362, RR2385N, RR2392N, RR2392NA, RR2393N, RR2432N, RR2432NA, RR2445N, RR2474N, RR2484N, RR2495N e RR2525N (Willcross Seed, King City Semente, King City, Mis- souri, USA); 1493RR, 1991NRR, 2217RR, 2301NRR, 2319RR, 2321NRR, 2341NRR, 2531 NRR, 2541 NRR, 2574RR, 2659RR, 2663RR, 2665NRR, 2671 NRR, 2678RR, 2685RR, 2765NRR, 2782NRR, 2788NRR, 2791 NRR, 3410RR, 3411NRR1 3419NRR, 3421NRR, 3425NRR, 3453NRR, 3461NRR, 3470CRR, 3471 NRR, 3473NRR, 3475RR, 3479NRR, 3491 NRR, 3499NRR, WX134, WX137, WX177 e WX300 (Wilken Seeds, Pontiac, Illinois, USA). Uma planta de elite é uma planta representativa de uma linhagem de elite. O QTL de resistência a doenças da presente invenção também pode ser introduzido em uma planta transgênica de Glycine max de elite que contém um ou mais genes para tolerância a herbicidas, maior rendimento, controle de insetos, resistência a doenças fúngicas, resistência a virus, resis- tência a nematóides, resistência a doenças bacterianas, resistência a doen- ças causadas por micoplasma, produção de óleos modificados, alta produ- ção de óleos, alta produção de proteínas, controle de germinação e de cres- cimento de mudas, maior nutrição para animais e seres humanos, menor teor de rafinose, resistência ao estresse ambiental, maior capacidade de di- gestão, enzimas industriais, proteínas, peptídeos e pequenas moléculas far- macêuticas, melhores características de processamento, melhor sabor, fixa- ção de nitrogênio, produção de sementes híbridas, alergenicidade reduzida, biopolímeros e biocombustíveis entre outros. Estas características agronô- micas podem ser fornecidas através dos métodos de biotecnologia vegetal na forma de transgenes em Glycine max.

É entendido ainda que uma planta de soja da presente invenção pode exibir as características de qualquer grupo de maturidade. O pólen da planta de soja selecionada pode ser criopreservado e utilizado em cruza- mentos com linhagens de elite de outros grupos de maturidade para a intro- gressão do lócus de resistência à doença fúngica em uma linhagem que não estaria normalmente disponível para cruzamento na natureza. As técnicas de criopreservação de pólen são bem-conhecidas na técnica (Tyagi e outros, Cryo Letters, 24: 119-124 (2003), Liang e outros, Acta Botaniea Sinica, 35: 733-738 (1993) e Honda e outros, Euphytiea 126: 315-320 (2002)).

O efeito de resistência a doenças do QTL pode variar com base no genótipo parental e nas condições ambientais em que o efeito de resis- tência a doenças é medido. Está dentro da perícia dos técnicos na técnica do cruzamento de plantas e sem experimentos desnecessários o uso dos métodos descritos aqui para a seleção de uma população de plantas ou de uma coleção de genótipos parentais daqueles que quando contêm um lócus de doença resultam em uma maior resistência a doenças em relação ao ge- nótipo parental. Aqui, uma doença de plantas pode ser causada por um fun- go, um vírus, uma bactéria ou um animal invertebrado.

Um número de mapas genéticos moleculares de Glycine foi rela- tado (Mansur e outros, Crop Sei. 36:1327-1336 (1996), Shoemaker e outros, Genetics 144: 329-338 (1996), Shoemaker e outros, Crop Science 32: 1091- 1098 (1992), Shoemaker e outros, Crop Science 35: 436-446 (1995), Tinley e outros, J. Cell Biochem. Suppl. 14E: 291 (1990), Cregan e outros, Crop Science 39:1464-1490 (1999)). Giycine max, Glycine soja e Glycine max x. Glycine soja compartilham grupos de ligação (Shoemaker e outros, Genetics 144: 329-338 (1996)). Como utilizado aqui, a referência aos grupos de liga- ção, G; C2; J; e N de Glycine max se refere ao grupo de ligação que corres- ponde aos grupos de ligação, G; C2; J; e N do mapa genético de Glycine max (Mansur e outros, Crop Science. 36: 1327-1336 (1996), Cregan e outros, Crop Science 39:1464-1490 (1999) e Soybase, Agricultural Research Service, United States Department of AgricuIture).

Um alelo de um QTL pode, evidentemente, compreender vários genes ou outros fatores genéticos mesmo dentro de uma região genômica contígua ou grupo de ligação, tal como um haplotipo. Como utilizado aqui, um alelo de um QTL pode, portanto, abranger mais de um gene ou outro fator genético em que cada gene individual ou componente genético é tam- bém capaz de exibir variação alélica e em que cada gene ou fator genético é também capaz de produzir um efeito fenotípico sobre a característica quanti- tativa em questão. Em uma modalidade da presente invenção o alelo de um QTL compreende um ou mais genes ou outros fatores genéticos que tam- bém são capazes de exibir variação alélica. Não é pretendido assim que o uso do termo "um alelo de um QTL" exclua um QTL que compreende mais de um gene ou outro fator genético. Especificamente, um "alelo de um QTL" na presente invenção pode significar um haplotipo dentro de uma janela de haplotipos em que um fenótipo pode ser resistência a doenças. Uma janela de haplotipos é uma região genômica contígua que pode ser definida e ras- treada, com um conjunto de um ou mais marcadores polimórficos em que dos ditos polimorfismos indicam identidade por descendência. Um haplotipo dentro de tal janela pode ser definido pelo o "fingerprint" exclusivo de alelos em cada marcador. Como utilizado aqui, um alelo é um de várias formas al- ternativas de um gene que ocupam um certo lócus em um cromossomo. Quando todos os alelos presentes em um certo lócus em um cromossomo são os mesmos, tal planta é homozigota em tal lócus. Se os alelos presentes em um certo lócus em um cromossomo diferirem, tal planta é heterozigota em tal lócus.

As plantas da presente invenção podem fazer parte de ou ser geradas partindo de um programa de cruzamento. A escolha do método de cruzamento depende do modo de reprodução da planta, da condição de he- rança da(s) característica(s) que será(ão) melhorada(s) e do tipo de cultivar utilizado comercialmente (por exemplo, cultivar híbrido F1, cultivar de linha- gem pura etc.). Um cultivar é uma raça ou uma variedade de uma planta que foi criada ou selecionada intencionalmente e mantida através do cultivo.

As abordagens não-limitantes selecionadas para o cruzamento das plantas da presente invenção são apresentadas a seguir. Um programa de cruzamento pode ser melhorado utilizando a seleção auxiliada por mar- cador (MAS) da progênie de qualquer cruzamento. É entendido ainda que quaisquer cultivares comerciais e não comerciais podem ser utilizados em um programa de cruzamento. Fatores tais como, por exemplo, vigor na e- mergência, vigor vegetativo, tolerância ao estresse, resistência a doenças, formação de ramos, florescência, produção de sementes, tamanho de se- mentes, densidade de sementes, capacidade de ficar ereta e capacidade de ser debulhada etc. geralmente determinarão a escolha.

Para as características que podem ser altamente herdadas, uma escolha de plantas individuais superiores avaliadas em uma localização iso- lada será eficiente, enquanto que para características com baixa capacidade de herança, a seleção deve ser baseada em valores médios obtidos de ava- liações replicadas de famílias de plantas relacionadas. Os métodos de sele- ção populares incluem comumente a seleção de pedigrees, a seleção de pedigrees modificados, a seleção de massa e a seleção recorrente. Em uma modalidade preferida um programa de retrocruzamento ou de cruzamento recorrente é realizado. A complexidade da herança influencia a escolha do método de cruzamento. A criação por retrocruzamento pode ser utilizada para transferir um ou alguns genes favoráveis para uma característica que pode ser alta- mente herdada em um cultivar desejável. Esta abordagem foi utilizada ex- tensivamente para a criação de cultivares resistentes a doenças. Várias téc- nicas de seleção recorrentes são utilizadas para melhorar características herdadas quantitativamente controladas por vários genes. O uso da seleção recorrente em plantas de cultivo de autopolinização depende da facilidade de polinização, da freqüência de híbridos bem-sucedidos de cada evento de polinização e do número de prole híbrida proveniente de cada cruzamento bem-sucedido.

As linhagens de cruzamento podem ser testadas e comparadas com padrões apropriados em ambientes representativos da(s) área(s) al- vo(s) comercial(is) em relação a duas ou mais gerações. As melhores Iinha- gens são candidatas para novos cultivares comerciais; estas ainda deficien- tes nas características podem ser utilizadas como parentais para a produção de novas populações para seleção adicional.

Um método de identificação de uma planta superior é observar seu desempenho em relação a outras plantas experimentais e a um cultivar padronizado amplamente cultivado. Se uma única observação não for con- clusiva, observações replicadas podem fornecer uma melhor estimativa de seu valor genético. Um cultivador pode selecionar e cruzar duas ou mais linhagens parentais, seguido pelo autocruzamento e pela seleção repetidos, produzindo muitas combinações genéticas novas.

O desenvolvimento de novos cultivares de soja requer o desen- volvimento e a seleção de variedades de soja, o cruzamento destas varieda- des e a seleção de cruzamentos híbridos superiores. A semente híbrida po- de ser produzida através de cruzamentos manuais entre parentais férteis do sexo masculino selecionados ou através da utilização de sistemas de esteri- lidade do sexo masculino. Os híbridos são selecionados para certas caracte- rísticas gênicas isoladas tais como coloração da vagem, coloração da flor, rendimento de semente, coloração na puberdade ou resistência a herbicidas que indicam que a semente é realmente um híbrido. Dados adicionais das linhagens parentais, assim como o fenótipo do híbrido, influenciam na deci- são do cultivador se deve continuar com o cruzamento híbrido específico.

Os métodos de cruzamento de pedigrees e de cruzamento com seleção recorrente podem ser utilizados para desenvolver cultivares partindo de populações de cruzamento. Os programas de cruzamento combinam ca- racterísticas desejáveis de dois ou mais cultivares ou várias fontes de base ampla em conjuntos de cruzamento partindo dos quais os cultivares são de- senvolvidos através do autocruzamento e da seleção dos fenótipos deseja- dos. Novos cultivares podem ser avaliados para determinar quais possuem potencial comercial.

O cruzamento de pedigrees é comumente utilizado para melho- rar as plantas de cultivo de autopolinização. Dois parentais que possuem características complementares favoráveis são cruzados para produzir uma F1. Uma população F2 é produzida através do autocruzamento de uma ou de várias F1's. É realizada a seleção dos melhores indivíduos nas melhores fa- mílias. O teste replicado das famílias pode ser iniciado na geração F4 para aumentar a eficiência de seleção em relação a características com baixa capacidade de herança. Em um estágio avançado de intracruzamento (isto é, F6 e F7), as melhores linhagens ou misturas de linhagens fenotipicamente similares são testadas em relação à liberação potencial como novos cultivares.

A criação por retrocruzamento tem sido utilizada para transferir genes para uma característica que pode ser altamente herdada, simples- mente herdada para um cultivar homozigoto desejável ou linhagem intracru- zada, que é o parental recorrente. A fonte da característica que será transfe- rida é chamada de parental doador. É esperado que a planta resultante te- nha os atributos do parental recorrente (por exemplo, cultivar) e a caracterís- tica desejável transferida do parental doador. Após o cruzamento inicial, os indivíduos que possuem o fenótipo do parental doador são selecionados e cruzados repetidamente (retrocruzados) com o parental recorrente. É espe- rado que o parental resultante possua os atributos do parental recorrente (por exemplo, cultivar) e a característica desejável transferida do parental doador.

O procedimento de descendência de semente isolada no sentido restrito se refere ao plantio de uma população segregante, à colheita de uma amostra de uma semente por planta e à utilização da amostra de uma se- mente em planta na geração seguinte. Quando a população foi levada adian- te da F2 até o nível desejado de intracruzamento, as plantas de cujas linha- gens são derivadas irão cada uma seguir o curso de indivíduos F2 diferentes. O número de plantas em uma população diminui a cada geração devido à falha de algumas sementes de germinar ou de algumas plantas de produzir pelo menos uma semente. Como um resultado, nem todas as plantas F2 ori- ginalmente amostradas na população serão representadas por uma progênie quando o avanço da geração é completado.

Em um procedimento de várias sementes, os plantadores de soja comumente colhem uma ou mais vagens de cada planta em uma popu- lação e as debulham juntas para formar uma massa. Parte da massa é utili- zada para plantar a geração seguinte e parte é colocada em reserva. O pro- cedimento foi referido como técnica de descendência de uma única semente modificada ou de formação de massa de vagens.

O procedimento de várias sementes foi utilizado para diminuir o trabalho na colheita. É consideravelmente mais rápido debulhar as vagens com uma máquina que remover uma semente de cada manualmente para o procedimento com uma única semente. O procedimento de várias sementes torna possível plantar o mesmo número de sementes de uma população a cada geração de intracruzamento.

As descrições de outros métodos de cruzamento que são co- mumente utilizados para características e plantas de cultivo diferentes po- dem ser encontradas em um de vários livros de referência (por exemplo, Fe- hr, Principies of Cultivar Development Vol. 1, pp. 2-3 (1987)).

A presente invenção fornece ainda partes das plantas da pre- sente invenção. As partes das plantas, sem limitação, incluem semente, en- dosperma, óvulo e pólen. Em uma modalidade particularmente preferida da presente invenção, a parte da planta é uma semente.

As plantas ou partes das mesmas da presente invenção podem ser crescidas em cultura e regeneradas. Os métodos para a regeneração de plantas de Glycine max partindo de vários tipos de tecidos e os métodos pa- ra a cultura de tecido de Glycine max são conhecidos na técnica (Vide, por exemplo, Widholm e outros, In Vitro Selection and Culture-induced Variation in Soybean, In Soybean: Genetics, Molecular Biology and Biotechnology, eds. Verma e Shoemaker, CAB International, Wallingford, Oxon, Inglaterra (1996)). As técnicas de regeneração para plantas tal como Glyeine max po- dem utilizar como material de partida uma variedade de tipos de tecidos ou de células. Com Glyeine max, em particular, foram desenvolvidos processos de regeneração que começam com certos tipos de tecidos diferenciados tais como meristemas (Cartha e outros, Can. J. Bot. 59:1671-1679 (1981)), se- ções de hipocotilédone (Cameya e outros, Plant Science Letters 21: 289-294 (1981)) e segmentos de nós de caule (Saka e outros, Plant Science Letters, 19: 193-201 (1980), Cheng e outros, Plant Science Letters, 19: 91-99 (1980)). Foi relatada a regeneração de plantas de Glycine max sexualmente maduras inteiras partindo de embriões somáticos gerados partindo de ex- plantes de embriões imaturos de Glycine max (Ranch e outros, In Vitro Cel- lular & Developmental Biology 21: 653-658 (1985)). Também foi relatada a regeneração de plantas maduras de Glycine max partindo da cultura de teci- do através da organogênese e da embriogênese (Barwale e outros, Planta 167: 473-481 (1986), Wright e outros, Plant Cell Reports 5: 150-154 (1986)).

A presente invenção fornece ainda uma planta de soja resistente a doenças selecionada através da verificação em relação à resistência, à imunidade ou à susceptibilidade a doenças na planta de soja, a seleção compreendendo a apuração dos ácidos nucléicos genômicos em relação à presença de uma molécula marcadora que está ligada geneticamente a um alelo de um QTL associado com resistência a doenças na planta de soja, em que o alelo de um QTL também fica localizado em um grupo de ligação as- sociado com a soja resistente a doenças. A doença pode ser causada por um fungo, um vírus, uma bactéria ou um animal invertebrado. A presente invenção fornece ainda QTL que confere resistência à Ferrugem Asiática da Soja, incluindo o lócus 1 de resistência à ASR, o ló- cus 2 de resistência à ASR, o lócus 3 de resistência à ASR, o lócus 4 de re- sistência à ASR, o lócus 5 de resistência à ASR, o lócus 6 de resistência à ASR, o lócus 7 de resistência à ASR, o lócus 8 de resistência à ASR, o lócus 9 de resistência à ASR, o lócus 10 de resistência à ASR, o lócus 11 de resis- tência à ASR, o lócus 12 de resistência à ASR e o lócus 13 de resistência à ASR. Quatro Ioci dominantes e independentemente herdados para resistên- cia a P. pachyrhizi, denominados aqui como lócus 1 até 4 de resistência à ASR, foram identificados em PI 200492, PI 230970, PI 462312 (Ankur) e PI 459025B, respectivamente. Na presente invenção, o lócus 1 de resistência à ASR foi localizado no grupo de ligação G da soja. Os marcadores de SNP utilizados para monitorar a introgressão do lócus 1 de resistência à ASR são selecionados do grupo que consiste em NS0093250, NS0119710, NS0103004, NS0099454, NS0102630, NS0102915, NS0102913, NS0123728, NS0129943, NS0102168, NS0092723, NS0098177, NS0127343 e NS0101121. As seqüências de DNA do marcador de SNP do lócus 1 de resistência à ASR (apresentadas como as SEQ ID NOs: 67 até 80) podem ser amplificadas utilizando os iniciadores indicados como as SEQ ID NOs: 1 até 28 e detectadas com sondas indicadas como as SEQ ID NOs: 100 até 127. Na presente invenção, o lócus 2 de resistência à ASR fica mais provavelmente localizado no grupo de ligação J, próximo ou dentro do agru- pamento de resistência a doenças contendo resistência à Podridão Parda do Caule, ao Nematóide do cisto da soja e resistência à Mancha Foliar "olho de rã"; ou do grupo de ligação N. Na presente invenção, o lócus 3 de resistên- cia à ASR fica localizado no grupo de ligação C2. Os marcadores de SNP utilizados para monitorar a introgressão do lócus 3 de resistência à ASR são selecionados do grupo que consiste em NS0099746, NS0123747, NS0126598, NS0128378, NS0096829, NS0125408, NS0098902, NS0099529, NS0097798, NS0137477, NS0095322, NS0136101, NS0098982, NS0103749, NS0118897, NS0119715 e NS0130920. Estas seqüências de DNA dos marcadores (apresentadas como as SEQ ID NOs: 81 até 97) podem ser amplificadas utilizando os iniciadores indicados como as SEQ ID NOs: 29 até 62 e detectadas com sondas indicadas como as SEQ ID NOs: 128 até 161. Na presente invenção, o lócus 4 de resistência à ASR fica provavelmente localizado no grupo de ligação N.

A presente invenção fornece ainda haplotipos que conferem re- sistência à ASR que foram identificados em estudos de associação. Estas análises de genoma completo revelaram dois marcadores de SNP associa- dos com a resistência à ASR localizados em duas janelas diferentes no cro- mossomo 13. Na primeira janela de haplotipo, o marcador de SNP utilizado para monitorar a introgressão do lócus 5 de resistência à ASR, do lócus 6 de resistência à ASR, do lócus 7 de resistência à ASR, do lócus 8 de resistência à ASR e do lócus 9 de resistência à ASR é o NS0103033. Estas seqüências de DNA do marcador de SNP (apresentadas como a SEQ ID NO: 98) podem ser amplificadas utilizando os iniciadores indicados como as SEQ ID NOs: 63 e 64 e detectadas com sondas indicadas como as SEQ ID NOs: 162 e 163. Na segunda janela de haplotipo, o marcador de SNP utilizado para mo- nitorar a introgressão do lócus 10 de resistência à ASR, do lócus 11 de resis- tência à ASR, do lócus 12 de resistência à ASR e do lócus 13 de resistência à ASR é o NS0124935. Estas seqüências de DNA do marcador de SNP (a- presentadas como a SEQ ID NO: 99) podem ser amplificadas utilizando os iniciadores indicados como as SEQ ID NOs: 65 e 66 e detectadas com son- das indicadas como as SEQ ID NOs: 164 e 165.

É ainda entendido, que um ou mais marcadores mapeados dentro de 10 centimorgans ou menos das ditas moléculas marcadoras po- dem ser utilizados para a seleção e para a introgressão de loci de resistência à ASR.

É ainda entendido, que a presente invenção fornece células bac- terianas, vírus, microbianas, de insetos, de mamíferos e de plantas que compreendem os agentes da presente invenção.

As moléculas de ácidos nucléicos ou fragmentos das mesmas são capazes de se hibridizar especificamente com outras moléculas de áci- dos nucléicos sob certas circunstâncias. Como utilizado aqui, duas molécu- las de ácidos nucléicos são capazes de se hibridizar especificamente com uma outra se as duas moléculas forem capazes de formar uma estrutura de ácido nucléico de filamento duplo antiparalela. Uma molécula de ácido nu- cléico é o "complemento" de uma outra molécula de ácido nucléico se exibi- rem complementaridade completa. Como utilizado aqui, as moléculas exi- bem "complementaridade completa" quando cada nucleotídeo de uma das moléculas for complementar a um nucleotídeo da outra. Duas moléculas são "minimamente complementares" se puderem se hibridizar com uma outra com estabilidade suficiente para permitir que permanecem aneladas com a outra sob pelo menos condições de "baixa estringência" convencionais. Si- milarmente, as moléculas são "complementares" se puderem se hibridizar com uma outra com estabilidade suficiente para permitir que permaneçam aneladas uma com a outra sob condições de "alta estrigência" convencio- nais. As condições de estringência convencionais são descritas por Sambro- ok e outros, Em: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2- Edição, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, Nova York (1989) e por Haymes e outros, Em: Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approaeh, IRL Press, Washington, DC (1985). Desvios da complementaridade são, portanto, per- mitidos, contanto que tais desvios não impossibilitem completamente a ca- pacidade das moléculas de formar uma estrutura de filamento duplo. Para uma molécula de ácido nucléico servir como um iniciador ou uma sonda esta precisa apenas ser suficientemente complementar em relação à seqüência para ser capaz de formar uma estrutura de filamento duplo estável sob as concentrações de solventes e de sais particulares empregadas.

