JP6168993B2 - Ｓｃｎ耐性に連鎖したダイズマーカー - Google Patents

Description

優先権主張
本出願は、２０１０年１１月５日に出願された米国仮特許出願第６１／４１０，７８３号の利益を主張するものである。

本開示は、植物の疾患耐性に関する。いくつかの実施形態では、本開示は、ダイズにおけるダイズシストセンチュウ（ＳＣＮ）耐性に関する。特定の実施形態では、本開示は、生物におけるＳＣＮ耐性形質を同定するための組成物および方法、例えばＳＣＮ耐性と密接に連鎖した分子マーカーに関する。さらなる実施形態は、例えば、ＳＣＮ耐性と密接に連鎖した分子マーカーを使用することによって、ＳＣＮ耐性形質を宿主生物に導入するための組成物および方法に関する。

ダイズ、グリシンマックス（Glycine max）は、植物油およびタンパク質の主な供給源として、世界中で栽培される主な実用作物の１つである。低コレステロールおよび高繊維食に関する需要の増大により、食品としてのダイズの重要性が増している。１０，０００を超えるダイズ品種が現在米国に導入されており、その中で限られた数のダイズ品種が、ハイブリダイゼーションおよび選択プログラムから開発される栽培種の遺伝的基盤となる。Johnson and Bernard, The Soybean, Norman Ed., Academic Press, N.Y., pp.1-73, 1963。

ダイズシストセンチュウ、（ＳＣＮ、ヘテロデラグリシネス（Heterodera glycines）（ＨＧ）イチノヘ（Ichinohe））は、米国中、および世界の大部分の他のダイズ生産上位国中で、ダイズに影響を及ぼす１つの最も有害な害虫である。２００３年と２００４年の米国内の推定収穫高減は約２９０万トン〜３４０万トンであり、これは約１５億ドルの推定年間損失をもたらした。Wrather et al. (2001); Wrather and Koenning (2006)。ＳＣＮ表現型は、劣性と優勢の両方で多数の遺伝子によって制御される、非常に複雑な形質である。Concibido et al.(2004)。ＳＣＮ表現型決定は時間がかかり、コストおよび労働集約的である。

ＳＣＮ感染は様々な症状を引き起こし、それらは葉および茎のクロロシス、根の壊死、種子収率の低下、ならびに根および苗条生長の抑制を含み得る。ＳＣＮ感染の地上の症状はＳＣＮ感染に特有なわけではなく、栄養素欠乏、特に鉄欠乏、干ばつが原因のストレス、除草剤による障害または別の疾患と混同する可能性がある。感染の最初の兆候は、発育を阻害された黄色い葉を有する植物群である。さらに根における病原体を検出するのは困難である可能性がある。発育を阻害された根も、ストレスまたは植物疾患の一般的な症状であるからである。ＳＣＮの成体メスおよび嚢子は約１／３２インチ長であり、したがって拡大せずに目で見ることができる。根におけるＳＣＮの成体メスおよび嚢子の観察は、野外でＳＣＮ感染を検出し診断するための唯一の正確な方法である。

ＳＣＮの存在は、最初の土壌侵入時に通常明らかではない。ＳＣＮ集団の密度は、それが植物の地上症状または収率の低下を引き起こすのに十分となるまで、土壌中で増大するはずである。集団の密度は、有意な数値に達するまで数年を要する可能性がある。したがって、現在のＳＣＮによる損傷は、数年間で増大している侵入の結果である。ダイズはＳＣＮの主な宿主であるが、他のマメ科植物、例えば、緑莢インゲン、サヤインゲン、ドライビーンズ、赤インゲン豆、ライマメ、リョクトウ、ツルナシインゲンマメ、アズキマメ、サヤエンドウ、およびササゲは宿主として働くことができる。ＳＣＮのライフサイクルは３０日である。したがって、１つの増殖期は多世代の寄生虫を包含する。さらにＳＣＮの卵は、孵化前の数年間、土壌中で完全な状態であり得る。

過去において、一組の４つのダイズ生殖質系統におけるその繁殖と標準ＳＣＮ感受性ダイズ栽培種におけるその繁殖を比較することにより、ＳＣＮ集団に「レース」の名称が与えられた。最も一般的に使用されるレーススキームはＳＣＮの１６のレースを同定した。レースの名称は、線虫学者とダイズ生産者が特定ＳＣＮ集団の能力に関する情報を共有して、ＳＣＮに対する耐性用の特定遺伝子を含有するダイズ品種を繁殖させるのを可能にした。

２００３年、ＨＧ型試験が開発されてこのレース試験を代用した。この新たな試験は７個の耐性源（生殖質系統）を含み、７つの系統各々において土壌サンプルから線虫集団がどのくらいの数が増大したかを示す割合として、それらの結果は示される。この試験は、どの耐性源が試験する個々の領域に適しているか、およびどれが望ましくないかを示す。遺伝的耐性源は市販のダイズ品種において現在限られているので、これらの「耐性源」を循環させて毒性ＳＣＮ集団の構築を遅らせることが重要である。

米国内でのＳＣＮの発見直後、ＳＣＮ耐性源が同定された。Ross and Brim (1957) Plant Dis.Rep.41: 923-4。ＰｅｋｉｎｇおよびＰＩ８８７８８などのいくつかの系統が、品種改良プログラムにすぐに組み込まれた。その農業経済学的に望ましくない形質がないため、Ｐｅｋｉｎｇは耐性源として広く使用されるようになり、Ｐｉｃｋｅｔｔは最初のＳＣＮ耐性栽培種として発表された。特定ＳＣＮ耐性集団は耐性栽培種に優り得るという認識が、追加のＳＣＮ耐性源に関する広範囲のスクリーニングに至った。それはレース４より１０％を超える（ただし２０％未満の）嚢子の指数を有していたが、ＰＩ８８７８８はレース３および４耐性の一般的な供給源として現れ、Ｐｅｋｉｎｇおよびその誘導体はレース１および３の一般的な供給源として現れた。ＰＩ４３７６５４は知られている全レースに対する耐性を有するとして後に同定され、そのＳＣＮ耐性はＦｏｒｒｅｓｔに戻し交配された。現在、ＳＣＮ耐性を有することが知られている、１３０を超えるＰＩが存在する。ＰＩ２０９３３２およびＰＩ９０７６３は、他の例示的なＳＣＮ耐性ダイズ品種改良株である。同じ耐性源を有する全ての品種が比較可能な収率を有するわけではなく、それらはＳＣＮに対して同様に応答するわけでもない。

耐性ダイズ品種は、ＳＣＮの管理に利用可能な最有効ツールである。ＳＣＮ密度は耐性ダイズが成長すると通常低下する。大部分のＳＣＮ幼若虫は、耐性品種の根では栄養を得て発生することができないからである。しかしながら、任意の自然に侵入可能な領域では、いくらかのＳＣＮ幼若虫（＜１％）は現在入手可能な耐性品種において繁殖することができる。耐性ダイズ品種において繁殖することができるＳＣＮ幼若虫の数は、耐性品種が反復的に成長するとき増大する可能性がある。最終的に、ＳＣＮ耐性ダイズが毎回成長し侵入領域でダイズが生成する場合、ＳＣＮ集団は感受性品種としての耐性品種においても繁殖することができ得る。幸い、耐性品種において繁殖することができるＳＣＮ幼若虫の数は、感受性ダイズ品種が成長すると減少する。これらの線虫は、耐性品種において栄養を得ることができない土壌中の他のＳＣＮ幼若虫と食物に関してうまく競合しないからである。

ＳＣＮレース３は、中西部のダイズ生産州において最も顕著なレースであると考えられる。レース３耐性に関する遺伝学および品種改良に対して相当な努力がなされている。ＰｅｋｉｎｇとＰＩ８８７８８の両方がＳＣＮレース３に対して耐性がある一方で、従来の遺伝学的試験は、それらはレース３耐性に関して異なる遺伝子を有することを示唆する。Rao-Arelli and Anand (1988) Crop Sci.28: 650-2。レース３耐性は、おそらく３個または４個の異なる遺伝子の制御下にある。同上；Mansur et al. (1993) Crop Sci.33: 1249-53も同様に参照。連鎖群Ｇにマッピングする１つの主なＳＣＮ耐性ＱＴＬはｒｈｇ１である。Concibido et al.(1996) Theor.Appl.Genet.93: 234-41。他のＳＣＮ耐性ＱＴＬは連鎖群Ａ２、Ｃ１、Ｍ、Ｄ、Ｊ、Ｌ２５、Ｌ２６、およびＫにマッピングされる。同上；米国特許第５，４９１，０８１号を参照。ＳＣＮ耐性ＱＴＬは、少なくとも異なるＳＣＮレースに関する全体表現型変異の異なる割合を占めることにより、レース特異的に挙動する。Concibido et al. (1997) Crop Sci.37: 258-64。しかしながら、連鎖群Ｇにおけるｒｈｇ１遺伝子座は、任意の同定したＳＣＮレースの耐性の発生に必要である可能性がある。ただし、Qui et al. (1999) Theor. Appl. Genet.98: 356-64を参照。

ＳＣＮ形質と連鎖したマーカーにはＲＦＬＰ、ＳＳＲおよびＳＮＰがある。本開示中で同定したＳＮＰマーカーを使用して、品種改良プログラムをサポートするためにＳＣＮ遺伝子型を決定することができる。品種改良プログラムをサポートするためのＳＣＮ遺伝子型決定を実施するための、本開示中のＳＮＰマーカーの使用は、コストおよび時間を節約する、早期の望ましい子孫の選択、ならびにＳＣＮ耐性ダイズ品種のより正確で迅速な商品化をもたらす。

ＳＣＮ表現型と連鎖した分子マーカーを使用して、ダイズにおけるＳＣＮ耐性形質に関するマーカー支援型選択を容易にすることができる。マーカー支援型選択は、ＳＣＮ表現型決定と比較して、時間、コスト、および労力に関して重大な利点をもたらす。驚くことに、親遺伝子型において多形であったダイズゲノム中のＳＣＮ疾患耐性ＱＴＬ領域内または近辺で同定した１５個のＳＮＰマーカーの中で、わずか３個がＳＣＮ耐性形質と連鎖したことが本明細書において開示される。したがって、これら３個のＳＮＰマーカーは、ＳＣＮ耐性ダイズ品種のマーカー支援型選択において優れた有用性をもたらす。

ＳＣＮ耐性表現型と連鎖した（例えば連鎖した、密接に連鎖した、または非常に密接に連鎖した）核酸分子マーカーを本明細書中に記載する。特定の例において、分子マーカーはＳＮＰマーカーであってよい。例えば非制限的に、ＳＣＮ耐性表現型を有する植物を同定するため、（例えば、マーカー支援型品種改良または遺伝子形質転換によって）新たな植物遺伝子型にＳＣＮ耐性表現型を導入するため、およびＳＣＮ耐性表現型を有し得る植物を栽培するための、ＳＣＮ耐性表現型と連鎖した核酸分子マーカーの使用法も、本明細書中に記載する。

ダイズにＳＣＮ表現型を導入するための手段、およびＳＣＮ表現型を有する植物を同定するための手段をさらに記載する。いくつかの例では、ダイズにＳＣＮ表現型を導入するための手段は、ＳＣＮ表現型と連鎖した（例えば連鎖した、密接に連鎖した、または非常に密接に連鎖した）マーカーであってよい。いくつかの例では、ＳＣＮ表現型を有する植物を同定するための手段は、ＳＣＮ表現型と連鎖した（例えば連鎖した、密接に連鎖した、または非常に密接に連鎖した）マーカーと特異的にハイブリダイズするプローブであってよい。

本明細書中に記載する分子マーカーを使用して同定した、ＳＣＮ表現型を有する植物およびその植物に由来する植物材料も、本明細書中に記載する。したがって、ＳＣＮ耐性表現型と連鎖した１つまたは複数の分子マーカー（複数可）を使用するマーカー支援型選択によって生成するダイズ植物を記載する。