Como utilizado aqui, uma seqüência substancialmente homóloga é uma seqüência de ácido nucléico que irá se hibridizar especificamente ao complemento da seqüência de ácido nucléico à qual está sendo comparada sob condições de alta estringência. As sondas e os iniciadores de ácidos nucléicos da presente invenção podem ser hibridizar sob condições estrin- gentes com uma seqüência de DNA alvo. O termo "condições de hibridiza- ção estringentes" é definido como as condições sob as quais uma sonda ou um iniciador se hibridiza especificamente com uma ou mais seqüências al- vos e não com seqüências que não são alvos, que pode ser determinado de forma empírica. O termo "condições estringentes" é definido de forma fun- cional em relação à hibridização de uma sonda de ácido nucléico com um ácido nucléico alvo (isto é, com uma seqüência de ácido nucléico particular de interesse) através do procedimento de hibridização específico discutido em Sambrook e outros, 1989, em 9.52-9.55. Vide também, Sambrook e ou- tros, (1989) em 9.47-9.52, 9.56-9.58, Kanehisa Nucl. Acids Res. 12:203-213, (1984) e Wetmur e outros, J. Mol. Biol. 31:349-370 (1968). As condições de estringência apropriadas que promovem a hibridização do DNA são, por e- xemplo, 6,0 χ cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) a aproximadamente 45°C, seguido por uma lavagem de 2,0 χ SSC a 50°C e são conhecidas pe- los versados na técnica ou podem ser encontradas em Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y., 1989, 6.3.1-6.3.6. Por exemplo, a concentração de sais na etapa de lavagem pode ser selecionada de uma estringência baixa de aproximadamente 2,0 χ SSC a 50°C até uma estrin- gência alta de aproximadamente 0,2 χ SSC a 50°C. Em adição, a temperatu- ra na etapa de lavagem pode ser aumentada desde condições de baixa es- tringência à temperatura ambiente, aproximadamente 22°C, até condições de alta estringência a aproximadamente 65°C. Tanto a temperatura quanto o sal podem ser variados ou a temperatura ou a concentração de sal pode ser mantida constante enquanto que a outra variável é alterada.

Por exemplo, a hibridização utilizando sondas ou iniciadores de DNA ou de RNA pode ser realizada a 65°C em 6x SSC, 0,5% de SDS, 5x Denhardfs, 100 μg/mL de DNA não específico (por exemplo, DNA de es- perma de salmão submetido a ultrassom) com lavagem em 0,5x SSC, 0,5% de SDS a 65°C, para alta estringência.

É considerado que as condições de hibridização de estringência inferior tais como temperaturas de hibridização e/ou de lavagem menores podem ser utilizadas para identificar seqüências relacionadas que possuem um grau menor de similaridade de seqüência se a especificidade de ligação da sonda ou do iniciador com a(s) sequência(s) alvo(s) for preservada. Con- sequentemente, as seqüências de nucleotídeos da presente invenção po- dem ser utilizadas por sua capacidade de formar seletivamente moléculas em duplex com filamentos complementares de DNA, RNA ou fragmentos de cDNA. A detecção de segmentos de DNA através de hibridização é bem- conhecida pelos versados na técnica e dependendo assim da aplicação i- maginada, pode ser desejado empregar condições de hibridização variáveis para atingir graus variáveis de seletividade de sonda em direção à seqüência alvo e o método de escolha dependerá dos resultados desejados.

Como utilizado aqui, um agente, seja este uma molécula que ocorre naturalmente ou de outra maneira podendo ser uma "substancialmen- te purificada", se desejado, se referindo a uma molécula separada substan- cialmente de todas as outras moléculas normalmente associadas com a mesma em seu estado nativo. Mais preferencialmente uma molécula subs- tancialmente purificada é a espécie predominante presente em uma prepa- ração. Uma molécula substancialmente purificada pode ser mais que 60% livre, preferencialmente 75% livre, mais preferencialmente 90% livre e mais preferencialmente 95% livre das outras moléculas (sem incluir o solvente) presentes na mistura natural. Não é pretendido que o termo "substancial- mente purificadas" abranja moléculas presentes em seu estado nativo.

Os agentes da presente invenção serão preferencialmente "bio- Iogicamente ativos" em relação a um atributo estrutural, tal como a capaci- dade de um ácido nucléico de se hibridizar com uma outra molécula de áci- do nucléico ou a capacidade de uma proteína de se ligar através de um anti- corpo (ou de competir com uma outra molécula por tal ligação). Alternativa- mente, tal atributo pode ser catalítico e envolver assim a capacidade do a- gente de mediar uma reação ou uma resposta química.

Os agentes da presente invenção podem também ser recombi- nantes. Como utilizado aqui, o termo recombinante significa qualquer a- gente (por exemplo, DNA, peptídeo etc.), que é ou resulta, entretanto, indire- tamente, da manipulação humana de uma molécula de ácido nucléico.

Os agentes da presente invenção podem ser marcados com re- agentes que facilitam a detecção do agente (por exemplo, marcações fluo- rescentes (Prober e outros, Science 238:336-340 (1987), Patente Européia 144914), marcações químicas (Patente U.S. N- 4.582.789, Patente U.S. N° 4.563.417), bases modificadas (Patente Européia 119448), das quais todas são incorporadas aqui como referência em sua totalidade).

Em uma modalidade preferida, um ácido nucléico da presente invenção irá especificamente se hibridizar com uma ou mais das moléculas de ácidos nucléicos apresentadas nas SEQ ID NO: 67 até SEQ ID NO: 99 ou complementos das mesmas ou fragmentos de qualquer uma destas sob con- dições moderadamente estringentes, por exemplo, em aproximadamente 2,0 χ SSC e aproximadamente 65°C. Em uma modalidade particularmente prefe- rida, um ácido nucléico da presente invenção irá especificamente se hibridi- zar com uma ou mais das moléculas de ácidos nucléicos apresentadas nas SEQ ID NO: 67 até SEQ ID NO: 99 ou complementos ou fragmentos de qualquer uma destas sob condições de alta estringência. Em um aspecto da presente invenção, uma molécula de ácido nucléico marcadora da presente invenção possui a seqüência de ácido nucléico apresentada nas SEQ ID NO: 67 até SEQ ID NO: 99 ou complementos das mesmas ou fragmentos de qualquer uma destas. Em um outro aspecto da presente invenção, uma mo- lécula de ácido nucléico marcadora preferida da presente invenção comparti- lha entre 80% e 100% ou 90% e 100% de identidade de seqüência com a seqüência de ácido nucléico apresentada nas SEQ ID NO: 67 até SEQ ID NO: 99 ou complemento das mesmas ou fragmentos de qualquer uma des- tas. Em um aspecto adicional da presente invenção, uma molécula de ácido nucléico marcadora preferida da presente invenção compartilha entre 95% e 100% de identidade de seqüência com a seqüência apresentada nas SEQ ID NO: 67 até SEQ ID NO: 99 ou complemento das mesmas ou fragmentos de qualquer uma destas. Em um aspecto mais preferido da presente inven- ção, uma molécula de ácido nucléico marcadora preferida da presente in- venção compartilha entre 98% e 100% de identidade de seqüência com a seqüência de ácido nucléico apresentada nas SEQ ID NO: 67 até SEQ ID NO: 99 ou complemento das mesmas ou fragmentos de qualquer uma destas.

Marcadores genéticos adicionais podem ser utilizados para sele- cionar plantas com um alelo de um QTL associado com resistência a doen- ças fúngicas da soja da presente invenção. Os exemplos de bancos de da- dos de marcadores públicos incluem, por exemplo: Soybase, um Agricultural Research Service, United States DepartmentofAgricuIture.

Os marcadores genéticos da presente invenção incluem marca- dores "dominantes" ou "co-dominantes". Os marcadores "co-dominantes" revelam a presença de dois ou mais alelos (dois por indivíduo haplóide). Os "marcadores dominantes" revelam a presença de apenas um único alelo. A presença do fenótipo de marcador dominante (por exemplo, uma banda de DNA) é uma indicação de que um alelo está presente na condição homozi- gota ou heterozigota. A ausência do fenótipo de marcador dominante (por exemplo, ausência de uma banda de DNA) é meramente uma evidência de que "algum outro" alelo indefinido está presente. No caso de populações em que os indivíduos são predominantemente homozigotos e os loci são pre- dominantemente dimórficos, os marcadores dominantes e co-dominantes podem ser igualmente valiosos. À medida que as populações se tornam mais heterozigotas e multialélicas, os marcadores co-dominantes se tornam freqüentemente mais informativos do genótipo que os marcadores dominantes.

Os marcadores, tais como marcadores de repetições de se- qüências simples (SSR), marcadores de AFLP, marcadores de RFLP, mar- cadores de RAPD, marcadores fenotípicos, SNPs1 marcadores de isozimas, perfis de transcrição em microarranjo que estão ligados ou relacionados ge- neticamente aos alelos de um QTL da presente invenção podem ser utiliza- dos (Walton, Seed World 22-29 (Julho, 1993), Burow e outros, Molecular Dissection of Complex Traits, 13-29, ed. Paterson, CRC Press, Nova York (1988)). Os métodos para isolar tais marcadores são conhecidos na técnica. Por exemplo, os marcadores de SSR específicos ao lócus podem ser obti- dos através da verificação de uma biblioteca genômica em relação a repeti- ções de microssatélites, seqüenciando os clones "positivos", planejando os iniciadores que flanqueiam as repetições e amplificando o DNA genômico com estes iniciadores. O tamanho dos produtos da amplificação resultantes pode variar em números inteiros das unidades de repetição de bases. Para detectar um polimorfismo, os produtos da PCR podem ser marcados radia- tivamente, separados em géis de poliacrilamida desnaturantes e detectados através de autorradiografia. Os fragmentos com diferenças de tamanho >4 pb podem também ser resolvidos em géis de agarose, evitando assim a ra- dioatividade.

A detecção de sítios polimórficos em uma amostra de DNA, RNA ou cDNA pode ser facilitada através do uso de métodos de amplificação de ácidos nucléicos. Tais métodos aumentam especificamente a concentração de polinucleotídeos que possuem o sítio polimórfico ou que incluem tal sítio e seqüências localizadas de forma distai ou proximal ao mesmo. Tais molécu- las amplificadas podem ser facilmente detectadas por eletroforese em gel ou através de outros meios.

O método mais preferido de conseguir tal amplificação emprega a reação em cadeia da polimerase (PCR) (Mullis e outros, Cold Spring Har- bor Symp. Quant. Biol. 51:263-273 (1986), Pedido de Patente Européia 50.424, Patente Européia 84.796, Patente Européia 258.017, Patente Euro- péia 237.362, Patente Européia 201.184, Patente U.S. N2 4.683.202, Paten- te U.S. N2 4.582.788, Patente U.S. N2 4.683.194), utilizando pares de inicia- dores que são capazes de se hibridizar com as seqüências proximais que definem um polimorfismo em sua forma de filamento duplo.

No lugar da PCR, métodos alternativos, tal como a "Reação em Cadeia da Ligase" (LCR) pode ser utilizada (Barany, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:189-193 (1991), cuja totalidade é incorporada aqui como refe- rência). A LCR utiliza dois pares de sondas de oligonucleotídeo para amplifi- car de forma exponencial um alvo específico. A seqüência de cada par de oligonucleotídeos é selecionada para permitir que o par se hibridize com as seqüências adjacentes do mesmo filamento do alvo. Tal hibridização forma um substrato para uma ligase dependente do molde. Como com a PCR, os produtos resultantes servem assim como um molde nos ciclos subsequentes e uma amplificação exponencial da seqüência desejada é obtida.

O "Ensaio de Ligação de Oligonucleotídeos" (OLA) pode ser al- ternativamente empregado (Landegren e outros, Science 241:1077-1080 (1988), cuja totalidade é incorporada aqui como referência). O protocolo de OLA utiliza dois oligonucleotídeos que são planejados para serem capazes de se hibridizar com seqüências adjacentes de um filamento simples de um alvo. O OLA, como a LCR, é particularmente adequado para a detecção de mutações pontuais. Ao contrário da LCR, entretanto, o OLA resulta na ampli- ficação "linear" ao invés de exponencial da seqüência alvo.

Os esquemas baseados na ligação de dois (ou mais) oligonucle- otídeos na presença de um ácido nucléico que possui a seqüência do "dioli- gonucleotídeo" resultante, amplificando assim o dioligonucleotídeo, são tam- bém conhecidos (Wu e outros, Genomics 4:560-569 (1989), cuja totalidade é incorporada aqui como referência) e podem ser facilmente adaptados às fi- nalidades da presente invenção.

Outros procedimentos de amplificação de ácidos nucléicos co- nhecidos, tais como oligômeros específicos a alelos, tecnologia de DNA ra- mificado, sistemas de amplificação baseados na transcrição ou métodos de amplificação isotérmicos também podem ser utilizados para amplificar e ana- lisar tais polimorfismos (Patente U.S. N5 5.130.238, Patente Européia 329.822, Patente U.S. N2 5.169.766, Patente Européia 359.789, Kwoh e ou- tros, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:1173-1177 (1989) Patente Européia 368.906, Walker e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 89:392-396 (1992), dos quais todos são incorporados aqui como referência em sua totalidade).

Os polimorfismos também podem ser identificados através da análise de Polimorfismo de Conformação de Filamento Simples (SSCP). O SSCP é um método capaz de identificar a maior parte das variações de se- qüências em um filamento simples de DNA, tipicamente entre 150 e 250 nu- cleotídeos de comprimento (Elles, Methods in Molecular Medicine: Molecular Diagnosis of Genetic Diseases, Humana Press (1996); Orita e outros, Ge- nomies 5: 874-879 (1989)). Sob condições de desnaturação um filamento simples de DNA adotará uma conformação que é exclusivamente dependen- te de sua conformação de seqüência. Esta conformação será geralmente diferente, mesmo se apenas uma única base for alterada. Foi relatado que a maior parte das conformações altera a configuração física ou o tamanho su- ficientemente para ser detectável através de eletroforese.

Um atributo central dos SNPs é que o sítio do polimorfismo ocor- re em um único nucleotídeo. Os SNPs são mais estáveis que outras classes de polimorfismos. Sua taxa de mutação espontânea é de aproximadamente 10-9 (Kornberg, DNA Replication, W. H. Freeman & Co., San Francisco (1980)). Uma vez que os SNPs resultam de variação de seqüências, novos polimorfismos podem ser identificados através do sequenciamento de molé- culas genômicas aleatórias ou de cDNA. Os SNPs também podem resultar de deleções, mutações pontuais e inserções. Dito isso, os SNPs também são vantajosos como marcadores uma vez que são freqüentemente diagnós- ticos de "identidade por descendência" porque raramente surgem de origens independentes. Qualquer alteração de bases isoladas, seja qual for a causa, pode ser um SNP. Os SNPs ocorrem em uma freqüência maior que outras classes de polimorfismos e podem ser mais facilmente identificados. Na pre- sente invenção, um SNP pode representar um evento "indel" isolado, que pode consistir em um ou mais pares de bases ou de um polimorfismo de um único nucleotídeo.

Os SNPs podem ser caracterizados utilizando qualquer um de uma variedade de métodos. Tais métodos incluem o sequenciamento direto ou indireto do sítio, o uso de enzimas de restrição em que os respectivos alelos do sítio criam ou destroem um sítio de restrição, o uso de sondas de hibridização específicas ao alelo, o uso de anticorpos que são específicos para as proteínas codificadas pelos alelos diferentes do polimorfismo ou a- través de outra interpretação bioquímica. Os SNPs podem ser sequenciados utilizando uma variação do método de término de cadeia (Sanger e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 74: 5463-5467 (1977)) em que o uso de radio- isótopos é substituído por nucleotídeos didesóxi marcados de forma fluores- cente e submetidos ao sequenciamento automatizado baseado em capilari- dade (Patente U.S. N- 5.332.666, cuja totalidade é incorporada aqui como referência; Patente U.S. N- 5.821.058, cuja totalidade é incorporada aqui como referência). Os seqüenciadores automáticos estão disponíveis, por exemplo, na Applied Biosystems, Foster City, CA (3730x1 DNA Analyzer), Beckman Coulter, Fullerton, CA (CEQ™ 8000 Genetic Analysis System) e LI-COR, Inc., Lincoln, NE (4300 DNAAnaIysis System).

As abordagens para a analise dos SNPs podem ser categoriza- das em dois grupos. O primeiro grupo se baseia nos ensaios de extensão de iniciadores, tal como o minissequenciamento em fase sólida ou o pirosse- quenciamento. No método de minissequenciamento em fase sólida, uma DNA polimerase é utilizada especificamente para estender um iniciador que se anela imediatamente adjacente ao nucleotídeo variante. Um trifosfato de nucleosídeo marcado isolado complementar ao nucleotídeo no sítio variante é utilizado na reação de extensão. Apenas as seqüências que contêm o nu- cleotídeo no sítio variante serão estendidas pela polimerase. Um arranjo de iniciadores pode ser fixado em um suporte sólido em que cada iniciador é contido em quatro poços pequenos, cada poço sendo utilizado para um dos quatro trifosfatos de nucleosídeo presentes no DNA. O DNA ou o RNA mol- de de cada organismo de teste é colocado dentro de cada poço e é permiti- do que se anele com o iniciador. O iniciador é então estendido um nucleotí- deo utilizando uma polimerase e um trifosfato de nucleotídeo didesóxi mar- cado. A reação completada pode ter a imagem formada utilizando dispositi- vos que são capazes de detectar a marcação que pode ser radioativa ou fluorescente. Através da utilização deste método vários SNPs diferentes po- dem ser visualizados e detectados (Syvãnen e outros, Hum. Mutat. 13: 1-10 (1999)). A técnica de pirossequenciamento se baseia em um ensaio biolu- minométrico indireto do pirofosfato (PPi) que é liberado de cada dNTP após o alongamento da cadeia de DNA. Após a incorporação de bases mediada pela polimerase de Klenow, o PPi é liberado e utilizado como um substrato, junto com 5-fosfossulfato de adenosina (APS), para ATP sulfurilase, que re- sulta na formação de ATP. Subseqüentemente, o ATP realiza a conversão da luciferina em seu derivado óxi através da reação da luciferase. A produ- ção de luz subsequente se torna proporcional ao número de bases adiciona- das, até aproximadamente quatro bases. Para permitir a processividade do método o excesso de dNTP é degradado pela apirase, que também está presente na mistura de reação de partida, de forma que apenas os dNTPs são adicionados ao molde durante o procedimento de sequenciamento (Al- derborn e outros, Genome Res. 10: 1249-1258 (2000)). Um exemplo de um instrumento projetado para detectar e interpretar a reação de pirossequenci- amento está disponível na Biotage, Charlottesville, VA (PyroMark MD).

Um método de detecção de SNPs mais recente, baseado em ensaios de extensão de iniciadores é o ensaio GOOD. O ensaio GOOD (Sauer e outros, Nucleic Acids Res. 28: e100 (2000)) é um protocolo de ex- tensão de iniciadores específicos ao alelo que emprega espectrometria de massa de MALDI-TOF (tempo de vôo de dessorção/ionização a laser auxili- ada por matriz). A região de DNA que contém um SNP é amplificada primei- ro através da amplificação pela PCR. Os dNTPs residuais são destruídos utilizando uma fosfatase alcalina. Os produtos específicos ao alelo são então gerados utilizando um iniciador específico, um conjunto condicionado de a- S-dNTPs e a-S-ddNTPs e uma DNA polimerase fresca em uma reação de extensão de iniciadores. O DNA não modificado é removido através da di- gestão com 5'fosfodiesterase e os produtos modificados são alquilados para aumentar a sensibilidade de detecção na análise espectrométrica de massa. Todas as etapas são realizadas em um único frasco no menor volume de amostra praticável e não requerem purificação. A reação estendida pode receber uma carga positiva ou negativa e é detectada utilizando espectrome- tria de massa (Sauer e outros, Nucleic Acids Res. 28: e13 (2000)). Um ins- trumento em que o ensaio GOOD é analisado é, por exemplo, o sistema au- toflex® MALDI-TOF da Bruker Daltonics (Billerica, MA).

O segundo grupo, que se baseia no reconhecimento de molécu- las de DNA em heteroduplex, inclui a hibridização de oligonucleotídeos, en- saios com Taq-Man, beacons moleculares, ensaios de dot blot eletrônicos e cromatografia líquida de alto desempenho desnaturante. As hibridizações de oligonucleotídeos podem ser realizadas em massa utilizando microarranjos (Southern, Trends Genet. 12: 110-115 (1996)). Os ensaios com Taq-Man ® ou Real Time PCR (PCR em Tempo Real), detecta o acúmulo de um produto da PCR específico através da hibridização e da clivagem de uma sonda fluo- rogênica marcada duplamente durante a reação de amplificação. Um ensaio com Taq-Man inclui quatro oligonucleotídeos, dos quais dois servem como iniciadores da PCR e geram um produto da PCR que abrange o polimorfis- mo que será detectado. Os outros dois são sondas de transferência de e- nergia de ressonância de fluorescência específicas ao alelo (FRET). As son- das de FRET incorporam um fluoróforo e uma molécula de extinção em pro- ximidade íntima de forma que a fluorescência do fluoróforo é extinguida. O sinal das sondas de FRET é gerado através da degradação do oligonucleo- tídeo de FRET, de forma que o fluoróforo é liberado da proximidade para o agente de extinção e é assim capaz de emitir luz quando excitado em um comprimento de onda apropriado. No ensaio, são utilizadas duas sondas de FRET que carregam corantes repórteres fluorescentes diferentes, em que um corante exclusivo é incorporado em um oligonucleotídeo que pode se anelar com alta especificidade a apenas um dos dois alelos. Os corantes repórteres úteis incluem 6-carbóxi-4,7,2',7'-tetraclorofluoresceína (ΤΕΤ), 2'- cloro-7'-fenil-1.4-dicloro-6-carboxifluoresceína (VIC) e 6-carboxifluoresceína fosforamidita (FAM). Um agente de extinção útil é 6-carbóxi-N,N,N',N'- tetrametilrodamina (ΤΑΜRA). As sondas de FRET aneladas (mas não as não aneladas) são degradadas pela TAQ DNA polimerase uma vez que a enzima encontra a extremidade a 5' da sonda anelada, liberando assim o fluoróforo da proximidade de seu agente de extinção. Após a reação da P- CR1 a fluorescência de cada um dos dois agentes de fluorescência, assim como a da referência passiva, é determinada de forma fluorométrica. A in- tensidade normalizada da fluorescência para cada um dos dois corantes se- rá proporcional às quantidades de cada alelo inicialmente presente na amos- tra e assim o genótipo da amostra pode ser inferido. Um exemplo de um ins- trumento utilizado para detectar o sinal de fluorescência nos ensaios com Taq-Man® ou na Real Time PCR são o 7500 Real-Time PCR System (Appli- ed Biosystems, Foster City, CA).