、 、 及び （図１ａ−１は図１ａの続き、図１ｂ−１は図１ｂの続き）ＳＣＮに関する文献中で報告されたＳＣＮ耐性と関係があるＱＴＬの一覧を含む図である。 染色体および連鎖群（ＬＧ）を含むダイズゲノムの表記を含む図である。 ダイズ第１８染色体（連鎖群Ｇ）、ならびにＳＣＮ耐性と関係があるＱＴＬおよびＱＴＬ間隔、ならびにその中に位置するＳＮＰの表記を含む図である。 ダイズ第８染色体（連鎖群Ａ_２）、ならびにＳＣＮ耐性と関係があるＱＴＬおよびＱＴＬ間隔、ならびにその中に位置するＳＮＰの表記を含む図である。 ダイズ第１１染色体（連鎖群Ｂ_１）、ならびにＳＣＮ耐性と関係があるＱＴＬおよびＱＴＬ間隔、ならびにその中に位置するＳＮＰの表記を含む図である。 ダイズ第２０染色体（連鎖群Ｉ）、ならびにＳＣＮ耐性と関係があるＱＴＬおよびＱＴＬ間隔、ならびにその中に位置するＳＮＰの表記を含む図である。 ４個のＳＮＰ遺伝子座における２４個のダイズＳＣＮ関連栽培種または親株のクラスターを含む図である。使用した２４個のダイズ栽培種およびＳＣＮマッピング親株を示す表も含まれる。表中、第１行のサンプルおよび第２行中の最後の２個のサンプルはＳＣＮ感受性であり（緑色）、第２行中の最初の１０個のサンプルはＳＣＮ耐性であった（黄色）。第２行中の最後の３個のサンプルは２個のＳＣＮマッピング集団の親株であった。 ＳＣＮ耐性形質との同時分離を示した３個のＳＮＰ遺伝子座における９６株のクラスターを含む図である。 マッピング集団に割り当てたＳＣＮ指数の分布を含む図である。ヒストグラムは０．０１〜３．８の範囲、および０．６３の平均、および０．４６５のメディアンを示す。

配列表
添付の配列表中に列挙する核酸配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２において定義されるのと同様に、ヌクレオチド塩基に関する標準的な文字略語を使用して示す。各核酸配列の一方の鎖のみを示すが、相補鎖は示した鎖に対する任意の参照によって含まれると理解される。添付の配列表中：

配列番号１は、ｒｈｇ１−３９９５対立遺伝子に特異的なＫＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ競合的対立遺伝子特異的ＰＣＲ ＳＮＰ遺伝子型決定システム（ＫＡＳＰａｒ（商標））アッセイ中で使用したプライマー配列を示す。ＧＡＡＧＧＴＧＡＣＣＡＡＧＴＴＣＡＴＧＣＴＧＧＡＡＴＴＡＴＧＴＴＧＧＧＴＴＴＴＴＴＴＴＣＴＴＴＣＴＧＴ

配列番号２は、ｒｈｇ１−３９９５対立遺伝子に特異的なＫＡＳＰａｒ（商標）アッセイ中で使用した第２のプライマー配列を示す。ＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴＧＡＡＴＴＡＴＧＴＴＧＧＧＴＴＴＴＴＴＴＴＣＴＴＴＣＴＧＧ

配列番号３は、ｒｈｇ１−３９９５に関するＫＡＳＰａｒ（商標）アッセイ中で使用した共通リバースプライマー配列を示す。ＧＣＣＣＡＧＡＡＡＡＡＡＧＧＧＡＴＡＡＡＴＡＡＣＧＧＡＴＡ

配列番号４は、ＮＣＳＢ＿００４０７４対立遺伝子に特異的なＫＡＳＰａｒ（商標）アッセイ中で使用したプライマー配列を示す。ＧＡＡＧＧＴＧＡＣＣＡＡＧＴＴＣＡＴＧＣＴＡＴＴＡＴＧＴＴＧＴＡＡＣＡＣＡＡＡＴＴＴＧＣＡＣＣＴＣＡＴ

配列番号５は、ＮＣＳＢ＿００４０７４対立遺伝子に特異的なＫＡＳＰａｒ（商標）アッセイ中で使用した第２のプライマー配列を示す。ＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴＡＴＧＴＴＧＴＡＡＣＡＣＡＡＡＴＴＴＧＣＡＣＣＴＣＡＧ

配列番号６は、ＮＣＳＢ＿００４０７４に関するＫＡＳＰａｒ（商標）アッセイ中で使用した共通リバースプライマー配列を示す。ＣＴＡＴＡＣＡＡＣＴＡＡＡＴＣＧＴＡＡＴＴＣＣＡＴＴＧＴＡＴ

配列番号７は、ＢＡＲＣ＿０１０８８９−０１６９１対立遺伝子に特異的なＫＡＳＰａｒ（商標）アッセイ中で使用したプライマー配列を示す。ＧＡＡＧＧＴＧＡＣＣＡＡＧＴＴＣＡＴＧＣＴＧＡＡＡＡＡＡＴＡＡＡＡＴＴＧＡＴＣＡＴＣＡＣＡＴＡＴＧＧＴＴＡＧ

配列番号８は、ＢＡＲＣ＿０１０８８９−０１６９１対立遺伝子に特異的なＫＡＳＰａｒ（商標）アッセイ中で使用した第２のプライマー配列を示す。ＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴＧＡＡＡＡＡＡＴＡＡＡＡＴＴＧＡＴＣＡＴＣＡＣＡＴＡＴＧＧＴＴＡＡ

配列番号９は、ＢＡＲＣ＿０１０８８９−０１６９１に関するＫＡＳＰａｒ（商標）アッセイ中で使用した共通リバースプライマー配列を示す。ＴＡＡＧＴＧＡＧＧＧＣＡＡＴＧＴＡＴＴＡＧＴＡＴＹＡＡＧＴＡ

配列番号１０は、マーカーＮＣＳＢ＿００４０７４配列を示す。ＣＡＣＧＡＴＴＴＴＧＴＴＧＴＧＴＴＡＣＡＴＡＡＡＴＴＡＣＴＡＴＡＣＡＡＣＴＡＡＡＴＣＧＴＡＡＴＴＣＣＡＴＴＧＴＡＴＴＡＣ［Ａ／Ｃ］ＴＧＡＧＧＴＧＣＡＡＡＴＴＴＧＴＧＴＴＡＣＡＡＣＡＴＡＡＴＴＧＴＡＡＴＴＴＴＡＴＴＧＴＡＣＧＡＴＡＡＡＡＡＣＴＡＴＡＡＣ

配列番号１１は、マーカーＢＡＲＣ＿０１０８８９-０１６９１配列を示す。ＣＴＣＴＴＣＡＣＡＣＣＴＴＴＡＡＧＧＡＡＧＴＴＡＧＴＡＣＣＡＴＴＣＣＡＣＴＡＴＴＣＡＡＧＴＡＴＴＴＴＴＴＴＴＡＡＴＴＣＡＡＡＡＴＴＡＴＴＡＡＧＴＧＡＧＧＧＣＡＡＴＧＴＡＴＴＡＧＴＡＴＮＡＡＧＴＡ［Ｃ／Ｔ］ＴＡＡＣＣＡＴＡＴＧＴＧＡＴＧＡＴＣＡＡＴＴＴＴＡＴＴＴＴＴＴＣＡＴＧＧＣＴＴＴＧＴＣＧＡＡＡＧＴＡＡＣＡＴＴＡＴＡＴＴＧＴＧＧＴＴＴＴＡＡＡＴＧＡＡＡＡＴＣＴＧＴＧＡＴＴＴＧＣＡＴ

配列番号１２は、マーカーｒｈｇ１−３９９５配列を示す。ＴＣＴＧＡＴＡＡＣＴＡＴＧＡＣＡＧＣＡＴＣＴＴＣＣＡＡＧＡＴＡＡＴＧＡＣＴＴＣＣＡＡＧＴＴＣＣＡＡＣＡＣＴＧＧＣＴＣＴＧＴＡＣＡＴＴＴＧＡＡＣＴＡＡＴＴＴＴＡＴＡＴＣＡＴＴＴＡＴＣＴＡＴＴＧＴＧＡＴＴＧＡＡＡＴＡＴＡＡＡＡＴＴＧＡＡＧＴＧＡＴＧＴＧＡＡＣＡＡＴＡＣＡＡＡＴＣＡＣＡＴＣＴＴＧＡＡＴＴＡＡＡＡＴＡＴＣＴＡＡＣＡＡＣＴＧＧＡＡＣＡＡＡＴＡＡＧＡＧＧＣＣＣＡＧＡＡＡＡＡＡＧＧＧＡＴＡＡＡＴＡＡＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＧ［Ａ／Ｃ］ＣＡＧＡＡＡＧＡＡＡＡＡＡＡＡＣＣＣＡＡＣＡＴＡＡＴＴＣＣＡＡＣＴＴＣＡＡＡＡＴＴＣＡＣＴＣＡＡＴＡＡＡＡＡＧＴＴＴＡＡＣＡＴＧＴＡＡＡＴＴＴＡＣＴＴＧＧＡＡＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＴＡＡＣＣＡＡＴＡＡＴＡＡＴＡＡＴＡＡＴＡＡＡＡＧＡＡＡＴＣＡＧＴＴＴＴＡＴＡＧＣＡＴＴＡＡＴＴＴＧＧＧＡＴＧＣＴＣＴＧＣＴＴＧＴＡＴＧＣＡＡＡＴＧＧＣＡＣＡＡＣＣＴＴＡＣＣＣＴＣＡＡＧＡＴＴＧＣＡＡＡＡＣＡＣＡＧＡＴＧＡＧＴＡＡＣＡＧＡＴＧＣＡＡＴＧＴＧＡＡＴＣＡＡＴＡＡＡＡＡＧＴＡＴＴＧＴＴＧＣＧＴＴＧＴＴＧＡＴＧＡＣＡＣＡＡＣＣＴＴＡＣＴＣＡＴＡＡＡＡＡＡＴＧＣＡＴ

Ｉ．いくつかの実施形態の概要
特定の実施形態は、９６の試験ダイズ株においてダイズシストセンチュウ（ＳＣＮ）耐性形質との同時分離を示す、３個の例示的なＳＮＰマーカー（ｒｈｇ１−３９９５、ＢＡＲＣ＿０１０８８９＿０１６９１、およびＮＣＳＢ＿００４０７４）を含む。ＳＣＮ耐性と同時分離するマーカーはこの形質と連鎖しており、したがってマーカー支援型選択および品種改良において有用であり得る。ＳＣＮ耐性と連鎖したこれら３個の例示的なＳＮＰマーカーを同定するために使用する戦略も、本明細書中に開示する。グリシンマックス（Glycine max）ゲノム中の、これら３個の例示的なＳＮＰマーカーの物理的マップ位置を提供する。本明細書中に記載する３個の例示的なＳＮＰマーカーを使用し、ＫＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ競合的対立遺伝子特異的ＰＣＲ ＳＮＰ遺伝子型決定システム（ＫＡＳＰａｒ（商標））を使用する特異的アッセイを開発して、ＳＣＮ耐性形質を有する植物を迅速かつ正確に同定した。ＳＣＮ耐性と連鎖した３個の例示的なＳＮＰマーカーに関して本発明の実施形態を記載するが、当業者は、本明細書中に記載する技法を使用して、追加の同等なマーカーを同定することができることを理解するであろう。ＳＣＮ耐性と連鎖したＳＮＰマーカーを、例えばＳＣＮ遺伝子型決定において使用して、ダイズ品種改良集団からＳＣＮ耐性個体を選択することができる。

ダイズシストセンチュウ（ＳＣＮ）耐性は非常に複雑な形質である。ＳＣＮの侵入は１つまたは複数の異なるヘテロデラグリシネス（Heterodera glycines）レースによって引き起こされる可能性があり、その各々の耐性は異なる連鎖群に位置する異なる耐性遺伝子を必要とし得る。表１参照。表１中に開示する３個のマーカーはいずれも連鎖群Ｇ中に位置する。連鎖群Ｇ中のＳＣＮ耐性遺伝子（複数可）は、レース３および１４に対する耐性を担うと考えられる。