Os sinalizadores moleculares ("molecular beacons") são sondas de oligonucleotídeo que formam uma estrutura de haste-e-alça e possuem um fluoróforo que é extinto internamente. Quando se ligam aos alvos com- plementares, sofrem uma transição conformacional que ativa sua fluores- cência. Estas sondas reconhecem seus alvos com maior especificidade que as sondas lineares e podem discriminar facilmente alvos que diferem um do outro em um único nucleotídeo. A porção de alça da molécula serve como uma seqüência de sonda que é complementar a um ácido nucléico alvo. A haste é formada através do anelamento das duas seqüências do braço com- plementares que estão em ambos os lados da seqüência da sonda. Um gru- pamento fluorescente fica ligado na extremidade de um braço e um grupa- mento de extinção não-fluorescente fica ligado na extremidade do outro bra- ço. O híbrido da haste mantém o fluoróforo e o agente de extinção tão pró- ximos um do outro de forma que a fluorescência não ocorre. Quando o bea- con molecular encontra uma seqüência alvo, forma um híbrido sonda-alvo que é mais forte e mais estável que o híbrido da haste. A sonda sofre reor- ganização conformacional espontânea que força a separação das sequên- cias dos braços, separando o fluoróforo do agente de extinção e permitindo que o fluoróforo sofra fluorescência (Bonnet e outros, 1999). O poder dos beacons moleculares se baseia em sua capacidade de se hibridizar apenas com seqüências alvo que são perfeitamente complementares com a se- qüência da sonda, permitindo assim a detecção de diferenças de uma única base (Kota e outros, Plant Mol. Biol. Rep. 17: 363-370 (1999)). A detecção com beacons moleculares pode ser realizada, por exemplo, no Mx4000® Multiplex Quantitative PCR System da Stratagene (La Jolla, CA).

O ensaio de dot blot eletrônico utiliza um microchip semicondutor compreendido de um arranjo de microeletrodos coberto por uma camada de permeação de agarose contendo estreptavidina. Os amplicons biotinilados são aplicados no chip e submetidos à eletroforese em blocos selecionados através de corrente direta com polarização positiva, em que permanecem fixados através da interação com a estreptavidina na camada de permeação. O DNA em cada bloco é então hibridizado com misturas de oligonucleotí- deos específicos ao alelo marcados de forma fluorescente. Sondas com pa- reamento errado de um único par de bases podem então ser preferencial- mente desnaturadas através da inversão da polaridade da carga nos blocos individuais com amperagem crescente. É obtida uma imagem do arranjo uti- lizando uma câmera digital e a fluorescência é quantificada à medida que a amperagem é aumentada até o final. A intensidade de fluorescência é então determinada através da média dos valores da contagem de pixels sobre uma região de interesse (Gilles e outros, Nature Biotech. 17: 365-370 (1999)).

Uma aplicação mais recente baseada no reconhecimento de moléculas de DNA em heteroduplex utiliza cromatografia líquida de alto de- sempenho desnaturante (DHPLC). Esta técnica representa um ensaio alta- mente sensível e completamente automatizado que incorpora um autoamos- trador de 96 poços resfriado Peltier para a análise de SNP de alto rendimen- to. Se baseia em um método de cromatografia líquida de alto desempenho em fase inversa com par iônico. A parte central do ensaio é um co-polímero de poliestireno-divinilbenzeno, que funciona como uma fase estacionária. A fase móvel é composta de um agente de pareamento iônico, tampão de ace- tato de trietilamônio (TEAA), que medeia a ligação do DNA com a fase esta- cionária e um agente orgânico, acetonitrila (ACN), para atingir a separação subsequente do DNA da coluna. Um gradiente linear de CAN permite a se- paração de fragmentos com base na presença de heteroduplexes. A DHPLC identifica assim mutações e polimorfismos que causam a formação de hete- roduplexes entre nucleotídeos com pareamento errado no DNA amplificado pela PCR de filamento duplo. Em um ensaio típico, a variação de seqüência cria uma população mista de heteroduplexes e homoduplexes durante o re- anelamento de DNA do tipo selvagem e mutante. Quando esta população mista é analisada por DHPLC sob temperaturas parcialmente desnaturantes, as moléculas de heteroduplex são eluídas da coluna antes das moléculas de homoduplex, devido às suas temperaturas de fusão reduzidas (Kota e ou- tros, Genome 44: 523-528 (2001)). Um exemplo de um instrumento utilizado para analisar os SNPs através da DHPLC é o WAVE® HS System da Trans- genomic, Inc. (Omaha, NE).

Um método baseado em microarranjo para o monitoramento de alto rendimento da expressão gênica de plantas pode ser utilizado como um sistema de marcador genético. Esta abordagem baseada em 'chip' envolve a utilização de microarranjos de moléculas de ácidos nucléicos como alvos de hibridização específica ao gene para medir quantitativamente ou qualitativa- mente a expressão de genes de plantas (Schena e outros, Science 270:467- 470 (1995), cuja totalidade é incorporada aqui como referência; Shalon, Te- se de Ph.D. Stanford University (1996), cuja totalidade é incorporada aqui como referência). Cada nucleotídeo em uma seqüência grande pode ser pesquisado ao mesmo tempo. A hibridização pode ser utilizada para analisar eficientemente as seqüências de nucleotídeos. Tais microarranjos podem ser submetidos a sondas com qualquer combinação de moléculas de ácidos nucléicos. As combinações particularmente preferidas de moléculas de áci- dos nucléicos que serão utilizadas como sondas incluem uma população de moléculas de mRNA de um tipo de tecido conhecido ou de um estágio do desenvolvimento conhecido ou de uma planta submetida a um estresse co- nhecido (ambiental ou produzido pelo ser humano) ou qualquer combinação das mesmas (por exemplo, mRNA produzido por folhas estressadas com água no estágio de 2 folhas). Os perfis de expressão gerados através deste método podem ser utilizados como marcadores.

Para a finalidade de mapeamento do QTL, os marcadores inclu- ídos têm que ter origem de diagnóstico para que sejam feitas inferências em relação às populações subsequentes. Os marcadores de SNP são ideais para o mapeamento porque a probabilidade de que um alelo de SNP particu- lar é derivado de origens diferentes nas populações existentes de uma es- pécie particular é muito baixa. Como tal, os marcadores de SNP são úteis para rastrear e auxiliar a introgressão dos QTLs, particularmente no caso de haplotipos.

A ligação genética de moléculas marcadoras adicionais pode ser estabelecida através de um modelo de mapeamento gênico tal como, sem limitação, o modelo de marcador flanqueador relatado por Lander e Botstein, Genetics, 121:185-199 (1989) e o mapeamento de intervalos, baseado nos métodos de probabilidade máxima descritos por Lander e Botstein, Genetics, 121:185-199 (1989) e implementados no pacote de software MAPMA- KER/QTL (Lincoln e Lander, Mapping Genes Controlling Quantitative Traits Using MAPMAKER/QTL, Whitehead Institute for Biomedical Research, Mas- sachusetts, (1990). Um software adicional inclui Qgene, Versão 2.23 (1996), Department of Plant Breeding and Biometry, 266 Emerson Hall, Cornell Uni- versity, lthaca, NY, cujo manual é incorporado aqui como referência em sua totalidade). O uso do software Qgene é uma abordagem particularmente pre- ferida.

Uma estimativa de probabilidade máxima (MLE) em relação à presença de um marcador é calculada, junto com uma MLE assumindo ne- nhum efeito do QTL, para evitar falsos positivos. Um log10 de uma razão de chances (LOD) é então calculado como: LOD = Iogi0 (MLE em relação à pre- sença de um QTL/MLE não fornecido qualquer QTL ligado). O escore de LOD indica essencialmente o quanto é mais provável que os dados tenham aumentado assumindo a presença de um QTL versus em sua ausência. O valor limite de LOD para evitar um falso positivo com uma certa confiança, digamos 95%, depende do número de marcadores e do comprimento do ge- noma. Os gráficos indicando os limites de LOD são apresentados em Lander e Botstein, Genetics, "/21185-199 (1989) e são descritos adicionalmente por Arús e Moreno-González, Plant Breeding, Hayward, Bosemark, Romagosa (eds.) Chapman & Hall, Londres, pp. 314-331 (1993).

Podem ser utilizados modelos adicionais. Muitas modificações e abordagens alternativas para o mapeamento de intervalos foram relatadas, incluindo o uso de métodos não-paramétricos (Kruglyak e Lander, Genetics, 739:1421-1428 (1995), cuja totalidade é incorporada aqui como referência). Podem também ser utilizados vários métodos ou modelos de regressão, em que a característica sofre regressão em um grande número de marcadores (Jansen, Biometrics in Plant Breed, van Oijen, Jansen (eds.) Proceedings of the Ninth Meeting of the Eucarpia Section Biometrics in Plant Breeding, The Netherlands, pp. 116-124 (1994); Weber e Wricke1 Advances in Plant Breed- ing, Blackwell, Berlim, 16 (1994)). Os procedimentos que combinam o ma- peamento de intervalos com a análise de regressão, através dos quais o fe- nótipo sofre regressão em um único suposto QTL em um certo intervalo de marcadores e ao mesmo tempo em um número de marcadores que servem como 'co-fatores', foram relatados por Jansen e Stam, Genetics, 736:1447- 1455 (1994) e Zeng, Genetics, 736:1457-1468 (1994). Geralmente, o uso de co-fatores reduz a tendência e o erro de amostragem das posições estima- das dos QTLs (Utz e Melchinger1 Biometrics in Plant Breeding, van Oijen, Jansen (eds.) Proceedings of the Ninth Meeting of the Eucarpia Section Biometries in Plant Breeding, The Netherlands, pp. 195-204 (1994), aumen- tando assim a precisão e a eficiência do mapeamento dos QTLs (Zeng, Ge- netics, 736:1457-1468 (1994)). Estes modelos podem ser estendidos para experimentos de vários ambientes para analisar as interações genótipo- ambiente (Jansen e outros, Theo. Appl. Genet. 97:33-37 (1995);

A seleção de populações de mapeamento apropriadas é impor- tante para a construção de mapas. A escolha de uma população de mapea- mento apropriada depende do tipo de sistemas de marcadores empregados (Tanksley e outros, Molecular mapping of plant chromosomes. chromosome structure and function: Impact of new concepts J.P. Gustafson e R. Appels (eds.). Plenum Press, Nova York, pp. 157-173 (1988), cuja totalidade é in- corporada aqui como referência). Deve-se considerar a fonte dos parentais (adaptados vs. exóticos) utilizados na população de mapeamento. O parea- mento de cromossomos e as taxas de recombinação podem ser gravemente perturbados (suprimidos) em cruzamentos amplos (adaptados χ exóticos) e geralmente produzem distâncias de ligação enormemente reduzidas. Cru- zamentos amplos fornecerão geralmente populações segregantes com um arranjo relativamente grande de polimorfismos quando comparados com a progênie em um cruzamento estreito (adaptados χ adaptados).

Uma população F2 é a primeira geração de autocruzamento a- pós a semente híbrida ser produzida. Geralmente uma planta F1 isolada é autocruzada para gerar uma população que segrega todos os genes de for- ma Mendeliana (1:2:1). A informação genética máxima é obtida partindo de uma população F2 completamente classificada utilizando um sistema de marcadores co-dominantes (Mather, Measurement of Linkage in Heredity: Methuen e Co., (1938), cuja totalidade é incorporada aqui como referência). No caso de marcadores dominantes, são necessários testes de progênie (por exemplo, F3, BCF2) para identificar os heterozigotos, tornando assim equivalentes a uma população F2 completamente classificada. Entretanto, este procedimento é freqüentemente proibitivo devido ao custo e ao tempo envolvidos no teste de progênie. O teste de progênie de indivíduos da F2 é freqüentemente utilizado na construção de mapas em que os fenótipos não refletem de forma coerente o genótipo (por exemplo, resistência a doenças) ou em que a expressão de características é controlada por um QTL. Os da- dos de segregação provenientes das populações de testes de progênie (por exemplo, F3 ou BCF2) podem ser utilizados na construção de mapas. A sele- 1ção auxiliada por marcadores pode ser então aplicada à progênie cruzada com base nas associações de mapas de marcador-característica (F2, F3), em que os grupos de ligação não foram completamente desassociados pe- los eventos de recombinação (isto é, desequilíbrio máximo).

As linhagens intracruzadas recombinantes (RIL) (linhagens relacionadas geneticamente; geralmente >F5, desenvolvidas partindo de li- nhagens F2 autocruzadas continuamente em direção a homozigosidade) po- dem ser utilizadas como uma população de mapeamento. A informação ob- tida dos marcadores dominantes pode ser maximizada através da utilização de RIL porque todos os loci são homozigotos ou quase. Sob condições de ligação forte (isto é, aproximadamente <10% de recombinação), marcadores dominantes e co-dominantes avaliados nas populações de RIL fornecem mais informação por indivíduo que qualquer tipo de marcador em popula- ções de retrocruzamento (Reiter e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 89:1477-1481 (1992)). Entretanto, à medida que a distância entre os marca- dores fica maior (isto é, os Ioci ficam mais independentes), a informação nas populações de RIL diminui drasticamente quando comparadas com a de marcadores co-dominantes.

As populações de retrocruzamento (por exemplo, geradas de um cruzamento entre uma variedade bem-sucedida (parental recorrente) e uma outra variedade (parental doador) carregando uma característica ausente no primeiro) podem ser utilizadas como uma população de mapeamento. Uma série de retrocruzamentos com o parental recorrente pode ser feita para re- cuperar a maior parte de suas características desejáveis. Assim, é criada uma população que consiste em indivíduos quase similares ao parental re- corrente, mas cada indivíduo carrega quantidades variáveis ou um mosaico de regiões genômicas do parental doador. As populações de retrocruzamen- to podem ser úteis para mapear marcadores dominantes se todos os Ioci no parental recorrente forem homozigotos e os parentais doadores e recorren- tes tiverem alelos marcadores polimórficos contrastantes (Reiter e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 89:1477-1481 (1992)). A informação obtida partindo das populações de retrocruzamento utilizando marcadores co- dominantes ou dominantes é menor que a obtida partindo de populações F2 porque um, ao invés de dois, gametas recombinantes é amostrado por planta. As populações de retrocruzamento, entretanto, são mais informativas (em uma saturação de marcador baixa) quando comparadas com as RILs uma vez que a distância entre os loci ligados aumenta nas populações de RIL (isto é, aproximadamente 0,15% de recombinação). A maior recombina- ção pode ser benéfica para a resolução de ligações fortes, mas pode ser indesejável na construção de mapas com saturação de marcador baixa.

Linhagens quase isogênicas (NIL) criadas através de muitos re- trocruzamentos para produzir um arranjo de indivíduos que são quase idên- ticos em relação à composição genética exceto pela característica ou pela região genômica em questão podem ser utilizadas como uma população de mapeamento. No mapeamento com as NILs, apenas uma parte dos Ioci po- limórficos é esperada que seja mapeada em uma região selecionada.

A análise de segregantes em massa (BSA) é um método desen- volvido para a identificação rápida de ligação entre marcadores e caracterís- ticas de interesse (Michelmore e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:9828-9832 (1991)). Na BSA, duas amostras de DNA agrupadas são ex- traídas de uma população segregante que se origina de um único cruzamen- to. Estes agrupamentos contêm indivíduos que são idênticos em relação a uma característica particular (resistentes ou susceptíveis a uma doença par- ticular) ou uma região genômica, mas são arbitrários em regiões não ligadas (isto é, heterozigotos). As regiões não ligadas com a região alvo não diferi- rão entre as amostras agrupadas de muitos indivíduos na BSA.

Uma alternativa para o mapeamento de QTLs tradicional envolve realizar uma maior resolução através do mapeamento de haplotipos, versus marcadores individuais (Fan e outros 2006 Genetics). Esta abordagem ras- treia blocos de DNA conhecidos como haplotipos, que são definidos por marcadores polimórficos, que são assumidos como sendo idênticos por des- cendência na população de mapeamento. Esta suposição resulta em um tamanho de amostra eficiente maior, oferecendo maior resolução de QTL. Os métodos para a determinação da significância estatística de uma correla- ção entre um fenótipo e um genótipo, neste caso um haplotipo, podem ser determinados através de qualquer teste estatístico conhecido na técnica e com qualquer limite aceito de significância estatística sendo requerido. A aplicação de métodos particulares e de limites de significância é bem- conhecida na perícia do versado na técnica.

Os marcadores de SNP da presente invenção podem ser utiliza- dos para isolar ou para purificar substancialmente um alelo de um QTL que também está localizado no grupo de ligação associado com o lócus 1 de re- sistência à ASR, o lócus 2 de resistência à ASR, o lócus 3 de resistência à ASR, o lócus 4 de resistência à ASR, o lócus 5 de resistência à ASR, o lócus 6 de resistência à ASR, o lócus 7 de resistência à ASR, o lócus 8 de resis- tência à ASR, o lócus 9 de resistência à ASR, o lócus 10 de resistência à ASR, o lócus 11 de resistência à ASR, o lócus 12 de resistência à ASR e o lócus 13 de resistência à ASR. A construção de uma série sobreposta de clones (um "contig" de clones) ao longo da região pode fornecer a base para um mapa físico que abrange um alelo de um QTL de resistência a doenças fúngicas que fica localizado em um grupo de ligação associado com o lócus 1 de resistência à ASR, o lócus 2 de resistência à ASR, o lócus 3 de resis- tência à ASR, o lócus 4 de resistência à ASR, o lócus 5 de resistência à ASR, o lócus 6 de resistência à ASR, o lócus 7 de resistência à ASR, o lócus 8 de resistência à ASR, o lócus 9 de resistência à ASR, o lócus 10 de resis- tência à ASR, o lócus 11 de resistência à ASR, o lócus 12 de resistência à ASR e o lócus 13 de resistência à ASR. O sistema de clonagem com o cro- mossomo artificial de levedura (YAC) facilitou a caminhada ("walking") cro- mossômica e as estratégias de clonagem de tamanho grande. Uma aborda- gem contendo um sítio de marcação (tag) de seqüência (STS) utilizando os marcadores da presente invenção pode ser utilizada para a construção de clones de YAC ao longo das regiões do cromossomo. Tal abordagem con- tendo STS para a construção de mapas de YAC pode fornecer um mapa baseado em STS detalhado e ordenado de qualquer região cromossômica, incluindo a região que abrange o alelo de um QTL que fica também localiza- do em um grupo de ligação associado com o lócus 1 de resistência à ASR1 o lócus 2 de resistência à ASR, o lócus 3 de resistência à ASR, o lócus 4 de resistência à ASR, o lócus 5 de resistência à ASR, o lócus 6 de resistência à ASR, o lócus 7 de resistência à ASR, o lócus 8 de resistência à ASR, o lócus 9 de resistência à ASR, o lócus 10 de resistência à ASR, o lócus 11 de resis- tência à ASR, o lócus 12 de resistência à ASR e o lócus 13 de resistência à ASR. Os mapas de YAC podem ser suplementados por mapas físicos deta- lhados que são construídos ao longo da região utilizando clones de BAC, PAC ou bacteriófago P1 que contêm insertos variando em tamanho de 70 kb até várias centenas de kilobases (Cregan, Theor. AppiGen. 78:919-928 (1999), Sternberg, Proc. Nati Acad. Sci. 87:103-107 (1990), Sternberg, Trends Genet. 8:11-16 (1992); Sternberg e outros, New Biol. 2:151-162 (1990); Ioannou e outros, Nat. Genet. 6:84-89 (1994); Shizuya e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. 89:8794-8797 (1992), dos quais todos são incorpora- dos aqui como referência em suas totalidades).

Os conjuntos sobrepostos de clones são derivados da utilização dos marcadores disponíveis da presente invenção para verificar bibliotecas de BAC, PAC, bacteriófago P1 ou cosmídeo. Em adição, as abordagens de hibridização podem ser utilizadas para converter os mapas de YAC em ma- pas de "contig" de BAC, PAC, bacteriófago P1 ou cosmídeo. YACs inteiros e produtos de inter-Alu-PCR assim como seqüências de iniciadores de STSs apropriadas podem ser utilizados para verificar bibliotecas de BAC, PAC, bacteriófago P1 ou cosmídeo. Os clones isolados para qualquer região po- dem ser montados em "contigs" utilizando a informação contendo STS e a- bordagens de "fingerprinting" (Sulston e outros, Comput. Appl. Biosci. 4:125- 132 (1988)).

A degeneração do código genético, que permite que seqüências de ácidos nucléicos diferentes codifiquem a mesma proteína ou peptídeo, é conhecida na literatura. Como utilizado aqui, uma molécula de ácido nucléico é degenerada de uma molécula de ácido nucléico quando as moléculas de ácidos nucléicos codificam as mesmas seqüências de ácidos nucléicos, mas compreendem seqüências de nucleotídeos diferentes. Um aspecto da pre- sente invenção é que as moléculas de ácidos nucléicos da presente inven- ção incluem moléculas de ácidos nucléicos que são degeneradas da molé- cula de ácido nucléico que codifica a(s) proteína(s) dos alelos de caracterís- ticas quantitativas.

Um outro aspecto da presente invenção é que as moléculas de ácidos nucléicos da presente invenção incluem moléculas de ácidos nucléi- cos que são homólogas da molécula de ácido nucléico que codifica uma ou mais das proteínas associadas com o QTL.

O material genético exógeno pode ser transferido para uma planta através do uso de um vetor ou de uma construção de transformação de DNA vegetal planejada para tal finalidade. Um subgrupo particularmente preferido de material exógeno compreende uma molécula de ácido nucléico da presente invenção. O planejamento de tal vetor está geralmente dentro da perícia do estado da técnica (Vide, Plant Molecular Biology: A Laboratory Manual, eds. Clark, Springer, Nova York (1997). Os exemplos de tais plan- tas, incluem, sem limitação, alfalfa, Arabidopsis, cevada, Brassica, brócolis, repolho, frutas cítricas, algodão, alho, aveia, semente oleosa de colza, cebo- la, canola, linho, milho, uma planta ornamental, ervilha, amendoim, pimenta, batata, arroz, centeio, sorgo, soja, morango, cana-de-açúcar, beterraba de açúcar, tomate, trigo, álamo, pinheiro, abeto, eucalipto, maçã, alface, lenti- lha, uva, banana, chá, turfa, girassol, dendezeiro, Phaseolusetc.

Uma construção ou um vetor pode incluir o promotor endógeno do QTL de resistência a doenças fúngicas da presente invenção. A caracte- rística de resistência a doenças fúngicas poderia ser atingida da melhor ma- neira através da expressão da proteína de QTL identificada com o promotor endógeno. Alternativamente, um promotor heterólogo pode ser selecionado para expressar a proteína ou o fragmento de proteína de escolha. Estes promotores podem estar ligados de forma operacional a uma seqüência de polinucleotídeo que codifica a proteína que corresponde ao QTL de resistên- cia fúngica. O promotor heterólogo pode ser um que é selecionado com base na maturação ou no tempo de florescência, em que a sincronia de expressão da proteína desejada pode ser crítica para os parâmetros que afetam a ca- racterística de resistência a doenças fúngicas. A expressão eficiente do QTL de resistência a doenças fúngicas pode requerer também promotores que são expressos em tipos de tecidos específicos.

Alternativamente, os promotores podem estar ligados de forma operacional com outras seqüências de ácidos nucléicos, tais como as que codificam peptídeos de trânsito, proteínas marcadoras que podem ser sele- cionadas ou seqüências anti-senso. Os promotores podem ser selecionados com base no tipo celular em que o vetor será inserido ou com base em suas características reguladoras. Os exemplos de tais características incluem o aumento da atividade de transcrição, a capacidade de indução, a especifici- dade ao tecido e a especificidade ao estágio de desenvolvimento. Nas plan- tas, foram descritos os promotores que podem ser induzidos, de origem viral ou sintética, ativos de forma constitutiva, regulados de forma temporal e re- gulados de forma espacial (Poszkowski e outros, EMBO J., 3: 2719, 1989; Odell e outros, Nature, 313:810, 1985; Chau e outros, Science, 244:174-181. 1989). Os promotores constitutivos utilizados freqüentemente incluem o promotor 35S do CaMV (Odell e outros, Nature, 313: 810, 1985), o promotor 35S do CaMV intensificado, o promotor do Vírus Mosaico da Escrofulária (FMV) (Richins e outros, Nucleic Acids Res. 20: 8451, 1987), o promotor da nopalina sintase (nos) (Shaw e outros, Nucleic Acids Res. 12: 7831-7846 (1984)) e o promotor da octopina sintase (ocs).

Os promotores que podem ser induzidos úteis incluem promoto- res induzidos por ácido salicílico ou ácidos poliacrílicos (PR-1; Williams e outros, Biotechnology 10:540-543, 1992), induzidos pela aplicação de agen- tes de segurança (herbicidas de benzenossulfonamida substituídos; Hershey e Stoner, Plant Mol. Biol. 17: 679-690, 1991), promotores de choque térmico (Ou-Lee e outros, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 83: 6815, 1986; Ainley e ou- tros, Plant Mol. Biol. 14: 949, 1990), um promotor que pode ser induzido por nitrato derivado da seqüência de polinucleotídeos que pode ser transcrita da nitrito redutase do espinafre (Back e outros, Plant Mol. Biol. 17: 9, 1991), promotores que podem ser induzidos por hormônios (Yamaguchi-Shinozaki e outros, Plant Mol. Biol. 15: 905, 1990) e promotores que podem ser induzi- dos pela luz associados com a subunidade pequena da RuBP carboxilase e as famílias de LHCP (Kuhlemeier e outros, Plant Cell 1: 471, 1989; Fein- baum e outros, Mol. Gen. Genet. 226: 449-456, 1991; Weisshaar e outros, EMBO J. 10: 1777-1786, 1991; Lam e Chua, J. Biol. Chem. 266: 17131- 17135, 1990; Castresana e outros, EMBO J. 7: 1929-1936, 1988; Schulze- Lefert e outros, EMBO J. 8: 651, 1989).

Os promotores particularmente preferidos no vetor recombi- nante incluem o promotor da nopalina sintase (NOS) (Ebert e outros, 1987), o promotor da octopina sintase (OCS) (que é carregado em plasmídeos in- dutores de tumores de Agrobacterium tumefaciens), os promotores de cau- limovirus tais como o promotor 19S do vírus mosaico da couve-flor (CaMV) (Lawton e outros, 1987), o promotor 35S do CaMV (Odell e outros, 1985), o promotor 35S do vírus mosaico da escrofulária (Walker e outros, 1987); o promotor que pode ser induzido pela luz da subunidade pequena da ribulo- se-1,5-bisfosfato carboxilase (ssRUBISCO); o promotor EIF-4A do tabaco (Mandel e outros, Plant Mol. Biol, 29: 995-1004, 1995); o promotor da quiti- nase de Arabidopsis (Samac e outros, Plant Cell, 3:1063-1072, 1991); os promotores LTP (Proteína de Transferência de Lipídeos) do brócolis (Pyee e outros, Plant J., 7: 49-59, 1995); da chalcona isomerase da petúnia (Van Tu- nen e outros, EMBO J. 7: 1257, 1988); da proteína 1 rica em glicina do feijão (Keller e outros, EMBO L., 8: 1309-1314, 1989); da patatina da batata (Wen- zler e outros, Plant Mol. Biol., 12: 41-50, 1989); o promotor de Actina 7 de Arabidopsis (Número de acesso do Genbank U27811.1 Gl:1002528, 17- APR-1997 e Pedido de Patente PCT: W00144457A2; cuja totalidade é in- corporada aqui como referência); o promotor da Actina 8 de Arabidopsis (An e outros, Plant J. 10: 107-121 (1996) e Pedido de Patente PCT: W00144457A2); o promotor da subunidade pequena 4 da Rubisco de Arabi- dopsis (Krebbers e outros, Plant Mol. Biol. 11: 745-759 (1988)); o promotor do gene da napina de Brassica (Patente U.S. N° 5.420.034, cuja totalidade é incorporada aqui como referência); o promotor Suc2 de Arabidopsis (Truernit e outros, Planta 196: 564-570 (1995)); promotor do fator EF-1 alfa de alon- gamento de Arabidopsis (Axelos e outros, Mol. Gen. Genet. 219: 106-112 (1989)); e o promotor de conglicina 7s α beta de Glycine max, Sphas (Doyle e outros, J. Biol. Chem. 261: 9228-9238 (1986)).

As construções da presente invenção também podem incluir re- giões não-traduzidas a 5' adicionais (5' UTR) ou líderes de uma molécula de polinucleotídeo de mRNA ou gene que podem desempenhar uma função importante no início da tradução. Algumas 5' UTRs podem atuar como inten- sificadores da tradução e podem também ser incorporadas como parte do vetor recombinante. Por exemplo, as moléculas de polinucleotídeos líderes a 5' não-traduzidas derivadas de genes de proteínas de choque térmico de- monstraram aumentar a expressão gênica em plantas (vide, por exemplo, a Patente U.S. N° 5.659.122, cuja totalidade é incorporada aqui como referên- cia e a Patente U.S. N° 5.362.865, cuja totalidade é incorporada aqui como referência). Assim o vetor recombinante pode conter preferencialmente uma ou mais seqüências líderes não-traduzidas a 5' que servem para au- mentar a expressão da seqüência de ácido nucléico. Tais seqüências inten- sificadoras podem ser desejáveis para aumentar ou para alterar a eficiência de tradução do mRNA resultante. As seqüências de ácidos nucléicos a 5' preferidas incluem o líder da Actina 7 de Arabidopsis (Número de acesso do Genbank U27811.1 Gl:1002528, 17-APR-1997 e Pedido de Patente PCT: W00144457A2; cuja totalidade é incorporada aqui como referência); o líder da Actina 8 de Arabidopsis (An e outros, Plant J. 10: 107-121 (1996) e Pedi- do de Patente PCT: W00144457A2); o líder da subunidade pequena 4 da Rubisco de Arabidopsis (Krebbers e outros, Plant Mol. Biol. 11: 745-759 (1988)); o líder do gene da napina de Brassiea (Patente U.S. N° 5.420.034, cuja totalidade é incorporada aqui como referência); o líder de Suc2 de Ara- bidopsis (Truernit e outros, Planta 196: 564-570 (1995)); o líder do gene Hsp70 de Petunia hybrida (Winter e outros, Mol. Gen. Genet. 211: 315-319 (1988)); o líder do gene EPSPS de Arabidopsis (Klee e outros, Mol. Gen. Genet. 210: 437-442 (1987)); o lidero do fator EF-1 alfa de alongamento de Arabidopsis (Axelos e outros, Mol. Gen. Genet. 219: 106-112 (1989)); e o líder da conglicina 7sa beta de Glycine max (Doyle e outros, J. Biol. Chem. 261: 9228-9238 (1986)). Estas moléculas de polinucleotídeos reguladoras a montante adicionais podem ser derivadas de uma fonte que é nativa ou he- teróloga em relação aos outros elementos presentes na construção.

Em adição, as construções podem incluir moléculas de polinu- cleotídeos reguladoras adicionais da região não traduzida a 3' (3' UTR) dos genes de plantas. Uma 3' UTR ou terminador fornece tipicamente um sinal de término da transcrição e um sinal de poliadenilação que funciona em plantas para causar a adição de nucleotídeos adenilados na extremidade a 3' do mRNA. Geralmente, as seqüências de ácidos nucléicos localizadas algumas centenas de pares de bases a jusante do sítio de poliadenilação servem para terminar a transcrição. Em adição, algumas 3' UTRs fornecem propriedades adicionais tal como o aumento da estabilidade do mRNA como na 3' UTR do gene inibidor II de proteinase da batata (An e outros, The Plant Cell 1: 115-122 (1989)). Outras 3' UTRs podem fornecer seqüências que aumentam a degradação do mRNA tal como o motivo 5'-UUAUUUAUU-3' que é mostrado como contribuindo para a menor estabilidade de mensagens de RNA em células de animais (Zubiaga e outros, Mol. Cell Biol. 15: 2219- 2230 (1995)). Estas moléculas de polinucleotídeos reguladoras adicionais podem ser derivadas de uma fonte que é nativa ou heteróloga em relação aos outros elementos presentes na construção.

As 3' UTRs ou terminadores preferidos são a 3' UTR do gene do inibidor II da proteinase da batata (An e outros, The Plant Cell 1: 115-122 (1989)); o terminador E9 da subunidade pequena da Rubisco da ervilha (Co- ruzzi e outros, EMBO J. 3: 1671-1679 (1984)); o terminador 35S do vírus mosaico da couve-flor; o terminador do gene da napina de Brassica (Patente U.S. N° 5.420.034); o terminador do gene da conglicina 7sa beta de Glycine max (Doyle e outros, J. Biol. Chem. 261: 9228-9238 (1986)); o terminador Arc5 de Phaseoulus vulgaris (Goossens e outros, Eur. J. Biochem. 225: 787- 795 (1994)); o terminador da nopalina sintase de Agrobacterium tumefaciens (Rojiyaa e outros, 1987, Número de acesso do Genbank E01312 e Pedido de Patente U.S. N- US20020192813A1, cuja totalidade é incorporada aqui como referência); e o terminador do gene ADR12 de Glycine max (Datta e outros, Plant Moi Biol. 21: 859-869 (1993)).

Um vetor ou uma construção também podem incluir elementos reguladores derivados de íntrons de certos genes. Os exemplos dos tais in- cluem o íntron 1 de Adh (Callis e outros, Genes and Develop. 7:1183-1200 (1987); o íntron da sacarose sintase (Vasil e outros, Plant Physioi 97:1575- 1579 (1989); e o elemento TMV omega (Gallie e outros, The Plant Cell 7:301-311 (1989)). Os íntrons preferidos são o íntron da Actina 7 de Arabi- dopsis (Número de acesso do Genbank U27811.1 Gl: 1002528, 17-APR- 1997 e Pedido de Patente PCT: W0200144457A2; cuja totalidade é incorpo- rada aqui como referência); o íntron da Actina 8 de Arabidopsis (An e outros, Plant J. 10: 107-121 (1996) e Pedido de Patente PCT: W0200144457A2); e o íntron do fator EF-1 alfa de alongamento de Arabidopsis (Axelos e outros, Mol. Gen. Genet. 219: 106-112 (1989)). Estes e outros elementos regulado- res podem ser incluídos quando apropriado.

Um vetor ou uma construção também podem incluir um marca- dor que pode ser selecionado. Os marcadores que podem ser selecionados podem também ser utilizados para selecionar plantas ou células vegetais que contêm o material genético exógeno. Os exemplos dos tais incluem, mas não estão limitados a um gene neo (Potrykus e outros, Mol. Gen. Ge- net. 799:183-188 (1985)), que codifica a resistência à canamicina e pode ser selecionado utilizando canamicina, G418, etc.; um gene bar que codifica a resistência a bialaphos; um gene de EPSP sintase mutante (Hinchee e ou- tros, Bio/Technology 6:915-922 (1988)), que codifica resistência ao glifosato; um gene de nitrilase que confere resistência a bromoxinila (Stalker e outros, J. Biol. Chem. 263:6310-6314 (1988)); um gene de acetolactato sintase (ALS) mutante que confere resistência à imidazolinona ou à sulfoniluréia (por exemplo, Patente U.S. Ns 6.222.100, cuja totalidade é incorporada aqui co- mo referência); um gene DHFR resistente ao metotrexato (Thillet e outros, J. Biol. Chem. 263:12500-12508 (1988)); tolerância conferida a Dicamba, por exemplo, por um gene para dicamba monooxigenase (DMO) de Pseudomo- nas maltophilia (Pedido de Patente U.S. 20030135879, cuja totalidade é incorporada aqui como referência).

Um vetor ou uma construção também podem incluir um marca- dor que pode ser verificado. Os marcadores que podem ser verificados po- dem ser utilizados para monitorar a expressão. Os exemplos de marcadores que podem ser verificados incluem um gene de β-glucuronidase ou uidA (GUS) que codifica uma enzima para a qual vários substratos cromogênicos são conhecidos (Jefferson, Plant Mol. Biol, Rep. 5:387-405 (1987), cuja tota- lidade é incorporada aqui como referência; Jefferson e outros, EMBO J. 16:3901-3907 (1987), cuja totalidade é incorporada aqui como referência); um gene de lócus R, que codifica um produto que regula a produção de pigmen- tos de antocianina (coloração vermelha) em tecidos vegetais (Dellaporta e outros, Stadler Symposium 11:263-282 (1988), cuja totalidade é incorporada aqui como referência); um gene de β-lactamase (Sutcliffe e outros, Proc. Na- tl. Acad. Sci. (U.S.A.) 75:3737-3741 (1978), cuja totalidade é incorporada aqui como referência), um gene que codifica uma enzima para a qual vários substratos cromogênicos são conhecidos (por exemplo, PADAC, uma cefa- losporina cromogênica); um gene da luciferase (Ow e outros, Science 234:856-859 (1986), cuja totalidade é incorporada aqui como referência); um gene xylE (Zukowsky e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 80:1101-1105 (1983), cuja totalidade é incorporada aqui como referência) que codifica uma catechol dioxigenase que pode converter cathecóis cromogênicos; um gene de α-amilase (Ikatu e outros, Bio/Technol. 8:241-242 (1990), cuja totalidade é incorporada aqui como referência); um gene de tirosinase (Katz e outros, J. Gen. Microbiol. 129:2703-2714 (1983), cuja totalidade é incorporada aqui como referência) que codifica uma enzima capaz de oxidar tirosina em DO- PA e dopaquinona que por sua vez se condensa em melanina; e uma a- galactosidase.

Qualquer uma das técnicas conhecidas no estado da técnica para a introdução de transgenes em plantas pode ser utilizada para preparar uma planta resistente a doença fúngica de acordo com a invenção. Acredita- se que os métodos adequados para a transformação de plantas incluem vir- tualmente qualquer método através do qual o DNA pode ser introduzido em uma célula, tal como através de eletroporação como ilustrado na Patente U.S. N2 5.384.253; bombardeio de microprojéteis como ilustrado nas Paten- tes U.S. Nsi 5.015.580; 5.550.318; 5.538.880; 6.160.208; 6.399.861; e 6.403.865; transformação mediada por Agrobacterium como ilustrado nas Patentes U.S. 5.635.055; 5.824.877; 5.591.616; 5.981.840; e 6.384.301; e transformação de protoplastos como ilustrado na Patente U.S. N- 5.508.184. Através da aplicação de técnicas tais como estas, as células de virtualmente qualquer espécie de planta podem ser transformadas de forma estável e estas células podem ser desenvolvidas em plantas transgê- nicas. As técnicas úteis no contexto da transformação de algodão são des- critas nas Patentes U.S. N- 5.846.797. 5.159.135. 5.004.863 e 6.624.344; e as técnicas para a transformação de plantas de Brassica, em particular, são descritas, por exemplo, na Patente U.S. N- 5.750.871; e as técnicas para a transformação de soja são descritas, por exemplo, em Zhang e outros (Plant Cell Tissue Organ Cult 56:37-46 (1999) e Patente U.S. Na 6.384.301).

Tendo agora descrito de forma geral a invenção, a mesma será mais facilmente entendida através da referência aos exemplos a seguir que são fornecidos com a finalidade de ilustração e não é pretendido que sejam Iimitantes da presente invenção, a não ser que seja especificado.

Exemplos

Exemplo 1: Cruzamento de Linhagens Quase Isogênicas contendo loci de resistência à ASR

Mil e quatrocentos marcadores de polimorfismos de nucleotí- deos isolados (SNP), distribuídos aleatoriamente ao longo dos 20 grupos de ligação do mapa de ligação genética da soja, foram utilizados para identificar marcadores de SNP ligados fortemente ao lócus 1 de resistência à ASR. Um conjunto de linhagens de soja consistindo em linhagens quase isogênicas (NILs) desenvolvidas partindo de um cruzamento entre Williams 82 e o doa- dor do lócus 1 de resistência à ASR, Pl 200492. Linhagens derivadas de Pl 200492 foram utilizadas para identificar marcadores de SNP que eram poli- mórficos entre Williams 82 e Pl 200492. Estes marcadores de SNP polimór- ficos foram então utilizados para mapear a localização do lócus 1 de resis- tência à ASR utilizando uma população retrocruzamento segregante, L85- 2378. A L85-2378 foi desenvolvida através do cruzamento de Williams 82 com Pl 200492 e cinco ciclos de retrocruzamento ou essencialmente 6 do- ses de Williams 82, foram realizadas para recuperar a maior parte das carac- terísticas desejáveis de Williams 82. Assim, é criada a L85-2378 consistindo em indivíduos quase iguais ao parental recorrente, Williams 82, mas cada NIL individual carrega quantidades variáveis ou mosaico de regiões genômi- cas do parental doador, Pl 200492.

A população inteira foi genotipada com os marcadores de SNP polimórficos identificados anteriormente e foi subseqüentemente avaliada em relação à resistência à ferrugem da soja utilizando um ensaio de estufa. As associações entre o genótipo do marcador de SNP e o fenótipo de resistên- cia à ferrugem da soja foram avaliadas. Os marcadores de SNP observados como estando em altos desequilíbrios de ligação com a resposta fenotípica da doença do lócus 1 de resistência à ASR eram NS0093250, NS0119710, NS0103004, NS0099454, NS0102630, NS0102915, NS0102913, NS0123728, NS0129943, NS0102168, NS0092723, NS0098177, NS0127343 e NS0101121 e são apresentados na Tabela 1 e indicados co- mo as SEQ ID NOs: 67 até 80. Todos estes marcadores de SNP são mape- ados em uma região no grupo de ligação G do mapa de ligação genética da soja público. A Tabela 1 lista as seqüências para os iniciadores para a ampli- ficação pela PCR, indicadas como as SEQ ID NOs: 1 até 28 e as sondas, indicadas como as SEQ ID NOs: 100 até 127, correspondendo a estes mar- cadores de SNP. Dois marcadores de SNP foram identificados como sendo úteis no monitoramento da introgressão positiva do lócus 1 de resistência à ASR e correspondem aos marcadores de SNP NS0102913 e NSOI29943 e correspondem às SEQ ID NO: 73 e SEQ ID NO: 75, respectivamente.

A eficiência do lócus 1 de resistência à ASR contra os isolados de ferrugem da soja do Alabama foi também avaliada nas populações F2:3 a seguir: AG4403 χ PI 200492, AG3302 χ PI 200492, AG3201 χ PI 200492, AG26932 χ PI 200492, AG2402 χ Pl 200492. Em cada uma das populações, uma proporção de segregação de 3:1 foi observada indicando um padrão de herança de um único gene dominante.

Após o procedimento descrito para o lócus 1 de resistência à ASR, o lócus 3 de resistência à ASR foi mapeado utilizando NILs desenvol- vidas partindo do cruzamento entre Williams 82 e o parental doador, Pl 462312, seguido por cinco ciclos de retrocruzamento ou essencialmente 6 doses de Williams 82, foram realizadas para recuperar a maior parte das características desejáveis de Williams 82. Assim, é criada a L85-2378 con- sistindo em indivíduos quase iguais ao parental recorrente, Williams 82, mas cada linhagem quase isogênica individual carrega quantidades variáveis ou mosaico de regiões genômicas do parental doador, PI 200492. A população inteira foi genotipada com o conjunto de marcadores de SNP polimórficos identificados anteriormente e foi subseqüentemente avaliada em relação à resistência à ferrugem da soja utilizando um ensaio de estufa. As associa- ções entre o genótipo do marcador de SNP e o fenótipo de resistência à ferrugem da soja foram avaliadas. Os marcadores de SNP observados como estando em altos desequilíbrios de ligação com o lócus 3 de resistência à ASR eram NS0099746, NS0123747, NS0126598, NS0128378, NS0096829, NS0125408, NS0098902, NS0099529, NS0097798, NS0137477, NS0095322, NS0136101 e NS0098992 e são apresentados na Tabela 1 e indicados como as SEQ ID NOs: 81 até 93. Estes marcadores foram todos mapeados em LG C2 do mapa genético da soja público. A Tabela 1 lista as seqüências para os iniciadores para a amplificação pela PCR, indicadas co- mo as SEQ ID NOs: 29 até 54 e as sondas, indicadas como as SEQ ID NOs: 128 até 153, correspondendo a estes marcadores de SNP. O marcador utili- zado para monitorar a introgressão do lócus 3 de resistência à ASR corres- ponde ao marcador de SNP NS0137477 e é indicado como a SEQ ID NO: 90. Para confirmar a suposta localização do lócus 3 de resistência à ASR1 uma população F3:4 segregante foi desenvolvida entre AVRDC-8 e AG4403. AVRDC-8 é uma linhagem desenvolvida pelo Asian Vegetable Research and Development Center in Taiwan por cruzamento de Ankur (linhagem conten- do o lócus 3 de resistência à ASR) e Pl 230970 (doador do lócus 2 de resis- tência à ASR). Esta população está sendo atualmente genotipada em rela- ção aos marcadores de SNP e avaliada em relação à reação de resistência contra um isolado de ferrugem da soja de Loxley, AL para validar a Iocaliza- ção do lócus 3 de resistência à ASR.

As localizações aproximadas do lócus 2 de resistência à ASR e do lócus 4 de resistência à ASR foram determinadas posteriormente com base em uma análise dos polimorfismos entre um conjunto de linhagens Pl que são conhecidas por conterem o lócus 2 de resistência à ASR ou o lócus 4 de resistência à ASR, Pl 230970, Pl 459025B, o doador do lócus 2 de re- sistência à ASR e do lócus 4 de resistência à ASR, respectivamente e outras linhagens que foram relatadas na literatura como contendo qualquer um dos QTLs. Com base na análise dos polimorfismos, qualquer marcador de SNP polimórfico é uma região candidata próxima aos loci de resistência à ASR. Para o lócus 2 de resistência à ASR, duas regiões candidatas foram identifi- cadas e o lócus fica mais provavelmente localizado no grupo de ligação J, próximo ou dentro do agrupamento de resistência à doença Podridão Parda do Caule, de resistência ao Nematóide do Cisto da Soja e Mancha Foliar "olho de rã" ou dentro do grupo de ligação Ν. O lócus 4 de resistência à ASR fica provavelmente localizado no grupo de ligação N.