本明細書中に記載する戦略を使用して、ＳＣＮ耐性と連鎖した他の連鎖群（例えば、Ａ_２、Ｂ_１、およびＩ）中のマーカーを同定する。したがって、このようなマーカーを同定するための方法も提供する。一般的な戦略を使用して、他の対象の形質をマッピングすることもできる。この戦略は従来のマッピング戦略より有効であり、分子的品種改良プログラムにおいて特に有用であり得る。

ＩＩ．用語
マッピング集団：本明細書中で使用する用語「マッピング集団」は、ゲノムマッピングに使用する植物集団を指すことができる。マッピング集団は、典型的には、制御された親遺伝子型の交配から得られる。マッピング集団の開発用の親および交配設計の選択、および使用するマーカーの型に関する決定は、マッピングする遺伝子、マーカーの有用性、および分子マップに依存する。マッピング集団内の植物の親は、核酸配列レベルと表現型レベルの両方で、対象の形質（複数可）に関して十分な変異がなければならない。親の核酸配列の変異を使用して、マッピング集団の植物における組換え事象を追跡する。情報を与える多型マーカーの有用性は、核酸配列変異の量に依存する。

戻し交配：戻し交配法を使用して、植物中に核酸配列を導入することができる。植物中に新たな形質を導入するため、戻し交配技法は数十年間広く使用されている。N.Jensen, Ed., Plant Breeding Methodology, John Wiley & Sons, Inc., 1988。典型的な戻し交配プロトコールでは、対象の原型品種（再現親株）を、移動させる対象の遺伝子を有する第２の品種（非再現親株）と交配させる。この交配から生じた子孫は、次いで再現親株と再度交配させ、非再現親株由来の移動遺伝子以外に、再現植物のほぼ全ての望ましい形態学的および生理学的特徴が変換型植物において取り戻された植物を得るまで、そのプロセスを繰り返す。

ＫＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ競合的対立遺伝子特異的ＰＣＲ ＳＮＰ遺伝子型決定システム（ＫＡＳＰａｒ（商標））：ＫＡＳＰａｒ（商標）は、ＳＮＰ遺伝子型を決定するための市販の均一蛍光システムである（ＫＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｌｔｄ．、Ｈｏｄｄｅｓｄｏｎ、ＵＫ）。ＫＡＳＰａｒ（商標）アッセイは、３個の非標識プライマーを含有するＳＮＰ特異的「アッセイ混合物」、および他の必要とされる全構成要素、例えば、共通蛍光レポートシステムを含有する「反応混合物」を含む。これらの混合物以外に、ユーザーは、特にＦＲＥＴ可能プレートリーダー、マイクロタイタープレート（複数可）、および約５ｎｇ／ＬのＤＮＡを含有するＤＮＡサンプルを提供する。

典型的なＫＡＳＰａｒ（商標）アッセイは、（例えば、ＫＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのウエブサイトにおいてインターネット経由で無料で利用可能な、ＰｒｉｍｅｒＰｉｃｋｅｒ（商標）を使用した）対立遺伝子特異的プライマー設計、対立遺伝子特異的プライマーを含む反応混合物の調製、マイクロタイタープレートにおけるＤＮＡサンプルと反応混合物の混合、熱循環、蛍光プレートリーダーにおけるプレートの読み取り、ならびに蛍光データのプロットおよびスコア化のステップを含む。それぞれのサンプルからのデータは、ｘ軸とｙ軸がＦＡＭおよびＶＩＣ蛍光値に相当する二次元グラフ上に、一緒にプロットする。同じＳＮＰ遺伝子型を有するサンプルをプロット上に１つに集める（すなわち、Ａ／Ａ、Ａ／ａ、およびａ／ａ）。一般的な問題に対する解決策の指針を含めた、ＫＡＳＰａｒシステムに関する一層の技術情報は、ＫＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｌｔｄ．（例えば、the KASPar SNP Genotyping System Reagent Manual）から入手可能である。

連鎖した、密接に連鎖した、および非常に密接に連鎖した：本明細書中で使用する遺伝子またはマーカー間の連鎖は、染色体上の遺伝子またはマーカーが次世代中の個体に一緒に継代される測定可能な確率を示す現象を指すことができる。２つの遺伝子またはマーカーが互いに接近するほど、この確率は接近した状態になる（１）。したがって、用語「連鎖」は、（マーカー／遺伝子が異なる染色体上に位置する独立した一団から予想される）０．５を超える確率で、１つの遺伝子と一緒に継代される１つまたは複数の遺伝子またはマーカーを指すことができる。遺伝子の存在が個体における表現型に貢献するとき、遺伝子と連鎖したマーカーは表現型と連鎖していると言うことができる。したがって、用語「連鎖」は、マーカーと遺伝子の間の関係、またはマーカーと表現型の間の関係を指すことができる。

染色体上の２つの遺伝子またはマーカーの近接性は、遺伝子またはマーカーが次世代中の個体に一緒に継代される確率と直接関連するので、用語「連鎖」は、本明細書中では、同じ染色体上で互いに約２．０Ｍｂ以内に位置する１つまたは複数の遺伝子またはマーカーを指すこともできる。したがって、２つの「連鎖」遺伝子またはマーカーは、約２．１Ｍｂ、２．００Ｍｂ、約１．９５Ｍｂ、約１．９０Ｍｂ、約１．８５Ｍｂ、約１．８０Ｍｂ、約１．７５Ｍｂ、約１．７０Ｍｂ、約１．６５Ｍｂ、約１．６０Ｍｂ、約１．５５Ｍｂ、約１．５０Ｍｂ、約１．４５Ｍｂ、約１．４０Ｍｂ、約１．３５Ｍｂ、約１．３０Ｍｂ、約１．２５Ｍｂ、約１．２０Ｍｂ、約１．１５Ｍｂ、約１．１０Ｍｂ、約１．０５Ｍｂ、約１．００Ｍｂ、約０．９５Ｍｂ、約０．９０Ｍｂ、約０．８５Ｍｂ、約０．８０Ｍｂ、約０．７５Ｍｂ、約０．７０Ｍｂ、約０．６５Ｍｂ、約０．６０Ｍｂ、約０．５５Ｍｂ、約０．５０Ｍｂ、約０．４５Ｍｂ、約０．４０Ｍｂ、約０．３５Ｍｂ、約０．３０Ｍｂ、約０．２５Ｍｂ、約０．２０Ｍｂ、約０．１５Ｍｂ、約０．１０Ｍｂ、約０．０５Ｍｂ、約０．０２５Ｍｂ、および約０．０１Ｍｂ離れている可能性がある。ダイズにおけるＳＣＮ表現型と「連鎖」したマーカーの特定の例には、ダイズゲノムの第１８染色体上のヌクレオチド配列がある。

本明細書中で使用する用語「密接に連鎖した」は、同じ染色体上で互いに約０．５Ｍｂ以内に位置する１つまたは複数の遺伝子またはマーカーを指すことができる。したがって、２つの「密接に連鎖した」遺伝子またはマーカーは、約０．６Ｍｂ、約０．５５Ｍｂ、０．５Ｍｂ、約０．４５Ｍｂ、約０．４Ｍｂ、約０．３５Ｍｂ、約０．３Ｍｂ、約０．２５Ｍｂ、約０．２Ｍｂ、約０．１５Ｍｂ、約０．１Ｍｂ、および約０．０５Ｍｂ離れている可能性がある。

本明細書中で使用する用語「非常に密接に連鎖した」は、同じ染色体上で互いに約１００ｋｂ以内に位置する１つまたは複数の遺伝子またはマーカーを指すことができる。したがって、２つの「非常に密接に連鎖した」遺伝子またはマーカーは、約１２５ｋｂ、約１２０ｋｂ、約１１５ｋｂ、約１１０ｋｂ、約１０５ｋｂ、１００ｋｂ、約９５ｋｂ、約９０ｋｂ、約８５ｋｂ、約８０ｋｂ、約７５ｋｂ、約７０ｋｂ、約６５ｋｂ、約６０ｋｂ、約５５ｋｂ、約５０ｋｂ、約４５ｋｂ、約４０ｋｂ、約３５ｋｂ、約３０ｋｂ、約２５ｋｂ、約２０ｋｂ、約１５ｋｂ、約１０ｋｂ、約５ｋｂ、および約１ｋｂ離れている可能性がある。ダイズにおけるＳＣＮ表現型と「非常に密接に連鎖した」マーカーの特定の例には、ｒｈｇ１−３９９５、ＢＡＲＣ＿０１０８８９＿０１６９１、およびＮＣＳＢ＿００４０７４がある。

前述の事項を鑑みて、特定遺伝子または表現型と連鎖したマーカーには、その遺伝子または表現型と密接に連鎖したマーカー、およびその遺伝子または表現型と非常に密接に連鎖したマーカーがあることは理解される。ＳＣＮ表現型の連鎖した、密接に連鎖した、および非常に密接に連鎖した遺伝マーカーは、ＳＣＮ耐性ダイズ品種の同定、およびこの形質を他のダイズ品種に品種改良してＳＣＮ耐性を与えるための、マーカー支援型品種改良プログラムにおいて有用であり得る。

遺伝子座：本明細書中で使用する用語「遺伝子座」は、測定可能な特徴（例えば、形質）に対応するゲノム上の位置を指す。ＳＮＰ遺伝子座は、遺伝子座内に含有されるＤＮＡとハイブリダイズするプローブによって定義される。

マーカー：本明細書中で使用するマーカーは、特定の対立遺伝子を有する植物を同定するために使用することができる、遺伝子またはヌクレオチド配列を指す。マーカーは、所与のゲノム遺伝子座における変異として記載することができる。遺伝マーカーは、一塩基対の変化（一塩基多型、または「ＳＮＰ」）が周囲にある配列などの短いＤＮＡ配列、または長いＤＮＡ配列、例えば、マイクロサテライト／単純反復配列（「ＳＳＲ」）であってよい。「マーカー対立遺伝子」は、個々の個体中に存在するマーカーの型を指す。

本明細書中で使用する、用語マーカーは、ダイズ染色体ＤＮＡのクローンセグメント（例えば、ｒｈｇ１−３９９５、ＢＡＲＣ＿０１０８８９＿０１６９１、またはＮＣＳＢ＿００４０７４を含むセグメント）を指すことができ、ダイズ染色体ＤＮＡのクローンセグメントと相補的なＤＮＡ分子（例えば、ｒｈｇ１−３９９５、ＢＡＲＣ＿０１０８８９＿０１６９１、またはＮＣＳＢ＿００４０７４を含むセグメントと相補的なＤＮＡ）をさらに、または代替的に指すことができる。

いくつかの実施形態では、植物中のマーカーの存在を、核酸プローブの使用によって検出することができる。プローブはＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子であってよい。ＲＮＡプローブは、当技術分野で知られている手段、例えばＤＮＡ分子鋳型の使用によって合成することができる。プローブは、マーカーのヌクレオチド配列、および植物ゲノム由来の追加の連続ヌクレオチド配列の全部または一部を含有し得る。これを本明細書中では「連続プローブ」と呼ぶ。追加の連続ヌクレオチド配列は、従来理解されているように、植物染色体由来の連続ヌクレオチド配列が原型マーカーの５’または３’側に存在するかどうかに応じて、原型マーカーの「上流」または「下流」と呼ばれる。当業者によって理解されるように、マーカー中に含めるための追加の連続ヌクレオチド配列を得る方法は、ほぼ無限に繰り返すことができ（染色体の長さによってのみ制限される）、それによって染色体に沿った追加のマーカーを同定することができる。本発明のいくつかの実施形態において、全ての前に記載したマーカーを使用することができる。