Tabela 1: Marcadores de SNP para a identificação e para a seleção do lócus 1 de resistência à ASR e do lócus 3 de resistência à ASR.

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Exemplo 2: Coleta e propagação de esporos.

Os urediniosporos da Ferrugem Asiática da Soja de Phakopsora pachyrhizi foram coletados de plantas infectadas na estação Monsanto Lo- xley Agronomy (Loxley, AL), referida aqui como a cepa Loxley.

As plantas de soja foram inoculadas através da aspersão da par- te inferior das folhas com esporos suspensos em água contendo 0,01% de Tween-20. O desenvolvimento de lesões era visível sem aumento em torno de 7 até 10 dias com a esporulação ocorrendo 12 até 14 dias após a infec- ção. Os esporos das plantas infectadas foram coletados e ressuspensos em água deionizada esterilizada contendo 0,01% de Tween 20. A concentração de esporos foi determinada utilizando um hemocitômetro.

Exemplo 3: Ensaio de folhas removidas em relação à Resistência À Ferru- gem Asiática da Soja

Dois tipos de tecido foliar foram avaliados em relação à fenoti- pagem da doença ASR. Folhas unifoliadas, sete até dez dias após a emer- gência ou folhas trifoliadas V3, vinte e um até vinte e oito dias após a emer- gência, foram analisadas. Aproximadamente dois dias após a emergência do solo, a planta de soja carrega um par de folhas unifoliadas que estão com- pletamente desenroladas aproximadamente cinco dias depois e constituem as primeiras 'folhas verdadeiras'. Aproximadamente sete dias após a emer- gência, as folhas trifoliadas aparecem (compreendendo três folhas na extre- midade de um pecíolo). Três conjuntos emergem em seqüência e as primei- ras folhas trifoliadas são designadas como o estágio V1 e estão totalmente expandidas dez dias após a emergência. Os dois estágios V seguintes ocor- rem com uma diferença de uma semana. De forma notável, as folhas são inoculadas com a doença após terem tanto se desenrolado quanto endureci- do, isto é, não estão novas nem verdes. As unifoliadas tendem a endurecer muito rapidamente, em torno de 8-1 Od após a emergência, enquanto que as trifoliadas V2 e V3 podem não se desenrolar ainda até 24-28 dias após a emergência.

Três papéis de filtro Watmann #1 de 3,2 cm de diâmetro são co- locados em cada um dos 6 poços de uma placa de cultura de 6 poços (o vo- lume do poço é de 15,5 mililitros). As folhas são cortadas em pedaços de 3 centímetros por 3 centímetros e colocadas na superfície dos papéis de filtro Watmann com a parte inferior (porção estomatal) da folha voltada para cima. Aproximadamente 2,0 mililitros de água deionizada esterilizada são coloca- dos em cada poço da placa de cultura de tecido de 6 poços. Os urediniospo- ros da Ferrugem Asiática da Soja de Phakopsora pachyrhizi são suspensos em água deionizada esterilizada contendo 0,01% de tween 20 em uma con- centração de 1 X 105 urediniosporos por mililitro. Aproximadamente 50 mi- crolitros de suspensão de esporos são aplicados em cada pedaço de folha utilizando um vaporizador (Modelo Badger 155 Anthem, Badger Air-Brush Co., Franklin Park, IL) com um compressor (Modelo TC-20, Airbrush Depot, San Diego, CA) com ajuste de 1 quilograma por centímetro quadrado para umidade. A placa de 6 poços é então selada com parafilme e colocada em uma câmara de crescimento ajustada a 22 graus Celsius1 com um fotoperío- do de 12 horas de período de dia. As placas foram verificadas a cada 2 ou 3 dias para monitorar a progressão da doença e para garantir que os poços não secaram. A água deionizada é adicionada para completar o volume ori- ginal no poço quando necessário ou a umidade relativa da incubadora é a- justada em aproximadamente 80%. Os sintomas iniciais de lesões em de- senvolvimento devem ser evidentes sob um microscópio de dissecação a- proximadamente 3 até 5 dias após a inoculação. As lesões de esporulação devem ser evidentes 9 até 14 dias após a inoculação. Os escores médios de gravidade da ferrugem da soja são calculados partindo de vários testes. O escore de gravidade da ferrugem utiliza uma escala de classificação de 1 até 5; 1 - sendo imune, 2 - demonstrando lesões vermelhas/marrons ao longo de menos de 50% da área da folha, 3 - demonstrando lesões verme- lhas/marrons ao longo de mais de 50% da área da folha, 4 - demonstrando lesões queimadas ao longo de menos de 50% da área da folha e 5 - e de- monstrando lesões queimadas ao longo de mais de 50% da área da folha.

As seções de folha podem permanecer viáveis neste ensaio durante até 2 meses.

Experimentos utilizando soja susceptível à Ferrugem Asiática da Soja, Lee 74 demonstram de forma coerente altos níveis de infecção para cada ensaio realizado. Experimentos adicionais avaliando um suposto ger- moplasma resistente foram capazes de diferenciar números de acesso tole- rantes dos susceptíveis como demonstrado na Tabela 2. O número de aces- so Pl 200487 demonstrou um fenótipo de resistência lenta à ferrugem. Es- tão em andamento esforços para identificar marcadores que serão utilizados na introgressão do lócus de resistência identificado no Pl 200487 para o germoplasma de elite.

Em adição, a comparação da avaliação da ASR de tecido foliar unifoliado e trifoliado mostrou que leva aproximadamente 45 dias partindo da semente até o ponto de dados para os trifoliados e aproximadamente 23 di- as para os unifoliados. A redução do tempo de ensaio na metade, economi- za significativamente o ensaio de folhas removidas e o tempo necessário para determinar a classificação de resistência à doença. Reduzindo 3 sema- nas, as plantas podem ser propagadas em uma escala de tempo mais rápida e as plantas susceptíveis podem ser separadas mais cedo, economizando espaço no campo e na estufa.

Tabela 2: Escore médio de ferrugem para os números de acesso resistentes e susceptíveis como determinado utilizando tecido foliar unifoliado e trifolia- do; "-" indica que o ensaio não foi realizado.

<table>table see original document page 65</column></row><table> <table>table see original document page 66</column></row><table>

Exemplo 4: Teste de cruzamentos de Elite em relação à resistência a P. pa- chyrizi com o lócus 1 de resistência à ASR, o lócus 2 de resistência à ASR e o lócus 3 de resistência à ASR introgredidos.

Os cruzamentos com a linhagem parental resistente doadora, Pl 200492, contendo o lócus 1 de resistência à ASR foram realizados com vá- rias linhagens de elite da soja para monitorar a introgressão positiva do lócus 1 de resistência à ASR. Os ensaios de folhas em relação à resistência para a cepa Loxley foram realizados utilizando linhagens derivadas de cruzamen- tos com o número de acesso da linhagem parental resistente, Pl 200492 (ló- eus 1 de resistência à ASR) assim como os números de acesso resistentes conhecidos (PI 230970 (lócus 2 de resistência à ASR) e Pl 462312 (lócus 3 de resistência à ASR)) e linhagens de elite susceptíveis. Os escores de re- sistência para todas as linhagens testadas são apresentados na Tabela 3. Os escores médios de gravidade de ferrugem eram derivados de 4 plantas, cada uma com 4 replicações e classificadas em 4 dias diferentes (10DAI, 17DAI, 24DAI, 32DAI).

Tabela 3: Escore Médio de Gravidade de Ferrugem de eventos de retrocru- zamento de ASR e linhagens de elite.

<table>table see original document page 66</column></row><table> <table>table see original document page 67</column></row><table> <table>table see original document page 68</column></row><table> <table>table see original document page 69</column></row><table> <table>table see original document page 70</column></row><table> <table>table see original document page 71</column></row><table>

As linhagens que contêm o lócus 1 de resistência à ASR exibiam maior resistência à cepa Loxley. A introgressão do lócus 1 de resistência à ASR foi confirmada por MAS.

Exemplo 5: Teste de Números de acesso da Soja em relação à Resistência à ASR utilizando o Ensaio de Folha Removida

Setecentos supostos números de acesso resistentes à ASR fo- ram identificados com base nos ensaios de estufa, utilizando uma população mista de isolados de ASR de origem estranha. Os ensaios de folhas em re- lação à resistência à ASR foram realizados como descrito no Exemplo 3 uti- lizando um subconjunto de duzentos e cinqüenta dos setecentos supostos números de acesso resistentes USDA. Um conjunto complementar de du- zentos e cinqüenta números de acesso susceptíveis à ASR da USDA foi se- lecionado para comparação no ensaio de folhas com base na comparação das maturidades e das origens geográficas dos duzentos e cinqüenta núme- ros de acesso resistentes. Os escores médios de gravidade de ferrugem dos números de acesso resistentes principais (aqueles que exibiam um escore médio de gravidade de ferrugem de 1 até 2) são apresentados na Tabela 4 a seguir. Mil e quatrocentos marcadores de SNP, distribuídos a cada 5 centi- morgans ao longo dos 20 grupos de ligação do mapa de ligação genética da soja, serão utilizados para identificar os marcadores úteis para acompanhar a introgressão dos Ioci de resistência à ASR possuídos pelos números de acesso resistentes no germoplasma de elite.

Tabela 4: Números de Acesso Resistentes à ASR com Escore Médio de Gravidade de Ferrugem. <table>table see original document page 72</column></row><table> <table>table see original document page 73</column></row><table> <table>table see original document page 74</column></row><table>

Em adição, os marcadores de SNP distribuídos proximais e dis- tais ao lócus 3 de resistência à ASR foram genotipados em relação a um conjunto de oitenta e nove números de acesso resistentes. Foi observado que quatro marcadores de SNP adicionais (NS0103749, NS0118897, NS0119715 e NS0130920) estavam associados com o lócus de resistência à ASR e estão listados na Tabela e indicados como as SEQ ID NOs: 94 até 97. A Tabela 5 lista as seqüências dos iniciadores para a amplificação pela PCR, indicadas como as SEQ ID NOs: 55 até 62 e as sondas, indicadas co- mo as SEQ ID NOs: 154 até 161, correspondendo a estes marcadores de SNP.

Esta informação será utilizada para identificar novas fontes de resistência úteis na priorização da introgressão da ASR e outros loci de re- sistência a agentes patogênicos.

Tabela 5: Marcadores de SNP para a identificação e para a seleção do lócus 3 de resistência à ASR.

<table>table see original document page 74</column></row><table>

Exemplo 6: Utilização de estudos de associação para a identificação de Q- TLs que conferem resistência a doenças fúngicas A identificação de regiões ou genes associados com a doença é a primeira etapa em direção ao desenvolvimento de variedades resistentes. Quatro loci para resistência à ferrugem (lócus 1 de resistência à ASR1 lócus de resistência à ASR, lócus 3 de resistência à ASR1 lócus 4 de resistência à ASR) foram identificados anteriormente. Neste exemplo, o desequilíbrio de ligação e o mapeamento de associação de haplotipos foram aplicados em uma amostra de dados de controle de caso de germoplasma de soja.

Quatrocentos e noventa e duas linhagens de soja (246 pares resistentes-susceptíveis) foram classificados em relação à resistência à ferrugem assim como submetidas ao "fingerprinting" utilizando 797 SNPs. A resistência a doenças foi classificada em escalas de 1 até 5 em uma mistura de isolados de Phakopsora pachyrhizi, com menos de 3 como resistentes e mais de 4 como susceptíveis. Especificamente, o teste de controle de caso, o teste exato de Fishers, o teste F de marcador isolado e a regressão de tendência de haplotipo foram explorados em tamanhos de janela de 3, 5 e 9 SNPs consecutivos. Vários resultados de teste associam significativamente dois marcadores de SNP de duas janelas de haplotipos separadas, referidas aqui como janelas 1 e 2 de haplotipos de resistência a doenças fúngicas, no cromossomo 13 24-45 cM com resistência à doença fúngica; Os marcadores de SNP NS0103033 e NS0124935 ficam localizados nas janelas 1 e 2 de haplotipos de resistência a doenças fúngicas, respectivamente. Os iniciadores para NS0103033 (SEQ ID NO: 98) são indicados nas SEQ ID NOs: 63 e 64 e as sondas são indicadas nas SEQ ID NOs: 162 e 163. Os iniciadores para NS0124935 (SEQ ID NO: 99) são indicados nas SEQ ID NOs: 65 e 66 e as sondas são indicadas nas SEQ ID NOs: 164 e 165. Os escores de resistência para cada um dos haplotipos e o alelo marcador para cada haplotipo estão indicados na Tabela 5. Cada janela é denominada por cinco marcadores de SNP e os alelos para cada um é indicada como a seqüência do haplotipo. O alelo para NS0103033 na janela 1 de haplotipo e NS0124935 na janela 2 de haplotipo são indicados em negrito. Para NS0103033, o SNP é realmente um "indel" de 9 pb em que "Z" representa a deleção (*********) e "W" representa a inserção (GAAGTGGAT). As variedades que contêm os haplotipos resistentes da janela 1 e/ou 2 do haplotipo estão indicadas na tabela 6. Este esforço de mapeamento identificou QTLs adicionais de resistência à doença ARS em adição aos loci de resistência à ARS definidos anteriormente.

Tabela 5: Sumário da classificação das linhagens contendo haplotipos resis- tentes nas janelas 1 e 2 de haplotipos de resistência à ASR. Um escore de resistência de O indica que a linhagem era resistente e um escore de 1 indica que a linhagem foi denominada susceptível.

<table>table see original document page 76</column></row><table> <table>table see original document page 77</column></row><table> <table>table see original document page 78</column></row><table> <table>table see original document page 79</column></row><table>

Tendo ilustrado e descrito os princípios da presente invenção, deve ser evidente para os versados na técnica que a invenção pode ser mo- dificada em arranjo e detalhes sem se afastar de tais princípios. São reivin- dicadas todas as modificações que estão dentro do espírito e do âmbito das reivindicações em anexo.

Todas as publicações e os documentos de patentes publicados citados neste relatório descritivo são incorporados aqui como referência até a mesma extensão como se cada publicação ou pedido de patente individual estivesse especificamente e individualmente indicado como estando incorpo- rado como referência.

LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS

<110> Baley, George James

Butruille, David

Concibido, Vergel C

Eathington, Samuel R

Haverdink, Michael D

Kruger, Warren M

LeDeaux, John R

Narvel, James

Pitkin, John W

Tamulonis, John P

Xie, Chongqing

<120> PROCESSO PARA IDENTIFICAR LOCI DE CARACTERÍSTICAS QUANTI-

TATIVAS DE RESISTÊNCIA A DOENÇAS NA SOJA E COMPOSIÇÕES DOS MESMOS

<130> 38-21(53517)

<140> 60/808430

<141> 2006-05-25

<160> 165

<210> 1 <211> 21 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220> <223> artificial

<400> 1 cacctgttgc ttctccacca t

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> artificial

<400> 2 gggtggtgct cttggaggta

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> artificial

<400> 3

taaagcaaaa ggacgttacg acaa

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> artificial

<400> 4

gcattgattt gtccacgaag aac

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220> <223> artificial

<400> 5

ttgcaatttt ttatatcttg atttcacat

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> artificial

<400> 6

gcgaagaatc aaaactggtc aaa

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> artificial

<400> 7

aagtggagga ggaaatgatg ga

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> artificial

<400> 8 caagggccct gattatgtga a

<210> 9

<211> 27

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220> <223> artificial

<400> 9

acaaggacaa ggctatgaga agtaaga

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> Sequencia Artficial

<220>

<223> artificial

<400> 10 ggccatgaat caagccactt

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> Sequencia Artficial

<220>

<223> artificial

<400> 11

gagttagatt tatccggcaa cga

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> Sequencia Artficial

<220>

<223> artificial

<400> 12

cccgaagaga tgtcatgtta acaa

<210> 13

<211> 26

<212> DNA

<213> Sequencia Artficial

<220> <223> artificial

<400> 13

gggttacctt catagctgct attttc

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> artificial

<400> 14 gggcacaaca cctgaatgg

<210> 15

<211> 29

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> artificial

<400> 15

ccgcagtgaa tcaagtaatt agttaataa

<210> 16

<211> 27

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> artificial

<400> 16

aaggtttagt tcgatcagtg attttga

<210> 17

<211> 32

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220> <table>table see original document page 85</column></row><table> <22 3> artificial

<400> 21

gtaataatcc caaacatttt tcttcga

<210> 22

<211> 28

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> artificial

<400> 22

gggatgagtt gaattaattt tcaaagta

<210> 23

<211> 26

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> artificial

<400> 23

gcatgctgct tttaactatg aaacat

<210> 24

<211> 28

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> artificial

<400> 24

gttgatgaag tatacaattt catttgca

<210> 25

<211> 26

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220> <223> artificial

<400> 25

aaaccaagtg aggagacatt aattca

<210> 26

<211> 25

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> artificial

<400> 26

ggctgagttg ggttaatatc acatt

<210> 27

<211> 25

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> artificial

<400> 27

aaaaagttga atgatcacct gcatt

<210> 28

<211> 26

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> artificial

<400> 28

catttgtctt ttgcaggcta atctaa

<210> 29

<211> 22

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220> <223> artificial

<400> 29

atgggcaaca gttgtcatat gg

<210> 30

<211> 24

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> artificial

<400> 30

tgatgatggc atggaattat tacc

<210> 31

<211> 26

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> artificial

<400> 31

atttttggta cctctctttc cttcaa

<210> 32

<211> 2 6

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> artificial

<400> 32

ttattaccaa catccaaaca cacaca

<210> 33

<211> 26

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220> <223> artificial

<400> 33

gtggcaagga aataatcagt agcttt

<210> 34

<211> 31

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> artificial

<400> 34

atccttaaca tgatttatgt tgtaatttgt g

<210> 35

<211> 24

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> artificial

<400> 35

ggaggaaggg tatgcaactt ttac

<210> 36

<211> 23

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> artificial

<400> 36

catttcttca acatccgaac caa

<210> 37

<211> 27

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220> <223> artificial

<400> 37

cataagacgc gttaaacgtc agtactt

<210> 38

<211> 26

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> artificial

<400> 38

ccaacgatct tgctaattag cacata

<210> 39

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> artificial

<400> 39

cgaggttgtt agccgttgga

<210> 40

<211> 26

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> artificial

<400> 40

accaatcaac ctttctttat cgtttt

<210> 41

<211> 25

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220> <223> artificial

<400> 41

tgtggtaatg cattttcttg gtctt

<210> 42

<211> 26

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> artificial

<400> 42

gaacaggttc caacactaat gtgagt

<210> 43

<211> 23

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> artificial

<400> 43

tggaagcaat gtcaatcaat tca

<210> 44

<211> 22

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> artificial

<400> 44

tccatggcat ccttaagggt aa

<210> 45

<211> 25

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220> <223> artificial

<400> 45

caattttatt cttggcacct tcatt

<210> 46

<211> 24

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> artificial

<400> 46

gtgaagtgta ttccagtggt gtga

<210> 47

<211> 24

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> artificial

<400> 47

cgcatatcaa caggacagac aaaa

<210> 48

<211> 28

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> artificial

<400> 48

cgttgagagt actattaata gccctcaa

<210> 49

<211> 26

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220> <223> artificial

<400> 49

caggcgatcc ctaattataa ttatcc

<210> 50

<211> 19

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> artificial

<400> 50

cgcaggaggg acatggtaa

<210> 51

<211> 25

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> artificial

<400> 51

ggagacagtc atgacatgca tattg

<210> 52

<211> 26

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> artificial

<400> 52

tcaactgcat tgttgcttta atttct

<210> 53

<211> 22

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220> <223> artificial

<400> 53 accgtgtcct taaagctttc ca

<210> 54

<211> 27

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> artificial

<400> 54

aaggttatat aaatcaaggg gaatgct

<210> 55

<211> 19

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> artificial

<400> 55 cgcctgggag caacaagat

<210> 56

<211> 21

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> artificial

<400> 56 ttcgaagaat gggagcagaa a

<210> 57

<211> 26

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220> <223> artificial

<400> 57

tggagatcat ctataccgaa tggatt

<210> 58

<211> 30

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> artificial

<400> 58

tgtcttgata attacacagc tctgatacaa

<210> 59

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> artificial

<400> 59 gaaatgcggg catatatgca

<210> 60

<211> 29

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> artificial

<400> 60

gcttctggtt ctagttctaa cttctacca

<210> 61

<211> 17

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220> <223> artificial

<400> 61 gggtcgggtc gaaccaa

<210> 62

<211> 25

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> artificial

<400> 62

cgaatattca gtgaaacggg ttaaa

<210> 63

<211> 21

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> artificial

<400> 63 aggcggcttg aagaatttga c

<210> 64

<211> 23

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> artificial

<400> 64 ttagccaaaa tccatagcag gaa

<210> 65

<211> 22

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220> <223> artificial

<400> 65

aacatcaggg tcagcattcc at 22

<210> 66

<211> 24

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> artificial

<400> 66

cacaatatgg tcagacagct ttcc 24

<210> 67

<211> 492

<212> DNA

<213> Glycine niax

<400> 67

aacaaactcc aacaccccaa cgacgtcatt catggaagga cgctgggtcc catcctcatg 60 caaacagctt agcgcaacct cgccaaatct gttcaaacac tgagttgcta tctggccctt 120 tagttttgca tccacaatgg cacccagaga acccttctga tatagatgct tcgcccaatc 180 aacc agtgac acctgttgct tctccaccat gcggagcaaa ggctgtctcc cagacaatac 240 ctccaagagc accaccccaa aggagtacac gtcagacttc tcagtcaaac gctgtcgttt 300 gtaatactcc gggtctaaat atccaacgct acctttcacc tgagtgctca catgggtcat 360 tgaagaacca atgggcccaa ttcgggataa cccgaagtct gaaaccttgg ccacccattt 420 ctcatccaat aagatgttgg tgctcttcac gtcacggtga atgatcatgt gcttcgcacc 480 cgtatgcaga ta 492

<210> 68 <211> 655

<212> DNA

<213> Glycine max

<400> 68

attgataata taaagcaaaa ggacgttacg acaaaaagct cgttccccat gaatagttct 60 tcgtggacaa atcaatgctc tgtagtactg ttggcttaga ttaattttac tacggattta 120 cctacggtca caaaattgac tgctgaaaat ctttacagta cttcatcttt ttcatacatt 180

aaaaatttac tttatttctt atatatatat tattagtata atcaattatg catatatacc 240

aaccgatcga gcccttgctt catttccaaa caatatggca tacgaaaatc tatttattat 300

atagagatta aatgtgaaca cttcttagtt cttaactcgt gtggttgtat tattatgaaa 360

caccagcctc ttcggctata ctcaattcta ttctattaag atcttggtta aagttttaca 420

ttcatcttta ttttaacagt atcctatata agaaaatagg caaaaagatg ccacagctgc 480

attaatttgc tagaaaaata taggtgacta gcctgtaaaa ttatgtcaat ctcttgctct 540

gctaccttat caagccgcac tgttgcactg attgcatgta gaggcatcgc aacagcactt 600

aatttgcgag atactggtag tatatgattt taattggacc ccaacaagcc atttt 655

<210> 69

<211> 668

<212> DNA

<213> Glycine max

<400> 69

acttttgtac aagctcatca atgtatatca tagtttttga aatcggtaat gaaccaatgc 60

aaaaaatggt ttaaacccgt atttctttag gagatattag gtgaattgga tgattaagga 120

aaaatggaag gaaaaaatat cacaagttta attcctgcta ataaaattaa tattttaaca 180

actaacattt gctcatataa aaaaccccaa tattttttaa aatttaatct aaagcatttt 240

taagttaact aaaaacatat ttaataagaa ttaaaatagt tgtaaattat tttattaatt 300

attattaatt actcttataa aacatataat ttaatcatta tatcaatttg caatttttta 360

tatcttgatt tcacataatc ttatattaac ttcttgtttt cttttttatt ctagatgtaa 420

acttgttatg aagtgatttt actgggtttt gaccagtttt gattcttcgc caattccttg 480

aacgattttg tagtttattt atatcaaaca ctaaatcaat tcatcagttt tctgggtcaa 540

accaacaaat ttgatctggc atcttataac acaattgttt atggaaaaca catctaatgt 600

gattaaacaa ggacatcacg caacttggca gttaccactt ctttgccttt gctccaatat 660

ttttattt 668 <210> 70 <211> 612 <212> DNA

<213> Glycine max

<400> 70

ctagtggtga caatattcct gaaaggggtg gcaacaatgg tgggaggtcg ggtaatccag 60 gaatgggagg aagaagacca ccaggtgttt ttggattttg aagtggagga ggaaatgatg 120

gatctatttt tggaggaaat atgtgtttca cataatcagg gcccttgatg ttttgaatgc 180

ttggtttttc gttgcaaaga actggctgtc taagaggctt gaatgagaaa aagccggctg 240

agaatatgtg tagtccttcc tttctggact tgaggcacag tgatgaagaa gttgctgctg 300

aggcaacagc acaataaggc tcactgctat ttattagttt cacagtgcat ccttttattc 360

ttttcacatg tttgctcact gagaaaggca actgcacctt gaactcccca tgctcatctg 420

tcttcacttc tttcctaaac cttggctttg acctcccata cccatctttg cattctacag 480

caactgatgc acctgccatc atgaatatag aaaaacataa gacaacatga cttcataatc 540

aaaatttaga gcatgtgtgt aagagttaag agatatgaaa ctgaaccttt ttaagaaaaa 600

taagtcaagc ag 612 <210> 71 <211> 941 <212> DNA <213> Glycine max

<400> 71

caagcttgtt gcctgcagaa aaagcacatg ggatagttgt taatagtttt gaagagttgg 60

aagcagaata tgttgaagag tgtcaaagat ttacggacca tagggtatgg tgtgttgggc 120

ctgtgtcgct gtcaaataag gatgacaagg acaaggctat gagaagtaag agaaactcaa 180

gtgatattga gagtgagtat gtgaagtggc ttgattcatg gcctccgagg tcagtgattt 240

atgtttgcct tggtagccta aaccgtgcaa cgccagagca gttgatagag ctcgggttag 300

gattggaagc gacaaaaagg ccattcattt gggtgcttag aggtgcatat ggaagagagg 360

agatggagaa gtggctgttg gaagatgggt ttgaagagag ggtgaaaggg agagggcttt 420

tgatcaaggg ttgggtgcca caagtgttga tcttatcaca tagagcaata ggagcgttca 480

tgacacattg cggatggaat tccacactcg aagggatttg tgctggcgtg ccgttggtaa 540

cttttcctct gtttgctgag cagttcatca atgagaaact tgtacaagtg gtgaagattg 600

gcgtgagtgt gggagctgaa tctgttgttc acttgggtga agaagataag tctcgggttc 660

aggtgaccag agaaaatgtt ctggattcta ttgaaaggta atgggagaat ggccaaaaaa 720

aaaaaaaata taggaaaggg ctttaaagta ttccgccatt ggcagggaaa gcaaaaaaaa 780

aagtgggttt tttttctcac atggtcctac tcattgggcc atataccttt ggagggttaa 840

ccaagtttaa ccagggttct attttttgtt ttcaacacca attgcttttc tcaagggtca 900

accttaaacc caatttgtct tccgaaagaa tttttttttt a 941 <210> 72 <211> 652

<212> DNA

<213> Glycine max

<400> 72

taattatatt atttgatttt ttttattcat gacatttatt ttatataatt ttttcttagt 60

ttggtcaaat attatcatcc ttttcattat ctcactaata aggtggattt tttttgtttg 120

acaaaatttc ttttttcaga ttggtcaaag ctaaagaaga tagaggagtt agatttatcc 180

ggcaacgaat ttaagggacc acttccctcg tcttttgtta acatgacatc tcttcgggag 240

ttggaaattt ctcataatca cttcattgga aatttcgatt ctaacattgc aagccttaca 300

tcacttgaat attttggttt tacagaaaac caatttgaag ttcctgtttc tttctcaaca 360

tttgccaatc attcaaagat caagttgatc gacggtggag gaaacagatt catattggac 420

tcacaacata gtttaccaac ttggattcca aaatttcagt tacaagagct tagtgtgtct 480

tcaacaactg aaactaagtc tcttccactc cccaattttc ttctatacca aaacagttta 540

atcagcctag acttcagtag ttggaagttg gaaggagact ttccttattg gttgttggaa 600

aacaacacaa aaatgactga agctctgttt agaaattgct ctttcactgg tg 652 <210> 73 <211> 671 <212> DNA <213> Glycine max

<400> 73

aaggattgat gtataaagct attgctgttg ccaacaatgc tgctgagaat gacactgcaa 60

agctcacata gaaaacatac atgtccacca aactaccatc gtctacatga gtgtgtgaat 120

catttggtat aatactaggt ggaggattgc aactttttga cagtggaggt ccacaaagga 180

aggggttacc ttcatagctg ctattttcaa aggtcgagaa ttgtcctttc cattcaggtg 240

ttgtgcccga taagttgttg tgtgccacac tgaatacttc aagggaggtt agcttactca 300

gttgaggagg aatttgacca ctcaacttgt taaatgaaag gtctaaactc tctgtttgta 360

ccaaattgga gaatgtagct ggaatttgcc caatcaaatc attatgagac aagttcaatg 420

ctcgaattct tgtcaaattt ccaagatcaa atgggatatt cccattcagt ttattgtggg 480

acaagtcaat tccagacata taagcaagga tgctccttgt gtaagtgtcg gttctcttct 540

ttgaagtgaa atttactttc tcttccacat ttggtaattg tgatgggaaa attttatttt 600

ggcctgtaga accccaaccg gacaatcttt ccaaaaaccg ttcaggatcc ttattctcaa 660

aagacatttt t 671 <210> 74

<211> 619

<212> DNA

<213> Glycine max

<400> 74

aaatctctca ggtcattgct aatctgctaa taattaatat ttacttatgt aataatttct 60

ctgactatat ttgtgttaac tttgcgttga aattcaccat atgcaggaca cttcaactag 120

aatacataga tctctttctg atccactggc ccattgctac taagcctgga aaagttgtgt 180

accccattga agtatcagag atagtggaat ttgacatgaa gggtgtgtgg ggatccatgg 240

aggagtgcca gagacttggc ctcaccaaag ccattggagt cagcaacttc tccatcaaga 300

agcttgaaaa attgctctct tttgctacca tccctcccgc agtgaatcaa gtaattagtt 360

aataattaag ttgatcacac attagtttaa ttacctgact gatccactga tcaaaatcac 420

tgatcgaact aaaccttaat caatccttaa caggtagaag ttaaccttgg gtggcaacaa 480

cagaagctta gagatttctg caaggaaaag ggtattactg taactgcctt ctcacccctg 540

aggaagggtg ctagtagggg tgctaatttt gtgctggaca atgatgtaat caaagaattg 600

gcagatgctc atggcaaga 619 <210> 75 <211> 978 <212> DNA <213> Glycine max <400> 75

ttgcatgctt ttagtagatg aattacacat aagtaaaaca agtaaaattt atacaagtga 60

ccaggtataa aatgatggcc acttgcaagt tagatatgca tatacataaa gtaaaagtaa 120

actgtttcca gtaaaaactt gtgctcaaaa gaaccaacag tggttcacta aaatcttatt 180

agtccagcat agggcataaa gatgtgtatt aaaccatcac aatatgcaca acattcgccg 240

agaggtttca gatattttga taagctaatt agatgataat aataataatc agatgacact 300

gctcttctgc aatgaaagac ttcatctgag gaatgtgagt tcttgatatt ttaaataata 360

ggagcatata ggatatagca taggcagaga cacgcaaacg gctacagttg ttgatcaatc 420

agattactgg atgtggttct ttaccttcta tccccaggaa tgaatcatta tagccttatt 480

ataggtatct ctcccaatct gacatatatc tcctttccta gggatataaa cagcaaatca 540

aaacctttaa caaaaggaaa gtattcactt acaatgatag caccaacagg gtccatccaa 600

tcatcaacat aatttgccaa aagtgcagca ataaggccaa tgatattagt gatcacatca 660 aaaaagtgat cctgggcata ggctttaatt atctcattgg taaaagaacg acagtaaatc 720

atcagcagga atttcaccaa agtcactgaa agcataatgc ccacaaccca gcgctcttgt 780

tccttggtca agttgaatgc attttcctgg aaatgtcatt acgagacaca ttagaaatac 840

ctagaaaaaa aagagatcct aaatgcaact aaatgaaaat ttaatgtttt agcagtttgg 900

gtgtcagatt tgcctaaaaa aatagagcaa gaatcaactt acagaagata ttaatgtgcg 960

ggtagactcc aagattat 978 <210> 76 <211> 845 <212> DNA

<213> Glycine max

<400> 76

ttgcctgcag gcatagtcca tctgaggata ttactagtat tttgtatgat gtgtttgact 60

attttgagga tgtcagggag caaggtggga gggtgtttgt gcactgttgt caaggggtgt 120

ctaggtctac ctccttggtc attgcttacc ttatgtggag ggaagggcag agttttgatg 180

atgcttttca gtttgtgaag gcggcgagag ggattgctga tccaaatatg gggtttgctt 240

gccagctgtt gcagtgccag aagagggttc atgctgtccc tcttagccct agctctttgc 300

tgaggatgta tagaattgct ccccattcgc cgtatgatcc tttgcatctt gttccaaaaa 360

tgttggtgga tccttcatta gctgcattgg actccagagg tgcgtttatc gtgcacattc 420

cttcagcaat atatgtttgg gtgggtaaga actgtgaggc caccatggag agggacgcca 480

gaggggctgt tggccagatt gtccggtatg agaaggtaca agggcctatt gtgatgatta 540

aggaaggtga ggagcctgtt tacttttggg atgctttttc agattttctg cccttaatgg 600

acaaatctgg caaatctggc agtaggatag aagatggaaa actatttgtt ttgcctggta 660

agaggagagt agatgcatac aatgttgatt acgaagtttt cacaaaagca atcacgggag 720

ggcttcgtgc cttcttttgg ttcattctgg tgaacatgaa acccatttgc ctgcaaggga 780

aaatatttgg agtgtaaggc gtaaagtttc ccattggtac atggaaagag ttgttacggt 840

ccctc 845 <210> 77 <211> 533 <212> DNA <213> Glycine max <400> 77

tcaaaccatg ttaaactgtc tatttttctt ctccctctgt tcgcacagct tctaagcatg 60 gcattcctca aattggtgcc aaattgcaag aatttctggc tgatttttgg aatataattt 120

tacttcggaa gagggaggag caacttcaat aaaaaatact ttctaatttg aaattttaac 180

tccactattt tataagtaat aatcccaaac atttttcttc gatttttcaa tagcaatccc 240

tcctctttcc tctactttga aaattaattc aactcatccc agtttagaat ttgtgattta 300

aaattttgat catagaaatt aggaatatac agtaaaactt tatttggggc taagaaaatg 360

ataaccagaa aaggaataaa acataaaaga caacaattaa ttgaaacata catgtcaata 420

attagtttaa taaggacgct cacagccaca tccgttgatg gttttccact gttattactt 480

agtctagttg atgctgtagt agcattggta ttcggggaat aagcctctga gca 533

<210> 78

<211> 645

<212> DNA

<213> Glycine max

<400> 78

aggtaatcct aatgcatgct gcttttaact atgaaacatt aaattcctat aagttatatg 60

cattgcgaag agttctgtgc aaatatgcaa atgaaattgt atacttcatc aacaagtata 120

cagaatacta cacttgaaga ttgtataagt cttagcctat ggtgttttat tttgtgtcat 180

caaatactat accaaattgg atcacattat cagcagaaaa tcataataca taagtttaaa 240

tcccaaaaat gcaaggtttc aaagaatgac tgaacaaaat caatgagaaa caacactcca 300

gcacaatttg tagacagttg agcataaact aataaaaata tatttcaatt agtaaagaag 360

ttgtcaaaac ctaacctttt gcttgatcca gctatgtcgt ttgccactgc gaggacaaag 420

aagcacttgc actgaagagt gcttaaaaaa tctacgagtc tcctcatcat gagttgccat 480

gacaccatcc tgaacgtaaa gtccaagagt atctcaaaac taaagctaaa agggaaaatc 540

ataaatatta tatttggatt aatgaaaaaa aataacttaa taatctaagt ctttcttgaa 600

ataaagtaaa aatcagtagt catacatgag aaagtgttaa tgaag 645

<210> 79

<211> 1178

<212> DNA

<213> Glycine max

<400> 79

tctcgggtag ttgagtctta gtgagttagt taatgacaac taattacagc tgtcatagct 60

aacagctttg tctatataaa cagatctgta ctctggagtt agttgggtta atgaaactaa 120

agtttttttc ctctttcatt ttctgttatt aaaaatcttc tctcaagatt ctattaacgg 180 acatacaagc actcgtaata ataaactaag gattaatatg ttctagcata tttatttcct aaatttgtgc ttctgggttt tgattatttt tcttgaacaa tttgattata agcttttgtc aagatgtact aatgtgtaac atgatttcct agtgaggaga cattaattca gatagatctc attaacccaa ctcagccgtg gtcactagct tctcctttac ctgtatctac ctttgcctct cgttccctag ttgctcaaca cattcctaaa ccaccttcat cgggacagtc actaccgaca tcccaactaa ctcctgcaag tattccagaa ctagagaagg attcaagtgc tctatctgtt gaaacagatg aactagggtt cattgctcat ccacagtcat catctatagg gactgaaaag gtcttggtag tggccactgt agtttatatc tagtttcaga aattgacttt gttatttaac ctcaagacat gacagcacat agtttcttag <210> 80 <211> 807

<212> DNA

<213> Glycine max

<400> 80

tctacttgta ggagatatag aatctaagat cgatgatatg ccttacctgg atcagctatt ttctgactct gctcgccccc atctgagagc ctctcgtcag atttggcatg ttcttatatc aattctttta tatttaagtt catgccacaa tgttatataa aaaagttgaa tgatcacctg aaagtactta caatctaaaa ccaatggttt aatgtattac attgtcatgt cctgtaggct agaattataa ttatccattg cttttaatga ggggggaggt gctgatcttg ttcttcccac

gaataatatg gtagaatact tacatgtaaa 240 atgacatggc aatgcctctc attatttgtc 300 acactcaact agcttttcag tcagtttctt 360 atactcatga aagaaaaata agctaatcca 420 tatttgtctt cttactacag atacaaacca 480 ttttgctcaa ccatgattgc tgaatgtgat 540 ttgaatcgac aatctggtgc atcaaataca 600 gagtcccttg taaagtcatt aagttatgtg 660 cggctttttc aaccagcttc atttgctgga 720 ttgtcatctt tgctgagtaa atccttcaat 780 acaccaagtt ctgcaagtgt tccaaaaaca 840 tcaaggttat caaaaatcga aaaagctaat 900 gatgttctaa aatggcgctg gcttgaggaa 960 taataatcta tgtttcatgt tggtttaggt 1020 tctactttac ctgttagttt tttcccactg 1080 atttttaatg cagtgatcga gctgtgaatt 1140 aaataggt 1178

gaaggggcaa ccatggaaat tttttggaac 60

gcagtcttct cctgtaacac caataactaa 120

aataacagca tctaaacgca caaaaccggg 180

aacttgcatt tttgatattt ttctttttct 240

taaatcttgc ataatttatt tttagccaaa 300

cattatagtt aataaggtta ttgtgaaatt 360

atagaatatt agattagcct gcaaaagaca 420

tctatgaaaa taaaaataaa ttttagtgta 480

acagaaaatt tcttattgat taattgactg 540

ttcataatat ctttttattc ttcaaagaaa 600 tagagcaagt aatctttatg cagtagtttg gggttctgtt tggttcatta accactcatt 660

cccataaaga ctgtagtgtt ccatgaatta tcgtttgttt atatggtcaa aattatgtga 720

taagtattta tttgctactc tacagtttga tactctctct ttggggataa atgcttgagt 780

actctttttc gcccaagatg cataaaa 807

<210> 81

<211> 1395

<212> DNA

<213> Glycine max

<400> 81

acttgcctga gagtgttgtt gcttctgaac aggctgcatg ttcatcacat ttgaaagaaa 60

ctgttggaaa acctactctt gatgcatctc aacccagccc aactgctact cccagagata 120

ttgaggcttt tggccgatct ctaagaccaa acattgtttt gaatcataat ttctccttgt 180

tggatcaagt tcaatctgca agaaacatgg agactgatcc tagtaatcgg gatgtcaaga 240

gattgaaagt ttctgataat atggtggtgg acaaacagct ggtagattcc aaccatgggc 300

aacagttgtc atatgggtat gataatgtgg tcaaagatgg gtggtcaggt aataattcca 360

tgccatcatc agatcctaat atgctaagct tttcaacaaa gccacttgat ggacagtaca 420

caaatgcatc ttctcaagag gaggttggtt atggtaaaaa aattgctctt aatgttgctg 480

acagtaacaa agcagcctct gttaaaagtg attattctct ggtaaatcct caaatggcac 540

catcatggtt tgagcgatat ggaactttta aaaatggtaa gatgttgcca atgtacaatg 600

cacagaaaat gactgctgct aagataatgg accagccttt cattgtagca aaccaattca 660

gatagtttgc gctttcataa ttcagtagag caaattcaga gtgtcagtga tgctcagcta 720

agtaatgcta gtgaaagtcc aatgcctgct ttagctgcaa ataagcatgc agactctcag 780

ttatcgacac ctgctgttga acctgactta cttattatga gaccgaagaa gcgaaaaagt 840

gccacatctg aactcatacc atggcataaa gaactgttac agggttctga aaggcttcga 900

gatatcaggt ggttgccaaa actaagtgat ttaatgtgct tatttttcgg tgttgctatt 960

gttggtgtag taaaagatcc catgtctcca gttgatattg tgttgtttca attgttttga 1020

aagaaaacgg tgtgtttcca tagtgtcagt atgactattt taatattgtt ttatgtttat 1080

caatatatca agtatttgtt ttcctataac ttaaaatttc ttactatgtg gcagtgtggc 1140

agaattagac tgggctcaaa gtgcaagcag attgattgaa aaggtttgtt tataataaaa 1200

tcagtctacg catgaatcta taattctata atttatgagt tcactttact ctgtataatt 1260

ataattatag gttgaagaca gtgtggaggt agttgaagat ttgccagcag tggtgaagtc 1320

aaaaagaaga cttgtcttgt actactcagc ttatgcagca acaacttagt cctcctccag 1380 ctgcaggcag gcgag 1395