オリゴヌクレオチドプローブ配列は合成によって、またはクローニングによって調製することができる。適切なクローニングベクターは当業者によく知られている。オリゴヌクレオチドプローブは標識または非標識状態であってよい。例えば、利用するヌクレオチドを例えば放射性^３２Ｐで標識する、ニックトランスレーション、ランダムプライミング、ターミナルデオキシトランスフェラーゼによるテーリングなどによる放射能標識を非制限的に含む、核酸分子を標識するための広く様々な技法が存在する。使用することができる他の標識には、例えば非制限的に、フルオロフォア（例えば、ＦＡＭおよびＶＩＣ）、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素阻害剤などがある。あるいは、単独で、または他の反応物質と共に検出可能なシグナルをもたらす標識の使用を、（例えば、前に示した標識により）標識される受容体と結合するリガンドに置き換えて、単独で、または他の試薬と共に検出可能なシグナルをもたらすことができる。例えば、Leary et al.(1983) Proc.Natl.Acad.Sci.USA80: 4045-9を参照。

プローブは、原型マーカーのヌクレオチド配列と不連続なヌクレオチド配列を含有することができ、このプローブは本明細書中では「不連続プローブ」と呼ぶ。不連続プローブの配列は、ゲノム上の原型マーカーの配列と十分密接して位置し、したがって不連続プローブは同じ遺伝子または形質（例えば、ＳＣＮ耐性）と遺伝的に連鎖している。例えば、いくつかの実施形態では、不連続プローブは、ダイズゲノム上の原型マーカーの５００ｋｂ、４５０ｋｂ、４００ｋｂ、３５０ｋｂ、３００ｋｂ、２５０ｋｂ、２００ｋｂ、１５０ｋｂ、１２５ｋｂ、１００ｋｂ、０．９ｋｂ、０．８ｋｂ、０．７ｋｂ、０．６ｋｂ、０．５ｋｂ、０．４ｋｂ、０．３ｋｂ、０．２ｋｂ、または０．１ｋｂ以内に位置する。

プローブは、検出するマーカーの正確なコピーであってよい。プローブは、対象生物（例えばダイズ）の染色体ＤＮＡのクローンセグメントと実質的に同一であるヌクレオチド配列を含む、またはそれからなる核酸分子であってもよい。本明細書中で使用する用語「実質的に同一である」は、８５％を超えて同一であるヌクレオチド配列を指すことができる。例えば、実質的に同一であるヌクレオチド配列は、参照配列と８５．５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９．５％同一であってよい。

プローブは、検出するマーカーの正確なコピー（「ＤＮＡ標的」）と「特異的にハイブリダイズ可能である」または「特異的に相補的である」核酸分子であってもよい。「特異的にハイブリダイズ可能である」と「特異的に相補的である」は、核酸分子とＤＮＡ標的の間で安定的かつ特異的な結合が生じるような、十分な程度の相補性を示す用語である。核酸分子は、特異的にハイブリダイズ可能であるその標的配列と１００％相補的である必要はない。特異的結合が望ましい条件下、例えばストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、核酸と非標的配列の非特異的結合を回避するのに十分な程度の相補性があるとき、核酸分子は特異的にハイブリダイズ可能である。

個々の程度のストリンジェンシーをもたらすハイブリダイゼーション条件は、選択するハイブリダイゼーション法の性質、ならびにハイブリダイズする核酸配列の組成および長さに応じて変化する。一般に、ハイブリダイゼーションの温度、およびハイブリダイゼーションバッファーのイオン強度（特にＮａ^＋および／またはＭｇ^＋＋濃度）がハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定するが、洗浄時間もストリンジェンシーに影響を与える。個々の程度のストリンジェンシーを得るのに必要なハイブリダイゼーション条件に関する計算は当業者に知られており、例えば、Sambrook et al. (ed.) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nded., vol.1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, chapters 9 and 11;およびHames and Higgins (eds.) Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, 1985において論じられる。核酸のハイブリダイゼーションに関するさらなる詳細な説明および指針は、例えば、Tijssen,"Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays,"in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter2, Elsevier, NY, 1993;およびAusubel et al., Eds., Current Protocols in Molecular Biology, Chapter2, Greene Publishing and Wiley-Interscience, NY, 1995において見ることができる。

本明細書中で使用する「ストリンジェントな条件」は、ハイブリダイゼーション分子とＤＮＡ標的の間に５０％未満のミスマッチがある場合のみ、その下でハイブリダイゼーションを行う条件を包含する。「ストリンジェントな条件」は、特定レベルのストリンジェンシーをさらに含む。したがって、本明細書中で使用する「適度なストリンジェンシー」条件は、その下で５０％を超える配列ミスマッチがある分子がハイブリダイズしない条件であり、「高いストリンジェンシー」の条件は、その下で２０％を超えるミスマッチがある配列がハイブリダイズしない条件であり、「非常に高いストリンジェンシー」の条件は、その下で１０％を超えるミスマッチがある配列がハイブリダイズしない条件である。

以下は代表的な、非制限的なハイブリダイゼーション条件である。

（少なくとも９０％の配列同一性を共有する配列を検出する）非常に高いストリンジェンシー。１６時間６５℃において５×ＳＳＣバッファー中でのハイブリダイゼーション、それぞれ１５分間室温において２×ＳＳＣバッファー中での二回の洗浄、およびそれぞれ２０分間６５℃において０．５×ＳＳＣバッファー中での二回の洗浄。

（少なくとも８０％の配列同一性を共有する配列を検出する）高いストリンジェンシー。１６〜２０時間６５〜７０℃において５×〜６×ＳＳＣバッファー中でのハイブリダイゼーション、それぞれ５〜２０分間室温において２×ＳＳＣバッファー中での二回の洗浄、およびそれぞれ３０分間５５〜７０℃において１×ＳＳＣバッファー中での二回の洗浄。

（少なくとも５０％の配列同一性を共有する配列を検出する）適度なストリンジェンシー。１６〜２０時間室温〜５５℃において６×ＳＳＣバッファー中でのハイブリダイゼーション、それぞれ２０〜３０分間室温〜５５℃において２×〜３×ＳＳＣバッファー中での少なくとも二回の洗浄。

前に論じた全てのプローブに関して、プローブは、追加の核酸配列、例えばプロモーター、転写シグナル、および／またはベクター配列を含むことができる。前に論じた任意のプローブを使用して、ＳＣＮ耐性と関連がある遺伝子と密接に連鎖した追加のマーカーを定義することができ、このように同定したマーカーは、本開示中で命名した例示的なマーカーと同等である可能性があり、したがって本発明の範囲内にある。

マーカー支援型品種改良：本明細書中で使用する用語「マーカー支援型品種改良」は、１つまたは複数の複雑な形質（例えば、ＳＣＮ耐性）に関して直接品種改良するための手法を指すことができる。現行では、植物生産者は、農業経済学的に望ましい形質と連鎖した、花の色、種皮の外見、またはアイソザイム変異などの、容易に検出可能な形質を確認しようと試みる。したがって植物生産者は、容易に検出可能な形質の分離を追求することにより分離、品種改良集団において農業経済学的に望ましい形質を追求する。しかしながら、植物の品種改良に使用することができるこのような連鎖関係は非常に少ない。

マーカー支援型品種改良は、植物品種を改良するための、時間およびコスト効率の良い方法をもたらす。マーカー支援型品種改良の適用のいくつかの例は、アイソザイムマーカーの使用に関する。例えば、Tanksley and Orton, eds.(1983) Isozymes in Plant Breeding and Genetics, Amsterdam: Elsevierを参照。一例は、トマトにおける線虫疫病に耐性がある遺伝子と関係があるアイソザイムマーカーである。Ｍｉという名称の遺伝子によって制御される耐性はトマトの第６染色体上に位置し、Ａｐｓ１、酸性ホスファターゼアイソザイムと非常に密接に連鎖している。Ｍｉ遺伝子を間接的に選択するためのＡｐｓ１アイソザイムマーカーの使用は、標準的な電気泳動技法により集団の分離を明確に決定することができ、アイソザイムマーカーを実生組織においてスコア化し、植物を成熟状態に維持する必要をなくすことができ、アイソザイムマーカー対立遺伝子の共同優占はホモ接合体とヘテロ接合体の区別を可能にするという利点を与えた。Rick (1983) in Tanksley and Orton上記を参照。

量的形質遺伝子座：本明細書中で使用する用語「量的形質遺伝子座」（ＱＴＬ）は、様々な程度で量的形質、もしくは表現型の根底をなし、２つ以上のＤＮＡ配列（例えば遺伝子、非コード配列、および／または遺伝子間配列）の間の相互作用の原因となり得る、考えられるＤＮＡ配列（例えば遺伝子、非コード配列、および／または遺伝子間配列）として同定されているＤＮＡのストレッチ、またはＤＮＡの発現産物およびそれらの環境を指すことができる。量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）を分子的に同定して、量的形質の指定に関与する配列を含有するゲノム領域のマッピングを手助けすることができる。

本明細書中で使用する用語「ＱＴＬ間隔」は、ＱＴＬ形質の根底をなす遺伝子と連鎖したＤＮＡのストレッチを指すことができる。ＱＴＬ間隔は、典型的には、ただし必ずではないが、ＱＴＬ自体より大きい。ＱＴＬ間隔は、ＱＴＬに関して５’および／または３’であるＤＮＡのストレッチを含有することができる。

配列同一性：２つの核酸またはポリペプチド配列の文脈で、本明細書中で使用する用語「配列同一性」または「同一性」は、指定比較ウインドウにわたり最大対応性でアラインメントをとるとき同一である、２つの配列中の残基を指すことができる。

本明細書中で使用する用語「配列同一性の割合」は、比較ウインドウにわたる２つの最適アラインメント配列（例えば、核酸配列）の比較によって決定される値を指すことができ、比較ウインドウ中の配列の一部分は、２配列の最適アラインメントに関して（付加または欠失を含まない）参照配列と比較して付加または欠失（即ちギャップ）を含む可能性がある。その割合は、同一ヌクレオチドまたはアミノ酸残基が両配列中に存在する位置の数を決定して一致位置の数を得ること、比較ウインドウ中の位置の総数で一致位置の数を割ること、およびその結果に１００を掛けて配列同一性の割合を得ることによって計算される。

比較用配列のアラインメントをとるための方法は当技術分野でよく知られている。様々なプログラムおよびアラインメントアルゴリズムは、例えば、Smith and Waterman (1981) Adv.Appl.Math.2: 482; Needleman and Wunsch (1970) J.Mol.Biol.48: 443; Pearson and Lipman (1988) Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85: 2444; Higgins and Sharp (1988) Gene 73: 237-44; Higgins and Sharp (1989) CABIOS 5:151-3; Corpet et al.(1988) Nucleic Acids Res.16: 10881-90; Huang et al.(1992) Comp.Appl.Biosci.8: 155-65; Pearson et al. (1994) Methods Mol.Biol.24: 307-31; Tatiana et al.(1999) FEMS Microbiol.Lett.174: 247-50中に記載される。配列アラインメント法および相同性の計算の詳細な考察は、例えば、Altschul et al. (1990) J.Mol.Biol.215: 403-10において見ることができる。

国立生物工学情報センター（Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＮＣＢＩ）のＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ（商標）；Altschul et al. (1990)）を、いくつかの配列分析プログラムと共に使用するため、国立生物工学情報センター（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）を含めたいくつかの供給源から、およびインターネットで利用可能である。このプログラムを使用した配列同一性の決定の仕方に関する記載は、ＢＬＡＳＴ（商標）の「ヘルプ」セクションの下においてインターネットで利用可能である。核酸配列の比較のため、デフォルトパラメーターに設定したデフォルトＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスを使用して、ＢＬＡＳＴ（商標）（Ｂｌａｓｔｎ）プログラムの「Ｂｌａｓｔ ２ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」機能を利用することができる。参照配列とさらに高い類似性を有する核酸配列は、この方法によって評価すると高い割合の同一性を示す。

一塩基多型：本明細書中で使用する用語「一塩基多型」（ＳＮＰ）は、個体におけるゲノム（または他の共有配列）中の一ヌクレオチドが種または対の染色体のメンバー間で異なるときに存在する、ＤＮＡ配列変異を指すことができる。集団内で、特定集団において観察される遺伝子座での最小対立遺伝子頻度であるわずかな対立遺伝子頻度を、ＳＮＰに割り当てることができる。これは単に、一塩基多型に関する２つの対立遺伝子頻度の低い方である。異なる集団は、少なくとも若干異なる対立遺伝子頻度を示すと予想される。特定集団は、有意に異なる対立遺伝子頻度を示し得る。いくつかの例では、ＳＣＮ耐性と連鎖したマーカーはＳＮＰマーカーである。