<210> 82

<211> 618

<212> DNA

<213> Glycine max

<400> 82

atttcttata ctcaaatttt tggtacctct ctttccttca ataaaatttc ttcttttata 60

catgtgtgtg tgtgtgtttg gatgttggta ataaatttct gccagaggat ttgaagatga 120

agagtccata agtttgttga ttacttgata caatctaata gagtatttta accggcccat 180

tttttttctt gggctaaagt gatgtaacat ctaacaagtg ttgaggagat aaaacatttt 240

caaggagttt gattgttgga tatctagagc aattgtaggg ttttattgta ttcatgatgc 300

ttcttaatca ttcaaattgt ttgtgccttt tcatgttata gctttgtgaa gaggagttac 360

tcaaggaaga agcgctttta gtaaaaaaac aacttatttc ctttagtttt attaatgact 420

tgtatgcaga ttggacaaca ctttagggat ggctacttgc ataaagaaga atttaagata 480

gtttatgttg ctccaatgaa ggtatgttga tgcttttgtt tttctttaca tttctctatt 540

cagatttgct ttttgttccc tgcatttgtg tgccattact catttctaag tatagattct 600

tgtcctttcc aggctttg 618

<210> 83

<211> 1085

<212> DNA

<213> Glycine max

<400> 83

tctttcgcca gcttgctgcc tgcagtaaga tccaaccttt atggtgggat tctatgtcct 60

ggataaatct caaaggtgct atgcctttga gtacaaaaca gctgttcatg cagtactcct 120

ttttgcaaga agatggtaga aggaatagga ggtggcaata ctggtggttg gctatcactt 180

ggtctacttg gcagcttcga aaccgaattc tgttctctgg agcgactttt gatggaaaca 240

aattggttga agacgccact ttcttaatgt ggacttggct tcataatttg gagaaggatt 300

ttactattca tttcaatcac tggtccagta acttcaaaca tcattttttg cagtagtagg 360

ggtgtttttt gggttcatat cacatgtatt ttcttcccat attttggttc ctaatcagac 420

ttatgttgcc tgattgagga accatattta tggtgtctaa ctctgtattt agtacctctg 480

gtacttttct aatatatata tagttttatc tttgctgatc aaaaaaaaaa aagtactcat 540

ttgtctattc ctgtaaagtg gcaaggaaat aatcagtagc tttaaaatca tctgatgtgt 600 ggatgtgaca caaattacaa cataaatcat gttaaggata tgaaaagtat gtactcatta 660

gtctcttcca tcaactaagc aaagcaacat ggaaatcatc tgtagctgag agtgactatt 720

aaattgtaag atttggaggt catggacctc atgtttatag ggacagtaaa attatccaat 780

tacccaaacc tttagacaat ctgaaatgca cacataatat ggtacaacag ttctaaatgg 840

ggcaggtaag tagcattcat tgctcaatat gtctataatt caagaatgaa gctttacatt 900

tagtgcatat ttggacctca gattggctta tttttgcttt aagaaaagct tatgatcaaa 960

atgttcaata aaaaacttaa agcttctttt tttttttcag tgtaaaatag tcagaaattc 1020

agaaccagat tgcacttagc cagttgtata taaaactatc caatggccat aaagaagaca 1080

gatca 1085

<210> 84

<211> 1052

<212> DNA

<213> Glycine max

<400> 84

aagttcactc ttaactaatg ttttttcact gtattcccta gctatatttc agactggtgt 60

gtgacagtct ttttttgttc atagatattg cggaagcttg aagaacgtgg ggctgaccta 120

gaccgcttgt atgagatgga ggaaaaagac attggggcat taattcgtta tgcgcctgga 180

ggaagggtat gcaactttta ctagaatgat tttcgaagat ttccatcaga ggttggttcg 240

gatgttgaag aaatgctgat taatgttttc ttatcccttc ccctttttag ttggtcaagc 300

aacacctagg gtattttcca tcacttcagt tatcagcaac tgtgagtcca attaccagaa 360

ctgtgttgaa ggtatttcat gatgaagatt tttttttcca gactgctcag ttgacatttt 420

ttcattgatt tcatcacatc aaaaagcctt gatacctaat tctgcatcac cactcattat 480

tttcaggttg atctggtcat tacgcctgtt ttcatttgga aagatcgttt tcatggtact 540

gctcaacgtt ggtggatttt ggtagaggtg aataaatttt catgtgatga ttggtcacat 600

tgtaaattcc ttggtttttg ttaaaaactc tgatctcttg ttataaaagg agaaatttat 660

caagatgaag agaaagactt tcaaagagaa aggaggatga ggaatcctcc taaacaaagg 720

aacaaaacag aaaacaacta ggaagaaaga gataatcaga gaaacaaatc ttcccagttg 780

ctcgatataa ctttcagtga aaatgctaaa gaaaccccct ttaaagcaaa tagatactga 840

gcacctgatc ttataccaaa tcatgtgacg tgctaaagaa acctccttta aaaatactag 900

aacagcttgt agcatatgta gcagatttat acaaaaaatt agcttcttta cttctgtcaa 960

aaccttgaaa accaatcatc gataattgtt tttgagactt aggacacacc caacattaac 1020

tgaaaatgct gaataagtaa tgccagggag gg 1052 <210> 85

<211> 855

<212> DNA

<213> Glycine max

<400> 85

tagaattaca ggtctggaga agtatctgaa gactgtagat tcggtgcggg attggattct 60

gtttcatata tactttttta acaacataag ttaatttttc atatagtttt ttatttaatt 120

ttataaatat tttgaataaa accaaaaata tatgtaagtc gttcgtacat aagacgcgtt 180

aaacgtcagt acttaataat aataatatag tgtaagaaac tcaactgggg aagtgcataa 240

aaaaataaaa gtataaatac aagaaaaatg aactaagaaa gtgtgtactt atgtgctaat 300

tagcaagatc gttggaacaa aaagccaaat tgactggtac tttctcgtta atttcttcaa 360

ttttcattgt ttcgttaaat actagtggca tgtccgtcaa aagtcaaaag ccacatattg 420

atgaaattgt gttgttagaa taattaatta attacttgca gagcaaatct cctccacaat 480

ttttcttttt ttctctaccc aagagacttc ctttcaactc agatactctt tgattctctt 540

caggaaaaca tcaactaatt aaaatctaat tttgtctttg atactctttg tccgcggaat 600

tcaccacccc caccttctca atttgtttgc tttctgcttt cttacctctt ttttctcaga 660

tttcatttgg ttgatccttt cttcaattct tcttctgggt ttgtagttgt ttttttatct 720

gacttgtgtt tctaaaatcc atgaaccgta tgtgatttcc agtgtctttt tctttttcca 780

gattcccaga gagaaaaaag aaaaaatcct tttgtttgtg tgagactgta aggatcaatt 840

ggttgagttc tccta 855

<210> 86

<211> 1066

<212> DNA

<213> Glycine max

<400> 86

gtatggggcg attcaggagg tggaatctgc aatacaagag cttgaaggga acaatgaggg 60

gaatgtaatg ttgacagaaa ctgttggacc tgaacacata gccgaggttg ttagccgttg 120

gactggtata cctgtgacaa ggcttggcca aaacgataaa gaaaggttga ttggtcttgc 180

tgacagattg caccagagag ttgtggggca agaccaagca gttaatgctg ttgctgaagc 240

tgtgctgaga tcaagagctg ggcttggaag acctcagcaa ccaactggtt ccttcttgtt 300

cttgggtcca actggtgttg gcaagactga gctttcaaag gcacttgctg agcaactctt 360

cgatgacgaa aatcaattgg tgagaattga catgtctgaa tacatggaac aacactctgt 420 ttcgcggttg attggtgcac caccagggtg tgtggattga cattttcaca tttcagttta 480

ttgttagttt tctgtatgaa ctacagataa ctgactcatt gtttcgactt tcaggtatgt 540

tggacatgaa gaaggaggtc aactaactga agctataagg cggaggcctt atagtgtggt 600

actctttgat gaagtggaaa aggcacacac atctgtgttt aacactctcc ttcaagtctt 660

ggatgatggg aggttaactg atggccaagg ccgtactgtg gacttccgaa acactgtcat 720

tatcatgacc tccaaccttg gtgcagagca tctcctcact ggactttcag gaaaatcttc 780

aatgcaagta gcccgtgata gagtgatgca agaggtatgt ctcttgacac catttgttta 840

atatgtatga caaaggtctt tgtgctgtgt tttgacttgt gaccttgtct gttgaatttg 900

ttgtaacagg tgaggaggca ttttaggcca gagttgttga accggctcga tgaaattgtt 960

gtatttgatc ctctttcaca cgagcaacta aggaaggtca caaggttaca aatgaaggac 1020

gttgctagtc gtcttgctga gagaggaata gccattggca gtgacc 1066 <210> 87 <211> 890 <212> DNA <213> Glycine max <220>

<221> inseguro

<222> (719) . . (719)

<223> η = a, t, g, or g

<400> 87

attatgaagt atgtgacaga attgtgtttt caatatattt ctgacaatta gggattgcac 60

gggaaaatga acagcgacca gagaagttat ccttaaagaa gcaattgaag cggaaatgtc 120

tagaacaaaa tcccaatctt gtccaaaacc cagttatgtg tggatatgga gtgggtgctg 180

ccagtaacca gcccatggaa atcttgaact gtagccaacc aagtgagaac ttgcttatat 240

attaactttc tgaggaatac aataaaaaaa aattattttt ccttgaagtg atatgttttt 300

tcctgtcata cttggtatat tggatttagg aagtccctca aatgtatatc acagcttata 360

ttacatgctc tcttgtggta atgcattttc ttggtcttaa agattttggc cattttagta 420

gataatgtca aggtagtgag atttgagaat tagtgctctt agctgtactc acattagtgt 480

tggaacctgt tcttcctact tgtttatgtt tattgagaca ggtaccatgg cttgtggcaa 540

ggtgatattt tctaatggta tataaatata acctataaaa atgtagaccc tttatgagcc 600

tggaggatca aagaatggaa aatggaattt ggtttattac attcataggg gcgaaatgaa 660

atatgctgca tcatgattac cggcagacta aatcccaata aatcatcctt ttttctgana 720 ggaatggtcc cgcccagtta ggaaaaaact acaggtatct tttgaccgtt tgtggaagct 780

ctatgagtcg gttaaaccgc taactctatt cttttatatg caaggtgtct tctttttcga 840

gtaaacaaat caaatctctt aaaaaaaagc tccggataac ttatgtttca 890

<210> 88

<211> 640

<212> DNA

<213> Glycine max

<400> 88

aataaatgtc atggactatg atatacctga gcttgttgtt tttattcaag aggaacatca 60

gcaatttgtc aaggatactt gcattggtaa gggagtgtca ccagaaggca agtgtatgtc 120

agaagattgt gcagtaaatc atgatccaat gtcatgtcac tttgagaatg acttgaaccc 180

ccgaagagat tcaaatctaa gaactatgga agcaatgtca atcaattcaa atgggccaga 240

gtttgaatct aaacctctta cccttaagga tgccatggaa ttttatgatt caagaggttt 300

agtgatggat ggtgaagagg attcaggata caatatttca attgaccacc tcacaaagaa 360

gacaatacca gagaccatta gagaggtgag acactttaat ctcatccttg tgcattttac 420

gtctttggac gaggagttaa ttgtttttta gaatattgcc actaagacat taatacttat 480

attctaagca atataaaata tactgtggac tcgtcttctc ttttagcatg gttggtgaaa 540

ccccctacat caatgtacat cttctctttt gtttcatatg cttgattgta tgattgataa 600

aagattgaaa caagacttaa taatcatata gggagttacc 640

<210> 89

<211> 993

<212> DNA

<213> Glycine max

<400> 89

atcattttca aagagtgtat attttttttt tttaaatcgc tgagttccta aatataatcc 60

aaacactgaa ttgaggagtc aagtgctgtg tgtgtaagac attgcaaaat aagttaccac 120

aaattcaccg aagtttcata gatattgtct tattgttatt tgatcctgaa acatgctagc 180

aggattaata aaaagaataa aaatgttacc agctgcacta gtatagtttt gatcctgtca 240

tcctttctag caatggttcc attccttgaa tacacttcat ctgaatgacc aattttattc 300

ttggcacctt cattcttttc aatggaatca atgttggtgg agctcacacc actggaatac 360

acttcacccg aatgaccaat tttattcttg gaaccttcat tcttttcaat ggaatcaatg 420

ttggtggagc tcacaacact tgaatacact tcacccaaat gaccaatttt attcttggca 480 ccttcatttt tttcaatgca atcaatgttg atagagctca caacacttga agtcagctcc 540

atgatctgct cagactttgt tcctttgtca tcaattgcat cctcagtagt tgtctctggc 600

atatcttcat aagtagagag tttgacagaa tcgctgaaag aaactctttt aatttttggc 660

gttattgggc tttctaactt agaaacatct gattcaacca ttgacataga aaatctttgt 720

atcggaccag gttggataaa aaaatttcta ccctttgacc aaattttgtt agagtagtct 780

ttggttgtcc tccatctctt cagtttcgtg ctgccactgc tactttggct actggaagag 840

cctttaaagg tattaagttt caattcatcc gtttcgctcg atgtggaatt tggagagacc 900

ctctcaagct ccagaacaga atttggagcc tgcctttttc ccccaagatc cttgggtgga 960

tgttgccccc aaagctatct cttactgaag gaa 993

<210> 90

<211> 804

<212> DNA

<213> Glycine max

<400> 90

caagcttgca tgcctgcagt aaatatgcca tcaatatgag caagtgagca acagcctaaa 60

aattgttgga atgtttatgg ttagagattt aattggtttg catgattttg gtatttctat 120

ttattcataa tttggagaca cggatcatat aactttagga tttagatcaa gtagagtggt 180

tttaaaataa atcaggaatt gaatttaatt agttgtagat caaatttagt tggggttctt 240

gcactagtaa agttatgatt cttatggttt tcagtaggag ctaatcctgt attttgaatt 300

tacttatata gaatttgatc atttcagaat gatctgttag gtttcattta ccacccctta 360

cataccattt tttatcttca catctaaatt cttcttcctc tttggcgcat atcaacagga 420

cagacaaaat aaaatttaac ctgccttttt tagaagataa gttttgaggg ctattaatag 480

tactctcaac ggttatgctt ttgacttagt tgaacatttg ttcattgctt ttgattggct 540

cccccagtct tctcaatagc agtatcatca tcaacacaat cattctcctc tgccactacc 600

aactagtgct gagactactc ctaactctcc ttcgccaact ccatttcctc cgactttgtt 660

tccacttgat gatctcccca ttgaacttca taaaaatata tgttccactc aatacatctc 720

attatgttac cttaacctta acctatcatt gtttgtctct ttcctattat gctagtcttt 780

tgtgtttgat cctgtcatcc tgag 804

<210> 91

<211> 749

<212> DNA

<213> Glycine max <400> 91

tggcgcacca gaatggggac tgccgtccac agttccaatg atgacacttt acagtccata 60

tcattcaaat tttgttggac cttcatatca tcatccagga gctgaatcta ttaatcagat 120

gtggtcgacg aatgctcatc acttgcaggc gatccctaat tataattatc ctcatcctta 180

tagttatacc tatgattata attatacagc tcccgttgtt caccattacc atgtccctcc 240

tgcgccattg tttcataact ctttggttoa aaattctgtg ggagatgaaa ataatggagc 300

aactaccaat agtactgttg ctacaatttc agatgaagct agagaggaaa ttctggtgaa 360

atttcgaaac tttaaacaat ttgacgttgt tgaagacgtt tcagaccatc actttgttaa 420

tgccgactct tccatgcaac aggtagcctt ttaatgcaat ttttttcttc cagttttaat 480

cttaattatt taggtttaca tacagtcaat ttatttcatg aacagcattc aaagaattgg 540

gctaaaagaa tccagggaga gtggaagtca ttggagaagg atttaccagg tgagagttag 600

ttcgattagt attcatgtca taaattggct aaaatatttt ccttatctat ccaacttttt 660

gtatttaatt aaattgattt cttttacaag ccaatggatt tggactggat gaattggatt 720

cccaatttgg cattaaatat gctaaaggg 749

<210> 92

<211> 685

<212> DNA

<213> Glycine max

<400> 92

acccttcaga actgaatatt gctaacacac aaggcaacaa ccaaacttac acgacaaaca 60

tccacactaa aactgaaaaa cacaccttct tgcttgttca tcccgaagtt tggcatcaaa 120

ttctttgcta ggaggatact ttggcaaact tgaaggatca caaggtagag gctttgttgt 180

aaagaactaa atagcaagca aaccaaaagg agacagtcat gacatgcata ttgaagtatc 240

agcaacaata atttacatcc aaaataaaat agaaattaaa gcaacaatgc agttgagtaa 300

gagataatga ataaatacac acgaatatgc gataacatat caggatatat aagtgaggac 360

ttgcaataat agtaacaata agaattttct actatattac attcttggag gcaatacagg 420

ttaggacttg caacaatagc aacaataaag agacaacaaa ggagcatcaa tttgattaaa 480

gcaaaaggaa aacatgcaca aaaatgacaa aaaattccaa ggttgtcata ttttggagaa 540

tacacaacct aagtttgaaa tataatttaa tccaactctt tttaccaaca tgaacatcca 600

ctcttcgtta tgtgtactga ctgatattat aaaatgtact caagtagtct gaaaaattca 660

tcatgaattt catacctcac tcttc 685

<210> 93 <211> 652

<212> DNA

<213> Glycine max

<400> 93

attgtgattt tcactggttt gtgagagtgc aaaagaattg ttcagttgaa tgtgcaaaat 60

tgcttggatc agttgaaatg cacctatgaa tttgtatttt tcttttttat gacaaagggc 120

atgtagaata tgattatatt ttgtttgaat agtgtggggg agcattactg tttttttttt 180

tttggaaaaa aaaatctgat gtggtagtgg tgtctgattc acatgtggaa aattcttatg 240

gattgggaaa gaatattgat tgtttccttt tctcacagtg ctggtggtga aagcagtgga 300

ttccttgcat tcagagttca gggctgtgga taatttggtt gtgtgcaata ccaaccgtgt 360

ccttaaagct ttccagaatg ctcgagttgg atcccatgta agcattcccc ttgatttata 420

taacctttat gcaaatgtac atttaatatg atgctcaatg ctcaagggtt caaggctaat 480

aaacttgtta actgttttga ttgtaattgg tagagatgtc ctttaagcca ttgggctgat 540

cttgatgcct ttatgtattt tgacattttt accaaaaaca taactaatat aggaacccaa 600

aaacttagga ttcgattagg gagaacctaa ggctgcccat taaaacttga gc 652

<210> 94

<211> 821

<212> DNA

<213> Glycine max

<220>

<221> inseguro

<222> (798)..(798)

<223> η = a, t, c, or g

<4 00> 94

attccataac ggtttgcaac tcttgaagat cgtgactctg gtcgtgtcac tcctgcgtat 60

cgcgcctggg agcaacaaga ttagttgttc ctctcatggc ttcaatccac cgtttctgct 120

cccattcttc gaaatttcat cggctgcact agtttgtggc ttctctagga caaaatccac 180

aactattttc atgctcatac aaatgcaaag gcacggccac ttcgtacaga gctgcatcaa 240

ctcactcttg aaggtcgtac tatttctgat tatttgactg agattcagaa tcttgttgat 300

tcttttactg ctattggtga tccaatttct atttgcgaac atgttgacat tattattgaa 360

gaatgtgtac cagaaaacta tgagtcctct gtttcgcaca tcaataatag atctgaacct 420

ctcactattg atgaaatcaa aactgttctt ctcggtcatg aggctcagat tgacaaattc 480 aggaagaagg cagtggtttc ggttaatgtt gcttccacat ccactgtgtc ttctgtgact 540

aatccatctc atgctaattt tggaggtttc agaatcagaa tcagagtcag tataaaaaca 600

gaggacgtag cagtattcag tgttacatct gtcagaagtt tggtcatgat gttgccaact 660

gctggcacag gccctcaact tcctatgctc tgctccttat cctatgttgg cacaatttcc 720

caccatgcct cagctttatt ccaatttctt tggagctgct ctgcatttcc ctcttatctg 780

tttatgcagg ctcctgtntc tcaacaatgc cagcagccact 821 <210> 95 <211> 738 <212> DNA <213> Glycine max <400> 95

ctctagagtc gaccctgcag ttattatagt gacagaagag gaaaagtcac cacgactcat 60

atgtaaaaga aaagatagaa aatgatgaaa ggacaaggga aaaacactac actaattaag 120

tcaatttcat tacatcatta gaaaaggaca tgagggggga aaagaaaatg ttgtgaggca 180

atttacatgg gtatttgagg tgggaacata atctttagta cataccaaat ttctgtgtat 240

acattatagc atgtcccttt tttttttttt ctattctcaa gttgaattgg acagtaatag 300

attaatgttg taggatgcca agcacacaaa cattgagaat atattgatct tggctggaga 360

tcatctatac cgaatggatt acatggacct tgtgcagtta aacatgttaa ttttttgtat 420

cagagctgtg taattatcaa gacaattaag gcaattatat taggctttaa gttcttctca 480

ctacttgtta ttgaaattta ttactaattg tattctatga atatttttca tcattcacaa 540

aatcaaggca attaattaac acaaaaaaaa ctagttctat gtttcttttc tcttaccctt 600

cttatgttca tacaccaagt cttttgaata atttttgcca aaggttccaa agtttttaga 660

cacaccgagt tcatacatgg agtgtttctt aattttattt tcacaatttt tgctgattat 720

ctatctttta taattaat 738

<210> 96

<211> 710

<212> DNA

<213> Glycine max

<400> 96

tgtgatgctg tcaagagtgt tgtctacaaa ttttgcaaac cgagatacta gatgcctcaa 60

aattaagata ttaatttcag caataggtaa tgaataattt cttatggatg acagtctaga 120

ttcctctctc aaaaggagaa tcttctaaac aaactcattt taactcttga aattgtaagt 180 attaattacg ttaatctttt tattaattac tttaatattg tccctttttt gtgaatactt 240

atttataaaa cagacaacaa aaataagaat tttgtgaagt caaagattaa aatgattggt 300

gcatagactc taaagcaaat gggagtttac tcaaaatgtt tttctttttc aattggtcta 360

tatagtgaca tactatttta gtggccacta gattgtcatg agagtggaca taaaatggac 420

caaatcagcc atatcaggta tgtgggaagc gcactcatat agctaagtgc attgtttcca 480

catgaaattt cttactcttt tgagactcaa aagtacctat ctttagctaa tgcctgcatg 540

aaatgcgggc atatatgcac atgggtcctt tcagattata atgtggtaga agttagaact 600

agaaccagaa gctatactaa ccttggtaat tcgacaaaaa actaccaggt cgcgagagag 660

gttctggctg gggctttctt ctccttctat tgtgtccatc taaacgtttt 710

<210> 97

<211> 954

<212> DNA

<213> Glycine max

<400> 97

agtcgacctg caggaaaagt tgtaaataag gtaattaaat gctacaatat aatgattgac 60

aaaaacatta tctgtttagg aacaaatgga ttatatttta tgagacttaa acattgatga 120

aaaaaatggt caagcatcaa aagttgttat cagtcaatat ctctgtcaat aaatatccag 180

gacaagagtt gtgagccaac aatgaccatt cgttttgtaa tctgttatta tagcatatta 240

ttttgccctc tctataagag ggattaactc tttgactgaa aatacagaga aatattttac 300

aagccataaa tgcatttatt tggcctaaaa aacttaacac tttctttttg gccatacttg 360

tccgtgaaaa acgaaatttg ttggaatttt tcagggccaa aactgaaaat taaaaattaa 420

attgaaaaaa tgaaaatagc agataaaacg atttgaatga aagtaaaaat ttgtgaggga 480

attagagaat gttgagtaga gtgaaaatgg atcacgtacc gaataggaat gaggaacaag 540

agagagctcc gagaataacg aggatccctt cgccaagaaa cccttcaggc ttcagccttc 600

accgagaagc cgatcgagga acaggaaccc tagctgtcgt gaacgagaga gagtccgcag 660

tgcagttcac tgaatattca gctcacaact tttttttccc gaaacgggtc gggtcgaacc 720

aaaccggtta caaaacggag cggtttttaa cccgtttcac tgaatattcg gttcactgaa 780

tttgattagt ttgatcccta aaattaaaga ttaaattaat cactagtaat aattgtacca 840

aacttgacag acacacaccc tatcagtaag agctagtcta cctcggccta gaatacagac 900

taattaccca aaggttccag agaacaaatg aagtactgca ggcatgcaag ctgg 954 <210> 98 <211> 730 <212> DNA

<213> Glycine max

<400> 98

ttttattttc aaattcttct tgttacaaaa actttttaac tttttgatgg gtaaaatgta 60

caaataaacc attaattttg agcacttatt gatccttcac gaggttttct tctaaataaa 120

gttatacaca ggtatggatc gttgtatgca agaccacttc ttgagaagct tagggaagat 180

ggtgtataca tgaggcctct gggtaatgtc atttatctgt tgtgtggacc ctgcacatct 240

ccagaagttt gcaatcaact actcgtcaaa cttcttaggc ggcttgaaga atttgacgta 300

tgtaagaatt gaagtggatg aagtggataa gtctaatatt cctgctatgg attttggcta 360

agtttattgc tactattatt ttttgtgggg gaggaggaag gggcatgaat tgtaaatcca 420

agggttgcaa ttagcttggt tttttttcaa ttcagttgat gtattttatt tataaataaa 480

aaatgtatct tatttcaatt cccaccctcc ccccattttt aagatgttat taataaaaat 540

gttaaagtat ttaatcattt tctttcaata tttttggaaa aaaaatcaag ttatgtaatt 600

aaaaatatat attaactgga aacaaaacca gaataaatta aatagtcaat aggtctagta 660

acaattgaat agagtgtgag taattgtaaa tttttggaaa taatttttta attttatggg 720

ataaaaaaat 730

<210> 99

<211> 1061

<212> DNA

<213> Glycine max

<400> 99

agcagagtgc aacaaataga aaagggaaaa catccatttc aatagaaaga aaggttgagc 60

tgcaaattgt tgattaccaa tgcaatgggc ttcttccatc attatcagga acatcagggt 120

cagcattcca ttttgaaaca acgtggtaaa ggaaagctgt ctgaccatat tgtgcagcaa 180

catgcgttgt ctgtgtccaa gcaaatcata attagtaaaa ttaacattta cagccacacg 240

cttgtgcttc aagtaaaaca agaatcccaa actaccaaat tagcagatgt aaccagaaat 300

agacagccag gtataagaga tacataacat gctccaaatg ccttacccca gcaatctctt 360

gaataaaggg aaaatgaatc acagcaatct aacctgatat ccattcatat cggcagcact 420

cactcgagca ccctcctgga gtaaaagttc cgcaacctga atagcacccc gaaccgcact 480

ccaatgtaag gctgtctggc cagtatgatc cgttgcattt acatctcccc catgctgcca 540

accacaaatc aaccagttaa tttaggataa gactaattcc atacttaata tcaagccaaa 600

tttggctaca tacattcaat tgcaaaacaa acaaacacca cattcgattt ccatttccat 660 aacacaaaca tgacctacaa gccaacctga gctgagctga gctgagctga gctgagctaa 720 gctactttaa caaattcaaa ccaccaaaaa catcataatc aaatgttctt ctcttctaca 780 tctatatcat tccttcctta aacagcaata agtaactaat tcttacattt tcttttcttg 840 gagtaaaaaa atagtaattc agcgagtgcc aaaataacat acgcattcaa acaagcacaa 900 taaaagcaaa gtaagcaaag caaacacaat tcaacaaacc gatcaaagaa cctcaatgat 960 gtactgagca gcggcagtgc gattgttgag agcagcccac tgaagcgcgt agtatcccaa 1020 cccgtcgggc tcggtgacgg ggcaaccctc ttgctccacc a 1061

<210> 100 <211> 13

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<22 3> artificial

<400> 100

tctgggaggc age 13

<210> 101 <211> 14

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> artificial

<400> 101

tgggagacag cctt 14

<210> 102 <211> 15

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> artificial

<400> 102

ctcgttcccc atgaa 15

<210> 103 <211> 16

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> artificial

<400> 103

aagctcgttc tccatg

<210> 104

<211> 21

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> artificial

<400> 104

agatgtaaac ttgttataaa g

<210> 105

<211> 19

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> artificial

<400> 105

ttgttatgaa gtgatttta

<210> 106

<211> 15

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> artificial

<400> 106

tttggaggaa atatg

<210> 107 <211> 17

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> artificial

<400> 107 tttttggagg aagtatg

<210> 108

<211> 15

<212 > DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> artificial

<400> 108 ctcactctca atatc

<210> 109

<211> 15

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> artificial

<400> 109 cactctcaag atcac

<210> 110

<211> 15

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> artificial

<400> 110 agtggtccct taaat

<210> 111 <211> 15

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> artificial

<400> 111

agtggtccct caaat

<210> 112

<211> 13

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> artificial

<400> 112

aaggtcgaaa att

<210> 113

<211> 14

<212> DNA

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Claims (26)

1. Processo para analisar uma planta de soja em relação à resis- tência, à imunidade ou à susceptibilidade a doenças que compreende as etapas de: a. separação de um tecido vegetal da dita planta de soja; b. cultivo do dito tecido em um meio; c. exposição do dito tecido a um agente patogênico de planta; e d. avaliação do dito tecido em relação à resistência, à imunidade ou à susceptibilidade à doença causada pelo dito agente patogênico.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1 que compreende ainda: a. o isolamento de ácidos nucléicos da dita planta; b. avaliação dos ditos ácidos nucléicos em relação à presença de uma ou mais moléculas marcadoras para um lócus de característica quantitati- va associado com a dita resistência, imunidade ou susceptibilidade; e c. seleção da dita planta para uso em um programa de cruzamento.

3. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que o dito te- cido é uma folha, um tecido vascular, uma flor, uma vagem, uma raiz, um caule, uma semente ou uma parte dos mesmos.

4. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que a dita ex- posição do dito tecido a um agente patogênico de planta é realizada através de um meio selecionado do grupo que consiste na: (a) aplicação direta do agente patogênico no tecido; (b) inclusão do agente patogênico no meio de cultura; e (c) inclusão de um agente que é eficientemente contaminado com o a- gente patogênico e serve para inocular o tecido.

5. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que a dita ex- posição ao agente patogênico de planta pode ocorrer na forma de macromo- léculas, células, tecidos, organismos inteiros do agente patogênico ou com- binações dos mesmos, em que o agente patogênico e partes do mesmo, está vivo ou morto contanto que o material medie uma resposta imunológica no tecido hospedeiro.

6. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que a dita re- sistência, imunidade ou susceptibilidade a doenças compreende uma reação a um agente patogênico selecionado do grupo que consiste em Phakopsora pachyrhizi, Phakopsora meibomiae (ferrugem asiática da soja), Colletotri- chum truncatum, Colletotrichum dematium var. truncatum, Glomerella glyci- nes (antracnose da soja), Phytophthora sojae (podridão da raiz ou do caule causada por Phytophthora), Sclerotinia sclerotiorum (podridão do caule cau- sada por Sclerotinia), Fusarium solani f. sp. glycines (síndrome de morte sú- bita), Fusarium spp. (podridão da raiz causada por Fusarium), Macrophomi- na phaseolina (podridão cinzenta), Septoria glycines, (mancha parda), Pythi- um aphanidermatum, Pythium debaryanum, Pythium irregulare, Pythium ul- timum, Pythium myriotylum, Pythium torulosum (decomposição de sementes causada por Pythium), Diaporthe phaseolorum var. sojae (podridão da va- gem (cancro da haste da soja)), Phomopsis Iongicola (podridão do caule), Phomopsis spp. (decomposição de sementes causada por Phomopsis), Pe- ronospora manshurica (míldio felpudo), Rhizoetonia solani (podridão da raiz e caule causada por Rhizoctonia, podridão aérea causada por Rhizoctonia), Phialophora gregata (podridão parda do caule), Diaporthe phaseolorum var. caulivora (cancro do caule), Cercospora kikuchii (mancha púrpura da semen- te), Alternaria sp. (mancha alvo), Cercospora sojina (mancha foliar "olho de rã"), Selerotium rolfsii (podridão das estacas), Arkoola nigra (deterioração foliar negra), Thielaviopsis basieola, (podridão negra da raiz), Choanephora infundibulifera, Choanephora trispora (deterioração foliar causada por Choa- nephora), Leptosphaerulina trifolii (mancha foliar causada por Leptosphaeru- lina), Myeoleptodiseus terrestris (podridão da raiz causada por Mycoleptodis- cus), Neocosmospora vasinfeeta (podridão do caule causada por Neocos- mospora), Phyllostieta sojieola (mancha foliar causada por Phyllosticta), P- yrenoehaeta glycines (Mancha foliar causada por Pyrenochaeta), Cylindro- cladium crotalariae (mancha foliar ("Red crown rot")), Dactulioehaeta glyci- nes (mancha foliar vermelha), Spaceloma glycines (sarna), Stemphylium bo- tryosum (deterioração foliar causada por Stemphylium), Corynespora cassii- cola (mancha alvo), Nematospora coryli (mancha causada por levedura), Phymatotrichum omnivorum (podridão da raiz de algodão), Alfamovirus (ví- rus mosaico da alfafa, AMV), Comovirus (vírus do mosqueado do feijoeiro, BPMV), Potyvirus (vírus mosaico amarelo do feijoeiro, BYMV), Bromovirus (vírus do mosqueado clorótico do feijão-fradinho, CCMV), Begomovirus (ví- rus mosaico amarelo do feijão-da-China, MYMV), Potyvirus (vírus do mos- queado do amendoim, PeMoV), Potyvirus (vírus de estrias do amendoim, PStV), Cucumovirus (vírus do atrofiamento do amendoim, PSV), Caulimovi- rus (vírus do mosqueado clorótico da soja, SbCMV), Begomovirus (vírus de enrugamento foliar da soja, SCLV), Luteovirus (vírus de nanismo da soja, SbDV), Potyvirus (vírus mosaico da soja, SMV), Nepovirus (vírus do atrofia- mento grave da soja, SSSV), Nepovirus (vírus das manchas circulares do tabaco, TRSV), Bacillus subtilis (decomposição de sementes causada por Bacillus), Pseudomonas savastonoi pv. glycinea (deterioração bacteriana), Pseudomonas syringae subsp. syringae (folha enrugada causada por bacté- rias), Xanthomonas axonopodis pv. giycines, (pústula bacteriana), Curtobac- terium flaccumfaeiens pv. flaceumfaeiens, (mancha castanha bacteriana), Curtobaeterium flaceumfaeiens pv. flaceumfaeiens, Raistonia soianacearum, (murchamento causado por bactérias), Pseudomonas syringae pv. tabaei (mancha aureolada), Aphis giycines (afídeo da soja), Heterodera giycines (nematóide do cisto da soja), Meloidogyne arenaria, Meioidogyne hapla, Me- loidogyne incógnita, Meloidogyne javanica (nematóide das galhas radicula- res), Hoplolaimus Columbus, Hoplolaimus galeatus, Hoplolaimus magnist- ylus (nematóide em "arpão"), Pratylenchus spp. (nematóide das lesões), Pa- ratylenchus projectus, Paratylenchus tenuicaudatus (nematóide em forma de pino), Rotylenchulus reniformis (nematóide reniforme), Criconemella ornata (nematóide em anel), Hemicycliophora spp. (nematóide em bainha), Helio- eotylenchus spp. (nematóide espiralado), Belonolainus gracilis, Belonolainus longicaudatus (nematóide de ferrão), Quinisulcius acutus, Tylenchorhynchus spp. (nematóide atrofiador) e Paratrichodorus minor (nematóide das raízes em coto).

7. Processo de acordo com a reivindicação 3, em que o dito te- cido é analisado em relação à resistência, à imunidade ou à susceptibilidade a Phakopsora pachyrhizi, Phakopsora meibomiae (ferrugem asiática da so- ja), Colletotrichum truncatum, Colletotrichum dematium var. truncatum, Glo- merella glycines (antracnose da soja), Phytophthora sojae (podridão da raiz e do caule causada por Phytophthora), Sclerotinia sclerotiorum (podridão da raiz causada por Sclerotinia), Fusarium solani f. sp. glycines (síndrome de morte súbita), Fusarium spp. (Podridão da raiz causada por Fusaríum), Ma- crophomina phaseolina (podridão cinzenta), Septoria glycines, (mancha par- da), Pythium aphanidermatum, Pythium debaryanum, Pythium irregulare, Pythium ultimum, Pythium myriotylum, Pythium torulosum (decomposição de sementes causada por Pythium), Diaporthe phaseolorum var. sojae (cancro da haste da soja), Phomopsis longicola (podridão do caule), Phomopsis spp. (decomposição de sementes causada por Phomopsis), Peronospora man- shurica (míldio felpudo), Rhizoctonia solani (podridão da raiz e do caule cau- sada por Rhizoctonia, podridão aérea causada por Rhizoctonia), Phialophora gregata (podridão parda do caule), Diaporthe phaseolorum var. caulivora (cancro do caule), Cercospora kikuchii (mancha púrpura da semente), Alter- naria sp. (Mancha alvo), Cercospora sojina (mancha foliar "olho de rã"), S- clerotium rolfsii (podridão das estacas), Arkoola nigra (deterioração foliar ne- gra), Thielaviopsis basicola, (podridão negra da raiz), Choanephora infundi- bulifera, Choanephora trispora (deterioração foliar causada por Choanepho- ra), Leptosphaerulina trifolii (mancha foliar causada por Leptosphaerulina), Mycoleptodiscus terrestris (podridão da raiz causada por Mycoleptodiscus), Neocosmospora vasinfecta (podridão do caule causada por Neocosmospo- rá), Phyllosticta sojicola (mancha foliar causada por Phyllosticta), Pyreno- chaeta glycines (mancha foliar causada por Pyrenochaeta), Cylindrocladium crotalariae (mancha foliar), Dactuliochaeta glycines (mancha foliar verme- lha), Spaceloma glycines (Sarna), Stemphylium botryosum (deterioração fo- liar causada por Stemphylium), Corynespora cassiieola (mancha alvo), Ne- matospora eoryli (mancha causada por levedura), Phymatotrichum omnivo- rum (podridão da raiz de algodão), Alfamovirus (vírus mosaico da alfafa, AMV), Comovirus (vírus do mosqueado do feijoeiro, BPMV), Potyvirus (vírus mosaico amarelo do feijoeiro, BYMV), Bromovirus (vírus do mosqueado cio- rótico do feijão-fradinho, CCMV), Begomovirus (vírus mosaico amarelo do feijão-da-China, MYMV), Potyvirus (vírus do mosqueado do amendoim, Pe- MoV), Potyvirus (vírus de estrias do amendoim, PStV), Cucumovirus (vírus do atrofiamento do amendoim, PSV), Caulimovirus (vírus do mosqueado clo- rótico da soja, SbCMV), Begomovirus (vírus de enrugamento foliar da soja, SCLV), Luteovirus (vírus de nanismo da soja, SbDV), Potyvirus (vírus mosai- co da soja, SMV), Nepovirus (vírus do atrofiamento grave da soja, SSSV), Nepovirus (vírus das manchas circulares do tabaco, TRSV), Bacillus subtilis (decomposição de sementes causada por Baciilus), Pseudomonas savasto- noi pv. glycinea (deterioração bacteriana), Pseudomonas syringae subsp. syringae (folha enrugada causada por bactérias), Xanthomonas axonopodis pv. glycines, (pústula bacteriana), Curtobacterium flaccumfaciens pv. flac- cumfaciens, (mancha castanha bacteriana), Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens, Ralstonia solanacearum, (murchamento causado por bactérias), Pseudomonas syringae pv. tabaci (mancha aureolada), Aphis glycines (afídeo da soja), Heterodera glycines (nematóide do cisto da soja), Meloidogyne arenaria, Meloidogyne hapla, Meloidogyne incógnita, Meloi- dogyne javanica (nematóide das galhas radiculares), Hoplolaimus Columbus, Hoplolaimus galeatus, Hoplolaimus magnistylus (nematóide em "arpão"), Pratylenchus spp. (nematóide das lesões), Paratylenchus projectus, Parat- ylenchus tenuicaudatus (nematóide em forma de pino), Rotylenchulus reni- formis (nematóide reniforme), Criconemelia ornata (nematóide em anel), Hemicycliophora spp. (nematóide em bainha), Heliocotylenchus spp. (nema- tóide espiralado), Belonolainus gracilis, Belonolainus Iongicaudatus (nema- tóide de ferrão), Quinisulcius acutus, Tylenchorhynchus spp. (nematóide a- trofiador) e Paratrichodorus minor(nematóide das raízes em coto).

8. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que a dita planta de soja selecionada é selecionada do grupo que consiste em Glycine arenaria, Glycine argyrea, Glycine canescens, Glycine clandestine, Glycine curvata, Glycine cyrtoloba, Glycine falcate, Glycine latifolia, Glycine Iatrobea- na, Glycine max, Glycine microphylla, Glycine pescadrensis, Glycine pinda- nica, Glycine rubiginosa, Glycine soja, Glycine sp., Glycine stenophita, Glyci- ne tabacina e Glycine tomentella.

9. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que o dito meio compreende água e nutrientes necessários para sustentar a infecção, enquanto não interferem no efeito dos ditos Ioci de características quantitati- vas de resistência a doenças.

10. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que a dita resistência, imunidade ou susceptibilidade a doenças é selecionada do gru- po que consiste em tolerância à infecção por Phytophthora (podridão da ra- iz), resistência a Fusarium solani f. sp. glycines (síndrome de morte súbita), Cercospora sojina (mancha foliar "olho de rã"), Phialophora gegata (podridão parda do caule), Sclerotinia (podridão do caule) e resistência à ferrugem asi- ática da soja (ASR).

11. Processo de acordo com a reivindicação 2, em que o dito lócus de característica quantitativa é selecionado do grupo que consiste nos loci 1-13 de resistência à ASR.

12. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que a dita planta de soja é uma progênie proveniente de um cruzamento entre uma planta de soja que compreende um lócus de característica quantitativa de resistência a doenças desejável e uma planta de soja de uma linhagem de elite.

13. Planta de soja selecionada utiliza o processo como definido na reivindicação 2.

14. Molécula de DNA isolada ou recombinante selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 67 até 99.

15. Processo para seleção de uma planta de soja resistente à ASR que compreende as etapas de: a) isolamento de ácidos nucléicos de um grande número de plantas de soja; b) detecção nos ditos ácidos nucléicos isolados da presença de uma ou mais moléculas marcadoras associadas com o lócus 1 de resistência à ASR, em que a dita molécula marcadora é selecionada do grupo que consiste em NS0093250, NS0119710, NS0103004, NS0099454, NS0102630, NS0102915, NS0102913, NS0123728, NS0129943, NS0102168, NS0092723, NS0098177, NS0127343, NS0101121 e qualquer molécula marcadora mapeada dentro de 10 centimorgans ou menos das ditas moléculas marcadoras; e c) seleção de uma planta de soja que compreende a dita uma ou mais moléculas marcadoras, selecionando assim uma planta de soja resis- tente à ASR.

16. Processo para seleção de uma planta de soja resistente à ASR que compreende as etapas de: a) isolamento de ácidos nucléicos de um grande número de plantas de soja; b) detecção nos ditos ácidos nucléicos isolados da presença de uma ou mais moléculas marcadoras associadas com o lócus 3 de resistência à ASR, em que a dita molécula marcadora é selecionada do grupo que consiste em NS0099746, NS0123747, NS0126598, NS0128378, NS0096829, NS0125408, NS0098902, NS0099529, NS0097798, NS0137477, NS0095322, NS0136101, NS0098982 e qualquer molécu- la marcadora mapeada dentro de 10 centimorgans ou menos das ditas moléculas marcadoras; e c) seleção de uma planta de soja que compreende a dita uma ou mais moléculas marcadoras, selecionando assim uma planta de soja resis- tente à ASR.

17. Processo para seleção de uma planta de soja resistente à ASR que compreende as etapas de: a) isolamento de ácidos nucléicos de um grande número de plantas de soja; b) detecção nos ditos ácidos nucléicos isolados da presença de uma ou mais moléculas marcadoras associadas com os Ioci 5-9 de resistência à ASR, em que a dita molécula marcadora é selecionada do grupo que consiste em NS0103033 e qualquer uma molécula marcadora mapea- da dentro de 10 centimorgans ou menos das ditas moléculas marcado- ras; e c) seleção de uma planta de soja que compreende a dita uma ou mais moléculas marcadoras, selecionando assim uma planta de soja resis- tente à ASR.

18. Processo para seleção de uma planta de soja resistente à ASR que compreende as etapas de: a) isolamento de ácidos nucléicos de um grande número de plantas de soja; b) detecção nos ditos ácidos nucléicos isolados da presença de uma ou mais moléculas marcadoras associadas com os Loci 10-13 de resistên- cia à ASR, em que a dita molécula marcadora é selecionada do grupo que consiste em NS0124935 e qualquer uma molécula marcadora ma- peada dentro de 10 centimorgans ou menos das ditas moléculas mar- cadoras; e c) seleção de uma planta de soja que compreende a dita uma ou mais moléculas marcadoras, selecionando assim uma planta de soja resis- tente à ASR.

19. Processo para seleção de uma planta de soja resistente à ASR que compreende as etapas de: a) isolamento de ácidos nucléicos de um grande número de plantas de soja; b) detecção nos ditos ácidos nucléicos isolados da presença de uma ou mais moléculas marcadoras associadas com o lócus 2 de resistência à ASR, em que as ditas moléculas marcadoras são selecionadas de uma região que corresponde ao grupo de ligação J ou N; e c) seleção de uma planta de soja que compreende a dita uma ou mais moléculas marcadoras, selecionando assim uma planta de soja resis- tente à ASR.

20. Processo para seleção de uma planta de soja resistente à ASR que compreende as etapas de: a) isolamento de ácidos nucléicos de um grande número de plantas de soja; b) detecção nos ditos ácidos nucléicos isolados da presença de uma ou mais moléculas marcadoras associadas com o lócus 4 de resistência à ASR, em que as ditas moléculas marcadoras são selecionadas de uma região que corresponde ao grupo de ligação N; e c) seleção de uma planta de soja que compreende a dita uma ou mais moléculas marcadoras, selecionando assim uma planta de soja resis- tente à ASR.

21. Planta de soja resistente à ASR selecionada utilizando o processo como definido em qualquer uma das reivindicações 15-20.

22. Planta de soja que compreende pelo menos um lócus de resistência à ASR que sofreu introgressão selecionado do grupo que consis- te nos loci 5-13 de resistência à ASR.

23. Planta de soja de acordo com a reivindicação 22, em que o dito lócus de resistência à ASR que sofreu introgressão é originado dos nú- meros de acesso de soja listados na Tabela 6.

24.

Planta de soja de acordo com a reivindicação 22 que com- preende ainda um ou mais loci de resistência à ASR selecionados do grupo que consiste nos loci 1-4 de resistência à ASR.25.

Planta de soja da reivindi- cação 24, em que os ditos loci 1-4 de resistência à ASR é originado dos nú- meros de acesso de soja listados na Tabela 4.26. Planta de soja que com- preende um lócus de característica quantitativa que sofreu introgressão, em que o dito lócus é originado do número de acesso de soja PI 200487 e em que o dito lócus confere um fenótipo de formação de ferrugem lenta.