ＳＮＰは遺伝子のコード配列内、遺伝子の非コード領域内、または遺伝子間の遺伝子内領域内に入り得る。コード配列内のＳＮＰは、遺伝コードの縮重のため、生成されるタンパク質のアミノ酸配列を必ずしも変えるわけではない。両型が同じポリペプチド配列をもたらすＳＮＰは「同義的」と呼ばれる（時折サイレント突然変異と呼ばれる）。異なるポリペプチド配列が生成する場合、それらは「非同義的」と呼ばれる。非同義的変化はミスセンスまたはナンセンスのいずれかであってよく、ミスセンス変化は異なるアミノ酸をもたらし、ナンセンス変化は早期の停止コドンをもたらす。タンパク質コード領域に存在しないＳＮＰは、遺伝子スプライシング、転写因子結合の産物、または非コードＲＮＡの配列を依然有し得る。ＳＮＰは通常２対立遺伝子であり、したがって植物および動物において容易にアッセイされる。Sachidanandam (2001) Nature 409: 928-33。

形質または表現型：用語「形質」と「表現型」は、本明細書中では交互に使用する。本開示の目的では、特定対象の形質はＳＣＮ耐性である。

ＩＩＩ．対象の形質と連鎖したマーカーのＱＴＬベースの同定
Ａ．概要
いくつかの実施形態では、従来のマッピング手法と異なる戦略を使用して、形質（例えば、ＳＣＮ耐性）をマッピングする。例えば、便宜上、４ステップを含むものとして記載することができる戦略に従い、形質をマッピングすることができる。第１のステップでは、マッピングする形質に相当するＱＴＬ間隔の標的領域を決定することができる。第２のステップでは、標的ゲノム（例えば、ダイズゲノム）の決定したＱＴＬ間隔内または近辺に位置するマーカー（例えば、ＳＮＰマーカー）を選択することができる。第３のステップでは、選択したマーカーに関する個々の対象の遺伝子型決定を容易にする、特異的プライマーを設計することができる。特定の例では、ＫＡＳＰａｒ（商標）遺伝子型決定アッセイ中で使用するための特異的プライマーを設計する。第４のステップでは、形質の分離を示す集団を特異的プライマーを使用してスクリーニングし、形質と連鎖したマーカーを同定することができる。

Ｂ．対象の形質と連鎖したマーカーおよびそれらの同定
ＱＴＬ間隔の標的領域の決定およびマーカーの同定。
当業者に利用可能な任意の技法により、ＱＴＬを決定することができる。例えば、特定形質に貢献することが知られている遺伝子の位置を参照することによって、対象の特定形質に対応するＱＴＬの物理的位置を最初に決定することができる。いくつかの実施形態では、それぞれ第８、１１、１８、および２０染色体上の少なくとも４領域においてＳＣＮ耐性遺伝子を同定することができる。例えば、Concibido et al.(1996) Theor.Appl.Genet.93: 234-41, Concibido et al.(1997) Crop Sci.37: 258-64, Meksem et al.(1999) Theor.Appl. Genet.99: 1131-42, Qui et al.(1999) Theor.Appl.Genet.98: 356-64, Meksem et al.(2001) Mol.Breeding 7: 63-71, Li et al.(2009) Mol. Breeding 24: 63-76, Wu et al.(2009) Theor.Appl.Genet. 118: 1093-105、米国特許第５，４９１，０８１号、同第６，０９６，９４４号、同第６，１６２，９６７号、同第６，２７１，４３７号、同第６，２８４，９４８号、同第６，３００，５４１号、同第６，５３８，１７５号、同第７，１５４，０２１号、同第７，４８５，７７０号、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．２００２０１２９４０２、２００２０１４４３１０、２００３０００５４９１、２００３０１３５８８１、２００６０２２５１５０、２００６０２５３９１９、２００８００７２３５２、および２００９０１００５３７、ならびに国際ＰＣＴ公開ＷＯ１９９５０２０６６９Ａ２、ＷＯ２００１０５１６２７Ａ２、およびＷＯ２００８１５３８０４Ａ２を参照。いくつかの実施形態では、最初に同定したＱＴＬを、最初に同定したＱＴＬの境界と同じまたは異なる境界をゲノム内に有し得るＱＴＬの、低複雑性または広範囲の一覧にグループ分けまたは分類する。

いくつかの実施形態では、ＱＴＬ形質と連鎖するマーカーを含有する可能性がある、ＤＮＡの領域を選択することができる。この領域はＱＴＬ間隔と呼ぶことができる。例えば、ＱＴＬ間隔は、５’方向と３’方向の一方または両方に、ＱＴＬおよびＱＴＬ付近に存在する追加のゲノムＤＮＡを含むＤＮＡの領域であってよい。いくつかの実施形態では、ＱＴＬ間隔は、約４Ｍｂ、約３．５Ｍｂ、約３Ｍｂ、約２．５Ｍｂ、約２Ｍｂ、約１．５Ｍｂ、または約１Ｍｂであってよい。

特定の実施形態では、標的ゲノムを検索して、ＱＴＬ、およびＱＴＬ間隔内部、その近辺、またはその間に物理的に位置するマーカーを同定することができる。知られているマーカーの位置を含有する参照マップが標的ゲノムに利用可能である場合、その参照マップを使用してマーカーを同定することができる。標的ゲノムの核酸配列は、例えばＢＬＡＳＴ（商標）などのソフトウエアによって検索することもできる。いくつかの実施形態では、ＳＮＰマーカーを同定することができる。いくつかの実施形態では、ＳＣＮ耐性形質に対応するダイズゲノムのＱＴＬ、およびＱＴＬ間隔内部、その近辺、またはその間に物理的に位置する、マーカーを同定することができる。特定の例では、ＳＣＮ耐性形質に対応するダイズゲノムのＱＴＬ、およびＱＴＬ間隔内部、その近辺、またはその間に物理的に位置する、同定するＳＮＰマーカーは、表２中に列挙するマーカーからなる群から選択することができる。

他の実施形態では、対象の形質に対応するＱＴＬ、およびＱＴＬ間隔内部、その近辺、またはその間に物理的に位置する、同定したマーカーから、特定マーカーを選択することができ、そこからマッピング集団を作製する親株の間で、それらのマーカーは多型である。親株間の所与のマーカーの多型は、親株から生じるマッピング集団中の組換え事象を追跡する能力と直接関係がある。

特定の例では、親ダイズ株間の多型マーカーを選択しＳＣＮ耐性マッピング集団をスクリーニングして、存在する場合、どの多型マーカーがＳＣＮ耐性形質と連鎖しているか決定する。このようなマーカーは、ＳＮＰマーカーの１つの対立遺伝子がＳＣＮ耐性個体中にのみ出現し、かつＳＮＰマーカーの他の対立遺伝子がＳＣＮ感受性個体中にのみ出現するように分離し得る。マッピング集団は、ＳＣＮ耐性である一品種をＳＣＮ感受性である別の品種と交配させることによって作製することができる。いくつかの実施形態では、マッピング集団は、約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約９５、約１００、約１５０、約２００、約２５０、約３００、約３５０、約４００、約４５０、約５００、またはそれより多くの個体を含むことができる。いくつかの実施形態では、ＳＣＮ耐性ダイズ生殖質９８８６０−７１を１つまたは複数のＳＣＮ感受性生殖質（複数可）（例えば、７５２１３および６ＣＨ０２６−０３５）と交配して、マッピング集団を作製することができる。

いくつかの実施形態では、多型マーカーは、対象のＳＣＮ耐性形質に対応する遺伝子またはＱＴＬと連鎖しているかまたは内部に存在する一塩基多型（ＳＮＰ）であってよい。これらのＳＮＰマーカーは、それだけには限られないが、対象領域全体の短いもしくは長い配列の読み取りを可能にするサンガーの配列決定法またはハイスループット配列決定（「次世代」）方法を含めた、当技術分野で知られている任意のＤＮＡ配列決定法を使用して、遺伝子またはＱＴＬを含有する領域全体の配列決定により検出することができる。配列決定による遺伝子型決定をＳＮＰマーカーの検出に使用する、このような実施形態では、対象の遺伝子またはＱＴＬにおけるＳＮＰを含有する領域の隣接配列に対応するプライマーを配列決定性に利用して、対象領域全体を配列決定することができる。このような実施形態では、本明細書中に例示するＳＮＰの検出のため対象領域全体の配列決定に異なる遺伝子型を使用するとき、本明細書中に例示するＳＮＰ以外の他のＳＮＰを同定することができる。このような実施形態では、本明細書中に例示するＳＮＰ自体（個々のＳＮＰ）または例示した配列と連鎖した他のＳＮＰとの組合せ（ハプロタイプ）を、対象のＳＣＮ耐性形質に関する植物のマーカー支援型選択のため、遺伝子型を区別するのに利用することができる。

プライマー設計および連鎖のスクリーニング。
オリゴヌクレオチドプローブ（例えばプライマー）を設計して、対象の形質に対応するＱＴＬ、およびＱＴＬ間隔内部、その近辺、またはその間に物理的に位置するマーカーを特異的に検出することができる。一般に、マーカーの１対立遺伝子のみと特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブを設計することができる。いくつかの実施形態では、各々が他のプローブが特異的にハイブリダイズしないＳＮＰ対立遺伝子と特異的にハイブリダイズするように、２つのオリゴヌクレオチドプローブを設計してＳＮＰマーカーを検出する。当業者によって理解されるように、個々のマーカーに関するオリゴヌクレオチドプローブの長さまたは組成は、プローブをマーカーの１対立遺伝子に非特異的にせずに、確立した原理に従い変えることができる。

いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブはプライマーであってよい。具体的な実施形態では、ＫＡＳＰａｒ（商標）遺伝子型決定アッセイにおいてマーカーを検出するための、プライマーを設計することができる。特定の実施形態では、ＫＡＳＰａｒ（商標）遺伝子型決定アッセイを使用してダイズにおけるＳＣＮ耐性表現型と連鎖したマーカーを検出するための、プライマーを設計することができる。これらおよびさらなる実施形態では、検出システムはマッピング集団における個体の遺伝子型を決定するためのハイスループットで好都合な形式をもたらすことができ、それによって特定遺伝子または形質を有する個体の同定を非常に容易にすることができ、マーカー支援型選択プログラムの実施または実行を非常に容易にすることもできる。

具体的な実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブは、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）遺伝子型決定アッセイにおいてマーカーを検出するように設計されたプライマーであってよい。この方法は、ＳＣＮ耐性遺伝子と密接に連鎖したマーカーに特異的なプライマー、および一塩基多型（ＳＮＰ）を含有する蛍光標識プローブを利用する。耐性と関係があるＳＮＰプローブはＦＡＭなどの蛍光色素で標識し、一方感受性と関係があるプローブはＶＩＣなどの異なる蛍光色素で標識する。データは蛍光色素シグナルの有無として分析する。検出システムはマッピング集団における個体遺伝子型決定の多重化などの、ハイスループットで好都合な形式をもたらすことができ、それによって特定遺伝子または形質を有する個体の同定を非常に容易にすることができ、マーカー支援型選択プログラムの実施または実行を非常に容易にすることもできる。

例えば例示的マーカーと追加のマーカーの間の組換え頻度を決定することによって、本明細書中で命名する任意の例示的マーカー（例えば、表３中に列挙するマーカー、例えばｒｈｇ１−３９９５、ＢＡＲＣ＿０１０８８９＿０１６９１、およびＮＣＳＢ＿００４０７４など）の同等物として、追加のマーカーを同定することができる。このような決定は、Mather (1931), The Measurement of Linkage in Heredity, Methuen & Co., Londonの方法に基づく正射影法、次に組換え頻度を決定するための最大尤度試験を利用することができる。Allard (1956) Hilgardia 24: 235-78。組換え頻度の値が０．１０（すなわち１０％）以下である場合、追加のマーカーは、本開示の方法中で使用する目的の特定の例示的マーカーと、同等であると考えられる。

本発明のいくつかの実施形態では、任意および全てのＳＣＮ耐性遺伝子と連鎖したマーカーを同定することができる。さらに、本発明のいくつかの実施形態では、全てのＳＣＮ ＨＧ種に関する任意および全ての耐性に貢献する遺伝子座を制御するマーカーを同定することができる。

ダイズにおけるＳＣＮ耐性をもたらすための手段はＳＮＰマーカー対立遺伝子であってよく、生殖質９８８６０−７１に属するかまたは由来するダイズ植物における、そのＳＮＰマーカー対立遺伝子の検出は、その核酸配列を含む植物がＳＣＮ耐性表現型を有する、強力な指標を少なくとももたらす。いくつかの例では、ダイズにおけるＳＣＮ耐性をもたらすための手段は、表３中に列挙するマーカーからなる群から選択されるマーカーである。特定の例では、ダイズにおけるＳＣＮ耐性をもたらすための手段は、ｒｈｇ１−３９９５、ＢＡＲＣ＿０１０８８９＿０１６９１、およびＮＣＳＢ＿００４０７４からなる群から選択されるマーカーである。

ＳＣＮ耐性表現型を有するダイズ植物を同定するための手段は、ＳＣＮ耐性遺伝子型を有する生殖質９８８６０-７１に属するかまたは由来するダイズ植物から得たサンプルに加えると検出可能なシグナルを示す分子であってよいが、ＳＣＮ耐性表現型を有さない生殖質９８８６０−７１に属するかまたは由来するダイズ植物から得たサンプルに加えると、その手段は検出可能なシグナルを示さない。核酸の特異的ハイブリダイゼーションは検出可能なシグナルであり、ＳＣＮ耐性表現型と連鎖したＳＮＰマーカー対立遺伝子と特異的にハイブリダイズする核酸プローブは、したがってＳＣＮ耐性表現型を有するダイズ植物を同定するための手段であり得る。いくつかの例では、ＳＣＮ耐性表現型を有するダイズ植物を同定するための手段は、ＳＣＮ耐性表現型と連鎖したマーカーと特異的にハイブリダイズするプローブである。

Ｃ．対象の形質と連鎖したマーカーを使用する方法
対象の形質（例えば、ダイズにおけるＳＣＮ耐性）と連鎖した核酸分子マーカーを使用して対象の形質を有する植物を同定する方法は、植物生産者にコスト節約をもたらすことができる。このような方法は、（例えば、ＳＣＮ耐性を有するダイズ植物品種を脆弱性植物品種と交配させることによって）開発中に生じる個々の植物を、表現型決定する必要性を除去することができるからである。

特定の実施形態では、ダイズにおけるＳＣＮ耐性と連鎖したマーカーを使用して、ＳＣＮ耐性の１つまたは複数の決定因子を含有するＤＮＡのセグメント（複数可）を移動させることが可能である。特定の実施形態では、表３中に列挙するマーカーおよびそれらの同等物であるマーカーを含むマーカーの群から、マーカーを選択することができる。いくつかの実施形態では、ｒｈｇ１−３９９５、ＢＡＲＣ＿０１０８８９＿０１６９１、およびＮＣＳＢ＿００４０７４からなる群からマーカーを選択することができる。いくつかの実施形態では、ダイズにおけるＳＣＮ耐性と連鎖したマーカーを使用してＳＣＮ耐性の１つまたは複数の決定因子を含有するＤＮＡのセグメント（複数可）を移動させる方法は、ＳＣＮ耐性表現型と連鎖したマーカーと特異的にハイブリダイズ可能であるプローブで、２つの親植物のゲノムＤＮＡを分析するステップと、２つの親植物遺伝子型を有性交配して子孫集団を得るステップと、ＳＣＮ耐性表現型と連鎖したマーカーの存在に関してこれらの子孫を分析するステップと、ＳＣＮ耐性表現型と連鎖したマーカーを含有する子孫をレシピエントの遺伝子型と戻し交配させて第１の戻し交配集団を生成するステップと、次いで、親の遺伝子型およびＳＣＮ耐性表現型によって示される任意の望ましい形質（複数可）を含む最終子孫を得られるまで、戻し交配プログラムを続けるステップとを含むことができる。特定の実施形態では、各交配および戻し交配ステップにおいて得られる個々の子孫は、各世代でのＳＣＮマーカー分析によって選択する。いくつかの実施形態では、ＳＣＮ耐性表現型と連鎖したマーカーと特異的にハイブリダイズ可能であるプローブを用いた２つの親植物のゲノムＤＮＡの分析によって、一方の親植物が、プローブが特異的にハイブリダイズする少数の連鎖マーカーを含むこと、またはプローブが特異的にハイブリダイズする連鎖マーカーを含まないことが明らかになる。いくつかの実施形態では、各交配および／または戻し交配において得られる個々の子孫は個々の植物の配列変異によって選択する。

いくつかの実施形態では、ＳＣＮ耐性表現型と連鎖したマーカーを使用して、遺伝子形質転換により植物（例えばダイズ）中にＳＣＮ耐性の１つまたは複数の決定因子を導入することができる。特定の実施形態では、表３中に列挙するマーカーおよびそれらの同等物であるマーカーを含むマーカーの群から、マーカーを選択することができる。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えにより植物中にＳＣＮ耐性の１つまたは複数の決定因子を導入するための方法は、ＳＣＮ耐性表現型と連鎖したマーカーと特異的にハイブリダイズ可能であるプローブで植物（例えばダイズ）のゲノムＤＮＡを分析して、植物中のＳＣＮ耐性の１つまたは複数の決定因子を同定するステップと、例えばゲノムＤＮＡを抽出し１つまたは複数の制限エンドヌクレアーゼ酵素でそのゲノムＤＮＡを消化することによって、ＳＣＮ耐性表現型と連鎖したマーカーを含む植物のゲノムＤＮＡのセグメントを単離するステップと、ＤＮＡの単離セグメントを場合によっては増幅するステップと、宿主植物の細胞または組織中にＤＮＡの単離セグメントを導入するステップと、ＳＣＮ耐性表現型と連鎖したマーカーと特異的にハイブリダイズ可能であるプローブで宿主植物のＤＮＡを分析して、宿主植物中のＳＣＮ耐性の１つまたは複数の決定因子を同定するステップとを含むことができる。特定の実施形態では、ＤＮＡの単離セグメントを、それが宿主植物のゲノムに安定的に組み込まれるように宿主植物中に導入することができる。

いくつかの実施形態では、ＳＣＮ耐性表現型と連鎖したマーカーを使用して、他の生物、例えば植物中にＳＣＮ耐性の１つまたは複数の決定因子を導入することができる。特定の実施形態では、表３中に列挙するマーカーおよびそれらの同等物であるマーカーを含むマーカーの群から、マーカーを選択することができる。いくつかの実施形態では、ダイズ以外の生物中にＳＣＮ耐性の１つまたは複数の決定因子を導入するための方法は、ＳＣＮ耐性表現型と連鎖したマーカーと特異的にハイブリダイズ可能であるプローブで植物（例えばダイズ植物）のゲノムＤＮＡを分析して、植物中のＳＣＮ耐性の１つまたは複数の決定因子を同定するステップと、例えばゲノムＤＮＡを抽出し１つまたは複数の制限エンドヌクレアーゼ酵素でそのゲノムＤＮＡを消化することによって、ＳＣＮ耐性の１つまたは複数の決定因子を含む植物のゲノムＤＮＡのセグメントを単離するステップと、ＤＮＡの単離セグメントを場合によっては増幅するステップと、ダイズ以外の生物中にＤＮＡの単離セグメントを導入するステップと、ＳＣＮ耐性表現型と連鎖したマーカーと特異的にハイブリダイズ可能であるプローブでダイズ以外の生物のＤＮＡを分析して、生物中のＳＣＮ耐性の１つまたは複数の決定因子を同定するステップとを含むことができる。他の実施形態では、ＤＮＡの単離セグメントを、それが生物のゲノムに安定的に組み込まれるように生物中に導入することができる。

いくつかの実施形態では、ＳＣＮ耐性表現型と連鎖したマーカーを使用して、ＳＣＮ耐性の１つまたは複数の決定因子を有する植物を同定することができる。いくつかの実施形態では、植物はダイズ植物であってよい。例えば、植物は生殖質９８８６０−７１のダイズ植物であってよい。特定の実施形態では、核酸分子（例えば、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡ）を植物から抽出することができる。抽出した核酸分子は、ＳＣＮ耐性表現型と連鎖したマーカーと特異的にハイブリダイズ可能である１つまたは複数のプローブと、次いで接触させることが可能である。抽出した核酸分子と１つまたは複数のプローブの特異的ハイブリダイゼーションは、植物におけるＳＣＮ耐性の１つまたは複数の決定因子の存在を示す。

いくつかの実施形態では、ＳＣＮ耐性の多数の決定因子と連鎖したマーカーを同時に使用することができる。他の実施形態では、１つのＳＣＮ耐性の決定因子のみと連鎖したマーカーを使用することができる。具体的な例では、１つまたは複数の特定ＳＣＮ ＨＧレース（例えば、レース１、レース２、レース３、レース５、およびレース１４）に関してＳＣＮ耐性と連鎖したマーカーを同時に使用することができる。例えば、異なるＳＣＮ ＨＧレースに関してＳＣＮ耐性と連鎖した複数のマーカーを同時に使用することができる。
（実施例）

以下の実施例は、特定の個々の特徴および／または実施形態を例示するために示される。これらの実施例は、記載する個々の特徴または実施形態に対する開示を制限するものと解釈すべきではない。

材料および方法
２４個のダイズ栽培種およびＳＣＮマッピング親を使用して、ＳＣＮ耐性表現型と連鎖したマーカーを同定した。１４の栽培種、７５１１０、７５１５５、７５１６３、９９６３０、９９７２６、９５８９５−７５５ＰＲＵ、９９３４５−３１、７５１９２、７５２０９、７５１５９、Ｅｓｓｅｘ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ８２、７５２１３、および６ＣＨ０２６−０３５がＳＣＮ感受性であった。１０の栽培種、Ｍａｖｅｒｉｃｋ、Ｐｅｋｉｎｇ、ＰＩ２０９３３２、ＰＩ４３７６５４、９９８１１、９９２９４、Ｆｏｒｒｅｓｔ、ＰＩ８８７８８、ＰＩ４３７６５４、および９８８６０−７１がＳＣＮ耐性であった。

ＳＣＮバイオアッセイ：ＳＣＮバイオアッセイを実施して、ＳＣＮ耐性ダイズ品種９８８６０−７１とＳＣＮ感受性ダイズ品種７５２１３および６ＣＨ０２６−０３５の交配によって生じたマッピング集団の表現型の情報を得た。使用したマッピング集団の表現型の情報は表３中に列挙する。当技術分野は、ダイズ品種における耐性レベルを分類するための均一な手法を有していない。したがって、耐性レベルは「ＳＣＮスコア」の点で分類した。ＳＣＮスコア０〜１０＝Ｒ（耐性）、ＳＣＮスコア１０．１〜２９．９＝ＭＲ（中程度の耐性）、ＳＣＮスコア３０．０〜５９．９＝ＭＳ（中程度の感受性）、および６０＋＝Ｓ（感受性）。周知の感受性および耐性株と試験株を比較することによって、ＳＣＮ指数値を測定した。指数スコアは、サンプルに関して観察したＳＣＮ感受性の割合に直接基づいた。例えば、試験株が９植物の各々において１０の嚢子を有し、Ｗｉｌｌｉａｍｓ（感受性）が９植物の各々において１００の嚢子を有した場合、試験株は１０％の指数で分類した。最終指数は９植物のスコアの平均であった。

ＫＡＳＰａｒ（商標）反応：ＳＮＰを有するＤＮＡ配列を提供することにより、ＫＬＩＭＳ（商標）（ＫＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ）においてＰｒｉｍｅｒＰｉｃｋｅｒ（商標）ツールを使用してＫＡＳＰａｒ（商標）プライマーを設計した。３つのプライマー、Ａ１（対立遺伝子特異的プライマー１）、Ａ２（対立遺伝子特異的プライマー２）、およびＣ（一般的なリバースプライマー）を、ＫＡＳＰａｒ（商標）の化学的性質に基づき各々のＳＮＰ配列用に設計した。各ＫＡＳＰａｒ（商標）反応のアッセイ混合物は、ＫＡＳＰａｒ（商標）ＳＮＰ遺伝子型決定システムｖ２．０中と同様に調製した。最終反応体積は反応当たり５μＬであり、１μＬのＤＮＡ鋳型（５ｎｇ／μＬ）、２．５μＬの２×反応混合物、０．０６８７５μＬのアッセイ混合物、０．０４μＬの５０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、および１．３９１２５μＬのｄｄＨ_２Ｏを含んでいた。アッセイは３８４ウエル形式で実施した。アッセイ中に使用した熱循環条件は製造者の説明書に従った。９４℃で１５分間、２０サイクルの９４℃で１０秒間、５７℃で５秒間、および７２℃で１０秒間、ならびに２２サイクルの９４℃で１０秒間、５７℃で２０秒間、および７２℃で４０秒間。ＰＣＲ用プレートを遠心分離し、対立遺伝子特異的ＦＡＭとＶＩＣの強度を室温において分光蛍光計（Ｔｅｃａｎ ＧＥＮｉｏｓ（商標）、Ｍａｎｎｅｄｏｒｆ、スイス）で読み取った。データは直接ロードし、Ｋｌｕｓｔｅｒ Ｃａｌｌｅｒ（商標）を使用してＫＬＩＭＳ（商標）で分析した。

ＳＣＮ耐性遺伝子と連鎖したＱＴＬおよびＱＴＬ間隔の物理的位置の同定
ＳＣＮ耐性に関与するＱＴＬを、ＳＣＮに関する文献を研究することにより初期に同定した。ＳＣＮに関する文献中に見られる初期に同定したＳＣＮ関連ＱＴＬは、図１ａ、図１ａ−１、図１ｂ及び図１ｂ−１（図１ａ−１は図１ａの続き、図１ｂ−１は図１ｂの続き）中に列挙する。

ＳＣＮに関する文献中で初期に同定されたＱＴＬの一覧から、異なるＳＣＮレースに対する耐性に関与するいくつかの異なるＱＴＬ間隔を、ダイズゲノムマップとの参照によって決定した。例えば図２を参照。例えば、図３中に示すように連鎖群（ＬＧ）ＧにおけるＱＴＬ間隔を決定し、図４中に示すようにＬＧ Ａ_２におけるＱＴＬ間隔を決定し、図５中に示すようにＬＧ Ｂ_１におけるＱＴＬ間隔を決定し、図６中に示すようにＬＧ ＩにおけるＱＴＬ間隔を決定した。表２は、異なるＳＣＮレースに対する耐性に関与する、例示的ＱＴＬおよびそれらの対応する決定したＱＴＬ間隔を列挙する。

ＳＣＮ耐性遺伝子と連鎖したＱＴＬおよびＱＴＬ間隔の内部／近辺／間に物理的に位置するＳＮＰマーカーの同定
決定したＱＴＬ間隔の内部、その近辺、またはその間に物理的に位置するＳＮＰマーカーに関して、ＢＬＡＳＴ（商標）を使用してダイズゲノムを検索した。これらのＳＮＰマーカーのいくつかは、ＳＣＮ耐性表現型と連鎖している可能性があると仮定した。合計７９個のＳＮＰマーカーを、２４個のダイズ株（１４のＳＣＮ感受性と１０のＳＣＮ耐性）を使用する初期スクリーニング用に選択して、存在する場合、これらのＳＮＰマーカーのどれがＳＣＮ耐性表現型と連鎖しているかを決定した。７９個のマーカーの２５個がＬＧ Ｇに位置し、マーカーの１２個がＬＧ Ａ_２に位置し、マーカーの２２個がＬＧ Ｂ_１に位置し、マーカーの２０個がＬＧ Ｉに位置した。７９個の選択したマーカーの全てを表２中に列挙する。

ＫＡＳＰａｒ（商標）アッセイの開発
２４個の親株における７９個のＳＮＰマーカーの初期スクリーニングを、ＫＡＳＰａｒ（商標）遺伝子型決定アッセイを使用して実施した。７５個のＳＮＰマーカーを確認した。

ＬＧ Ｇ（Ｇｍ１８）において２１個のＳＮＰマーカーを確認した。ＮＣＳＢ＿００４０７２、ＢＡＲＣ＿０１５２７７＿０１９２９、ＮＣＳＢ＿００４０７３、ＮＣＳＢ＿００４０７４、ＮＣＳＢ＿００４０７５、ＮＣＳＢ＿００４０７６、ＮＣＳＢ＿００４０７７、ＮＣＳＢ＿００４０７８、ＮＣＳＢ＿００４０７９、ＮＣＳＢ＿００４０８０、ＮＣＳＢ＿００４０８１、ＮＣＳＢ＿００４０８２、ＮＣＳＢ＿００４０８３、ＮＣＳＢ＿００４０８４、ＮＣＳＢ＿００４０８５、ＮＣＳＢ＿００４０８６、ＮＣＳＢ＿００４０９７、ＮＣＳＢ＿００４０９８、ＮＣＳＢ＿００４１０７、ＮＣＳＢ＿００４１０８、およびＮＣＳＢ＿００４１０９。

ＬＧ Ａ２（Ｇｍ０８）において１２個のＳＮＰマーカーを確認した。ＢＡＲＣ＿０２５９１１＿０５０８９、ＢＡＲＣ＿０１９４１９＿０２９２１、ＮＣＳＢ＿００１７１０、ＮＣＳＢ＿００１７１１、ＮＣＳＢ＿００１７１２、ＮＣＳＢ＿００１７１３、ＮＣＳＢ＿００１７１４、ＮＣＳＢ＿００１７１５、ＮＣＳＢ＿００１７１６、ＮＣＳＢ＿００１７１７、ＮＣＳＢ＿００１７１８、およびＮＣＳＢ＿００１７１９。

ＬＧ Ｂ１（Ｇｍ１１）において２２個のＳＮＰマーカーを確認した。ＮＣＳＢ＿００２６４４、ＮＣＳＢ＿００２６４５、ＮＣＳＢ＿００２６４６、ＮＣＳＢ＿００２６４７、ＮＣＳＢ＿００２６４８、ＮＣＳＢ＿００２６４９、ＮＣＳＢ＿００２６５０、ＮＣＳＢ＿００２６５１、ＮＣＳＢ＿００２６５２、ＮＣＳＢ＿００２６５３、ＮＣＳＢ＿００２６５４、ＮＣＳＢ＿００２６５５、ＮＣＳＢ＿００２６５６、ＮＣＳＢ＿００２６５７、ＢＡＲＣ＿００７７０４＿０００９１、ＢＡＲＣ＿０１０２６９＿００５３７、ＢＡＲＣ＿９０４０５０＿０１００７、ＢＡＲＣ＿０１９５５７＿０３２０２、ＢＡＲＣ＿０１８６４９＿０３２２１、ＢＡＲＣ＿０２５７０３＿０４９９９、ＢＡＲＣ＿０１３５４７＿０１１５７、およびＢＡＲＣ＿０３５３７９＿０７１７８。

ＬＧ Ｉ（Ｇｍ２０）において２０個のＳＮＰマーカーを確認した。ＮＣＳＢ＿００４９７４、ＮＣＳＢ＿００４９７５、ＮＣＳＢ＿００４９７７、ＮＣＳＢ＿００４９７９、ＮＣＳＢ＿００４８８２、ＮＣＳＢ＿００４８８３、ＮＣＳＢ＿００４８８４、ＮＣＳＢ＿００４８８６、ＮＣＳＢ＿００４８８７、ＮＣＳＢ＿００４８８９、ＮＣＳＢ＿００４８８０、ＮＣＳＢ＿００４８８２、ＮＣＳＢ＿００４８８３、ＮＣＳＢ＿００４８８４、ＮＣＳＢ＿００４８８５、ＮＣＳＢ＿００４８８７、ＮＣＳＢ＿００４８８８、ＮＣＳＢ＿００４８９９、ＮＣＳＢ＿００４９００、およびＮＣＳＢ＿００４９０３。

初期スクリーニングは、２４個の親株間で４４個のＳＮＰマーカーを多型として同定した。ＳＣＮ耐性ダイズ品種９８８６０−７１とＳＣＮ感受性ダイズ品種７５２１３および６ＣＨ０２６−０３５の交配によって生じたマッピング集団に関するさらなる連鎖試験用に、２４個の多型マーカー（ＮＣＳＢ＿００１７１６（ＬＧ Ａ_２）、ＮＣＳＢ＿００２６４５（Ｂ_１）、ＮＣＳＢ＿００２６４６（Ｂ_１）、ＮＣＳＢ＿００２６４８（Ｂ_１）、ＮＣＳＢ＿００２６５１（Ｂ_１）、ＮＣＳＢ＿００２６５２（Ｂ_１）、ＮＣＳＢ＿００２６５４（Ｂ_１）、ＮＣＳＢ＿００２６５６（Ｂ_１）、ＢＡＲＣ＿０１３５４７＿０１１５７（Ｂ_１）、ＮＣＳＢ＿００４０７３（Ｇ）、ＮＣＳＢ＿００４０７４（Ｇ）、ＮＣＳＢ＿００４０７８（Ｇ）、ＮＣＳＢ＿００４０８０（Ｇ）、ＮＣＳＢ＿００４０８４（Ｇ）、ＮＣＳＢ＿００４０８５（Ｇ）、ＮＣＳＢ＿００４０９７（Ｇ）、ＮＣＳＢ＿００４１０９（Ｇ）、ＢＡＲＣ＿０１２２３７＿０１７５５（Ｇ）、ｒｇｈ１−６８９（Ｇ）、ｒｇｈ１−７５７（Ｇ）、ｒｇｈ１−２５６４（Ｇ）、ｒｇｈ１−３９９５（Ｇ）、およびＮＣＳＢ＿００４９００（Ｉ））を選択した。図７は、４個の多型マーカーに関するＫＡＳＰａｒ（商標）アッセイからの、代表的な遺伝子型決定データを示す。

ＳＣＮ耐性親と感受性親の間で１５個のＳＮＰマーカーが多型であった。これらの１５個の多型ＳＮＰマーカーは、マッピング集団中の９３の個体に対して後にスクリーニングした。

マッピング集団の個体に対して試験した親株間で、多型であった１５個のＳＮＰマーカーの中で、３個のＳＮＰ、ＮＣＳＢ＿００４０７４、ＢＡＲＣ＿０１０８８９＿０１６９１、およびｒｈｇ１−３９９５のみがＳＣＮ耐性形質との同時分離を示した。図８。これら３個のマーカーに関して個体の遺伝子型を決定するのに使用したＫＡＳＰａｒ（商標）プライマー配列は、表３中に列挙する。

参照としてダイズ栽培種Ｗｉｌｌｉａｍｓ８２のゲノム核酸配列を使用すると、ＢＡＲＣ＿０１０８８９＿０１６９１は１，６７４，５１１塩基対で第１８染色体上に位置し、ＮＣＳＢ＿００４０７４は１，６６３，６７１塩基対で第１８染色体上に位置し、ｒｇｈ１−３９９５は１，７１４，７４１塩基対で第１８染色体上に位置する。３個の連鎖マーカー（ＮＳＣＢ＿００４０７４、ＢＡＲＣ＿０１０８８９＿０１６９１、およびｒｈｇ１−３９９５）は全て、ｒｈｇ１遺伝子座内（ｒｈｇ１−３９９５）、または連鎖群Ｇにおいてその近辺（ＢＡＲＣ＿０１０８８９＿０１６９１およびＮＣＳＢ＿００４０７４）のいずれかに位置する。

耐性および中程度の耐性の表現型に関して、３個の連鎖マーカー全ての遺伝子型が表現型と一致した。感受性株に関しては、ＢＡＲＣ＿０１０８８９＿０１６９１は表現型と５つのミスマッチがあり、ＮＳＣＢ＿００４０７４は９つのミスマッチがあり、ｒｈｇ１−３９９５は６つのミスマッチがあった。表４参照。

本発明者らが、これら３個のＳＮＰマーカーを用いて任意の感受性遺伝子型を同定した後、偽陰性率は０％である。言い換えると、本発明者らは、３個のマーカーを使用して、ＳＣＮ感受性表現型を完璧な精度で同定することができる。本発明者らは、約１０〜１８％の「偽陽性」率でＳＣＮ耐性遺伝子型を予測することもできる（５１、感受性サンプルの合計数割る５または９）。したがって、同定されたＳＣＮ耐性遺伝子型の中で、それらの５〜９％のみがＳＣＮ感受性表現型を示すと予想される。

ＳＣＮ耐性表現型と連鎖したＬＧ Ａ_２、ＬＧ Ｂ_１、およびＬＧ ＩにおけるＳＮＰマーカー
連鎖群Ａ_２、Ｂ_１、およびＩにおけるＳＣＮ耐性と関連があるＱＴＬ間隔の内部、その近辺、またはその間に物理的に位置するＳＮＰマーカーに関して、ＢＬＡＳＴ（商標）を使用してダイズゲノムを検索する。ＳＮＰマーカーの一覧はＢＬＡＳＴ（商標）検索によって作製する。複数のＳＮＰマーカーを、ＳＣＮ感受性およびＳＣＮ耐性ダイズ株を使用する初期スクリーニング用に選択して、存在する場合、連鎖群Ａ_２、Ｂ_１、およびＩにおけるこれらのＳＮＰマーカーのどれがＳＣＮ耐性表現型と連鎖しているかを決定する。

親株において選択したＳＮＰマーカーの初期スクリーニングを、ＫＡＳＰａｒ（商標）遺伝子型決定アッセイを使用して実施する。一組の選択したＳＮＰマーカーを確認し、その部分集合は親株間の多型として同定する。多型ＳＮＰマーカーの少なくとも１つを、ＳＣＮ耐性ダイズ品種と１つまたは複数のＳＣＮ感受性ダイズ品種の交配によって生じたマッピング集団に関する連鎖試験用に使用する。１つまたは複数のこれらの多型ＳＮＰマーカーは、マッピング集団中の個体に対してスクリーニングする。

マッピング集団の個体においてＳＣＮ耐性形質と同時分離するＳＮＰは、ＳＣＮ耐性親品種においてＳＣＮ耐性と連鎖する連鎖群Ａ_２、Ｂ_１、およびＩにおけるマーカーとして同定する。連鎖マーカーの遺伝子型は、マッピング集団の個体において観察される表現型と一致する。

生殖質ＪＴＮ−５１０９におけるＳＣＮ耐性表現型と連鎖したＳＮＰマーカー
ＳＣＮ耐性と関連があるＱＴＬ間隔の内部、その近辺、またはその間に物理的に位置する複数のＳＮＰマーカー（例えば、表３中に列挙するマーカーの群から選択されるＳＮＰマーカー）を、ＳＣＮ耐性ダイズ品種ＪＴＮ−５１０９とＳＣＮ感受性ダイズ株を使用する初期スクリーニング用に選択して、存在する場合、これらのＳＮＰマーカーのどれがダイズ品種ＪＴＮ−５１０９においてＳＣＮ耐性表現型と連鎖しているかを決定する。

親株において選択したＳＮＰマーカーの初期スクリーニングを、ＫＡＳＰａｒ（商標）遺伝子型決定アッセイを使用して実施する。一組の選択したＳＮＰマーカーを確認し、その部分集合はダイズ品種ＪＴＮ−５１０９およびＳＣＮ感受性親株間の多型として同定する。多型ＳＮＰマーカーの少なくとも１つを、ダイズ品種ＪＴＮ−５１０９と１つまたは複数のＳＣＮ感受性ダイズ品種の交配によって生じたマッピング集団に関する連鎖試験用に使用する。これらの１つまたは複数の多型ＳＮＰマーカーは、マッピング集団中の個体に対してスクリーニングする。

マッピング集団の個体においてＳＣＮ耐性形質と同時分離するＳＮＰは、ダイズ品種ＪＴＮ−５１０９においてＳＣＮ耐性と連鎖するマーカーとして同定する。連鎖マーカーの遺伝子型は、マッピング集団の個体において観察される表現型と一致する。

レース３以外のＨＧレースにおけるＳＣＮ耐性表現型と連鎖したＳＮＰマーカー
ＰＩ８８７８８、Ｐｅｋｉｎｇ、ＰＩ４３７６５４、ＰＩ９０７６３、ＰＩ４３８４８９Ｂ、ＰＩ８９７７２、ＰＩ２０９３３２、ＰＵＳＣＮ１４、Ｈａｒｔｗｉｇ、Ｆｏｒｒｅｓｔ、およびＰｙｒａｍｉｄからなる群から選択されるＳＣＮ耐性ダイズ品種を１つまたは複数のＳＣＮ感受性ダイズ品種と交配させることによって、マッピング集団をレース３以外のＨＧレースに特異的に開発する。

特異的ＨＧレースに関してＳＣＮ耐性と関連があるＱＴＬ間隔の内部、その近辺、またはその間に物理的に位置するＳＮＰマーカーに関して、ＢＬＡＳＴ（商標）を使用してダイズゲノムを検索する。ＳＮＰマーカーの一覧はＢＬＡＳＴ（商標）検索によって作製する。複数のＳＮＰマーカーを、選択ＳＣＮ耐性ダイズ品種とＳＣＮ感受性品種を使用する初期スクリーニング用に選択して、存在する場合、特異的ＨＧレースに関して、これらのＳＮＰマーカーのどれがＳＣＮ耐性表現型と連鎖しているかを決定する。

親株において選択したＳＮＰマーカーの初期スクリーニングを、ＫＡＳＰａｒ（商標）遺伝子型決定アッセイを使用して実施する。一組の選択したＳＮＰマーカーを確認し、その部分集合は親株間の多型として同定する。多型ＳＮＰマーカーの少なくとも１つを、選択したＳＣＮ耐性ダイズ品種と１つまたは複数のＳＣＮ感受性ダイズ品種の交配によって生じたマッピング集団に関する連鎖試験用に使用する。これらの１つまたは複数の多型ＳＮＰマーカーは、マッピング集団中の個体に対してスクリーニングする。

マッピング集団の個体においてＳＣＮ耐性形質と同時分離するＳＮＰは、特異的ＨＧレースに関してＳＣＮ耐性親品種において、ＳＣＮ耐性と連鎖するマーカーとして同定する。連鎖マーカーの遺伝子型は、マッピング集団の個体において観察される表現型と一致する。

Claims (18)

1. ダイズ品種におけるＳＣＮ耐性の少なくとも１つの決定因子を含む植物を同定するための方法であって、
   植物から核酸分子を単離するステップと、
   ダイズ品種におけるＳＣＮ耐性表現型と連鎖したマーカーに関して単離核酸分子をスクリーニングするステップとを含み、マーカーが配列番号１０のマーカーと遺伝的に連鎖しており、前記マーカーの６１位のアデニンヌクレオチドで定義される一塩基多型（ＳＮＰ）の存在がダイズ品種におけるＳＣＮ耐性の少なくとも１つの決定因子を示す方法。
2. 単離核酸分子がゲノムＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
3. ＳＣＮ耐性表現型がＳＣＮレース３に対するＳＣＮ耐性である、請求項１に記載の方法。
4. ダイズ品種がダイズ品種９８８６０−７１である、請求項１に記載の方法。
5. ダイズ品種におけるＳＣＮ耐性表現型と連鎖したマーカーに関して単離核酸分子をスクリーニングするステップを、競合的対立遺伝子特異的ポリメラーゼ連鎖反応を使用して実施する、請求項１に記載の方法。
6. ＳＣＮ耐性ダイズ植物を生産するための方法であって、
   ＳＣＮ耐性の形質を有するダイズ植物を対象のダイズ品種由来のダイズ植物と交配させるステップと、
   マーカー支援型選択を使用して、ＳＣＮ耐性の形質を有するダイズ植物におけるＳＣＮ耐性表現型と連鎖したマーカーを含むＦ_１ダイズ植物を同定するステップであって、マーカーが配列番号１０のマーカーと遺伝的に連鎖しており、Ｆ_１ダイズ植物が対象のダイズ品種の任意の望ましい形質を有するステップと、
   同定したＦ_１ダイズ植物を繁殖させ、それによってＳＣＮ耐性ダイズ植物を生産するステップとを含む方法。
7. 対象のダイズ品種がＳＣＮ感受性ダイズ品種である、請求項６に記載の方法。
8. ＳＣＮ耐性がＳＣＮレース３に対する耐性である、請求項６に記載の方法。
9. ＳＣＮ耐性の形質を有するダイズ植物が品種９８８６０−７１のダイズ植物である、請求項６に記載の方法。
10. ＳＣＮ耐性の形質を有するダイズ植物におけるＳＣＮ耐性表現型と連鎖したマーカーが配列番号１０である、請求項９に記載の方法。
11. マーカー支援型選択を、競合的対立遺伝子特異的ポリメラーゼ連鎖反応を使用して実施する、請求項６に記載の方法。
12. ダイズ品種におけるＳＣＮ耐性の少なくとも１つの決定因子を移動させるための方法であって、
    （ａ）ダイズ品種における配列番号１０のマーカーと連鎖した少なくとも１つのマーカーと特異的にハイブリダイズ可能であるプローブで、第１の植物のゲノムＤＮＡをドナーの遺伝子型により分析し、そして、第２の植物のＤＮＡをレシピエントの遺伝子型により分析するステップと、
    （ｂ）２つの親植物遺伝子型を有性交配して子孫集団を得るステップと、
    （ｃ）少なくとも１つのマーカーの存在に関して子孫集団を分析するステップと、
    （ｄ）少なくとも１つのマーカーを含む子孫集団由来の個体をレシピエントの遺伝子型と戻し交配させて、次世代集団を生成するステップと、
    （ｅ）次世代集団のメンバーが、レシピエントの遺伝子型由来の望ましい形質および少なくとも１つのマーカーを含むかどうか決定するステップと、
    （ｆ）次世代集団のメンバーが、レシピエントの遺伝子型由来の望ましい形質および少なくとも１つのマーカーを含まない場合、レシピエントの遺伝子型由来の望ましい形質および少なくとも１つのマーカーを含む個体が同定されるまでステップ（ｄ）および（ｅ）を繰り返すステップとを含む方法。
13. 各交配および戻し交配ステップにおいて得られる個々の子孫を各世代でのＳＣＮマーカー分析によって選択する、請求項１２に記載の方法。
14. ダイズ品種がダイズ品種９８８６０−７１である、請求項１２に記載の方法。
15. 遺伝子形質転換により宿主生物中にダイズ品種におけるＳＣＮ耐性の少なくとも１つの決定因子を導入するための方法であって、
    ダイズ品種における配列番号１０のマーカーと連鎖したマーカーと特異的にハイブリダイズ可能であるプローブで植物のゲノムＤＮＡを分析して、植物中のダイズ品種におけるＳＣＮ耐性の少なくとも１つの決定因子を同定するステップと、
    前記マーカーと特異的にハイブリダイズ可能であるプローブと特異的にハイブリダイズする植物のゲノムＤＮＡのセグメントを単離するステップと、
    宿主生物中にゲノムＤＮＡの単離セグメントを導入するステップと、
    前記マーカーと特異的にハイブリダイズ可能であるプローブで宿主生物のＤＮＡを分析して、宿主生物中のダイズ品種におけるＳＣＮ耐性の少なくとも１つの決定因子を同定するステップとを含む方法。
16. ＤＮＡの単離セグメントを宿主生物のゲノムに安定的に組み込む、請求項１５に記載の方法。
17. 宿主生物がマメ科植物である、請求項１６に記載の方法。
18. 宿主生物がダイズ、緑莢インゲン、サヤインゲン、ドライビーンズ、赤インゲン豆、ライマメ、リョクトウ、ツルナシインゲンマメ、アズキマメ、サヤエンドウ、およびササゲからなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。

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